CN115104534B - 一种植物愈伤组织污染后的非损伤物理消毒和分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种植物愈伤组织污染后的非损伤物理消毒和分离方法，涉及植物组织培养技术领域。该植物愈伤组织污染后的非损伤物理消毒和分离方法，包括以下方法步骤：S1、首先将未污染的愈伤组织转移到无菌的愈伤培养基上，培养基为固体培养基则直接进入S2步骤；S2、准备无菌的长颈三角瓶。通过双孔活塞、导入管和导出管，进行无菌水、无菌培养基和低温等离子体的导入和导出，利用氧气电离产生的低温等离子对植物愈伤组织的非损伤性物理杀菌，同时通过无菌水漂洗、物理杀菌和固液分离培养，实现污染愈伤组织的杀菌和无菌愈伤组织的分离回收，最大程度上减少植物愈伤组织因为污染而造成的时间和人力成本损失。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，具体为一种植物愈伤组织污染后的非损伤物理消毒和分离方法。
背景技术
植物生物育种是现代生物技术领域的前沿基础应用科学，其涉及植物体的分子、细胞、遗传和表型，其中如何从成体植物器官组织中诱导出愈伤组织，是进行细胞分子遗传改良很基础和首要的一个关键技术环节，因为只有植物成体细胞在特定培养基诱导条件下形成愈伤组织，然后转移到另外一种再生培养基中能再生成完整植株，才可以对植物细胞进行分子遗传改良操作，而且植物愈伤组织的诱导、继代和再生培养各环节，均需要在无菌条件下操作。
植物愈伤组织的诱导和再生是实现植物生物育种的关键性技术环节之一，在无菌实验操作过程中，由于仪器或人员操作不规范，会无法避免的造成愈伤组织被环境微生物污染，起始植物愈伤组织诱导的植物外植体材料(例如叶片、茎段、根、种子等)在愈伤组织诱导之前可以通过酒精、次氯酸钠等消毒试剂进行表面消毒，以保证后面无菌操作条件下不再存在污染，因为植物外植体诱导的愈伤组织是细胞团，无法使用化学消毒试剂进行消毒，所以从植物外植体诱导出愈伤组织后的各种无菌操作过程中，如果发生真菌和细菌的污染，只能将愈伤组织丢掉，这对于愈伤组织诱导比较难，耗时比较长的植物而言，愈伤的污染和丢弃是造成时间与人工成本的浪费。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种植物愈伤组织污染后的非损伤物理消毒和分离方法，解决了植物愈伤组织因为多种因素受到污染而造成的时间和人力成本损失的问题。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种植物愈伤组织污染后的非损伤物理消毒和分离方法，包括以下方法步骤：
S1、首先将未污染的愈伤组织转移到无菌的愈伤培养基上，培养基为固体培养基则直接进入S2步骤；
S2、准备无菌的长颈三角瓶，长颈三角瓶口配有双孔活塞，活塞中插入玻璃材质的导入管和导出管；
S3、将受到污染的愈伤组织转移到无菌的长颈三角瓶，用无菌水悬浮漂洗2～3次，用移液枪吸走漂洗后的无菌水；
S4、在长颈三角瓶中加入无菌水，悬浮愈伤组织，之后盖上双孔活塞，双孔活塞插有导入管和导出管，在导入管口处接一个转接头；
S5、准备一台采用高频电源的低温等离子体发生装置，使用轴流式的放电装置进行放电，在尾端出口处收集等离子体；
S6、用橡胶导管将低温等离子体发生装置的尾端出气口与双孔活塞上的导入管转接头连通，将氧气电离产生的低温等离子体由尾端出口，经过橡胶导管、转接头和导入管，进入长颈三角瓶中，导入长颈三角瓶中的低温等离子体气体在愈伤悬浮液中杀菌；
S7、低温等离子体处理完后拆下橡胶导管，在转接头上接上注射器，利用注射器吸走低温等离子体处理后的无菌水，然后通过注射器将无菌的液体愈伤培养基导入长颈三角瓶中；
S8、在酒精灯火焰上，对长颈三角瓶和双孔活塞进行火焰消毒，然后套上隔菌盖，通过盖内的塑料卡扣固定在长颈三角瓶口部，之后将带有隔菌盖的长颈三角瓶在控温摇床中进行悬浮培养；
