CN115096970B - 一种磁性碳修饰的邻苯二酚传感器酶电极及其制备方法和应用 - Google Patents

一种磁性碳修饰的邻苯二酚传感器酶电极及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种磁性碳修饰的邻苯二酚传感器酶电极及其制备方法和应用，首先合成了三聚氰胺树脂包覆的Fe3O4纳米颗粒，再与羧基化的碳纳米管发生酰胺化反应生成Fe3O4@MF‑CNTs纳米粒子；所获磁性Fe3O4@MF‑CNTs纳米粒子具有优异的生物相容性和导电性；利用戊二醛将漆酶交联在Fe3O4@MF‑CNTs纳米粒子表面制备固定化漆酶，再将固定化漆酶滴涂在玻碳电极上，制备磁性碳修饰的邻苯二酚传感器酶电极。与现有技术相比，本发明具有方法简便，条件温和，检测限宽，灵敏度高，稳定性好等优点，能在弱酸性条件下检测邻苯二酚,在水体检测、环境监测、食品安全等领域具有潜在的应用前景。

Description

一种磁性碳修饰的邻苯二酚传感器酶电极及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物传感领域，具体涉及一种磁性碳修饰的邻苯二酚传感器酶电极及其制备方法和应用。
背景技术
邻苯二酚作为一种重要的化工中间体广泛用于塑料、农药、染料、涂料等化工产品的生产中。邻苯二酚具有易富集但难降解的特点，其毒性可以通过食物链传递，对生物个体有毒害作用，高浓度的酚会引起神经系统病变，因此，邻苯二酚的检测在生理医学及环境保护中都有着十分重要的意义。
目前最常用的检测技术有高效液相色谱(HPLC)气相色谱/质谱(GC/MS)、化学发光免疫分析法、酶联免疫吸附分析法、荧光极化免疫分析法等。但由于前处理工艺复杂，检测周期长，大多无法实现酚类化合物的实时原位分析。电化学酶生物传感器因其制备简单、响应速度快、成本低、灵敏度高、实时检测能力强而受到广泛关注。
发明内容
本发明的目的在于提供一种磁性碳修饰的邻苯二酚传感器酶电极及其制备方法，先合成了氨基树脂包覆的Fe3O4纳米颗粒，再与羧基化碳纳米管复合，具有优异的生物相容性和导电性，最后使用双功能试剂使Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子与漆酶共价结合，滴涂在玻碳电极上，构建了邻苯二酚传感系统，制备方法简单高效、条件温和。
本发明还有一个目的在于提供一种磁性碳修饰的邻苯二酚传感器酶电极的应用，用于邻苯二酚检测，具有检测限宽，灵敏度高，稳定性好等优点，且可在较酸环境中高效发挥作用。
本发明具体技术方案如下：
一种磁性碳修饰的邻苯二酚传感器酶电极的制备方法，包括以下步骤：
1)制备磁性Fe3O4@MF纳米粒子；
2)制备磁性Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子；
3)制备功能化磁性Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子；
4)Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子固定化漆酶；
5)磁性碳修饰的漆酶电极的制备。
步骤1)具体为：将磁性Fe3O4纳米粒子分散于溶剂中，加入表面活性剂、三聚氰胺和醛，调节溶液为碱性，进行反应，产物洗涤、分离得氨基树脂包覆的磁性Fe3O4纳米粒子，即磁性Fe3O4@MF纳米粒子；
步骤1)中，磁性Fe3O4纳米粒子分散于溶剂，浓度20-24mmol/L；
步骤1)中，所述调节溶液为碱性是指调节pH至9-11；
步骤1)中，所述磁性Fe3O4纳米粒子、三聚氰胺和醛的摩尔比为1：(3-12)：(3-36)；所述醛优选为甲醛水溶液，质量分数为37％；三聚氰胺和甲醛经过缩聚反应生成三聚氰胺树脂，在低交联状态下，三聚氰胺树脂的末端含有-OH、-NH等基团，可以作为固定酶的位点；
步骤1)中所述溶剂为醇和蒸馏水混合溶液，醇和蒸馏水的体积比为1：(1-3)；加入醇可以提高三聚氰胺的溶解度，并且与水互溶，可以将反应物充分分散开；所述醇为甲醇、乙醇或乙二醇，最优选为乙醇；
步骤1)中所述表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵，改善纳米粒子在溶液中的分散性，作为软模板与相应前驱体协同自组装形成核壳结构；所用表面活性剂在步骤1)混合溶液中的浓度为50-60mmol/L；
步骤1)中，调节调节溶液为碱性的试剂为强碱弱酸盐，优选为无水碳酸钠；
步骤1)中所述进行反应指在10℃-40℃下反应2-12h；即本发明在常温下也可以进行。
