CN115066253A - Il2突变蛋白 - Google Patents
Il2突变蛋白 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115066253A CN115066253A CN202180009469.XA CN202180009469A CN115066253A CN 115066253 A CN115066253 A CN 115066253A CN 202180009469 A CN202180009469 A CN 202180009469A CN 115066253 A CN115066253 A CN 115066253A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- wild type
- polypeptide
- mutein
- cells
- wild
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/20—Interleukins [IL]
- A61K38/2013—IL-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/55—IL-2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
本发明涉及IL2突变蛋白及其在治疗人疾病中的用途。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年1月14日提交的第62/960,847号美国临时申请的优先权,并通过引用全文纳入本文用于所有目的。
关于政府资金的声明
在构思本公开的主题或将其付诸实施时,没有使用美国政府的资金。
背景技术
白细胞介素2(IL-2)是一种主要由活化的CD4+ T细胞产生的多能性细胞因子,其参与产生正常的免疫反应。IL-2对免疫系统产生广泛的影响,在调节免疫激活、抑制和内稳态方面发挥重要作用。IL-2促进激活的T淋巴细胞的增殖和扩增,增强B细胞的生长,并激活单核细胞和自然杀伤细胞。人IL-2(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列可在Genbank中找到,登录号定位为NP_000577.2。
作为免疫系统刺激剂,IL-2已被用于治疗癌症和慢性病毒感染。然而,IL-2的作用也与调解自身免疫和移植排斥有关。IL2治疗,特别是高剂量的IL2治疗,与人对象的显著毒性有关。因此,治疗目标是保持IL2的理想作用,同时尽量最小化相关的自身免疫或免疫抑制反应。由于其在免疫调节和疾病中的作用,寻找新的IL-2类似物和变体仍然是一个活跃的研究领域。
IL-2通过与三种不同的细胞表面蛋白相互作用在哺乳动物免疫细胞上发挥作用:(1)CD25(也称为IL2受体α、IL-2Rα、p55),CD122(也称为白细胞介素-2受体β、IL2Rβ、IL15Rβ和p70-75)和CD132(也称为白细胞介素2受体γ、IL-2Rγ;或共有γ链,由其为该家族中其他多聚体受体的组分)。
CD25是55kD的多肽,其在Treg细胞中组成型表达,并在其他T细胞上诱导型表达,以反应(例如,被CD3)激活。hIL-2结合至hCD25的Kd约为10-8M。CD25在文献中也被称为"低亲和力"的IL-2受体。人CD25表达为272个氨基酸的前蛋白,其包括21个氨基酸的信号序列,翻译后被去除,以形成251个氨基酸的成熟蛋白。氨基酸22-240(成熟蛋白的氨基酸1-219)对应于胞外结构域。氨基酸241-259(成熟蛋白的氨基酸220-238)对应于跨膜结构域。氨基酸260-272(成熟蛋白的氨基酸239-251)对应于胞内结构域。CD25的胞内结构域相对较小(13个氨基酸),并且没有与任何独立的信号转导活性相关。尚未观察到IL2/CD25复合物产生可检测的胞内信号转导反应。人CD25的核酸和蛋白质序列可分别在Genbank登录号NM__000417和NP_0004Q8中找到。