S10、悬浮培养完成后，打开长颈三角瓶盖子，用移液枪将液体培养基吸走，将预培养的愈伤组织转移到无菌滤纸上晾干，然后转移到装有固体培养基的培养皿，培养皿封口后，在控温培养箱中无菌观察培养；
S11、无菌观察2～5天后，将愈伤组织转移到新的固体培养基或液体培养基中开展正常的科学研究。
优选的，所述S5步骤中，放电方式为介质阻挡放电，铜棒电极的外径为5.8mm，外围被外径为38mm石英管包裹作为阻挡介质，放电间隙设计为5～6mm，气体采用氧气，进气流速控制在1L/min。
优选的，所述S5步骤中，轴流式放电装置全长20cm，上端封口，侧端进气。
一种植物愈伤组织污染后的非损伤物理消毒和分离装置，包括长颈三角瓶、隔菌盖和培养皿，所述长颈三角瓶的顶端设置有双孔活塞，所述双孔活塞一侧的孔内设置有导出管，所述双孔活塞另一侧的孔内设置有导入管，所述导入管的外端套设有转接头，用橡胶导管将低温等离子体发生装置的尾端出气口与双孔活塞上的导入管转接头连通，所述隔菌盖的顶端中部设置有透气膜，所述隔菌盖与双孔活塞通过塑料卡扣卡合。
(三)有益效果
本发明提供了一种植物愈伤组织污染后的非损伤物理消毒和分离方法。具备以下有益效果：
本发明通过双孔活塞与导入管和导出管，进行无菌水、无菌培养基和低温等离子体的导入和导出，利用氧气电离产生的低温等离子对植物愈伤组织的非损伤性物理杀菌，同时通过无菌水漂洗、物理杀菌和固液分离培养，实现污染愈伤组织的杀菌和无菌愈伤组织的分离回收，最大程度上减少植物愈伤组织因为污染而造成的时间和人力成本损失。
附图说明
图1为本发明的长颈三角瓶结构示意图；
图2为本发明的转接头安装示意图；
图3为本发明的隔菌盖安装示意图；
图4为本发明的培养皿示意图；
图5为本发明的技术操作示意图。
其中，1、导出管；2、导入管；3、双孔活塞；4、长颈三角瓶；5、转接头；6、隔菌盖；7、透气膜；8、塑料卡扣；9、培养皿；10、植物愈伤组织。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：
本发明实施例提供一种植物愈伤组织污染后的非损伤物理消毒和分离方法，包括以下方法步骤：
S1、首先将未污染的愈伤组织转移到无菌的愈伤培养基上，培养基如果采用固体培养基，则直接进入S2步骤；
S2、准备无菌的长颈三角瓶4，长颈三角瓶4口配有双孔活塞3，活塞中插入玻璃材质的导入管2和导出管1，导入管2的长度要大于导出管1的长度；
S3、将受到污染的愈伤组织10转移到无菌的长颈三角瓶4，用无菌水悬浮漂洗2次，用移液枪吸走漂洗后的无菌水；
S4、在长颈三角瓶4中加入无菌水，悬浮愈伤组织，之后盖上双孔活塞3，双孔活塞3插有导入管2和导出管1，在导入管2口处接一个转接头5，便于后续低温等离子体的输入；
S5、准备一台采用高频电源的低温等离子体发生装置，使用轴流式的放电装置进行放电，产生的等离子体从设备的尾端出口处进行收集；
S6、用橡胶导管将低温等离子体发生装置的尾端出气口与双孔活塞3上的导入管接头5连通，从而将氧气电离产生的低温等离子体由尾端出口，经过橡胶导管、转接头5和导入管2，进入长颈三角瓶4中，导入长颈三角瓶4中的低温等离子体气体在愈伤悬浮液中杀菌，多余气体由导出管1排出，以减少瓶内气压；
S7、低温等离子体处理完后，拆下橡胶导管，在转接头5上接上注射器，利用注射器吸走低温等离子体处理后的无菌水，然后通过注射器将无菌的液体愈伤培养基导入长颈三角瓶4中；
S8、使用酒精灯火焰对长颈三角瓶4和双孔活塞3进行火焰消毒，然后套上隔菌盖6，隔菌盖6带有一个透气膜7，通过盖内的塑料卡扣8固定在长颈三角瓶4口部，之后将带有隔菌盖6的长颈三角瓶4在具备一定温度和转速的控温摇床中进行悬浮培养；
S10、悬浮培养完成后，打开长颈三角瓶4盖子，用移液枪将液体培养基吸走，将预培养的愈伤组织转移到无菌滤纸上晾干，然后转移到装有固体培养基的培养皿9，培养皿9封口后，在一定温度的控温培养箱中进行无菌观察培养；
S11、无菌观察2天后，将愈伤组织转移到新的固体培养基中开展正常的科学研究。