步骤1)中所述磁性Fe3O4纳米粒子的制备方法为：向铁源、醋酸钠中加入乙二醇，加热反应，洗涤，分离得磁性Fe3O4纳米粒子；所述铁源为氯化铁或硫酸铁；所述铁源与醋酸钠摩尔比为1：(5-10)；所述铁源在乙二醇中浓度为0.1-0.3mol/L；所述加热反应指在120℃-240℃下反应6-20h；本发明Fe3O4具有良好的电催化性能，因为Fe2+与Fe3+的相互转化加速了电子的转移，对电化学检测具有促进作用，磁性粒子的作用是便于分离固定化漆酶，有利于材料重复利用。
步骤2)具体为：将羧基化碳纳米管、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)混合在水中，进行活化，再加入磁性Fe3O4@MF纳米粒子，加热反应，产物洗涤，分离得磁性Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子；
步骤2)中所述羧基化碳纳米管的制备方法为：将碳纳米管分散在浓硫酸和浓硝酸的混合酸溶液中，在10-50℃下搅拌2-10h；浓硫酸和浓硝酸体积比为3：1；碳纳米管作为复合材料的基体可以提高材料的比表面积和导电性；碳纳米管经过氧化后生成羧基化碳纳米管；所用的浓硫酸和浓硝酸是分析纯；碳纳米管在混合酸溶液中的浓度为1-10g/L；
步骤2)中羧基化碳纳米管、EDC和NHS的质量比为1：5：4；所述活化是指：20-40℃下搅拌培养20-60min；磁性Fe3O4@MF纳米粒子与羧基化碳纳米管质量比为1：(1-3)；所述加热反应指在氩气保护下50℃-100℃下反应30-120min；碳纳米管上的羧基经过活化后，与Fe3O4@MF上的氨基反应形成酰胺键，酰胺键作为连接Fe3O4@MF和碳纳米管的桥梁，是合成Fe3O4@MF-CNTs复合材料的关键；所制备的Fe3O4@MF-CNTs复合材料具有良好的生物相容性、大的比表面积和优异的导电性，使得漆酶电极的电化学性能得到改善。
步骤3)具体为：将磁性Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子分散于双功能试剂溶液中，水浴，产物洗涤，分离获得功能化磁性Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子；
步骤3)中所述功能化试剂溶液为戊二醛水溶液，浓度为1-3wt％；
步骤3)中所述水浴方法为：在20-40℃下避光振荡水浴2-8h；
步骤3)中双功能试剂溶液与磁性Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子所用的质量比为(1-3)：2；
步骤4)具体为：将功能化磁性Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子分散在漆酶溶液中，水浴，得Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子固定化漆酶；
步骤4)中所述漆酶溶液中，漆酶活性为4.4U/mL；
步骤4)中所述水浴方法为：在20-40℃下避光振荡水浴1-4h；
步骤4)中Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子在漆酶溶液中浓度为1-5mg/mL；
步骤5)具体为：将Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子固定化漆酶溶液滴涂在光亮的工作电极表面，低温下晾干，用溶剂冲洗电极表面，得到漆酶电极；
步骤5)中Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子固定化漆酶溶液浓度为1-5mg/mL；滴涂的体积为2-10μL；
步骤5)中所述工作电极使用前，采用1.0、0.3和0.05μm氧化铝粉抛光，用乙醇和超纯水彻底清洗，氩气流干燥；所述工作电极为玻碳电极，直径为3mm；
步骤5)中所述低温下晾干，温度为1-5℃；
步骤5)中溶剂为超纯水或二次蒸馏水。
本发明提供的一种磁性碳修饰的邻苯二酚传感器酶电极，采用上述方法制备得到。
本发明一种磁性碳修饰的邻苯二酚传感器酶电极的应用，用于邻苯二酚的检测，尤其是酸性条件下邻苯二酚的检测，漆酶的最适pH为4.5，本发明在pH＝3.5-6.5均可以检测，但在pH＝4.5时最佳。目前已报道的传感材料生物相容性、导电性差，漆酶易失活，导致电极界面酶促反应的重现性差、活性不理想，限制了酚类生物传感器的应用，本发明制备的邻苯二酚传感器酶电极作用机理在于：漆酶可以氧化邻苯二酚，将反应产生的电子通过磁性碳快速转移到电极上，在电化学工作站中通过检测电子转移的数量(电流大小)从而得到邻苯二酚的浓度；因此能实现邻苯二酚的检测，尤其是酸性条件下邻苯二酚的检测，其检测限宽，灵敏度高，稳定性好。
