CN115089585A - Mdm2抑制剂rg7112联合依托泊苷在治疗肺癌中的应用 - Google Patents
Mdm2抑制剂rg7112联合依托泊苷在治疗肺癌中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了MDM2抑制剂RG7112联合依托泊苷在治疗肺癌中的应用，在临床和科研实践中发现在VP‑16刺激下，MDM2可以通过泛素化修饰TOP2β促进其降解，并降低肺癌细胞内TOP2cc复合物的水平，最终导致肺癌细胞对VP‑16产生耐药性。本发明证明了在VP‑16刺激下TOP2β降解新的机制，并证明TOP2β降解是肺癌细胞对VP‑16产生耐药性以及产生DNA损伤信号的主要原因，而且该过程主要由MDM2介导，从而揭示通过小分子RG7112抑制MDM2的功能可以提升肺癌细胞内由VP‑16介导产生的TOP2cc复合物的水平，进而增强对肺癌细胞的杀伤效果并降低DNA损伤信号，最终提出MDM2的抑制剂RG7112和VP‑16联合制备肺癌治疗药物的应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及MDM2的抑制剂RG7112与靶向 DNA拓扑异构酶Ⅱ的化疗药物依托泊苷联合使用在肺癌治疗中的应用。
背景技术
目前，我国肺癌的发病率和死亡率已跃居所有恶性肿瘤的首位。根据国际癌症研究机构的数据显示，我国2020年新发的肺癌病例高达815563例，死亡例数达714699例，肺癌导致的死亡人数比结肠癌、前列腺癌和乳腺癌的死亡人数加起来还要多。虽然在科学界和产业界不懈努力下，肺癌治疗手段得到了迅猛发展，但是肺癌药物治疗的响应率仍然有限、获得性耐药频发。抗肿瘤化疗药物比如：依托泊苷(VP-16)仍然是当前肺癌治疗最有效的药物之一。因此迫切需要寻找新的能够克服肿瘤耐药等的新策略，从达到更好的治疗效果。
DNA拓扑异构酶Ⅱ(TOP2)是一种调节DNA拓扑结构的特殊酶类，同时它也是多种抗肿瘤药物的细胞内靶点。比如：广泛应用于肺癌、睾丸癌等实体肿瘤治疗的依托泊苷(VP-16)；被批准用于治疗霍奇金淋巴瘤、儿童急性淋巴细胞白血病和一些脑癌的替尼泊苷(VM-26)等。这类药物通过抑制TOP2的 DNA再连接活性，增加并稳定TOP2-DNA共价复合物(TOP2cc)，从而导致肿瘤细胞死亡，因此也被称为TOP2毒药。目前研究表明与DNA形成共价复合物的 TOP2β会被26S蛋白酶体降解，从而暴露出隐藏在TOP2cc复合物中的DNA双链断裂(DSBs)，触发DNA损伤修复反应；如果这些DSBs不能正确修复则会导致基因组的不稳定性以及染色体重排。临床上用这类药物治疗的患者，常常会产生复发性的恶性肿瘤和心脏毒性也正是因为这个原因。同时TOP2β降解也会导致肿瘤细胞内细胞毒性的TOP2cc复合物水平下降而导致耐药的产生。因此，迫切需要深入研究在TOP2毒药刺激下TOP2β降解的分子机制以及阻断其降解的方式，从而为降低这类药物的副作用、提高治疗效果并拓展使用范围提供新的策略。
MDM2—一种原癌蛋白，通过直接抑制p53在细胞核内的转录活性或促进 p53在细胞质中的降解，对p53发挥负调控作用，以及通过调控其它众多抑癌因子，从而影响包括肺癌在内的各种癌症的进展和化疗药物的疗效。目前MDM2 已成为非常热门的肿瘤治疗靶点，很多靶向MDM2的小分子抑制剂正在不断被研发出来，比如：作用于MDM2的RING结合域从而抑制MDM2与p53等下游底物相互结合的RG7112。