CN115074421A - 一种肝细胞癌筛选检测方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种肝细胞癌筛选检测方法及其应用，以特征基因TP53I3为肝细胞癌标志物，通过检测肝细胞癌组织样本中特征基因TP53I3的表达量实现筛选检测肝细胞癌，并将对该特征基因TP53I3的检测应用于一种肝细胞癌筛选检测与预后评估试剂盒，所述试剂盒包括特征基因TP53I3基因的引物组分以及所采用检测方法对应的辅助试剂，该试剂盒通过检测特征基因TP53I3基因的表达量，应用于肝细胞癌筛选检测与预后评估，本发明公开了一种新的肝细胞癌标志物：特征基因TP53I3，在肝细胞癌辅助诊断、预后评估和治疗领域具有重要的应用价值。

Description

一种肝细胞癌筛选检测方法及其应用
技术领域
本发明属于肿瘤分子生物学领域，特别涉及一种肝细胞癌筛选检测方法及其应用。
背景技术
肝癌是发生于肝细胞的恶性肿瘤。2021年CA杂志报道全球肝癌约有90.71万新发病例和82.17万死亡病例死亡率为8.3％，在所有肿瘤类型中位列第三。根据起源，肝癌可分为原发性和继发性两种。原发性肝癌主要分为肝细胞癌(75-85％)和肝内胆管癌(10-15％)两类。致瘤机制不明确、缺乏早期诊断标志物和非特异性治疗手段是肝细胞癌的最大特点，有效的治疗很大程度上依赖于对肝细胞癌的早期发现和治疗。
肝细胞癌通常在长期患有肝病的患者中发生，大部分患者没有症状，由筛查而被诊断。筛查分成高危人群筛查和肿瘤本身针对性的筛查。高危人群筛查是针对长期慢性乙肝病人、有肝硬化的病人、患有丙肝的病人等这些肝癌的易发高危人群的筛查。另一部分需要重点关注的人群是那些肝脏已经出现了可疑的病变，但是又没有明确是肿瘤的病人。肝细胞癌的针对性检查主要分为影像学检查和实验室检查。影像学检查最常用的是体表超声这种经济实用的方法，但它对检查医生的经验和水平以及对设备要求比较高。另外，必要的时候还会采用增强CT或者核磁等。对于实验室检查，主要包括肝功能检查、血常规检查以及肿瘤标志物检查等。
目前临床上正在使用的肝细胞癌相关的肿瘤标志物包括甲胎蛋白(AFP)和异常凝血酶原(DCP)等,但尚无单一标志物可诊断肝细胞癌。
AFP是一种糖蛋白，正常情况下这种蛋白主要来自胚胎的肝细胞，胎儿出生约两周后AFP从血液中消失，因此正常人血清中AFP的含量不到20ng/mL。但当肝细胞发生癌变时，又恢复了产生这种蛋白质的功能。所以AFP是迄今为止最广泛用于HCC筛查、早期诊断以及疗效和预后评估的生物标志物。使用常用的HCC阳性截止值(AFP水平≥20ng/mL)时，AFP的敏感度为41-65％，特异度为80-94％。但AFP阴性(<20ng/mL)率在52％的小HCC(<3cm)患者及53.5％的TNM I期患者中发现，表明近一半的HCC患者AFP阴性，尤其是早期和小HCC，作为肝细胞癌的早期筛查指标不理想。
DCP在肝脏合成，当维生素K缺乏或服用某些抗凝药物时异常升高，DCP是肝脏在合成凝血酶原过程中前体羧化不完全所致，所以全称脱-γ-羧基凝血酶原。当肝细胞发生癌变、羧化酶基因表达水平下降或者肝细胞内存在羧化酶抑制剂时患者血清DCP含量升高，是伴随肝癌特异产生的异常凝血酶原。使用常用的HCC阳性截止值(DCP≥40mAU/mL)诊断早期肝细胞癌的灵敏度和特异性分别为64％和89％，准确度为86.3％。但患者维生素K缺乏、饮酒或者服用华法林等抗凝剂均可导致DCP的异常升高。
因此，研究开发一种高特异性和高灵敏性的标志物用于肝细胞癌的诊断，对于肝细胞癌的诊断和治疗具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肝细胞癌筛选检测方法及其应用，通过特征基因TP53I3能够识别或鉴定肝细胞癌，用于肝细胞癌筛选检测与预后评估，以及其在检测试剂盒中的应用。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种肝细胞癌筛选检测方法，所述方法是以特征基因TP53I3为肝细胞癌标志物，通过检测肝细胞癌组织样本中所述特征基因TP53I3的表达量实现筛选检测肝细胞癌。
进一步地，所述方法包括以下步骤：
S1、选取肝细胞癌样品，所述样品包括组织、细胞和血液；
S2、提取总RNA；
S3、总RNA反转录合成cDNA；
S4、加入特征基因TP53I3的特异性引物，以反转录的cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增；