本发明制备过程中，首先合成了氨基树脂包覆的Fe3O4纳米颗粒，再与羧基化碳纳米管复合，新合成的磁性Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子具有优异的生物相容性和导电性，最后使用双功能试剂使Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子与漆酶共价结合，滴涂在玻碳电极上，构建了邻苯二酚传感电极。Fe3O4易于于分离回收且具有良好的电催化性能，因为Fe2+与Fe3+的相互转化加速了电子的转移，对电化学检测具有促进作用。三聚氰胺树脂包覆后Fe3O4表面具有丰富的胺基可以作为漆酶的固定位点，但三聚氰胺树脂的包覆会使得Fe3O4的导电性降低，不利于电子的转移，碳纳米管的导电性良好，比表面积大，生物相容性好，因此碳纳米管的复合可以提高材料的性能，改善检测效果。
与现有技术相比，本发明制备的高灵敏漆酶电极具有方法简便，条件温和，检测限宽，灵敏度高，稳定性好等优点，并且可在较酸环境中高效发挥作用,使其在水体检测、环境监测、食品安全等领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1实施例1所制备的Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子透射电子显微镜照片；
图2实施例1所制备的Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子透射电子显微镜局部放大图；
图3为实施例1所制备的Fe3O4@MF和Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子X-射线粉末衍射图；
图4为实施例1所制备的漆酶电极在不同浓度邻苯二酚中的循环伏安图；在图4中，横坐标为电压(V)，纵坐标为电流(μA)；测试环境为25℃、pH＝4.5、0.2mol/L的醋酸缓冲溶液；
图5为实施例1所制备的漆酶电极对不同浓度邻苯二酚的电流响应图；在图5中，横坐标为邻苯二酚浓度(μmol/L)，纵坐标为电流(μA)；在浓度为20-800μmol/L和800-4000μmol/L时与循环伏安图的峰电流呈线性关系。
具体实施方式
实施例1
一种磁性碳修饰的邻苯二酚传感器酶电极的制备方法，包括以下步骤：
1)磁性Fe3O4纳米粒子及磁性Fe3O4@MF纳米粒子的制备过程如下：
1-1)称取0.9g FeCl3·6H2O，3.6g NaAc·3H2O置于聚四氟乙烯内衬中，加入20mL乙二醇，搅拌均匀，得到橙黄色乳液，将反应釜于200℃下反应8h，冷却至室温；产品用乙醇洗涤3次，蒸馏水洗涤3次，分离即可得磁性Fe3O4纳米粒子；
1-2)将1-1)制备1mmol磁性Fe3O4纳米粒子分散于30mL蒸馏水和14mL无水乙醇中，加入0.92g十六烷基三甲基溴化铵，1.13g三聚氰胺，超声10min，35℃反应30min，用无水碳酸钠调节pH至10，加入0.75mL 37wt％的甲醛水溶液，机械搅拌(200转/min)，于35℃反应6h；磁分离，乙醇洗3次，水洗3次，在烘箱中于60℃干燥得到磁性纳米粒子Fe3O4@MF；
2)磁性纳米粒子Fe3O4@MF-CNTs及功能化磁性Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子的制备过程如下：
2-1)用15mL 18M浓硫酸溶液和5mL 12M浓硝酸溶液的混合酸溶液处理100mg的多壁碳纳米管，在25℃下磁力搅拌6h，制备羧基化碳纳米管。离心收集固体，用超纯水洗涤至中性，然后在烘箱中60℃干燥，得到羧基化碳纳米管CNTs-COOH；
2-2)称取20mg CNTs-COOH，加入60mL去离子水，80mg NHS，100mg EDC，超声10min，在37℃下于200转/min机械搅拌30min，加入10mg磁性Fe3O4@MF纳米粒子，再在氩气保护下于80℃反应1h，即可获得磁性Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子。
2-3)称取5mg Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子加入4mL 2wt％戊二醛水溶液，30℃避光振荡4h，水洗2次，即可获得所述功能化磁性Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子；
由图1、2可知实施例1所获Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子分散均匀，Fe3O4@MF纳米粒子为粒径为120纳米的聚集体。再利用酰胺键连接在羧基化碳纳米管表面，形成Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子。
3)Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子固定化漆酶及磁性碳修饰的漆酶电极的制备过程如下：