目前RG7112正在I期临床试验用于治疗多种固体肿瘤、软组织肉瘤、急性髓细胞性白血病等；因此，全面了解MDM2调控的下游靶点和具体的机制对于将这类潜在的肿瘤治疗药物推向临床并规避可能潜在的不良因素具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供MDM2抑制剂RG7112联合依托泊苷在治疗肺癌中的应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种制备新的肺癌治疗药物的组合，该组合包括MDM2的抑制剂RG7112和VP-16。发明人在临床和科研实践中发现在VP-16刺激下，MDM2可以通过泛素化修饰TOP2β促进其降解，并降低肺癌细胞内TOP2cc复合物的水平，最终导致肺癌细胞对 VP-16产生耐药性，以及产生DNA损伤信号，诱导副作用的发生。而MDM2 的抑制剂RG7112联合VP-16制备的药物可以产生协同作用，促进肺癌细胞的凋亡，提升对肺癌细胞的杀伤效果，并降低治疗过程中产生副作用的概率。
第一方面：本发明提供的药物组合包括RG7112(结构式见下式A)和 VP-16(结构式见下式B),该组合可制备治疗肺癌并降低治疗过程中产生副作用的药物。
第二方面：本发明所提供的药物组合可以分别靶向2种不同的抗肿瘤治疗靶点，RG7112靶向抑制MDM2，VP-16靶向TOP2β，两者共同杀伤肺癌细胞，并且该两者的组合具有协同作用。
第三方面：本发明所提供的药物组合中RG7112通过抑制MDM2的功能，进而抑制VP-16刺激下TOP2β的泛素化降解，从而提升肺癌细胞内具有毒性的TOP2cc复合物的水平,从而抑制肺癌细胞的生长、增殖及克隆形成，促进肺癌细胞的凋亡，增加肺癌细胞对VP-16的敏感性，抑制耐药性的产生。
第四方面：本发明所提供的药物组合中RG7112抑制VP-16刺激下TOP2β的降解后，还可以降低由TOP2β降解所引起的DNA双链断裂，降低DNA 损伤信号，从而降低药物治疗过程中产生心脏毒性等的副作用。
本发明的技术效果和优点：证明了在VP-16刺激下TOP2β降解新的机制，并证明TOP2β降解是肺癌细胞对VP-16产生耐药性以及产生DNA损伤信号的主要原因，而且该过程主要由MDM2介导，从而揭示通过小分子RG7112抑制 MDM2的功能可以提升肺癌细胞内由VP-16介导产生的TOP2cc复合物的水平，进而增强对肺癌细胞的杀伤效果并降低DNA损伤信号，最终提出MDM2的抑制剂RG7112和VP-16联合制备肺癌治疗药物的应用，该组合药物可以提升肺癌治疗效果并降低副作用的产生。
附图说明
图1为本发明在肺癌细胞中敲低MDM2能够抑制由依托泊苷介导的TOP2 β的降解，并提升TOP2cc复合物水平示意图。
图2为本发明MDM2与TOP2β直接结合，并促进其泛素化修饰示意图。
图3为本发明MDM2的小分子抑制剂RG7112能够抑制MDM2与TOP2β直接的相互作用，并抑制依托泊苷刺激下TOP2β的泛素化修饰及降解，提升肺癌细胞内TOP2cc复合物水平示意图。
图4为本发明RG7112联合VP-16能提升肺癌细胞对VP-16的敏感性，抑制肺癌细胞生长、增殖、克隆形成，并促进其凋亡示意图。
图5为本发明RG7112联合VP-16能降低由VP-16所引起的DNA双链断裂，降低DNA损伤程度示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了如图1-5所示的MDM2抑制剂RG7112联合依托泊苷在治疗肺癌中的应用：
实施例1：本发明中所使用的到小分子化合物和抗体来源
实施例2：细胞株及培养条件
本发明所使用到的细胞株有：人胚肾上皮细胞293，以及人肺癌细胞系H1299 和A549。所有细胞为发明人实验室长期培养并保存。三株细胞系均培养在含有10％FBS,1％青/链霉素的DMEM培养基中。细胞培养于5％CO2，37℃的培养箱中；需要传代或扩增细胞时，先用真空泵吸去培养基，然后用1X PBS 清洗一次，加入0.05％的胰蛋白酶消化相应时间，1:1加入含有10％FBS的培养基终止消化，随后离心机700rpm离心2分钟收集细胞，进行后续操作。
