CN115068588A - 金雀花有效成分在制备抗hpv凝胶上的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种金雀花有效成分在制备抗HPV凝胶上的应用，将金雀花中的有效成分组合制备成抗HPV凝胶，所述抑菌凝胶的制备原料按质量百分比计包括：金雀花有效成分0.5～1.5%、酸酐化牛β‑乳球蛋白0.4～0.6%、卡波姆0.5～1.5%、甘油8～12%、三乙醇胺1～2%以及纯水余量。本发明制得的凝胶，不含化学原料和乙醇，对皮肤温和无刺激，对HPV感染的治疗具有明显疗效。

Description

金雀花有效成分在制备抗HPV凝胶上的应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种金雀花有效成分在制备抗HPV凝胶上的应用。
背景技术
人类乳头瘤病毒（Humanpapillomavirus，HPV），是球形DNA病毒感染引起的一种性传播疾病，人类是唯一的宿主。研究发现在约90%宫颈癌组织中可检测到人类乳头瘤病毒，其中HPV16和HPV18等高危型HPV感染与宫颈癌密切相关，就目前而言HPV感染是宫颈癌及其癌前病变的必要因素这一点已成为共识。尤其是近十年来，宫颈癌发病率迅速上升，使之成为妇女健康的一大威胁。
目前HPV疫苗主要针对HPV16、18在内的常见HPV型别具有预防作用，对其他型别的交叉预防作用有限。且HPV疫苗对于已有HPV感染或癌前病变患者无明显治疗作用。因此临床多认为对不同人群开展常规HPV及宫颈细胞学检测的筛查更为重要，可做到早期预防、早期治疗。
目前针对HPV感染的治疗较多，其中局部用药为常用的方法之一，药物种类繁多，但临床治愈率均不理想。因此有必要开发出新的抗HPV的药物。
金雀花（拉丁文名:Parochetus communis），又名紫雀花，为豆科、紫雀花属匍匐草本。金雀花提取物是苗药金雀花经过水热提取（类似传统中药煎服方法）后浓缩的浸膏。相关研究已经表明，金雀花中富含黄酮、香豆素、皂苷、有机酸类等成分。该植物以全草入药，性味归经酸、涩，温，具有滋阴、和血、健脾的功效。治劳热咳嗽、头晕腰酸、妇女气喘白带、小儿疳积、乳痈、跌打损伤等。然而截至目前，苗药金雀花潜在的应用尚未被全部发掘出来。
发明内容
本发明的目的在于提供一种免洗抗HPV凝胶，本发明提供的抗HPV凝胶不含化学原料和乙醇，对皮肤温和无刺激，对HPV感染的治疗具有明显疗效。
为了解决上述问题，本发明采取了如下技术方案：
一种金雀花有效成分在制备抗HPV凝胶上的应用，将金雀花中的有效成分组合制备成抗HPV凝胶，所述抗HPV凝胶的制备原料按质量百分比计包括：金雀花有效成分0.5～1.5%、酸酐化牛β-乳球蛋白0.4～0.6%、卡波姆0.5～1.5%、甘油8～12%、三乙醇胺1～2%以及纯水余量。
优选的，所述金雀花有效成分为金雀花提取物。
优选的，所述金雀花有效成分包括紫檀素类化合物和卡拉加素类化合物。
优选的，所述紫檀素类化合物和卡拉加素类化合物的质量比为1:(0.1～10)。
优选的，所述紫檀素类化合物选自3-羟基-4,9-二甲氧基紫檀素、4,9-二羟基-3-甲氧基紫檀素、美迪紫檀苷、高丽槐树葡萄糖苷以及3-甲氧基-8,9-二氧亚甲基紫檀素中的一种或者几种。
优选的，所述卡拉加素类化合物选自卡拉加素A和卡拉加素C中的一种或者两种。
优选的，所述3-羟基-4,9-二甲氧基紫檀素、4,9-二羟基-3-甲氧基紫檀素、美迪紫檀苷、高丽槐树葡萄糖苷以及3-甲氧基-8,9-二氧亚甲基紫檀素在凝胶中的质量比为(1～5):（1～6):(1～3.6):(0.6～2.4):(0.5～1.8)。
