CN115089603A - 脂多糖在制备治疗成人弱视的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于化合物新的制药用途领域，具体地说，涉及一种脂多糖在制备治疗成人弱视的药物中的应用。本发明通过构建由LPS诱导的小胶质细胞激活的成年小鼠单眼剥夺模型，探明激活的小胶质细胞对成年小鼠视皮层V1B区可塑性再激活及机制研究，发现在视觉发育关键期和关键期后腹腔注射LPS激活大脑中的小胶质细胞，可延长小鼠视觉发育关键期，可将视皮层可塑性延续至成年时期；在成年时期注射LPS，可重启ODP可塑性，在视皮层发育成熟后单眼剥夺可改变眼优势，实现视皮层可塑性重塑，可以治疗单眼剥夺弱视小鼠的弱视眼视力。

Description

脂多糖在制备治疗成人弱视的药物中的应用

技术领域

本发明属于化合物新的制药用途领域，具体地说，涉及一种脂多糖在制备治疗成人弱视的药物中的应用。

背景技术

弱视是由于在视觉发育早期，因形觉剥夺和(或)双眼异常相互作用引起的单眼或双眼最佳矫正视力减退，而无明显器质性异常的视功能疾患。在临床上定义为眼部无明显器质性病变，以功能性为主所引起的最佳矫正视力低于正常且双眼最佳矫正视力相差两行者视为弱视。其中形觉剥夺是弱视主要成因之一，单眼形觉剥夺较双眼所造成的后果更为严重。

弱视的治疗效果与年龄密切相关，也与弱视程度、类型与注视性质密切相关，早起发现和坚持综合治疗是治疗弱视的关键。国际上一般公认为关键期或敏感期是指小儿自出生至6岁，最迟平均为8.5岁，发病率为3～4％，而0～7岁为最佳治疗期，12岁以后的治疗效果极差。目前，弱视的治疗方法以物理疗法为主，其中传统的“遮盖疗法”虽已经历了200多年的延用，但仍然被认为是目前最主要和最有效的治疗方法。

相较于易早期干预的儿童弱视，由于各种原因错失年幼最佳弱视治愈时间而出现成年弱视成为成人视力不良的重要原因。弱视严重影响成年患者的工作选择与生活质量。此外，当所谓“健眼”患眼部疾病或受伤后，单眼弱视的患者视觉缺陷的风险将大幅增加。由于我国人口基数大，新增人口多，弱视造成的视力障碍给近四千万的成年群体及国家带来沉重的社会经济负担。因而重视成年弱视群体防治，寻求有效治疗手段具有着深远的社会意义。

脂多糖(LPS)是革兰氏阴性细菌外膜的外小叶的主要表面分子，并且只存在于所述外小叶中。LPS通过血清补体和吞噬细胞阻止细菌破坏，并且参与用于集群的粘附。LPS是一组结构上相关的复杂分子，大小是大约10,000道尔顿，并且由三个共价连接的区域组成：

(i)外部区域的O-特异性多糖链(O-抗原)；

(ii)核心寡糖中心区；

(iii)最内部的区域，其作为疏水性锚，包含携带长链脂肪酸的糖胺二糖单元。

已经证明LPS的生物活性，例如致死毒性、制热性和佐剂性，与脂质A部分相关。相反，免疫原性与O-特异性多糖成分(O-抗原)相关。长期以来，已知LPS和脂质A都具有强佐剂作用，但这些分子的高毒性排除了将它们用于疫苗制剂。

作为神经系统发育相关的视功能疾患，弱视尤其单眼形觉剥夺性弱视可导致严重视觉发育障碍。由于视觉发育关键期后视皮层神经可塑性的降低，成年弱视有效治疗仍是当前重大临床难题。目前，对于成人弱视的治疗药物也很少，寻求一种新的对成人弱视有治疗效果的药物是眼科界的追求热点。现有技术中未见有LPS对成人弱视有治疗作用的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供LPS的新用途，即在制备治疗成人弱视的药物中的应用。

为实现上述目的，本发明提供脂多糖在制备治疗成人弱视的药物中的应用。

本发明通过构建由LPS诱导的小胶质细胞激活的成年小鼠单眼剥夺模型，探明激活的小胶质细胞对成年小鼠视皮层V1B区可塑性再激活及机制研究，发现在视觉发育关键期和关键期后腹腔注射LPS激活大脑中的小胶质细胞，可延长小鼠视觉发育关键期，可将视皮层可塑性延续至成年时期；在成年时期注射LPS，可重启ODP可塑性，在视皮层发育成熟后单眼剥夺可改变眼优势，实现视皮层可塑性重塑，可以治疗单眼剥夺弱视小鼠的弱视眼视力。