S5、荧光定量PCR检测肝细胞癌组织样本中TP53I3的表达量，起始点表示产物聚集的对数期开始，该期产物的荧光信号呈指数增长，检测仪将此点定义为Ct值；
S6、根据目的基因与内参基因Ct值之差ΔCt可以预测靶基因产物起始浓度，实现对肝细胞癌的筛选检测。
进一步地，S4所述特异性引物为：TP53I3-F:5’-AAGCGAGGAAGTCTGATCAC和TP53I3-R:5’-TTCGGTCACTGGGTAGATTC。
进一步地，S6所述内参基因为GAPDH，S6所述预测靶基因产物起始浓度的方法为：在PCR反应条件相同的情况下，ΔCt值越低，靶基因的起始浓度越大。
一种肝细胞癌筛选检测与预后评估试剂盒，所述试剂盒采用上述任一项所述方法进行肝细胞癌筛选和检测。
进一步地，所述试剂盒为荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括特征基因TP53I3的特异性引物、PCR反应液和荧光染料，所述试剂盒用于肝细胞癌筛选检测及预后评估。
进一步地，所述特异性引物为：
TP53I3-F:5’-AAGCGAGGAAGTCTGATCAC和TP53I3-R:5’-TTCGGTCACTGGGTAGATTC。
进一步地，所述PCR反应液为荧光定量PCR反应液，所述荧光定量PCR反应液包括dNTP、Mg2+、Taq酶及PCR缓冲液，所述Taq酶为热启动酶。
进一步地，所述荧光染料为SYBR GreenⅡ。
进一步地，所述特异性引物适用于SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、复合探针的检测。
本发明具有以下有益效果：
特征基因TP53I3作为肝细胞癌新发现的标志物，为肝细胞癌的检测和筛选提供了一种特异性、灵敏性更高的标志物，对肝细胞癌筛选检测的灵敏度和特异性都更高，可进一步提高肝细胞癌诊断的准确性，对于肝细胞癌的诊断及治疗具有重要意义；基于TP53I3的荧光定量PCR的靶向诊断技术最大的优点在于发现早期形态学变化不明显的肿瘤细胞和组织，操作方便可应用于早期筛查和诊断；此外，特征基因TP53I3也可以用于肝细胞癌患者预后的监测，TP53I3表达量的升高提示患者的预后会变差，在肝细胞癌辅助诊断、预后评估和治疗领域具有重要的应用价值；TP53I3的敲低显著抑制肝细胞癌细胞的增殖，是肝细胞癌治疗的潜在靶标，说明特征基因TP53I3作为全新的肝细胞癌诊断的肿瘤标志物，有望成为肝细胞癌治疗靶点，具有十分重要的科学意义和生理意义。
附图说明
图1为利用Hi-C的方法获取3对肝细胞癌和癌旁组织样本的差异互作数据并绘制的差异互作热图；
图2为利用RNA-seq的方法，在3对肝细胞癌和癌旁组织样本中检测的差异表达基因情况示意图；
图3为位于染色体差异互作区域上的全部基因表达概况；
图4A为利用DAVID网站，分析染色体内差异互作显著区域上的差异高表达基因富集的信号通路的结果，B为利用DAVID网站，分析染色体间差异互作显著区域上的高表达基因富集的信号通路的结果，C为利用DAVID网站，分析染色体互作显著区域上的差异低表达基因富集的信号通路的结果；
图5为参与信号通路富集的部分差异表达基因RNA-seq测序结果；
图6为利用荧光定量PCR的方法，在10对肝细胞癌和癌旁组织中检测TP53I3基因表达量的结果示意图；
图7为通过TCGA数据分析TP53I3基因在肝细胞癌和癌旁组织中的表达量；
图8A为利用GSE6764表达谱芯片数据，分析肝细胞癌患者和癌旁组织中TP53I3基因的表达量信息，B为利用GSE36376表达谱芯片数据，分析肝细胞癌患者和癌旁组织中TP53I3基因的表达量信息，C利用GSE57957表达谱芯片数据，分析肝细胞癌患者和癌旁组织中TP53I3基因的表达量信息；
图9A为利用GEPIA数据，根据TP53I3基因的表达量对肝细胞癌患者的总体生存时间的分析结果，B为利用GEPIA数据，根据TP53I3基因的表达量对肝细胞癌患者的无疾病生存时间的分析结果；
图10为利用本发明的肝细胞癌检测试剂盒，在100对肝细胞癌和癌旁组织中检测TP53I3基因的表达量的结果示意图；
图11为TP53I3的敲低能够抑制肝细胞癌的增殖结果示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本专利的技术方案作进一步说明。
实施例1
一种肝细胞癌筛选检测方法，所述方法是以特征基因TP53I3为肝细胞癌标志物，通过检测肝细胞癌组织样本中所述特征基因TP53I3的表达量实现筛选检测肝细胞癌。