优选的，所述卡拉加素A和卡拉加素C在凝胶中的质量比为1:(0.2～5)。
本发明还提供了一种所述的抗HPV凝胶的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）按照配比取卡波姆和甘油混合，搅拌分散至糊状液；
（2）将金雀花有效成分、酸酐化牛β-乳球蛋白与纯水搅拌均匀，得到的液体在搅拌条件下加入步骤（1）的糊状液，搅拌均匀，然后加入三乙醇胺，分散均匀即得所述抗HPV凝胶。
牛β-乳球蛋白的等电点在4.5～5.5之间，3-羟基-邻苯二甲酸酐一般具有强酸性，而牛β-乳球蛋白上肽链上含有碱性氨基酸残基，3-羟基-邻苯二甲酸酐可将牛β-乳球蛋白上的碱性氨基酸修饰，改变牛β-乳球蛋白原有的表面电荷分布，增大牛β-乳球蛋白的负电荷带电量，酸酐修饰后的牛β-乳球蛋白即为酸酐化牛β-乳球蛋白。人类乳头瘤病毒(HPV)是一种小的DNA病毒，病毒基因为双链环状的DNA，其表面带正电荷。通过酸酐修饰后的牛β-乳球蛋白上的负电荷可以络合HPV表面的正电荷，使HPV的蛋白失活。
卡波姆别名聚丙烯酸，一般为白色疏松状粉末，是一种优秀的凝胶基质。卡波姆为丙烯酸键合烯丙基蔗糖或季戊四醇烯丙醚的高分子聚合物，有一定的酸性，通过适当调节卡波姆溶液的pH，卡波姆分子作为羧基给予体能与一个或两个以上羧基结合形成氢键，使卷曲的分子因电斥力张开而增稠。随着大分子逐渐溶解，黏度也逐渐上升，在低浓度时形成澄明溶液，在高浓度是形成半透明的凝胶。因此，卡波姆具有很好的粘合性和成膜性，常常用做医疗器械中妇科凝胶类产品的主要原料。
甘油别名丙三醇，是一种无色、无臭、有团味、澄明的浓和液体。通常从油脂中提炼而来，甘油具有很强的吸湿性。涂在皮肤上能形成层薄现，能隔绝空气和防止水分蒸发，还能吸收空气中的水分，甘油可以来利调节凝胶形状的作用。
金雀花中富含黄酮、香豆素、皂苷、有机酸类等成分。已知金雀花提取物具有明显的抑菌作用，现将金雀花的有效成分与牛β-乳球蛋白等原料一起组合制备成凝胶，研究其在抗HPV上的应用。
本发明的有益效果：
本发明以金雀花中的有效成分和牛β-乳球蛋白结合来制备抗HPV凝胶，制得的凝胶不含化学原料和乙醇，经临床试验表明，本发明的凝胶对HPV感染的治疗具有明显疗效。
具体实施方式
一、金雀花提取物的制备
将金雀花干燥、粉碎后过40～100目筛，然后用70%甲醇水溶液冷浸3次，每次3天，合并滤液，减压回收溶剂，得金雀花提取物。
二、金雀花有效成分中的化合物制备
1、提取：将金雀花干燥、粉碎后过40～100目筛，然后用70%甲醇水溶液冷浸3次，每次3天，合并滤液，减压回收溶剂，得金雀花总浸膏。将金雀花总浸膏用1.5倍体积的水分散，然后依次用等倍量的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，并回收溶剂，分别得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位。
2、分离：将石油醚和乙酸乙酯部位溶于甲醇过滤，得到沉淀部分e，将该沉淀置于500 mL的圆底烧瓶中，进行经典的乙酰化衍生反应（即加入300 mL吡啶和过量的醋酸酐，在室温下搅拌过夜），反应结束后，加入少量的柠檬酸中和吡啶，乙酸乙酯萃取，得到产物f。产物f用氯仿溶解后加硅胶拌样，上样于硅胶H柱，氯仿/甲醇（体积比100:1，50:1，25:1）洗脱，薄层色谱检识合并相同组分，得到馏分 fr.1～fr.2。