进一步地，本发明提供脂多糖在制备通过激活小胶质细胞来治疗成人弱视的药物中的应用。

本发明中，所述药物为单方制剂或复方制剂。

所述单方制剂或复方制剂的剂型为注射剂、鼻腔喷雾剂、口服混悬液、片剂或胶囊。

所述的单方制剂为脂多糖与药用辅料制成的；

所述的复方制剂为脂多糖与至少一种其他药物活性成分和药用辅料制成的。

当复方制剂中的其他药物活性成分为一种时，所述的脂多糖与其他药物活性成分的质量比为20～99：80～1。

所述其他药物活性成分为治疗眼部疾病的药物活性成分、抗抑郁药物活性成分以及改善肠道菌群的药物或膳食纤维。

进一步地，所述药物的给药剂量以脂多糖计为0.1～1.0mg/kg。

优选地，所述药物的给药剂量以脂多糖计为0.5mg/kg。

所述药物在视觉发育关键期和关键期后给药。

本发明所提供的LPS作为制备治疗成人弱视药物具有以下优点：

(1)毒副作用小，目前将LPS作为佐剂在疫苗研发领域得到了广泛应用，临床试验未发现明显毒副作用；

(2)疗效显著，在视觉发育关键期和关键期后腹腔注射LPS激活大脑中的小胶质细胞，可延长小鼠视觉发育关键期，可将视皮层可塑性延续至成年时期；在成年时期注射LPS，可重启ODP可塑性，在视皮层发育成熟后单眼剥夺可改变眼优势，实现视皮层可塑性重塑，可以治疗单眼剥夺弱视小鼠的弱视眼视力。

附图说明

图1为单眼剥夺小鼠模型；

图2为各组小鼠图形视觉诱发电位P100波的比较；

图3为V1B区小胶质细胞被激活后形态变化；

图4A为视皮层V1B区小胶质细胞激活后对神经元包裹并置换抑制性突触的形态；

图4B视皮层V1B区小胶质细胞激活后对神经元包裹接触比例；

图5A为BLPS激活小胶质细胞对成年小鼠视皮层mIPSC振幅的影响；

图5B为BLPS激活小胶质细胞对成年小鼠视皮层mIPSC频率的影响；

图5C为各组小鼠对侧脑区V1B区mIPSC波形示意图；

图6A为各组小鼠双眼PVEP P100波波幅的比较(右眼剥夺眼)；

图6B为各组小鼠双眼PVEP P100波波幅的比较(左眼非剥夺眼)。

具体实施方式

以下为本发明的具体实施方式，所述的实施例是为了进一步描述本发明，而不是限制本发明。

实施例1、脂多糖注射液

组分：

制备方法：采用药学领域常用的方法制备得到。

实施例2、脂多糖鼻腔喷雾剂

组分：

制备方法：采用药学领域常用的方法制备得到。

实施例3、脂多糖口服混悬液

组分：

制备方法：采用药学领域常用的方法制备得到。

实施例4、脂多糖片剂

组分：

制备方法：采用药学领域常用的方法制备得到。

实施例5、脂多糖胶囊

组分：

制备方法：将上述组分按重量称取后，然后将原料按常规软胶囊生产工艺制成颗粒式胶囊，装瓶即得胶囊。

试验例1

1、实验方法

1.1、单眼剥夺

将麻醉后的小鼠右眼眼睑周围碘伏消毒，上下眼睑剪除，滴用可乐必妥滴眼液预防感染，用8-0缝线将眼睑单纯间断缝合，术后在伤口处涂抹典必殊眼膏，建立小鼠单眼剥夺弱视模型，如图1。

1.2、LPS注射

生理盐水将LPS粉末溶解配为浓度为1mg/ml的储存液，分装储存于-20℃。注射前将LPS储存液稀释为0.1mg/ml，按照0.5mg/kg剂量腹腔注射于小鼠。注射方法为连续注射四天，间隔6天，再进行下一循环。

1.3、电极植入手术

将麻醉后的小鼠双眼涂抹修护膏，颅顶部皮毛剪除，露出颅骨。记号笔标记出左脑视皮层区域，位于后囟“人”字缝旁约3mm，电钻在标记处钻出直径约2.5mm颅窗，暴露硬脑膜，将自制电极(刺激电极)置于硬脑膜后覆盖圆形玻璃片，用强力胶将玻璃片固定于颅骨；用同样方法在对侧额叶部位开同样大小颅窗植入记录电极。最后利用牙科水泥将橡胶电极保护管封闭固定于暴露的颅骨。