实施例3：免疫印迹实验
(1)正常培养的细胞经转染干扰RNA、小分子药物处理等(具体处理方式见图例标注)操作后，用细胞刮将培养皿上的细胞刮下，倒入15ml离心管后，用水平离心机1200rpm，离心2分钟，收集细胞沉淀，并冻存于-80冰箱待用。
(2)将所有细胞沉淀取出后加入适量的RIPA强裂解液(碧云天：P0013B), 混匀后冰浴，随后用超声破碎仪进行超声。超声条件为：30％功率，超声1秒停2秒，超7-8次，总共超3轮；接着4℃离心机13600rpm离心25分钟，吸取上清至新的1.5ml EP管，即为总蛋白混合液。
(3)最后用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。
(4)根据目的蛋白的分子量分别配制相应浓度的下层分离胶和上层浓缩胶 (配方如下)，制成SDS-PAGE凝胶。
(5)根据蛋白浓度，制备用于跑胶的样品，体系如下：
(6)样品制备好后进行混匀，并在离心机上13600rpm离心30秒，100℃金属浴中变性8分钟。
(7)随后利用Thermo电泳仪进行电泳，电泳条件为：60V恒压跑30分钟左右，待溴酚蓝指示剂跑入分离胶2-3mm后将电压调至120V继续电泳至溴酚蓝跑至凝胶底部。
(8)蛋白转膜：提前用转膜缓冲液浸泡海绵垫、滤纸及硝酸纤维素膜(NC 膜)，随后制备“三明治”样转膜结构。首先取一张浸泡的滤纸，然后铺上硝酸纤维素膜，接着将电泳完的凝胶盖于NC膜上，最后再铺一层滤纸，最后在该“三明治”样转膜结构上下分别垫两层海绵，整体结构置入转膜内胆，凝胶面靠近内胆负极，NC膜面靠近正极。
(9)调整电泳仪为恒流，250mA电泳90分钟。
(10)转膜结束后取出NC膜，1XTBST清洗一遍，并用1XTBST配制5％的脱脂牛奶，水平摇床上用70rpm/min速度对NC膜封闭1小时。
(11)根据抗体说明书用1％的脱脂牛奶配制抗体稀释液，将对应的NC膜置于相应的抗体稀释液中，4℃冰箱中水平摇床上孵育15-18小时。
(12)用3％的脱脂牛奶配制相应的二抗稀释液，将洗好的NC膜置入二抗稀释液中，水平摇床室温孵育1.5-2小时。
(13)最后根据试剂盒操作说明配制ECL显色液，将NC膜正面朝上置于保鲜膜上，均匀滴加ECL显色液于NC膜上，室温孵育5分钟。在暗室中用X 光胶片压片，并用X光洗片机显影。待胶片干燥后用扫描仪进行扫描，并保存结果。
如图1A-D所示：VP-16的刺激促进TOP2β的降解，而同时敲低MDM2能抑制TOP2β降解并延长其半衰期。
如图2A-E所示：MDM2与TOP2β存在直接的相互作用，并且MDM2能促进 TOP2β的泛素化修饰。
如图3A-D所示：RG7112能抑制由VP-16介导的TOP2β的降解。
如图4G所示：RG7112联合VP-16能促进H1299细胞发生凋亡。
实施例4：流式细胞仪检测TOP2cc复合物水平
(1)培养皿上正常培养0.5-1X10^6个细胞，VP-16等药物处理细胞(处理方式见图例)，胰酶消化，收集细胞，PBS重悬，冰浴。
(2)随后在离心机上4摄氏度，224g，离心5min。
(3)用500ul含2mM PMSF的PHEM溶液重悬。
(4)加入500ul 2x提取缓冲液，混匀，4度混匀仪上轻轻混匀5min；(提取缓冲液现加入肝素)。
(5)加入325ul 4％的多聚甲醛溶液，室温孵育30min。
(6)离心机室温500g，离心5min,弃上清。
(7)1ml PBS重悬，500g，5min,室温离心,弃上清，重复一遍。
(8)加入50ul封闭液重悬，室温孵育1小时；离心弃上清；