CD122是单通道I型跨膜蛋白。人CD122(hCD122)表达为551个氨基酸的蛋白质,前26个氨基酸包括信号序列,其在成熟的525个氨基酸的蛋白质中翻译后被裂解。氨基酸27-240(成熟蛋白的氨基酸1-214)对应于胞外结构域,氨基酸241-265(成熟蛋白的氨基酸225-239)对应于跨膜结构域,氨基酸266-551(成熟蛋白的氨基酸240-525)对应于胞内结构域。如本文所用,术语CD122包括CD122蛋白的天然存在的变体,其包括S57F和D365E(根据成熟的hCD122蛋白的编号)。hCD122在UniProtKB数据库中被引为条目P14784。人CD122的核酸和蛋白质序列可分别在Genbank登录号NM_000878和NP_000869中找到。
CD132是1型细胞因子受体,被IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21的受体复合物共有,因此被称为“共有”γ链。人CD132(hCD132)表达为369个氨基酸的前蛋白,包括22个氨基酸的N-末端信号序列。氨基酸23-262(成熟蛋白的氨基酸1-240)对应于细胞外结构域,氨基酸263-283(成熟蛋白的氨基酸241-262)对应于21个氨基酸的跨膜结构域,氨基酸284-369(成熟蛋白的氨基酸262-347)对应于胞内结构域。hCD132在UniProtKB数据库中被引为条目P31785。人CD132的核酸和蛋白质序列可分别在Genbank登录号NM_000206和NP_000197中找到。
IL2受体蛋白组合以产生两个其他IL-2受体复合物:(a)“中等亲和力”IL2受体,其包括CD122和CD132(也称为IL2Rβγ)和(b)“高亲和力”IL2受体复合物,其包括CD25、CD122和CD132蛋白(也称为IL2Rαβγ”)。hIL-2对于中等亲和力的CD122/CD132(IL2βγ)受体复合物的Kd约为10e-9M。中等亲和力的CD122/CD132(IL2βγ)受体复合物主要在静息的T细胞和NK细胞上表达。hIL-2对于高IL-2亲和力受体复合物的Kd约为10e-11M。大多数细胞,例如静息的T细胞,对IL-2的反应性很低,因为它们只表达CD122和CD132,相对于CD25/CD122/CD132高亲和力受体复合物,其对IL-2的亲和力相对较低。高亲和力受体复合物主要在诱导型表达CD25的激活的淋巴细胞和组成型表达CD25的Treg细胞上被鉴定。
鉴于IL2分子的多能性作用,及其被证明有能力调节与人疾病相关的多种细胞类型的活性,保留了天然分子的某些所需特征同时根据治疗场景将不需要的特征最小化的IL-2突变蛋白将能够用于治疗人的疾病。
Garcia等(国际申请号PCT/2018/062122,2019年5月31日公开的PCT国际公开号WO2019/104092 A1,以下称为“Garcia‘092”)描述了某些具有包括第18、22和126位的修饰的IL2突变蛋白,此外,其表现出对CD132的结合减弱,同时保留部分IL2活性。
本发明提供了具有IL-2部分激动剂和拮抗剂功能的IL-2突变蛋白。
发明内容
本发明提供了治疗和/或预防炎症性、感染性或自身免疫性疾病、紊乱或病症的方法和组合物,其通过给予治疗有效量的人IL-2突变蛋白,该IL-2突变蛋白对CD132的结合亲和力减少,而保留了与野生型人IL-2的活性相当的对CD122和/或CD25的显著的结合亲和力。
在一些实施方式中,本发明提供治疗和/或预防炎症性、感染性或自身免疫性疾病、紊乱或病症的方法和组合物,其通过给予治疗有效量的人IL-2突变蛋白且给予补充剂(supplementary agent)与之组合,该IL-2突变蛋白对CD132的结合亲和力减少,而保留了与野生型人IL-2功能的活性相当的对CD122和/或CD25的显著的结合亲和力,所述补充剂包括但不限于化疗、免疫检查点调节剂、放疗和/或物理干预治疗(如手术)中的一个或多个。