1.4、PVEP记录

将麻醉后的小鼠置于鼠台，剪开缝合的右眼眼睑，使小鼠双眼正对距离15cm的视觉刺激显示屏。将小鼠头部预置的记录电极、参考电极与外接放大器连接，视觉刺激为有MATLAB自编程序控制的翻转黑白棋盘格，空间频率为0.02周/度，时间频率为1HZ，叠加240次。两只眼分别记录，利用黑色胶布遮住记录眼的对侧眼，记录信号由CED1401系统、Spike2软件采集，后由MATLAB自编分析程序进行数据分析得出P100波形，包括峰时值和波幅。眼优势值(OD值)C/I＝对侧眼P100波幅值/同侧眼P100波幅值。

2、结果

2.1、各组小鼠图形视觉诱发电位P100波的比较

①对照组：7只，常规饲养，无干预措施；

②MD对照组：7只，P61～P80天龄进行右眼单眼剥夺(眼睑缝合)；

③实验组A：7只，P26～P80天龄间断LPS注射(P26～P29，P36～P39，P46～P49，P56～P59，P66～P69，P76～P79)，P61～P80天龄进行右眼单眼剥夺；

④实验组B：7只，P40～P80天龄间断LPS注射(P40～P43，P50～P53，P60～P63，P70～P73)，P61～P80天龄进行右眼单眼剥夺；

⑤实验组C：7只，P61～P80天龄间断LPS注射(P61～P64，P71～P74)，同时进行右眼单眼剥夺。

对照组、MD对照组分别与实验组A、实验组B、实验组C之间，右眼(剥夺眼)P100波波幅差异显著，且具有统计学意义(P＝0.0003，如图2)。对照组与MD对照组双眼P100波波幅均无显著差异(P＝0.209)。对照组、MD对照组分别与实验组A、实验组B、实验组C之间，左眼(非剥夺眼)P100波波幅无显著差异(P＝0.948)。

结果表明：LPS可以在成年小鼠关键期后重新开启视皮层可塑性，为成年小鼠弱视治疗提供大脑皮层可塑性条件见图2。

2.2、LPS腹腔注射后激活视皮层小胶质细胞，置换抑制性神经元，重启视皮层可塑性

2.2.1

①对照组：7只，常规饲养，无干预措施；

②MD对照组：7只，P61～P80天龄进行右眼单眼剥夺(眼睑缝合)；

③实验组(LPS注射组)：7只，LPS连续注射四天。

实验组(LPS注射组)LPS连续注射四天后，全脑小胶质细胞激活，此时计数各组小鼠大脑初级视皮层V1B区2/3层每20倍镜下视野中小胶质细胞数量。实验组(LPS注射组)小胶质细胞数目显著高于对照组和MD对照组(见图3)。

将小胶质细胞(Iba1)、抑制性突触(VGAT)、神经元(NeuN)共定位，可以观察到激活的小胶质细胞包裹在神经元周围，将抑制性突触置换(如图4A)。计数包裹在神经元周围并置换抑制性突触的小胶质细胞的占比，实验组(LPS注射组)与对照组和MD对照组相比显著升高(如图4B)，对照组、MD对照组、实验组(LPS注射组)分别为30.25±6.25％、33.17±7.26％、63±7.35％，差异具有统计学意义(P＝0.000)。

2.2.2

①对照组：7只，常规饲养，无干预措施；

②MD对照组：7只，P61～P80天龄进行右眼单眼剥夺(眼睑缝合)；

③LPS+MD组：10只，P21～P60天龄进行右眼单眼剥夺，P61将右眼缝合的眼睑剪开，同时将左眼进行反转剥夺至P80，同时P61～P80间断LPS注射(P61～P64，P71～P74)。

对照组、MD对照组、LPS+MD组小鼠的被记录到的mIPSC的振幅均值分别为36.87±6.93、39.29±8.75、30.43±7.17pA，通过单因素方差分析和LSD-t组间比较得知，对照组与MD对照组间mIPSC振幅幅值无差异，但LPS+MD组的mIPSC振幅较前两组显著降低，对照组与LPS+MD组振幅有显著差异(P＝0.008)，MD对照组与LPS+MD组振幅有显著差异(P＝0.002)；对照组、MD对照组、LPS+MD组小鼠的被记录到的mIPSC的频率均值分别为10.73±3.07、11.27±2.62、7.35±2.01Hz，通过单因素方差分析和LSD-t组间比较得知，对照组与MD对照组间mIPSC频率无差异，但LPS+MD组的mIPSC频率较前两组显著降低，对照组与LPS+MD组频率有显著差异(P＝0.000)，MD对照组与LPS+MD组振幅有显著差异(P＝0.000)见图5A-C。