3-1)将所获功能化Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子加入2mL漆酶溶液，漆酶活性为4.4U/mL，Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子浓度为2.5mg/mL；于30℃避光振荡2h，即可获得所述Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子固定化漆酶；
3-2)采用1.0、0.3和0.05μm氧化铝粉抛光直径为3mm玻碳电极，用乙醇和超纯水清洗玻碳电极，并在氩气流干燥；将5μL 2.5mg/mL的Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子固定化漆酶溶液滴涂在玻碳电极表面，在4℃下干燥，再用超纯水冲洗漆酶电极表面，即得。
图3为实施例1所制备的Fe3O4@MF和Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子X-射线粉末衍射图；根据标准PDF卡片JCPDS 99-0073，Fe3O4@MF衍射谱从左至右分别对应于Fe3O4的(111)、(220)、(311)、(222)、(400)、(422)、(511)、(440)晶面。在复合材料的XRD光谱中，除了Fe3O4@MF的特征峰，还观察到约26°的特征衍射峰，根据标准卡片JCPDS 41-1487，对应于碳纳米管的(002)晶面。
上述制备的磁性碳修饰的邻苯二酚传感器酶电极应用，用于检测磁性碳修饰的邻苯二酚传感器酶电极。
具体检测操作步骤如下：
1)分别称取0.1mol醋酸钠和0.1mol冰乙酸，用超纯水溶解，转移至500mL容量瓶，定容，分别得到0.2mol/L醋酸钠溶液和0.2mol/L醋酸溶液，再按比例配置成0.2mol/L醋酸/醋酸钠缓冲溶液，pH＝4.5；
2)电解槽中加入100mL上述缓冲溶液，以上述制备的漆酶电极作为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，向缓冲溶液中加入不同浓度的邻苯二酚，邻苯二酚终浓度分别20、50、70、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2500、3000、3500、4000μM；在电化学工作站上测试电极的循环伏安曲线。获得的数据是循环伏安曲线图，以电压为横坐标，电流为纵坐标；依据循环伏安曲线图，以邻苯二酚浓度为横坐标，以氧化峰峰电流值为纵坐标，获得工作曲线，当浓度为c＝20-800μmol时:ip(μA)＝17.49+0.05c(μmol/L)(R2＝0.994)；当浓度为c＝800-4000μmol时:ip(μA)＝33.03+0.03c(μmol/L)(R2＝0.998)。
本发明所制备的Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子大小均匀，Fe3O4@MF聚集体的粒径为120nm，再利用酰胺键连接在羧基化碳纳米管表面，形成Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子。所获磁性碳修饰的酶电极能有效检测水中的邻苯二酚，检测范围0.02-4mmol/L。
实施例2
一种磁性碳修饰的邻苯二酚传感器酶电极的制备方法，包括以下步骤：
1)磁性Fe3O4纳米粒子及磁性Fe3O4@MF纳米粒子的制备过程如下：
1-1)称取0.9g FeCl3·6H2O，3.6g NaAc·3H2O置于聚四氟乙烯内衬中，加入20mL乙二醇，搅拌均匀，得到橙黄色乳液，将反应釜于180℃下反应10h，冷却至室温；产品用乙醇洗涤3次，蒸馏水洗涤3次，分离即可得磁性Fe3O4纳米粒子；
1-2)将1-1)制备的1mmol Fe3O4纳米粒子分散于30mL蒸馏水和14mL乙醇中，加入0.92g十六烷基三甲基溴化铵，1.13g三聚氰胺，超声10min，35℃反应30min，用无水碳酸钠调节pH至10，加入0.75mL质量浓度37wt％的甲醛水溶液，机械搅拌(200转/min)，于35℃反应6h。磁分离，乙醇洗3次，水洗3次，在烘箱中于60℃干燥获得磁性纳米粒子Fe3O4@MF；
2)磁性Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子及功能化磁性Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子的制备过程如下：
2-1)用15mL,18M浓硫酸溶液和5mL,12M浓硝酸溶液的混合酸溶液处理100mg的多壁碳纳米管，在25℃下磁力搅拌6h，制备羧基化碳纳米管。离心收集固体，用超纯水洗涤至中性，然后在烘箱中60℃干燥，得到CNTs-COOH；