S5步骤中，放电方式为介质阻挡放电，铜棒电极的外径为5.8mm，外围被外径为38mm石英管包裹作为阻挡介质，放电间隙设计为5mm，气体采用氧气，进气流速控制在1L/min。
S5步骤中，轴流式放电装置全长20cm，上端封口，侧端进气，等离子体从尾端出口处被输出。
如图1-5所示，本发明实施例提供一种植物愈伤组织污染后的非损伤物理消毒和分离装置，包括长颈三角瓶4、隔菌盖6和培养皿9，长颈三角瓶4的顶端设置有双孔活塞3，双孔活塞3的两侧设置有相应的通孔；
双孔活塞3一侧的孔内设置有导出管1，导出管1的作用是让瓶身内部的气体被排出，双孔活塞3另一侧的孔内设置有导入管2，导入管2的长度大于到导出管1的长度，导入管2的外端套设有转接头5，转接头5的作用是通过橡胶导管与低温等离子体发生装置的尾端出气口连通，向瓶身内部输送低温等离子体；
隔菌盖6的顶端中部设置有透气膜7，透气膜7的作用是保障长颈三角瓶4的内部与瓶身外部保持连通，隔菌盖6与双孔活塞3通过塑料卡扣8卡合；
在本实施例中，通过双孔活塞3上设置的导入管2和导出管1，以及转接头5来连接低温等离子发生装置，进行无菌水、无菌培养基和低温等离子体的导入和导出，利用氧气电离产生的低温等离子对植物愈伤组织的非损伤性物理杀菌。
实施例二：
本发明实施例提供一种植物愈伤组织污染后的非损伤物理消毒和分离方法，包括以下方法步骤：
S1、首先将未污染的愈伤组织转移到无菌的愈伤培养基上，培养基如果采用液体培养基，则先将长颈三角瓶4中受污染的液体培养基，用移液枪吸走，将受污染的愈伤组织在无菌滤纸上吸干多余液体培养基，然后再进入S2步骤；
S2、准备无菌的长颈三角瓶4，长颈三角瓶4口配有双孔活塞3，活塞中插入玻璃材质的导入管2和导出管1，导入管2的长度要大于导出管1的长度；
S3、将受到污染的愈伤组织10转移到无菌的长颈三角瓶4，用无菌水悬浮漂洗3次，用移液枪吸走漂洗后的无菌水；
S4、在长颈三角瓶4中加入无菌水，悬浮愈伤组织，之后盖上双孔活塞3，双孔活塞3插有导入管2和导出管1，在导入管2口处接一个转接头5，便于后续低温等离子体的输入；
S5、准备一台采用高频电源的低温等离子体发生装置，使用轴流式的放电装置进行放电，产生的等离子体从设备的尾端出口处进行收集；
S6、用橡胶导管将低温等离子体发生装置的尾端出气口与双孔活塞3上的导入管转接头5连通，从而将氧气电离产生的低温等离子体由尾端出口，经过橡胶导管、转接头5和导入管2，进入长颈三角瓶4中，导入长颈三角瓶4中的低温等离子体气体在愈伤悬浮液中杀菌，多余气体由导出管1排出，以减少瓶内气压；
S7、低温等离子体处理完后，拆下橡胶导管，在转接头5上接上注射器，利用注射器吸走低温等离子体处理后的无菌水，然后通过注射器将无菌的液体愈伤培养基导入长颈三角瓶4中；
S8、使用酒精灯火焰对长颈三角瓶4和双孔活塞3进行火焰消毒，然后套上隔菌盖6，隔菌盖6带有一个透气膜7，通过盖内的塑料卡扣8固定在长颈三角瓶4口部，之后将带有隔菌盖6的长颈三角瓶4在具备一定温度和转速的控温摇床中进行悬浮培养；
S10、悬浮培养完成后，打开长颈三角瓶4盖子，用移液枪将液体培养基吸走，将预培养的愈伤组织转移到无菌滤纸上晾干，然后转移到装有固体培养基的培养皿9，培养皿9封口后，在一定温度的控温培养箱中进行无菌观察培养；
S11、无菌观察4天后，将愈伤组织转移到新的固体培养基中开展正常的科学研究。
S5步骤中，放电方式为介质阻挡放电，铜棒电极的外径为5.8mm，外围被外径为38mm石英管包裹作为阻挡介质，放电间隙设计为6mm，气体采用氧气，进气流速控制在1L/min。
S5步骤中，轴流式放电装置全长20cm，上端封口，侧端进气，等离子体从尾端出口处被输出。
如图1-5所示，本发明实施例提供一种植物愈伤组织污染后的非损伤物理消毒和分离装置，包括长颈三角瓶4、隔菌盖6和培养皿9，长颈三角瓶4的顶端设置有双孔活塞3，双孔活塞3的两侧设置有相应的通孔；
