CN115096682A

CN115096682A - 一种恶性黑色素瘤进行脱色素的方法

Info

Publication number: CN115096682A
Application number: CN202211028956.3A
Authority: CN
Inventors: 曹放; 黄小征; 周立新
Original assignee: Beijing Cancer Hospital
Current assignee: Beijing Cancer Hospital
Priority date: 2022-08-26
Filing date: 2022-08-26
Publication date: 2022-09-23

Abstract

本发明涉及一种恶性黑色素瘤进行脱色素的方法，该方法通过使用3%过氧化氢加Tris‑HCl缓冲液与硼酸盐缓冲液混合加热对样本中的黑色素进行脱色，即能很好地与我们免疫组化自动化检测平台融合，同时又对细胞的形态、结构和细胞内分子影响最小，不影响后续的免疫组化检测，可有效辅助黑色素瘤疾病的诊疗。

Description

一种恶性黑色素瘤进行脱色素的方法

技术领域

本发明属于检测技术领域，具体的，本发明涉及一种恶性黑色素瘤进行脱色素的方法。

背景技术

恶性黑色素瘤是病理科日常工作中总是会不时遇到的一类肿瘤，尤其是在肿瘤专科医院。随着临床诊疗的需要，病理医生不仅需要对这类疾病做出正确的诊断，还需要对它的生物学行为，包括核分裂像、浸润的深度、治疗后肿瘤消退评级以及蛋白分子特征等等多个方面进行评定。

DAB(二氨基联苯胺)是免疫组化染色常用的染色剂底物，可在过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化的积累，形成浅棕色不溶产物。用于检测过氧化物酶的活性，灵敏度高，特异性好，是辣根过氧化物酶（HRP）结合物最常用的底物，常用于进行细胞或组织染色检测。然而因为黑色素瘤中往往有大量的黑色素沉积，这些黑色素不仅遮盖了正常的组织结构和细胞形态，而且它们的颜色与DAB显色剂所产生的黄色近似，会导致结果难以区分。虽然有一些替代的免疫组化染色底物如3-氨基-9-乙基咔唑（AEC），该底物显色后为红色，可以避免颜色上的交叉，但是该底物染色为非常规免疫组化技术，并不是所有的抗体均能适用这种技术；另外HRP/AEC光稳定性差，在光照下容易褪色，不适用切片的长期保存。在免疫组化染色之前对切片进行黑色素脱色素处理，而不对免疫组化染色技术本身进行改动，这种处理技术更符合临床上较大工作量的实际需求以及自动化免疫组化染色流程。

最早的黑色素脱色技术始于1897年，最初采用0.1%高锰酸钾进行氧化脱色素，随后在不同的实验条件下多种脱色方法得以发展，然而仅有两种脱色方法因为脱色效果较好以及较强的可操作性而常被使用。这两种方法分别为高锰酸钾-草酸脱色法和过氧化氢脱色法。这两种方法均利用了黑色素在碱性溶液中是可溶的特性，能够较为彻底地对黑色素颗粒进行溶解。虽然目前针对这两种脱色方法的研究较多，但是在不同的实验条件下，这两种方法仍有各自的局限性，如脱色时间过长、脱色效果不稳定、酸碱环境影响后期免疫组化染色以及高温导致组织结构破坏、染色出现脱片现象等等。另外，在临床病理的实际操作过程中，往往需要对福尔马林固定的切片进行脱色素处理，并且后期需要跟自动化免疫组化程序进行对接，因此需要一种简单易行、但又脱色效果稳定的技术来满足临床需求。

发明内容

为了弥补现有技术的缺陷，本发明提供一种对恶性黑色素瘤进行脱色素的方法，该方法既能很好地与自动化免疫组化检测平台融合，同时又对细胞的形态、结构和细胞内分子影响最小，不影响后续的免疫组化检测。为了实现上述技术效果，本发明提供如下的技术方案：

本发明的第一个方面，提供一种黑色素瘤脱色试剂，所述试剂包含：3%过氧化氢加Tris-HCl缓冲液与0.01M硼酸盐缓冲液。

本发明的第二个方面，提供一种对恶性黑色素瘤进行脱色素的方法，所述方法包括如下步骤：

（1）黑色素瘤组织样本进行脱蜡处理；

（2）将脱蜡处理后的组织样本与上述脱色试剂在90℃的温度下接触，使组织内的黑色素逐渐消失。

本发明的第三个方面，提供上述脱色试剂以及脱色素的方法在制备用于诊断黑色素瘤的产品中的应用。

在一种实施方式中，所述产品为试剂或试剂盒。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1 为高锰酸钾溶液的脱色效果。组织样本为直肠恶性黑色素瘤（A、C、E）和皮肤恶性黑色素瘤（B、D、F）；A-D为脱色后HE图片，E、F为脱色后进行S-100免疫组化检测。A、B放大20倍，C、D放大400倍，E、F放大200倍，标尺位于左下方。