(9)1：200封闭液稀释anti-Top2β一抗，加入50ul抗体稀释液混匀，室温孵育2小时。
(10)清洗后，1:100封闭液稀释二抗，加入50ul抗体稀释液，黑暗中室温孵育1小时；加入950ul PBS，离心弃上清。
(11)300ul PBS重悬细胞，加入5ul 12mg/ml的Rnase A溶液，室温孵育30min 后加入20ul/ml的PI染液室温孵育15min。
(12)最后流式细胞分析。
如图1E所示：敲低MDM2后可以提升肺癌细胞内由VP-16介导产生的TOP2cc 复合物的水平。
如图3G所示：MDM2的抑制剂RG7112联合VP-16能明显提升细胞内TOP2cc 复合物的水平。
实施例5：免疫共沉淀实验
(1)收集一大皿的细胞沉淀，随后加入1ml RIPA弱裂解液(碧云天：P0013D)，含蛋白酶、磷酸酶抑制剂。并用超声破碎仪超声裂解细胞，直至离心看不到细胞沉淀。
(2)样品4℃，13600rpm离心25分钟，取上清。
(3)上清裂解液取45μl作为全细胞裂解液作为对照。最后往剩余裂解液中加入2μgIgG或相应的抗体，接着在垂直旋转仪上，4℃孵育4小时。
(4)随后取20μl Protein A/G beads，并用1ml裂解液清洗一次，将beads继续加入细胞裂解中，混匀后，继续孵育24小时。
(5)孵育结束后用裂解缓冲液清洗beads。
(6)清洗结束后，加入50μl的2X Loading Buffer，并在100℃变性5分钟从而洗脱与beads结合的蛋白。
(7)最后取上清进行免疫印迹分析。
如图2A-D所示：无论是外源性和内源性的MDM2与TOP2β都存在直接的相互作用。
如图2E所示：RG7112能抑制MDM2与TOP2β之间的结合。
实施例6：体内泛素化水平检测
(1)正常培养的HEK293细胞转染相应的质粒，48小时后用相应的药物处理 (处理方式见图例)，随后收集细胞沉淀。
(2)之后按照免疫共沉淀的实验方法进行处理，其中选用的Protein A/G beads更改为HA-beads。该beads能与被泛素化修饰后的HA-ub-TOP2β结合。
(3)最后通过免疫印迹实验检测不同处理条件下TOP2β泛素化水平差异。
如图2E所示：MDM2能促进TOP2β的泛素化修饰水平。
如图3F所示：MDM2的小分子抑制剂RG7112能抑制TOP2β被泛素化修饰。
实施例7：ATPlite细胞增殖实验
(1)正常培养的H1299和A549细胞胰酶消化后，PBS重悬，取10μl滴加至Bio-RAD细胞计数板边缘，待细胞悬液以虹吸的方式充满计数板后用 Bio-Rad TC20细胞计数仪进行计数。
(2)根据计数的结果，分别取1800(H1299)和2500(A549)个细胞用培养基制成总体积为100μl的悬液，加入到96孔板中。
(3)待细胞贴壁后，用培养基倍比稀释DMSO、RG7112、VP-16或者 RG7112+VP-16至所需浓度，然后往96孔板中继续加入含有相应药物浓度的培养基至终体积为200μl。
(4)细胞在二氧化碳恒温培养箱中继续培养72小时，之后取出96孔板， PBS 清洗后加入ATP检测液，水平摇床避光震荡5分钟。
(5)随后将反应液转移入用于检测的96孔白板中，使用SpectraMax ID酶标仪检测化学发光强度。
(6)实验独立重复三次，最后用SPSS软件计算细胞对不同药物的半数抑制浓度，并用GraphPad软件绘图。
如图4A,4C所示：肺癌细胞系H1299和A549对RG7112的IC20值分别为 8.1μM和0.08Μm；
如图4B,4D所示：RG7112的IC20值联合VP-16能促使H1299和A549对VP-16 的IC50值分别由1.52μM和0.68μM降低至0.69μM和0.31μM。