进一步地，所述方法包括以下步骤：
S1、选取肝细胞癌样品，所述样品包括组织、细胞和血液；
S2、提取总RNA；
S3、总RNA反转录合成cDNA；
S4、加入特征基因TP53I3的特异性引物，以反转录的cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增；
S5、荧光定量PCR检测肝细胞癌组织样本中TP53I3的表达量，起始点表示产物聚集的对数期开始，该期产物的荧光信号呈指数增长，检测仪将此点定义为Ct值；
S6、根据目的基因与内参基因Ct值之差ΔCt可以预测靶基因产物起始浓度，实现对肝细胞癌的筛选检测。
进一步地，S4所述特异性引物为：TP53I3-F:5’-AAGCGAGGAAGTCTGATCAC和TP53I3-R:5’-TTCGGTCACTGGGTAGATTC。
进一步地，S6所述内参基因为GAPDH，S6所述预测靶基因产物起始浓度的方法为：在PCR反应条件相同的情况下，ΔCt值越低，靶基因的起始浓度越大。
一种肝细胞癌筛选检测与预后评估试剂盒，所述试剂盒采用上述任一项所述方法进行肝细胞癌筛选和检测。
进一步地，所述试剂盒为荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括特征基因TP53I3的特异性引物、PCR反应液和荧光染料，所述试剂盒用于肝细胞癌筛选检测及预后评估。
进一步地，所述特异性引物为：
TP53I3-F:5’-AAGCGAGGAAGTCTGATCAC和TP53I3-R:5’-TTCGGTCACTGGGTAGATTC。
进一步地，所述PCR反应液为荧光定量PCR反应液，所述荧光定量PCR反应液包括dNTP、Mg2+、Taq酶及PCR缓冲液，所述Taq酶为热启动酶。
进一步地，所述荧光染料为SYBR GreenⅡ。
进一步地，所述特异性引物适用于SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、复合探针的检测。
本发明涉及的特征基因TP53I3序列：
SEQUENCE LISTING
Figure BDA0003684724090000041
实施例2
Hi-C测序：
1、临床样本收集
本研究选取了3例原代肝细胞癌组织和癌旁正常组织，由解放军总医院第五医学中心负责采集和提供。所有患者均已提供书面的知情同意书。要求收集手术切除的肝细胞癌组织和癌旁正常组织的患者来源均为HBV感染者，均无自身免疫疾病或其他癌症病史，术前未接受过新辅助化疗或其他抗肿瘤治疗。样本采集应在手术结束后立即将新鲜样本在4℃平稳运输回实验室，在2h内进行组织消化，保证细胞最大活性。
2、肝细胞癌组织和癌旁正常组织的消化
(1)将新鲜癌旁正常组织或肝癌组织块转移到RPMI-1640培养基中，置于冰上或4℃暂存；
(2)在超净台中用无菌镊子取出组织块，置于无菌培养皿中，先用RPMI-1640培养基淋洗3次，再滴入少许无血清培养基保持组织湿润，然后使用无菌剪刀和镊子将组织剪碎并转移至多个1.5mL离心管中，在离心管内在进一步充分剪碎至匀浆状；
(3)配置完成的胶原酶混合液从-20℃冰箱中取出，解冻至室温；使用无菌剪刀减掉部分1mL枪头的枪尖，吸取适量胶原酶混合液，重悬剪碎的组织，重复该过程，将离心管放置到二氧化碳培养箱中维持37℃，进行消化。
(4)消化期间每隔15min吹打一次，当离心管内溶液可以无障碍通过1mL枪头时即可停止消化(消化时间应控制在60-90min)，观察细胞悬液的状态(是否还残留较大的组织颗粒)，选择合适的细胞过滤器(40μm细胞筛网或300目细胞筛)，过滤细胞悬液，收集滤过液；
(5)将滤液以1000-2000rpm离心10min，用微量移液器去除上清液，收集管底沉淀；
(6)缓慢加入1mL PBS重悬细胞，补加PBS至10mL，洗涤收集到的细胞沉淀2次，使用取10μL用与细胞计数。剩余重悬液1000-2000rpm离心10min收集细胞。(收集的细胞量达到2×107，才进行后续操作)
3、Hi-C建库
(1)取完全培养基45mL重悬细胞，加入2.5mL 37％甲醛水溶液混匀，室温放置10min，期间每隔1min将溶液轻柔摇匀一次。
(2)加入5mL 2.5M甘氨酸溶液，轻柔混匀终止交联反应，转移回超净台，在室温条件下放置5min，然后转移至冰上放置15min以上；
(3)将细胞悬浮液用1500rpm离心10min，弃掉上清，细胞沉淀可储存在-80℃冰箱储存或直接进行下一步操作；
(4)再使用限制性内切酶在37℃下孵育，将交联的DNA切断，使交联点产生切口；