在一些实施方式中,本发明提供了治疗和/或预防炎症性、感染性或自身免疫性疾病、紊乱或病症的方法和组合物,其通过给予治疗有效量的人IL-2突变蛋白,该IL-2突变蛋白对CD132的结合亲和力减少,而保留了与野生型人IL-2功能的活性相当的对CD122和/或CD25的显著的结合亲和力,其中所述IL2突变蛋白的血清浓度以达到或高于足以促进与此类IL2突变蛋白相关联的CD3激活的原代T细胞增殖的IL2突变蛋白有效浓度但处于或低于足以诱导与此类IL2突变蛋白相关联的T细胞活化的IL2突变蛋白有效浓度的水平维持一段时间。
在一些实施方式中,本发明提供了人白细胞介素-2(IL-2)突变蛋白,其提供了对一种或多种IL2受体的修饰的结合特性,用于治疗炎症性、感染性或自身免疫性疾病、紊乱或病症。在一些实施方式中,IL-2突变蛋白对hCD132的胞外结构域的结合亲和力下降。
在一些实施方式中,IL-2突变蛋白对hCD132的胞外结构域的结合亲和力下降,同时保留对hCD25/hCD122受体复合物的显著结合和/或hCD25/hCD122/hCD132受体复合物的激活。
在一些实施方式中,IL-2突变蛋白对CD132的结合亲和力减少,同时保留对hCD25的基本结合亲和力。
在一方面,本发明提供hIL-2突变蛋白,与野生型人IL-2(hIL-2)相比,其表现出对hCD25显著或增强的结合亲和力,和对hCD132受体胞外结构域降低的结合亲和力。在一些实施方式中,IL-2突变蛋白包括一个或多个氨基酸取代,这降低了CD132受体结合亲和力,所述取代选自第18、22和126位氨基酸,根据成熟野生型hIL-2编号。
另一方面,本发明提供了一种多肽,其包括式的氨基酸序列:
(AA1)a–(AA2)b-(AA3)c-(AA4)d-(AA5)e-(AA6)f-(AA7)g-(AA8)h-(AA9)i-T10-Q11-L12-Q13-L14-E15-H16-L17-(AA18)-L19-D20-L21-(AA22)-M23-I24-L25-N26-G27-I28-N29-N30-Y31-K32-N33-P34-(AA35)-L36-T37-(AA38)-(A A39)-L40-T41-F42-K43-F44-Y45-M46-P47-K48-K49-A50-T51-E52-L53-K54-(AA55)-L56-Q57-C58-L59-E60-E61-E62-L63-K64-P65-L66-E67-E68-(AA69)-L70-N71-L72-A73-(AA74)-S75-K76-N77-F78-H79-(AA80-(AA81)-P82-R83-D84-(AA85)-(AA86)-S87-N88-(AA89)-N90-(AA91)-(AA92)-V93-L94-E95-L96-(AA97)-G98-S99-E100-T101-T102-F103-(AA104)-C105-E106-Y107-A108-(AA109)-E110-T111-A112-(AA113)-I114-V115-E116-F117-L118-N119-R120-W121-I122-T123-F124-(AA125)-(AA126)-S127-I128-I129-(AA130)-T131-L132-T133
其中:
·a、b、c、d、e、f、g、h和i各自单独地选自0或1;
·AA1是A(野生型、a=1)或缺失(a=0);
·AA2是P(野生型、b=1)或缺失(b=0);
·AA3是T(野生型、c=1)、C、A、G、Q、E、N、D、R、K、P或缺失(c=0);
·AA4是S(野生型、d=1)或缺失(d=0);
·AA5是S(野生型、e=1)或缺失(e=0);
·AA6是S(野生型、f=1)或缺失(f=0);
·AA7是T(野生型、g=1)或缺失(g=0);
·AA8是K(野生型、h=1)或缺失(h=0);
·AA9是K(野生型、i=1)或缺失(i=0);
·AA18是L(野生型)或R、L、G、M、F、E、H、W、K、Q、S、V、I、Y、H、D或T;
·AA22是Q(野生型)或F、E、G、A、L、M、F、W、K、S、V、I、Y、H、R、N、D、T或F;
·AA35是K(野生型)或E;
·AA38是R(野生型)、W或G;