实施例8：软琼脂克隆形成实验
(1)将500-100个相应的细胞接种于铺有软琼脂的60mm培养皿中，待细胞贴壁后用相应浓度的药物处理细胞10-14天。
(2)之后去除培养基，用PBS缓冲液清洗后加入R250考马斯亮蓝染液，染色30分钟后流水冲洗，显微镜下观察。
(3)将细胞总数超过50个的克隆团定义为阳性克隆。阳性克隆的数量越多代表细胞的存活能力越强，同时也反应了药物对肿瘤细胞的杀伤效果。
(4)最后用Bio-Rad凝胶成像系统拍照，并记录克隆团的数量，进行统计分析。
如图4E所示：RG7112联合VP-16能抑制肺癌细胞的克隆形成能力。
实施例9：流式细胞仪检测凋亡水平
(1)H1299细胞进行转染或相应的小分子化合物处理后，留存上清；贴壁细胞用胰酶消化相应时间。
(2)将上清和消化也混合，终止胰酶消化，室温1000g离心5分钟。
(3)弃上清，PBS清洗后加入195μl Annexin V-FITC结合液重悬细胞。
(4)接着再往重悬液中加入5μl Annexin V-FITC并进行混匀。
(5)之后继续加入10μl碘化丙啶染色液，混匀。
(6)室温避光孵育10-20分钟，随后置于冰浴中避光。
(7)用300目40μm的细胞筛过滤细胞，防止细胞黏连。
(8)混匀样品，流式细胞仪检测细胞凋亡水平。
如图4F,4G所示：RG7112联合VP-16能促进肺癌细胞发生凋亡。
实施例10：中性彗星拖尾实验
(1)正常培养的H1299细胞用2mM胸腺嘧啶处理24小时，使所有细胞同步到含有相同DNA量的同一周期。
(2)PBS清洗后用相应浓度的药物处理1小时，随后将细胞重悬制成2x10^4 个/ml的悬液。
(3)用ddH2O配制1％的低熔点胶，将细胞重悬液与3倍体积的1％低熔点胶混匀，并将混匀液均匀涂抹与载玻片上，待胶凝固后置入裂解液中裂解细胞。
(4)裂解，清洗后将载玻片置入电泳液0.6V/cm，电泳25分钟。
(5)电泳结束后将载玻片置入2.5μg/ml的PI染色液中对DNA进行染色。
(6)染色结束后用蒸馏水浸泡，并清洗两遍，倒置荧光显微镜下观察 (536nm)，随机挑选至少50个以上的细胞拍照记录。
(7)将记录好的图像导入CometScore15.0软件中，分析并统计获得的彗星拖尾分数。彗星拖尾分数越高表明DNA双链断裂水平越高，DNA损伤程度越高。
如图5A-B所示：RG7112联合VP-16能抑制由VP-16所引起的DNA双链断裂和DNA损伤信号。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (5)
1.一种肺癌治疗药物的组合，其特征在于，该组合包括MDM2的抑制剂RG7112和VP-16。
2.根据权利要求1所述的MDM2抑制剂RG7112联合依托泊苷在治疗肺癌中的应用，其特征在于，RG7112用于靶向抑制MDM2，VP-16用于靶向TOP2β，两者共同杀伤肺癌细胞。
3.根据权利要求1所述的MDM2抑制剂RG7112联合依托泊苷在治疗肺癌中的应用，其特征在于，RG7112通过抑制MDM2的功能，抑制VP-16刺激下TOP2β的泛素化降解。
4.根据权利要求1所述的MDM2抑制剂RG7112联合依托泊苷在治疗肺癌中的应用，其特征在于，RG7112抑制VP-16刺激下TOP2β的降解后，可以降低由TOP2β降解所引起的DNA双链断裂。
5.根据权利要求1所述的MDM2抑制剂RG7112联合依托泊苷在治疗肺癌中的应用。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20220923 |
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