(5)用生物素标记DNA末端并在37℃下孵育45分钟，用20％SDS溶液灭活酶；
(6)添加T4 DNA连接酶进行DNA连接，并在16℃下孵育4-6小时。
(7)加入蛋白酶K，在65℃下孵育，交联过夜。
(8)除去未交联的末端，利用Covaris超声细胞破碎仪将检测合格的DNA打断为长度在350bp左右的DNA片段。
(9)通过
Figure BDA0003684724090000051
M-280Streptavidin捕获生物素标记的DNA片段，通过Illumina平台进行测序。
4、确定相互作用变化显著的染色体区域
(1)1Mb分辨率下计算正常和肿瘤样本中每个窗口的互作概率；
(2)过滤掉互作数目为0的、不符合典型离散分布的窗口；
(3)计算保留下来的窗口的p value，使用错误发现率(FDR)多次校正p value，得到q value；
(4)通过比对肝细胞癌组织和正常组织间的互作情况，得到差异互作数据并绘制差异互作热图，结果如图1所示。分析结果表明，染色体内部的差异相互作用比染色体间的差异相互作用更显著(图1中的对角线位置)，染色体间的某些位置在肝细胞癌组织和正常组织间的差异相互作用十分明显(图1中深色区域)，但直观来看无法在三对样本中找到共同的区域，需进行定量分析。
(5)统计三对配对样本的正常和肿瘤样本间均存在显著差异互作的窗口个数(差异互作数，表1)，将排名前四位的染色体(chr2，chr11，chr5，chr1)或染色体对(chr15-chr22，chr16-chr19，chr4-chr10，chr13-chr21)视为染色体相互作用变化显著的区域。
表1A染色体内差异互作数统计
Figure BDA0003684724090000061
表1B染色体间差异互作数统计
Figure BDA0003684724090000071
Figure BDA0003684724090000081
Figure BDA0003684724090000091
Figure BDA0003684724090000101
Figure BDA0003684724090000111
实施例3
转录组测序：
1、RNA-seq
(1)RNA提取：通过基于Trizol的方法提取细胞全RNA。使用RNA Nano系统(K5500，Kaiao，China)测量RNA完整性。
(2)RNA-seq文库制备：使用poly-T寡核苷酸连接的磁珠从总RNA中纯化mRNA。将四种荧光标记的dNTP、DNA聚合酶和接头引物添加到测序流动池中进行扩增。当每个测序簇延伸互补链时，每个荧光标记的dNTP都可以释放相应的荧光。测序仪捕获荧光信号后通过计算机软件将光信号转化为测序峰，从而获得待测片段的序列信息。
2、基因差异表达分析
通过研究不同样本间的基因表达的生物学重复性情况，建立基于负二项式分布的确定基因表达差异情况的分析模型，以padj<0.05，|log2foldchange|>1为标准，可将差异表达基因与其他基因区分开。对正常样本和肿瘤样本间表达存在差异的基因进行统计，结果如图2所示。
3、联合分析
将实施例2中获得的染色体相互作用变化显著的区域与差异表达基因相匹配，获得了在肿瘤发生过程中，受染色体相互作用改变影响较大的差异表达基因，其表达情况如图3所示，基因列表见表2。分析结果显示，位于染色体结构变异区域上的基因在肿瘤和正常组织中的表达存在显著差异，整体来看，肿瘤组织中的基因表达更多的呈现下调的趋势。
表2染色体结构变异区域的差异表达基因
Figure BDA0003684724090000121
Figure BDA0003684724090000131
Figure BDA0003684724090000141
Figure BDA0003684724090000151
Figure BDA0003684724090000161
Figure BDA0003684724090000171
实施例4
肝细胞癌标志物分析：
基因通路富集分析是分析基因在细胞中的代谢途径以及其功能的过程。本发明中，利用David对差异表达基因进行通路富集分析。DAVID提供了较为全面的基因功能注释工具，有助于帮助科研人员更好的了解基因背后的生物学意义。该网站可进行基因本体(Gene ontology，GO)，基因组注释(Genome annotation)，KEGG富集，REACTOME富集等分析。通过在网站首页提交需要分析的差异基因列表，选择物种信息为H.sapiens，再点击cluster选项即可得到富集分析结果。对实施例3中获得的差异表达基因进行通路富集分析，结果参见图4。分析结果表明，肝细胞癌差异高表达基因多富集在细胞周期和p53等信号通路。对临床取得的三对配对的肝细胞癌样本中参与信号通路富集的基因表达进行分析，绘制柱形图，结果参见图5。依据已发表的文献或细胞标志物数据库，经进一步筛选我们确定了肝细胞癌特征基因为TP53I3。