馏分fr.1经硅胶反复柱色谱以及Sephadex LH-20 纯化得到化合物Ⅰ和Ⅱ；馏分fr.2经硅胶H柱，氯仿/甲醇（体积比 25:1，15: 1）洗脱，薄层色谱检识合并相同组分，得到馏分fc.1～fc.2，fc.1 经硅胶H柱，氯仿/甲醇(体积比 100:1，50:1) 洗脱，分离得到化合物Ⅲ。馏分fc.2分为四段，第一段经Sephadex LH-20 凝胶柱层析，分离得到化合物Ⅳ。第二段经 Sephadex LH-20 凝胶柱层析，分离得到化合物Ⅴ。第三段经Sephadex LH-20 凝胶柱层析，氯仿/甲醇（体积比70:30）洗脱，分离得到化合物Ⅵ。第四段经Sephadex LH-20 凝胶柱层析，氯仿/甲醇（体积比90:10）洗脱分离得到化合物Ⅶ。
3、纯化：取上述得到的化合物用甲醇溶解，经制备液相色谱即得纯的化合物。
制备柱：Robusta C18（250mm×4.6mm，10μL），甲醇（A）-0.1%醋酸水（B）梯度洗脱，0～5min，A：20%；5～40min，A：20%～80%；柱温35℃；波长280nm。
4、化合物的鉴定：
（1）取化合物样品用甲醇溶解，依次采用气相液相色谱（GC）和质谱（MS）进行分析。
（2）分析条件
GC 条件: 石英毛细管柱HP-FFAP( 30 m×0.25 mm×0.25 μm) 程序升温，起始温度为 40℃保持3 min，以5℃/ min升温速率，升温到120℃保持2 min，再以6℃/ min升温速率，升温至完成分析，载气为He( 99.99%) ，柱流量1.0μL/min。
MS 条件: EI 源，电子能量 70 eV，接口温度 230℃，离子源温度230℃，溶剂延迟时间2.5 min，扫描范围为35～550μm。
5、结论
化合物Ⅰ鉴定为3-羟基-4,9-二甲氧基紫檀素；
化合物Ⅱ鉴定为4,9-二羟基-3-甲氧基紫檀素；
化合物Ⅲ鉴定为美迪紫檀苷；
化合物Ⅳ鉴定为3-甲氧基-8,9-二氧亚甲基紫檀素；
化合物Ⅴ鉴定为高丽槐树葡萄糖苷；
化合物Ⅵ鉴定为卡拉加素A；
化合物Ⅶ鉴定为卡拉加素C。
以上化合物的具体结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
Figure DEST_PATH_IMAGE003
。
三、本发明的金雀花有效成分在制备抗HPV凝胶上的应用
实施例1：
本实施例提供了一种抗HPV凝胶，其制备原料为：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
。
其制备方法具体包括以下步骤：
（1）按照配比取卡波姆和甘油混合，搅拌分散至糊状液；
（2）将金雀花有效成分（金雀花提取物）、酸酐化牛β-乳球蛋白与纯水搅拌均匀，得到的液体在搅拌条件下加入步骤（1）的糊状液，搅拌均匀，然后加入三乙醇胺，分散均匀即得所述抗HPV凝胶。
实施例2：
本实施例提供了一种抗HPV凝胶，其制备原料为：
Figure DEST_PATH_IMAGE005
。
其中，紫檀素类化合物/卡拉加素类化合物为任意比例（1/0.05）；卡拉加素A/卡拉加素C=1/0.2。
其制备方法具体包括以下步骤：
（1）按照配比取卡波姆和甘油混合，搅拌分散至糊状液；
（2）将金雀花有效成分（3-羟基-4,9-二甲氧基紫檀素、卡拉加素A、卡拉加素C）、酸酐化牛β-乳球蛋白与纯水搅拌均匀，得到的液体在搅拌条件下加入步骤（1）的糊状液，搅拌均匀，然后加入三乙醇胺，分散均匀即得所述抗HPV凝胶。
实施例3：
本实施例提供了一种抗HPV凝胶，其制备原料为：
Figure DEST_PATH_IMAGE006
。