图2为1%过氧化氢+Tris-HCl在不同温度下的脱色效果。组织样本为皮肤恶性黑色素瘤（左列）和直肠恶性黑色素瘤（右列）。A 、B图为未脱色组织的HE图片。C、D（65℃）、E、F（80℃）、G、H（85℃）以及I、J（90℃）是在相应温度下采用Tris-HCl +1%过氧化氢脱色素后组织的HE图片；

图3为 3%过氧化氢+Tris-HCl在不同温度下的脱色效果。组织样本为皮肤恶性黑色素瘤（左1列）和直肠恶性黑色素瘤（右2列）；A 、B、C图为未脱色组织的HE图片。D、E、F（65℃）、G、H、I（80℃）以及J、K、L（90℃）是在相应温度下采用3%过氧化氢+Tris-HCl脱色素后的HE图片。左1列、左2列组织放大50倍，右1列组织放大600倍，标尺位于左下方；

图4为皮肤恶性黑色素瘤或直肠恶性黑色素瘤经过3%过氧化氢+Tris-HCl缓冲液在90℃ 15min脱色后进行自动化免疫组化染色。组织样本为皮肤恶性黑色素瘤（左1列）和直肠恶性黑色素瘤（右2列）。A、B为脱色后组织的HE图片，C为脱色前直肠恶性黑色素瘤。D-F为MelinA免疫组化染色，细胞显示膜染色。G-I为Ki67染色，细胞显示核染色；J-L为S-100染色，细胞显示核浆染色。左1列、左2列组织放大50倍，右1列组织放大400倍，标尺位于左下方。

图5为纵膈及肺内恶性黑色素瘤经过3%过氧化氢+硼酸盐缓冲液在90℃ 15min脱色后进行HE染色及自动化免疫组化染色。组织样本为纵膈恶性黑色素瘤（A-E）和两灶肺转移性恶性黑色素瘤（F-J为同一病灶，K-O为另一病灶）。A、F、K为脱色前组织，可见大量黑色素，组织中央可见坏死伴色素沉积。B、G、L为脱色后组织，未见色素残存。C、H、M为高倍镜下观察脱色后组织，细胞形态保存良好。D、I、N为脱色后组织进行SOX10免疫组化染色，细胞核着色，无非特异性着色。E、J、O为脱色后组织进行HMB45免疫组化染色，细胞胞浆着色，无非特异性着色。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1 实验材料及脱色条件的选择

材料：

收集多种色素丰富的黑色素瘤标本，分别为直肠恶性黑色素瘤和皮肤恶性黑色素瘤标本（标本均来自北京肿瘤医院病理科的恶性黑色素瘤患者，均已签署知情同意书），采用高锰酸钾-草酸脱黑色素方法、过氧化氢-Tris-HCl缓冲液方法、以及过氧化氢-Tris-HCl+硼酸盐缓冲液脱黑色素方法脱黑色素方法。

将前述两种黑色素瘤组织样品分别蜡封后切割为4μm厚切片，置于在含有带正电荷的阳离子载玻片（购于江苏世泰实验器材有限公司）上，烤片70°C, 1小时，进行脱蜡步骤，均在下述方案的溶液中进行水洗浸泡，进行脱色素处理。为了分析不同因素对脱色效果的影响，我们设计了如下4种脱色方案：

方案（1）：室温下，切片在0.5%高锰酸钾水洗浸泡3分钟，随后再在1%草酸水洗浸泡2分钟，随后在碱性修复液中浸泡修复1小时或半小时，复水冲洗，脱水，封片显微镜检观察；

方案（2）：切片分别在不同温度下（65℃、80℃、90℃）的1%过氧化氢+Tris-HCl的混合溶液中水洗浸泡15分钟；

方案（3）：切片分别在不同温度下（65℃、80℃、90℃）的3%过氧化氢+Tris-HCl的混合溶液中水洗浸泡15分钟；

方案（4）：3%过氧化氢加Tris-HCL缓冲液与0.01M硼酸盐缓冲液(购于厦门海标科技有限公司，生产批号20220117H，PH值为9.18（25℃）)混合，加热到90℃，将切片放入，水洗浸泡15分钟；

方案（2）-（4）水洗浸泡15分钟（黑色素漂白）后，使用莱卡bondⅢ机碱性修复100℃，20分钟，封闭剂5分钟，羊血清室温封闭10分钟，一抗室温10分钟，二抗室温8分钟，DAB显色剂室温5分钟，苏木素复染15分钟，脱水，封片显微镜检观察。