2-2)称取20mg CNTs-COOH，加入60mL去离子水，80mg NHS，100mg EDC，超声10min，在37℃下于200转/min机械搅拌30min，加入10mg Fe3O4@MF，再在氩气保护下80℃反应1h，即可获得磁性Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子。
2-3)称取5mg Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子加入4mL 2wt％戊二醛水溶液，于30℃避光振荡4h，水洗2次，即可获得所述功能化磁性Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子；
3)Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子固定化漆酶及漆酶电极的制备过程如下：
3-1)将5mg所获功能化Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子加入2mL漆酶，漆酶活性为4.4U/mL，Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子浓度为2.5mg/mL；于30℃避光振荡2h，即可获得所述Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子固定化漆酶；
3-2)采用1.0、0.3和0.05μm氧化铝粉抛光直径为3mm玻碳电极，用乙醇和超纯水彻底清洗，在氩气流中干燥；将5μL 2.5mg/mL的Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子固定化漆酶溶液滴涂在玻碳电极表面，在4℃下干燥，再用超纯水冲洗酶电极表面。
漆酶电极用于检测邻苯二酚的操作步骤同实施例1；
所获Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子大小均匀，Fe3O4@MF聚集体的粒径为115nm，再利用酰胺键连接在羧基化碳纳米管表面，形成Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子。所获磁性碳修饰的酶电极可以有效检测水中的邻苯二酚，检测范围0.02-3.98mmol/L。
实施例3
一种磁性碳修饰的邻苯二酚传感器酶电极的制备方法，包括以下步骤：
1)磁性Fe3O4纳米粒子及磁性Fe3O4@MF纳米粒子的制备过程如下：
1-1)称取0.9g FeCl3·6H2O，3.6g NaAc·3H2O置于聚四氟乙烯内衬中，加入20mL乙二醇，搅拌均匀，得到橙黄色乳液，将反应釜于200℃下反应8h，冷却至室温；产品用乙醇洗涤3次，蒸馏水洗涤3次，分离即可得磁性Fe3O4纳米粒子；
1-2)将1-1)制备1mmol磁性Fe3O4纳米粒子分散于30mL蒸馏水和14mL乙醇中，加入0.92g十六烷基三甲基溴化铵，1.13g三聚氰胺，超声10min，35℃反应30min，用无水碳酸钠调节pH至10，加入1.5mL 37wt％甲醛水溶液，机械搅拌(200转/min)，于35℃反应6h。磁分离，乙醇洗3次，水洗3次，在烘箱中于60℃干燥得到磁性Fe3O4@MF纳米粒子；
2)磁性Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子及功能化磁性Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子的制备过程如下：
2-1)用15mL,18M浓硫酸溶液和5mL,12M浓硝酸溶液的混合酸溶液处理100mg的多壁碳纳米管，在25℃下磁力搅拌6h，制备羧基化碳纳米管。离心收集固体，用超纯水洗涤至中性，然后在烘箱中于60℃干燥，得到CNTs-COOH；
2-2)称取20mg CNTs-COOH，加入60mL去离子水，80mg NHS，100mg EDC，超声10min，在37℃下于200转/min机械搅拌30min，加入10mg Fe3O4@MF，再在氩气保护下80℃反应1h，即可获得磁性Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子。
2-3)称取5mg Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子加入4mL 2wt％戊二醛水溶液，30℃避光振荡4h，水洗2次，即可获得所述功能化磁性Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子；
3)Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子固定化漆酶及漆酶电极的制备过程如下：