其中，紫檀素类化合物/卡拉加素类化合物为任意比例（1/11）；卡拉加素A/卡拉加素C=1/0.2。其余制备方法同实施例2。
实施例4：
本实施例提供了一种抗HPV凝胶，其制备原料为：
Figure DEST_PATH_IMAGE007
。
其中，紫檀素类化合物/卡拉加素类化合物=1/2；
3-羟基-4,9-二甲氧基紫檀素/4,9-二羟基-3-甲氧基紫檀素/美迪紫檀苷/高丽槐树葡萄糖苷/3-甲氧基-8,9-二氧亚甲基紫檀素为任意比例（1/1/1/1/1）。
卡拉加素A/卡拉加素C为任意比例（1/0.1）。
其制备方法具体包括以下步骤：
（1）按照配比取卡波姆和甘油混合，搅拌分散至糊状液；
（2）将金雀花有效成分（3-羟基-4,9-二甲氧基紫檀素、4,9-二羟基-3-甲氧基紫檀素、美迪紫檀苷、高丽槐树葡萄糖苷、3-甲氧基-8,9-二氧亚甲基紫檀素、卡拉加素A、卡拉加素C）、酸酐化牛β-乳球蛋白与纯水搅拌均匀，得到的液体在搅拌条件下加入步骤（1）的糊状液，搅拌均匀，然后加入三乙醇胺，分散均匀即得所述抗HPV凝胶。
实施例5：
本实施例提供了一种抗HPV凝胶，其制备原料为：
Figure DEST_PATH_IMAGE008
。
其中，紫檀素类化合物/卡拉加素类化合物=1/10；卡拉加素A/卡拉加素C=1/0.2。
其制备方法具体包括以下步骤：
（1）按照配比取卡波姆和甘油混合，搅拌分散至糊状液；
（2）将金雀花有效成分（3-羟基-4,9-二甲氧基紫檀素、卡拉加素A、卡拉加素C）、酸酐化牛β-乳球蛋白与纯水搅拌均匀，得到的液体在搅拌条件下加入步骤（1）的糊状液，搅拌均匀，然后加入三乙醇胺，分散均匀即得所述抗HPV凝胶。
实施例6：
本实施例提供了一种抗HPV凝胶，其制备原料为：
Figure DEST_PATH_IMAGE009
。
其中，紫檀素类化合物/卡拉加素类化合物=1/4；
4,9-二羟基-3-甲氧基紫檀素/美迪紫檀苷/高丽槐树葡萄糖苷=3.5/2.3/1.4。
其制备方法具体包括以下步骤：
（1）按照配比取卡波姆和甘油混合，搅拌分散至糊状液；
（2）将金雀花有效成分（4,9-二羟基-3-甲氧基紫檀素、美迪紫檀苷、高丽槐树葡萄糖苷、卡拉加素A）、酸酐化牛β-乳球蛋白与纯水搅拌均匀，得到的液体在搅拌条件下加入步骤（1）的糊状液，搅拌均匀，然后加入三乙醇胺，分散均匀即得所述抗HPV凝胶。
实施例7：
本实施例提供了一种抗HPV凝胶，其制备原料为：
Figure DEST_PATH_IMAGE010
。
其中，紫檀素类化合物/卡拉加素类化合物=1/2；
3-羟基-4,9-二甲氧基紫檀素/4,9-二羟基-3-甲氧基紫檀素/美迪紫檀苷/高丽槐树葡萄糖苷/3-甲氧基-8,9-二氧亚甲基紫檀素=1/1/1/0.6/0.5。
卡拉加素A/卡拉加素C=1/5。
其余制备方法同实施例4。
实施例8：
本实施例提供了一种抗HPV凝胶，其制备原料为：
Figure DEST_PATH_IMAGE011
。
其中，紫檀素类化合物/卡拉加素类化合物=1/0.1；
3-羟基-4,9-二甲氧基紫檀素/4,9-二羟基-3-甲氧基紫檀素/美迪紫檀苷/高丽槐树葡萄糖苷/3-甲氧基-8,9-二氧亚甲基紫檀素=5/6/3.6/2.4/1.8。
其制备方法具体包括以下步骤：
（1）按照配比取卡波姆和甘油混合，搅拌分散至糊状液；
（2）将金雀花有效成分（3-羟基-4,9-二甲氧基紫檀素、4,9-二羟基-3-甲氧基紫檀素、美迪紫檀苷、高丽槐树葡萄糖苷、3-甲氧基-8,9-二氧亚甲基紫檀素、卡拉加素C）、酸酐化牛β-乳球蛋白与纯水搅拌均匀，得到的液体在搅拌条件下加入步骤（1）的糊状液，搅拌均匀，然后加入三乙醇胺，分散均匀即得所述抗HPV凝胶。