TP53I3(p53诱导基因3，又称PIG3)，由位于编码肿瘤抑制蛋白p53的基因下游的基因编码，其主要的细胞作用是产生活性氧(ROS)并参与p53介导的细胞凋亡和DNA损伤反应。TP53I3可通过激活PI3K/Akt/PTEN通路促进甲状腺乳头状癌的生长并发挥致癌作用。还可以促进肺腺癌(LUAD)的细胞迁移和侵袭。
实施例5
人肝细胞癌和癌旁组织中TP53I3的定量PCR分析：
1、样本收集：
组织样本来自于10对该细胞癌患者的住院病历手术切除样本，每对包含肝细胞癌组织和配对的癌旁组织。所有标本取下后放入液氮罐中，随后放入-80冰箱中保存。所有膀胱癌组织及癌旁组织经解放军总医院第五医学中心病理科病理检查确认。所有标本的使用符合解放军总医院第五医学中心伦理委员会的伦理要求。
2、RNA提取：
按照Trizol提取组织RNA的步骤提取总RNA:
(1)匀浆：将组织剪成小块，放入普通的玻璃或匀浆器内，每50-80mg组织加入1mLTrizol匀浆，随后12000×g离心10min，取澄清的Trizol裂解产物进行以下操作。
(2)每1mL Trizol加入0.2mL氯仿，猛烈晃动15sec，室温放置2-3min，4℃12000×g离心15min。
(3)取含总RNA的上层无色液体至一新的离心管中，每毫升Trizol约可吸取0.5-0.55mL。
(4)向上清中加入5mL异丙醇，颠倒混匀，常温沉淀10min，4℃12000×g离心10min，在管底可见RNA沉淀，弃上清。
(5)向上清加入1mL75％乙醇，颠倒混匀，4℃7500×g离心5min，弃上清，重复一次。
(6)将离心管置于室温放置10min晾干。
(7)向中间部位加入预热的Rnase-Free ddH2O，一般：107细胞加入16～30μL水溶解，得到RNA溶液。利用Nanodrop 2000测定浓度。
3、反转录合成cDNA模板：
gRNA去除反应体系：
组成成分 使用量
5×gDNA Buffer 2μL
Total RNA X
RNase-Free ddH<sub>2</sub>O 不足到10μL
从2所得的RNA溶液中用RNA专用移液枪取出3-5μL于PCR管中，用于测定该RNA溶液的浓度。总RNA的量应在1-2mg之间，根据RNA溶液的浓度确定gDNA去除体系中Total RNA的用量。
gDNA去除反应体系配好后置于42℃，孵育3min，然后置于冰上放置。
反转录反应体系：
试剂 使用量
10×king RT Buffer 2μL
Fastking RT Enzyme Mix 1μL
FQ-RT Primer Mix 2μL
RNase-Free ddH<sub>2</sub>O 补足到10μL
将反转录反应中的Mix加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀。42℃孵育15min，95℃孵育3min之后置于冰上，得到的cDNA可用于后续试验或低温保存。
4、荧光定量PCR检测TP53I3表达量：应用所述试剂盒进行定量PCR检测TP53I3表达量，以反转录得cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增，TP53I3的检测引物如下：
TP53I3-F:5’-AAGCGAGGAAGTCTGATCAC
TP53I3-R:5’-TTCGGTCACTGGGTAGATTC
荧光定量PCR体系：
试剂 用量
2×PCR反应液 10μL
引物 各1μL
DNA模板 1μL
RNase-Free ddH<sub>2</sub>O 补足到20μL
其中，所述标准DNA模板为扩增获得的TP53I3基因的从DNA模板。荧光定量PCR条件如下：
Figure BDA0003684724090000181
Figure BDA0003684724090000191
因此，利用荧光定量PCR的方法，在10对膀胱癌和癌旁组织检测TP53I3基因的表达量，结果如图6所示，TP53I3基因在肝细胞癌中显著高表达，结果表明TP53I3在肝细胞癌中的表达量显著高于癌旁组织，P<0.05。
实施例6
TCGA数据库中分析人肝细胞癌和癌旁组织中TP53I3的表达量。