实施例2 脱色结果分析

2.1 高锰酸钾溶液能够有效地脱色素，但是细胞形态失真，免疫组化检测存在非特异性着色。

结果显示，0.5%高锰酸钾溶液水洗浸泡3分钟对直肠和皮肤来源的恶性黑色素瘤能够有效地脱色素（图1A,B）,即使是色素相当丰富的直肠恶性黑色素瘤（图1A），切片内也未见明确色素残存（图1A）。但是在高倍镜下，细胞及细胞核明显肿胀（图1C,D）。即使尝试多种实验条件，免疫组化检测结果仍不理想。可见较多非特异性着色，表现为胞核抗体胞浆着色，胞浆抗体胞核着色，其中S-100抗体，可表现为染色阴性，或胞浆胞核弱着色，可见较多核碎（图1E），或者胞浆胞核胞膜弥漫阳性（图1F）。

2.2 较低浓度的过氧化氢在不同温度下均不能有效地脱色素

结果如图2显示，使用1%过氧化氢+Tris-HCl在不同温度下，均不能对皮肤恶性黑色素瘤进行有效地脱色素（图2,C-H）。即使在在高温90℃，两次15min溶液浸泡的条件下，黑色素细胞内仍有大量色素残存（图2,I-J）。这些色素将影响形态学的观察和免疫组化的判读。

2.3 3%过氧化氢在高温情况下能够有效地脱色素

我们挑选了一例色素非常丰富的直肠恶性黑色素瘤和皮肤恶性黑色素瘤，采用3%过氧化氢+Tris-HCl在不同温度下进行脱色素，脱色时间仍为15min。在较低温度65℃时，该浓度的过氧化氢不能有效地脱色素，黑色素细胞内仍有较多色素残存（图3,D-F），并且在该浓度下，即使延长脱色时间，仍不能有效地脱色素。同样的情况见于脱色温度为80℃时（图3,G-I）。当脱色温度达到90℃，脱色时间为15min时，3%过氧化氢+Tris-HCl能够有效地脱色素（图3,J-L）。该条件能够将恶性黑色素瘤中大量的色素去除，并且在HE染色中，未观察到细胞结构及形态的变化（图3，L）。

2.4 3%过氧化氢的脱色条件能更好地与自动化免疫组化染色程序衔接，染色效果稳定

皮肤恶性黑色素瘤或直肠恶性黑色素瘤经过3%过氧化氢+Tris-HCl缓冲液在90℃15min脱色后进行自动化免疫组化染色。我们发现脱色素后，光镜下能够很好地观察细胞的形态、核分裂像及浸润深度，细胞浆稍微有一点膨大（图4，A、B），而脱色之前，细胞胞浆内含有大量的色素（图4，C），这些色素严重影响了黑色素瘤免疫组化结果的判读。我们的脱色条件能够很好地与自动化免疫组化染色程序衔接，染色效果稳定（图4，D-F为MelinA，G-I为Ki67，J-L为S-100）。脱色素后，我们未观察到因脱色素而导致的非特异性着色。

2.5 进一步优化

由于3%过氧化氢+Tris HCl缓冲液处理后，HE染色玻片脱色会有轻微的细胞浆膨大，因此我们进一步对3%过氧化氢+Tris HCl缓冲液的脱色方案进行改进——加入硼酸盐缓冲液。其优化原理在于，硼酸盐缓冲液（PH值9.18）由硼砂和PH标准溶液组成，由于PH标准溶液的PH值是已知的，并达到规定的准确度，使其在具有良好的复现性和稳定性的同时，还具有较大缓冲容量。我们将3%过氧化氢-Tris-HCl缓冲液中加入0.01M硼酸盐缓冲液，结果发现，3%过氧化氢-Tris-HCl缓冲液+硼酸盐缓冲液相结合能够有效地脱色素。此外，我们不仅尝试了对皮肤和粘膜相关的恶性黑色素瘤组织脱色，而且还对纵膈及肺内转移性恶性黑色素瘤进行了脱色素，结果发现， 3%过氧化氢-Tris-HCl缓冲液+硼酸盐缓冲液的脱色效果在多种组织中都非常稳定（图5 A-I），并且脱色素后，细胞形态保存良好，可以清晰展示细胞内超微结构，如居中的核仁，以及细胞内活动，细胞浆正常清晰，如核分裂像和凋亡等（图5 G-I）。此外，在免疫组化检测中，脱色程序还能够与自动化免疫组化染色程序进行良好衔接，且黑色素瘤相关的免疫组化分子指标未见特异性着色（图5 J-O），更能满足临床需求。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims

1.一种黑色素瘤脱色试剂，其特征在于，所述试剂包含：3%过氧化氢加Tris-HCl缓冲液与0.01M硼酸盐缓冲液混合。

2.一种对恶性黑色素瘤进行脱色素的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

黑色素瘤组织样本进行脱蜡处理；

将脱蜡处理后的组织样本与权利要求1所述的脱色试剂在90℃的温度下接触，使组织内的黑色素逐渐消失。

3.权利要求1所述的脱色试剂或权利要求2所述的方法在制备用于诊断黑色素瘤的产品中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品为试剂或试剂盒。