在成年大脑初级视皮层V1B区，激活的小胶质细胞，置换抑制性突触，降低微小抑制性突触电流的振幅和频率，改变了抑制性突触传递功能，使抑制性突触数量减少。

LPS可以在成年小鼠关键期后重新开启视皮层可塑性，为成年小鼠弱视治疗提供大脑皮层可塑性条件。

2.3、LPS可以治疗成年弱视小鼠

①CON组：7只，常规饲养，无干预措施；

②MD组：7只，P21～P60天龄进行右眼单眼剥夺；

③MD+LPS组：10只，P21～P60天龄进行右眼单眼剥夺，P61将右眼缝合的眼睑剪开，同时将左眼进行反转剥夺至P80，同时P61～P80间断LPS注射(P61～P64，P71～P74)

④CLOP组：10只，在MD+LPS组的基础上，P61～P80每天注射氯吡格雷。

其中，氯吡格雷(CLOP)注射为：将硫酸氯吡格雷片(商品名：泰嘉)研磨成粉末，用生理盐水溶解配制成5mg/ml，按照50mg/kg剂量对小鼠腹腔注射。氯吡格雷是高选择性的嘌呤能受体P2Y12受体的拮抗剂，P2Y12受体在小胶质细胞特异性表达。

对各组进行PVEP记录，方法同上。结果见图6A和图6B。

本发明人验证了LPS激活小胶质细胞后可以对成年弱视小鼠的治疗作用，这一临床意义更为重要。本发明实验中，对小鼠进行了全关键期(P21-P60)的单眼剥夺，造成了弱视模型，P21-P60包含了全关键期(P21-P35)，P60小鼠各项发育已完全成熟，在此期间单眼剥夺(右眼)，可造成小鼠剥夺性弱视，PVEP P100波波幅较正常对照组明显下降(P＝0.000)；LPS联合反转剥夺治疗弱视可显著提高剥夺眼的P100波波幅(P＝0.000)，但与正常对照组相比还有明显差异(P＝0.025)；在LPS联合反转剥夺的基础上增加氯吡格雷注射的CLOP组(小胶质细胞活性抑制剂)，与MD+LPS组相比显著降低剥夺眼P100波波幅(P＝0.005)，但与MD组相比无显著性差异(P＝0.053)(如图6A)。

在MD+LPS组中由于进行反转剥夺，左眼的P100波波幅较MD组(P＝0.011)和CLOP组(P＝0.017)均有明显降低(如图6B)。见图6-A和图6-B所示。根据实验结果本发明发现：

①LPS腹腔注射联合反转剥夺治疗的弱视眼的P100波振幅较MD组的弱视眼有显著提升，但还未达到与CON组的正常水平；

②LPS腹腔注射联合反转剥夺治疗的非剥夺眼由于在成年时可塑性重启后进行了剥夺，其P100波波幅较CON组和MD组均有显著降低；

③根据双眼P100波幅值，计算测出的C/I值在LPS腹腔注射联合反转剥夺治疗后显著提高，达到与正常对照组相似的水平。

Claims (10)

1.脂多糖在制备治疗成人弱视的药物中的应用。

2.脂多糖在制备通过激活小胶质细胞来治疗成人弱视的药物中的应用。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物为单方制剂或复方制剂。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述单方制剂或复方制剂的剂型为注射剂、鼻腔喷雾剂、口服混悬液、片剂或胶囊。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，

所述的单方制剂为脂多糖与药用辅料制备而成的；

所述的复方制剂为脂多糖与至少一种其他药物活性成分和药用辅料制备而成的。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，当复方制剂中的其他药物活性成分为一种时，所述的脂多糖与其他药物活性成分的质量比为20～99：80～1。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述其他药物活性成分为治疗眼部疾病的药物活性成分、抗抑郁的药物活性成分以及改善肠道菌群的药物或膳食纤维。

8.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物的给药剂量以脂多糖计为0.1～1.0mg/kg。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物的给药剂量以脂多糖计为0.5mg/kg。

10.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物在视觉发育关键期和关键期后给药。

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