在TCGA数据库中分析TP53I3基因在肝细胞癌中的表达量，如图7所示，通过分析TCGA数据库，相比于正常肝组织，TP53I3在肝细胞癌中显著高表达，P<0.05。
实施例7
在NCBI搜索原代肝细胞癌组织的表达谱芯片结果，搜索到芯片数据GSE6764,GSE36376和GSE57957三个数据库中含有肝细胞癌组织和癌旁组织的TP53I3表达量信息。如图8所示，通过分析GSE6764，GSE36376和GSE57957表达谱芯片数据，相比于正常肝组织，TP53I3在肝细胞癌中显著高表达。
实施例8
基因表达与预后的相关性：
运用Gene expression Profiling Interactive Analysis(GEPIA2)在线分析工具(http://www.oncolnc.org/)对预后进行分析，使用的数据库为肝细胞癌(LIHC)数据。GEPIA是基于TCGA和GTEx数据库中的肿瘤和正常样本进行基因表达分析的工具。GEPIA2是GEPIA的增强和更新版本，具有更高的分辨率和更多的功能。GEPIA2涵盖了84种癌症亚型，将基因表达定量从基因水平扩展到转录本水平，并支持特定癌症亚型的分析以及亚型之间的比较。此外随着单细胞测序的广泛应用，GEPIA2还采用新的基因特征量化分析技术，从而让用户得到不同癌症类型细胞亚群特征基因的分布，是强大的癌症基因组学数据工具。
TCGA(The Cancer Genome Atlas)是由美国在2005年发起的癌症和肿瘤基因图谱计划，旨在应用基因组分析技术研究癌症中的基因组变化，做了大规模的基因组测序，样本量过万，包含了三十多种癌症。GTEx(Genotype-Tissue Expression是正常组织转录组测序的数据库。通常，使用TCGA进行数据分析时，会发现该项目纳入的正常组织转录组测序数据非常少，这个时候需要加入GTEx数据库数据，二者结合进行分析，数据分析结果如图9所示。
分析结果表明，TP53I3高表达的患者与更短的总生存期(P＝0.02)和无疾病生存期(P＝0.0047)相关。以上结果表明，肝细胞癌中TP53I3高表达显著影响肝细胞癌患者的临床结局，提示了更差的预后。这一发现可帮助临床医生认识疾病发展规律，提前对患者进行干预治疗，改善不良的治疗预后。
实施例9
利用TP53I3的差异表达对肝细胞癌组织进行筛查：
选取100对人肝细胞癌组织和癌旁组织，按Trizol提取组织RNA的步骤提取总RNA，再利用Nanodrop 2000测定RNA浓度和纯度。采用天根生化科技(北京)有限公司FastKingRT试剂盒(货号KR116-02)对提取的总RNA反转录合成cDNA。采用Thermo Fisher公司SYBRMix，以反转录的cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增。TP53I3的检测引物如下：
TP53I3-F:5’-AAGCGAGGAAGTCTGATCAC
TP53I3-R:5’-TTCGGTCACTGGGTAGATTC
PCR条件如下：
Figure BDA0003684724090000201
荧光定量PCR检测肝细胞癌组织样本中TP53I3的表达量，产物扩增曲线在反应的早期就可能被监测到，起始点表示产物聚集的对数期开始，该期产物的荧光信号呈指数增长，检测仪将此点定义为Ct值。根据目的基因与GAPDH Ct值之差(ΔCt)可以预测靶基因产物的起始浓度，即在PCR反应条件相同的情况下，靶基因的起始浓度越大，则ΔCt值就越低。将癌旁对照组ΔCt均值的95％可信区间的下界(X±SD)作为本诊断试验的Cut-off值，其值为5.6864。在此分界值条件下，本诊断实验的灵敏度为87％，特异度为99％。如图10所示，本发明的肝细胞癌检测试剂盒，在100对肝细胞癌和癌旁组织中检测TP53I3基因的表达量，结果表明TP53I3在肝细胞癌中的表达量显著高于癌旁组织，P<0.0001。
Figure BDA0003684724090000202
利用本发明试剂盒筛选肝细胞癌临床灵敏度可用来衡量某种试验检测出有病者的能力，灵敏度是将实际有病的人正确地判定为真阳性的比例。本实验灵敏度＝87/100×100％＝87％。临床特异度是衡量试验正确地判定无病者的能力，特异度是将实际无病的人正确地判定为真阴性的比例。本实验特异度＝99/(1+99)×100％＝99％。
因此，特征基因TP53I3作为全新的肝细胞癌诊断的肿瘤标志物，有望成为肝细胞癌治疗靶点，具有十分重要的科学意义和生理意义。
实施例10
TP53I3功能鉴定：