对比例1：
本对比例提供了一种抗HPV凝胶，其与实施例1的区别在于，金雀花提取物的质量为0.3g，酸酐化牛β-乳球蛋白的质量为0.2g。
对比例2：
本对比例提供了一种抗HPV凝胶，其与实施例1的区别在于，金雀花提取物的质量为2g，酸酐化牛β-乳球蛋白的质量为1g。
三、本发明的抗HPV凝胶的体外细胞毒性
1、参照标准：GB/T16886.5-2017/ISO 10993-5:2009《医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验》。
2、供试品和对照品制备
（1）供试品制备：取本发明制备的抗HPV凝胶1g，充入10mL浸提介质，置二氧化碳培养箱37±1℃浸提24小时制备样品浸提液，取浸提液按1:2比例稀释液进行试验。
（2）空白对照样品制备：同批浸提介质，置于二氧化碳培养箱37±1℃浸提24小时，制备空白对照液。
（3）阴性对照品制备：取高密度聚乙烯树脂（批号P25141125，生产单位：山东优索化工科技有限公司），用超纯水洗净，121℃灭菌30min后，按0.2g/mL的比例加入同批浸提介质，置于二氧化碳培养箱37±1℃浸提24小时，制备阴性对照液。
（4）阳性对照品制备：取二甲基亚砜（批号20201202，生产单位：国药集团化学试剂有限公司)，过滤除菌后，取0.5mL，加入9.5mL浸提介质，置于二氧化碳培养箱37±1℃浸提24小时，制备阳性对照液。
3、试验方法
取已培养72h的生长旺盛的L929细胞，用0.25%胰蛋白酶溶液消化后加入细胞培养基RPMI-1640，吹打混匀后在显微镜下计数，将细胞悬液配制成密度1×105/mL。吸2 mL细胞悬液注入培养皿内，置二氧化碳培养箱37±1℃培养至近汇合单层细胞形成。
弃去原培养液，空白对按照组、阴性对照组、阳性对照组、供试品组加入各自样品溶液，各吸2 mL注入培养皿内，置二氧化碳培养箱37±1℃培养24小时。
4、试验结果
培养结束后，于显微镜下观察细胞变化，当细胞毒性分级大于2级时被认为有细胞毒性作用，结果见下表1。
表 1
Figure DEST_PATH_IMAGE013
由上表1的结果可知，本发明的抗HPV凝胶的细胞毒性分级为2级，反应程度为轻度，不具备细胞毒性作用。
四、本发明的抗HPV凝胶的临床抗HPV效果
1、试验对象
纳入标准：①年龄大于或等于18岁，有性生活史的女性；②近3个月未接受妇科相关治疗；③高危型HPV16和（或）18型感染阳性（采用HC2方法检测，测量值大于1.0为阳性）。
排除标准：①既往有宫颈癌及癌前病变；②孕妇及哺乳期妇女；③有相关药物过敏史；④有免疫系统疾病或严重心脏、肝、肾功能不全。
2、试验方法
将纳入患者随机分为观察组1～10（分别为实施例1～8以及对比例1、2制备的抗HPV凝胶治疗组）及对照组（保妇康栓治疗组），每组各50例。观察组平均年龄为（32.35±4.12）岁，分娩次数平均( 2.16±1.12) 次，体重指数（BMI）平均( 25.98±3.26)kg/m2。对照组年龄平均（33.01±5.31）岁，分娩次数（2.23±1.34）次，体重指数（BMI）平均（26.30±2.99）kg/m2。两组患者的平均年龄、分娩次数、BMI 数据比较，差异无统计学意义( P＞0.05) 。观察组的患者每天晚上用温开水清洗阴道后，取实施例1～9以及对比例1、2制备的凝胶2～4g进行阴道给药。
3、疗效比较方法
治疗后分别于1个月、半年对不同组患者进行HPV16、18 亚型感染的检查。