3-1)将5mg获功能化Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子加入2mL漆酶，漆酶活性为4.4U/mL，Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子浓度为2.5mg/mL；于30℃避光振荡2h，即可获得所述Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子固定化漆酶；
3-2)采用1.0、0.3和0.05μm氧化铝粉抛光直径为3mm玻碳电极，用乙醇和超纯水清洗干净，氩气流干燥；将5μL 2.5mg/mL的Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子固定化漆酶溶液滴涂在玻碳电极表面，在4℃下干燥，再用超纯水冲洗酶电极表面。
漆酶电极用于检测邻苯二酚的操作步骤同实施例1；
所获Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子大小均匀，Fe3O4@MF聚集体的粒径为130nm，再利用酰胺键连接在羧基化碳纳米管表面，形成Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子。所获磁性碳修饰的酶电极可以有效检测水中的邻苯二酚，检测范围0.05-4mmol/L。
实施例4
一种磁性碳修饰的邻苯二酚传感器酶电极的制备方法，包括以下步骤：
1)磁性Fe3O4纳米粒子及磁性Fe3O4@MF纳米粒子的制备过程如下：
1-1)称取0.9g FeCl3·6H2O，3.6g NaAc·3H2O置于聚四氟乙烯内衬中，加入20mL乙二醇，搅拌均匀，得到橙黄色乳液，将反应釜于200℃下反应8h，冷却至室温；产品用乙醇洗涤3次，蒸馏水洗涤3次，分离即可得磁性Fe3O4纳米粒子；
1-2)将1-1)制备1mmolFe3O4纳米粒子分散于30mL蒸馏水和14mL乙醇中，加入0.92g十六烷基三甲基溴化铵，1.13g三聚氰胺，超声10min，35℃反应30min，用无水碳酸钠调节pH至10，加入0.75mL 37wt％甲醛水溶液，机械搅拌(200转/min)，于35℃反应6h。磁分离，乙醇洗3次，水洗3次，在烘箱中60℃干燥得到磁性Fe3O4@MF纳米粒子；
2)磁性Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子及功能化磁性Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子的制备过程如下：
2-1)用15mL,18M浓硫酸溶液和5mL,12M浓硝酸溶液的混酸溶液处理100mg的多壁碳纳米管，在25℃下磁力搅拌6h，制备羧化碳纳米管。离心收集固体，用超纯水洗涤至中性，然后在烘箱中60℃干燥，得到CNTs-COOH；
2-2)称取10mg CNTs-COOH，加入60mL去离子水，40m NHS，50mg EDC，超声10min在37℃下于200转/min机械搅拌30min，加入10mg Fe3O4@MF，再在氩气保护下于80℃反应1h，即可获得磁性Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子。
2-3)称取5mg Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子加入4mL 2wt％戊二醛水溶液，30℃避光振荡4h，水洗2次，即可获得所述功能化磁性Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子；
3)Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子固定化漆酶及漆酶电极的制备过程如下：
3-1)将5mg所获功能化Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子加入2mL漆酶，漆酶活性为4.4U/mL，Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子浓度为2.5mg/mL；于30℃避光振荡2h，即可获得所述Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子固定化漆酶；
3-2)采用1.0、0.3和0.05μm氧化铝粉抛光直径为3mm玻碳电极，用乙醇和超纯水清洗干净，氩气流干燥；将5μL 2.5mg/mL的Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子固定化漆酶溶液滴涂在玻碳电极表面，在4℃下干燥，再用超纯水冲洗酶电极表面。