1、siRNA干扰；
为了TP53I3的功能，合成靶向TP53I3的siRNA，并转染至肝细胞癌细胞系。
(1)将2×105个HepG2细胞接种到六孔细胞培养板中，在六孔板中利用2mL的1640完全培养基进行培养。
(2)细胞完全贴壁后，弃去六孔板中的液体，利用纯DMEM培养基对细胞进行2h的饥饿培养。
(3)将5μL的siRNA加至250μL的DMEM培基中混匀，室温静置5min，获得混合溶液A。
(4)向250μL的纯DMEM培基中加入10μL的Lipo2000，涡旋混匀，室温静置10min，获得混合溶液B。
(5)将含有siRNA的混合溶液A与含有Lipo2000的混合溶液B混合均匀，将混合液室温静置20min。
(6)将静置完成的混合液均匀滴加至六孔板的各个孔中，确保混合液分散均匀，将六孔板培养于在37℃细胞培养箱。
(7)4-6h的共培养结束后，弃去六孔板中所有培养基，在仅含血清的DMEM培养基的体系下，继续对细胞进行48h的培养。
2、细胞毒性实验；
(1)将T25瓶中的HepG2细胞用0.25％胰酶消化细胞。等到细胞呈圆形，但未完全脱离时，通过添加完全培养基将胰酶稀释至0.05％以终止消化。通过离心机以1000rpm的转速进行3min的离心，用完全培养基重悬细胞得到细胞悬液。
(2)对细胞悬液中含有的细胞总数进行计算，通过向细胞悬液中添加DMEM完全培养基对细胞悬液进行稀释，将两种细胞稀释至浓度为5×104个/mL。
(3)在96孔板的每孔中加入100μL细胞稀释液，并将96孔板在培养箱中过夜培养。
(4)继续培养24h、48h和72h。
(5)达到预计的孵育时间后，弃去残留在96孔细胞板中的的培养基，加入100μLMTT浓度0.5mg/mL的RPMI溶液，继续孵育4h。
(6)测定96孔细胞培养板中各孔在570nm处的吸光度。
结果显示，TP53I3的敲低显著抑制肝细胞癌细胞的增殖(图11)，是肝细胞癌治疗的潜在靶标，进一步说明，特征基因TP53I3作为全新的肝细胞癌诊断的肿瘤标志物，有望成为肝细胞癌治疗靶点，具有十分重要的科学意义和生理意义。
以上实施例对本发明进行了进一步阐述和说明，以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的方法及其核心思想，对于本领域的一般技术人员，依据本申请的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，本说明书内容不应理解为对本申请的限制。
序列表
<110> 北京化工大学
<120> 一种肝细胞癌筛选检测方法及其应用
<141> 2022-06-08
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 999
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atgttagccg tgcactttga caagccggga ggaccggaaa acctctacgt gaaggaggtg 60
gccaagccga gcccggggga gggtgaagtc ctcctgaagg tggcggccag cgccctgaac 120
cgggcggact taatgcagag acaaggccag tatgacccac ctccaggagc cagcaacatt 180
ttgggacttg aggcatctgg acatgtggca gagctggggc ctggctgcca gggacactgg 240
aagatcgggg acacagccat ggctctgctc cccggtgggg gccaggctca gtacgtcact 300
gtccccgaag ggctcctcat gcctatccca gagggattga ccctgaccca ggctgcagcc 360
atcccagagg cctggctcac cgccttccag ctgttacatc ttgtgggaaa tgttcaggct 420
ggagactatg tgctaatcca tgcaggactg agtggtgtgg gcacagctgc tatccaactc 480
acccggatgg ctggagctat tcctctggtc acagctggct cccagaagaa gcttcaaatg 540
gcagaaaagc ttggagcagc tgctggattc aattacaaaa aagaggattt ctctgaagca 600