疗效标准：痊愈：HC2法测量值小于1.0；无效：HC2法测量值小于1.0。有效率=痊愈例数/总例数×100%。
4、试验结果
表 2
Figure DEST_PATH_IMAGE014
注：*表示与对照组相比P＜0. 05。
由上表2的结果可知，治疗后 1 月复查，观察组1～8（实施例1～8）的患者HPV感染治疗总有效率为 80.00% ～88.00%，对照组患者总有效率为44.00%；治疗后半年复查，观察组1～8患者治疗总有效率为82.00～88.00%，对照组总有效率为52.00%。
由此可见，治疗结束后 1 个月、半年复查时与对照组相比，观察组1～8患者 HPV感染治疗疗效均高于对照组，差异均有统计学意义( P 均＜0. 05)。
其中，观察组5～8的疗效较为明显，表现优异。与实施例1相比，观察组9、10（对比例1、2）改变了金雀花提取物与酸酐化牛β-乳球蛋白的质量后，其疗效明显下降，说明该两种原料的质量配比具备特定性。
以上所述，仅是本发明较佳实施例而已，并非对本发明的技术范围作任何限制，故凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围的。

Claims (9)

1.一种金雀花有效成分在制备抗HPV凝胶上的应用，其特征在于：将金雀花中的有效成分组合制备成抗HPV凝胶，所述抗HPV凝胶的制备原料按质量百分比计包括：金雀花有效成分0.5～1.5%、酸酐化牛β-乳球蛋白0.4～0.6%、卡波姆0.5～1.5%、甘油8～12%、三乙醇胺1～2%以及纯水余量。
2.根据权利要求1所述的金雀花有效成分在制备抗HPV凝胶上的应用，其特征在于：所述金雀花有效成分为金雀花提取物。
3.根据权利要求1所述的金雀花有效成分在制备抗HPV凝胶上的应用，其特征在于：所述金雀花有效成分包括紫檀素类化合物和卡拉加素类化合物。
4.根据权利要求3所述的金雀花有效成分在制备抗HPV凝胶上的应用，其特征在于：所述紫檀素类化合物和卡拉加素类化合物的质量比为1:(0.1～10)。
5.根据权利要求3所述的金雀花有效成分在制备抗HPV凝胶上的应用，其特征在于：所述紫檀素类化合物选自3-羟基-4,9-二甲氧基紫檀素、4,9-二羟基-3-甲氧基紫檀素、美迪紫檀苷、高丽槐树葡萄糖苷以及3-甲氧基-8,9-二氧亚甲基紫檀素中的一种或者几种。
6.根据权利要求3所述的金雀花有效成分在制备抗HPV凝胶上的应用，其特征在于：所述卡拉加素类化合物选自卡拉加素A和卡拉加素C中的一种或者两种。
7.根据权利要求5所述的金雀花有效成分在制备抗HPV凝胶上的应用，其特征在于：所述3-羟基-4,9-二甲氧基紫檀素、4,9-二羟基-3-甲氧基紫檀素、美迪紫檀苷、高丽槐树葡萄糖苷以及3-甲氧基-8,9-二氧亚甲基紫檀素在凝胶中的质量比为(1～5):（1～6):(1～3.6):(0.6～2.4):(0.5～1.8)。
8.根据权利要求6所述的金雀花有效成分在制备抗HPV凝胶上的应用，其特征在于：所述卡拉加素A和卡拉加素C在凝胶中的质量比为1:(0.2～5)。
9.一种根据权利要求1～8任一项所述的抗HPV凝胶的制备方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
（1）按照配比取卡波姆和甘油混合，搅拌分散至糊状液；
（2）将金雀花有效成分、酸酐化牛β-乳球蛋白与纯水搅拌均匀，得到的液体在搅拌条件下加入步骤（1）的糊状液，搅拌均匀，然后加入三乙醇胺，分散均匀即得所述抗HPV凝胶。
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