双孔活塞3一侧的孔内设置有导出管1，导出管1的作用是让瓶身内部的气体被排出，双孔活塞3另一侧的孔内设置有导入管2，导入管2的长度大于到导出管1的长度，导入管2的外端套设有转接头5，转接头5的作用是通过橡胶导管与低温等离子体发生装置的尾端出气口连通，向瓶身内部输送低温等离子体；
隔菌盖6的顶端中部设置有透气膜7，透气膜7的作用是保障长颈三角瓶4的内部与瓶身外部保持连通，隔菌盖6与双孔活塞3通过塑料卡扣8卡合。
通过无菌水漂洗、物理杀菌和固液分离培养的方式，实现了污染愈伤组织的杀菌和无菌愈伤组织的分离回收，最大程度上减少植物愈伤组织因为污染而造成的时间和人力成本损失。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (4)
1.一种植物愈伤组织污染后的非损伤物理消毒和分离方法，其特征在于：包括以下方法步骤：
S1、首先将未污染的愈伤组织转移到无菌的愈伤培养基上，培养基为固体培养基则直接进入S2步骤；
S2、准备无菌的长颈三角瓶(4)，长颈三角瓶(4)口配有双孔活塞(3)，活塞中插入玻璃材质的导入管(2)和导出管(1)；
S3、将受到污染的愈伤组织(10)转移到无菌的长颈三角瓶(4)，用无菌水悬浮漂洗2～3次，用移液枪吸走漂洗后的无菌水；
S4、在长颈三角瓶(4)中加入无菌水，悬浮愈伤组织，之后盖上双孔活塞(3)，双孔活塞(3)插有导入管(2)和导出管(1)，在导入管(2)口处接一个转接头(5)；
S5、准备一台采用高频电源的低温等离子体发生装置，使用轴流式的放电装置进行放电，在尾端出口处收集等离子体；
S6、用橡胶导管将低温等离子体发生装置的尾端出气口与双孔活塞(3)上的导入管转接头(5)连通，将氧气电离产生的低温等离子体由尾端出口，经过橡胶导管、转接头(5)和导入管(2)，进入长颈三角瓶(4)中，导入长颈三角瓶(4)中的低温等离子体气体在愈伤悬浮液中杀菌；
S7、低温等离子体处理完后拆下橡胶导管，在转接头(5)上接上注射器，利用注射器吸走低温等离子体处理后的无菌水，然后通过注射器将无菌的液体愈伤培养基导入长颈三角瓶(4)中；
S8、在酒精灯火焰上，对长颈三角瓶(4)和双孔活塞(3)进行火焰消毒，然后套上隔菌盖(6)，通过盖内的塑料卡扣(8)固定在长颈三角瓶(4)口部，之后将带有隔菌盖(6)的长颈三角瓶(4)在控温摇床中进行悬浮培养；
S10、悬浮培养完成后，打开长颈三角瓶(4)盖子，用移液枪将液体培养基吸走，将预培养的愈伤组织转移到无菌滤纸上晾干，然后转移到装有固体培养基的培养皿(9)，培养皿(9)封口后，在控温培养箱中无菌观察培养；
S11、无菌观察2～5天后，将愈伤组织转移到新的固体培养基或液体培养基中开展正常的科学研究。
2.根据权利要求1所述的一种植物愈伤组织污染后的非损伤物理消毒和分离方法，其特征在于：所述S5步骤中，放电方式为介质阻挡放电，铜棒电极的外径为5.8mm，外围被外径为38mm石英管包裹作为阻挡介质，放电间隙设计为5～6mm，气体采用氧气，进气流速控制在1L/min。
3.根据权利要求1所述的一种植物愈伤组织污染后的非损伤物理消毒和分离方法，其特征在于：所述S5步骤中，轴流式放电装置全长20cm，上端封口，侧端进气。
4.一种植物愈伤组织污染后的非损伤物理消毒和分离装置，其特征在于：应用于权利要求1-3任一项所述的一种植物愈伤组织污染后的非损伤物理消毒和分离方法，包括长颈三角瓶(4)、隔菌盖(6)和培养皿(9)，所述长颈三角瓶(4)的顶端设置有双孔活塞(3)，所述双孔活塞(3)一侧的孔内设置有导出管(1)，所述双孔活塞(3)另一侧的孔内设置有导入管(2)，所述导入管(2)的外端套设有转接头(5)，用橡胶导管将低温等离子体发生装置的尾端出气口与双孔活塞(3)上的导入管转接头(5)连通，所述隔菌盖(6)的顶端中部设置有透气膜(7)，所述隔菌盖(6)与双孔活塞(3)通过塑料卡扣(8)卡合。
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