acgctgaaat tcaccaaagg tgctggagtt aatcttattc tagactgcat aggcggatcc 660
tactgggaga agaacgtcaa ctgcctggct cttgatggtc gatgggttct ctatggtctg 720
atgggaggag gtgacatcaa tgggcccctg ttttcaaagc tactttttaa gcgaggaagt 780
ctgatcacca gtttgctgag gtctagggac aataagtaca agcaaatgct ggtgaatgct 840
ttcacggagc aaattctgcc tcacttctcc acggagggcc cccaacgtct gctgccggtt 900
ctggacagaa tctacccagt gaccgaaatc caggaggccc ataagtacat ggaggccaac 960
aagaacatag gcaagatcgt cctggaactg ccccagtga 999
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
aagcgaggaa gtctgatcac 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
ttcggtcact gggtagattc 20

Claims (10)

1.一种肝细胞癌筛选检测方法，其特征在于，所述方法是以特征基因TP53I3为肝细胞癌标志物，通过检测肝细胞癌组织样本中所述特征基因TP53I3的表达量实现筛选检测肝细胞癌。
2.根据权利要求1所述的一种肝细胞癌筛选检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1、选取肝细胞癌样品，所述样品包括组织、细胞和血液；
S2、提取总RNA；
S3、总RNA反转录合成cDNA；
S4、加入特征基因TP53I3的特异性引物，以反转录的cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增；
S5、荧光定量PCR检测肝细胞癌组织样本中TP53I3的表达量，起始点表示产物聚集的对数期开始，该期产物的荧光信号呈指数增长，检测仪将此点定义为Ct值；
S6、根据目的基因与内参基因Ct值之差ΔCt可以预测靶基因产物起始浓度，实现对肝细胞癌的筛选检测。
3.根据权利要求2所述的一种肝细胞癌筛选检测方法，其特征在于，S4所述特异性引物为：TP53I3-F:5’-AAGCGAGGAAGTCTGATCAC和TP53I3-R:5’-TTCGGTCACTGGGTAGATTC。
4.根据权利要求2所述的一种肝细胞癌筛选检测方法，其特征在于，S6所述内参基因为GAPDH，S6所述预测靶基因产物起始浓度的方法为：在PCR反应条件相同的情况下，ΔCt值越低，靶基因的起始浓度越大。
5.一种肝细胞癌筛选检测与预后评估试剂盒，其特征在于，所述试剂盒采用权利要求1-4任一项所述方法进行肝细胞癌筛选和检测。
6.根据权利要求5所述的一种肝细胞癌筛选检测与预后评估试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括特征基因TP53I3的特异性引物、PCR反应液和荧光染料，所述试剂盒用于肝细胞癌筛选检测及预后评估。
7.根据权利要求6所述的一种肝细胞癌筛选检测与预后评估试剂盒，其特征在于，所述特异性引物为：
TP53I3-F:5’-AAGCGAGGAAGTCTGATCAC和TP53I3-R:5’-TTCGGTCACTGGGTAGATTC。
8.根据权利要求6所述的一种肝细胞癌筛选检测与预后评估试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液为荧光定量PCR反应液，所述荧光定量PCR反应液包括dNTP、Mg2+、Taq酶及PCR缓冲液，所述Taq酶为热启动酶。
9.根据权利要求6所述的一种肝细胞癌筛选检测与预后评估试剂盒，其特征在于，所述荧光染料为SYBR GreenⅡ。
10.根据权利要求6所述的一种肝细胞癌筛选检测与预后评估试剂盒，其特征在于，所述特异性引物适用于SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、复合探针的检测。
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