漆酶电极用于检测邻苯二酚的操作步骤同实施例1；
所获Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子大小均匀，Fe3O4@MF聚集体的粒径为120nm，再利用酰胺键连接在羧基化碳纳米管表面，形成Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子。所获磁性碳修饰的酶电极可以有效检测水中的邻苯二酚，检测范围0.08-3mmol/L。
只有漆酶修饰电极无法进行检测：取5μL漆酶溶液(4.4U/mL)滴在按照上述相同的方法打磨过的电极表面，4℃下干燥，用超纯水冲洗酶电极表面。电解槽中加入100mL醋酸缓冲溶液，以上述制备的漆酶电极作为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，向缓冲溶液中加入不同浓度的邻苯二酚，在电化学工作站上测试电极的循环伏安曲线。由于漆酶表面是不导电的蛋白质外壳，阻碍了电子在电极上的转移，在循环伏安曲线中不能检测到氧化还原峰。
本发明稳定性测试：取4支按照上述相同的方法打磨过的电极，滴涂5μL 2.5mg/mL的Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子固定化漆酶溶液，4℃下干燥，用超纯水冲洗酶电极表面。电解槽中加入100mL醋酸缓冲溶液，以上述制备的漆酶电极作为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，向缓冲溶液中加入0.5mmol/L的邻苯二酚，在电化学工作站上测试电极的循环伏安曲线。4支电极氧化峰峰电流的相对标准偏差在1.85％,说明本发明的误差小，稳定性好。

Claims (8)

1.一种磁性碳修饰的邻苯二酚传感器酶电极的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
1）制备磁性Fe3O4@MF纳米粒子：将磁性Fe3O4纳米粒子分散于溶剂中，加入表面活性剂、三聚氰胺和醛，调节溶液为碱性，进行反应，产物洗涤、分离，即得；
2）制备磁性Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子；
3）制备双功能化磁性Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子：将磁性纳米粒子Fe3O4@MF-CNTs分散于双功能试剂戊二醛水溶液中，水浴，产物洗涤，分离得双功能化磁性Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子；
4）Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子固定化漆酶；
5）磁性碳修饰的漆酶电极的制备。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述磁性Fe3O4纳米粒子、三聚氰胺和醛的摩尔比为1：（3-12）：（3-36）。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2）具体为：将羧基化碳纳米管、N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺混合在水中，进行活化，再加入磁性纳米粒子Fe3O4@MF，加热反应，产物洗涤，分离得磁性纳米粒子Fe3O4@MF-CNTs。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤2）中羧基化碳纳米管、EDC和NHS的质量比为1：5：4；磁性纳米粒子Fe3O4@MF与羧基化碳纳米管质量比为1：（1-3）。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4）具体为：将功能化磁性Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子分散于溶剂中，加入漆酶溶液，水浴，得Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子固定化漆酶。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤5）具体为：将Fe3O4@MF-CNTs纳米粒子固定化漆酶溶液滴涂在光亮的工作电极表面，低温下晾干，用溶剂冲洗电极表面，得到漆酶电极。
7.一种权利要求1-6任一项所述制备方法制备的磁性碳修饰的邻苯二酚传感器酶电极。
8.一种磁性碳修饰的邻苯二酚传感器酶电极的应用，其特征在于，用于邻苯二酚的检测。
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