·AA39是M(野生型)、L或V;
·AA55是H(野生型)或Y;
·AA69是V(野生型)或A;
·AA74是Q(野生型)、P、N、H、S;
·AA80是L(野生型)、F或V;
·AA81是R(野生型)、I、D或T;
·AA85是L(野生型)或V;
·AA86是I(野生型)或V;
·AA89是I(野生型)或V;
·AA92是I(野生型)或F;
·AA97是K(野生型)或Q;
·AA104是M(野生型)或A;
·AA109是D(野生型)、C或具有激活的侧链的非天然氨基酸;
·AA113是T(野生型)或N;
·AA125是C(野生型)、A或S;
·AA126是Q(野生型)或H、M、K、C、D、E、G、I、R、S或T;和
·AA130是S(野生型)、T、G或R;和
前提是如果AA18是R且AA22是E,则AA126不是H、M、K、C、D、E、G、I、R、S或T。
在本方面的一些实施方式中,
·AA18选自下组:L(野生型)或R、L、G、M、F、E、H、W、K、Q、S、V、I、Y、H、D或T;
·AA22选自下组:Q(野生型)或F、E、G、A、L、M、F、W、K、S、V、I、Y、H、R、N、D、T或F;和
·AA126选自下组:Q(野生型)或H、M、K、C、D、E、G、I、R、S或T。
在一些实施方式中,该多肽包括选自下组的一组突变:L18R、Q22E和Q126M;L18R、Q22E Q126T;L18R;Q22E;Q126H;L18R和Q126H;Q22E和Q126H;L18G、Q22E和Q126H;L18A、Q22E和Q126H;L18M、Q22E和Q126H;L18F、Q22E和Q126H;L18W、Q22E和Q126H;L18K,Q22E和Q126H;L18Q、Q22E和Q126H;L18E、Q22E和Q126H;L18S、Q22E和Q126H;L18V、Q22E和Q126H;L18I、Q22E和Q126H;L18Y、Q22E和Q126H;L18H、Q22E和Q126H;L18N、Q22E和Q126H;L18D、Q22E和Q126H;L18T、Q22E和Q126H;L18R、Q22G和Q126H;L18R、Q22A和Q126H;L18R、Q22L和Q126H;L18R、Q22M和Q126H;L18R、Q22F和Q126H;L18R、Q22W和Q126H;L18R、Q22K和Q126H;L18R、Q22S和Q126H;L18R、Q22V和Q126H;L18R、Q22I和Q126H;L18R Q22Y和Q126H;L18R Q22H和Q126H;L18R Q22R和Q126H;L18R Q22N和Q126H;L18R Q22D和Q126H;和L18R Q22T和Q126H。
在一些实施方式中,该多肽是PEG化的。在一些实施方式中,多肽是PEG化的且所述PEG化多肽的PEG组分的分子量为约10kD至约70kD。
在一些实施方式中,多肽是融合蛋白。在某些实施方式中,融合蛋白包含Fc结构域。
另一方面,本发明提供了编码本文所述的多肽的核酸。在一些实施方式中,核酸是DNA。
另一方面,本发明提供了重组表达载体,其包含本文所述的核酸。在一些实施方式中,载体是病毒载体。在某些实施方式中,载体是非病毒载体。
另一方面,本发明提供了用本文所述载体转化的宿主细胞。
另一方面,本发明提供药物制剂,其包括本文所述的多肽、核酸或载体。
另一方面,本发明提供一种治疗患有自身免疫或炎性疾病、紊乱或病症或病毒感染的哺乳动物对象的方法,所述方法包括给予治疗有效量的本文所述药物制剂。
在一些实施方式中,该方法进一步包括给予一种或多种选自下组的补充试剂:类固醇、Janus激酶抑制剂、钙调磷酸酶抑制剂、mTor抑制剂、IMDH抑制剂、生物制剂、疫苗和治疗抗体。在某些实施方式中,治疗抗体是结合选自下组的蛋白质的抗体:BLyS、CD11a、CD20、CD25、CD3、CD52,IgEIL-12/IL-23、IL-17a、IL-1β、IL-4Rα、IL-5、IL-6R、整合素-α4β7、RANKL、TNFα、VEGF-A和VLA-4。
在一些实施方式中,该疾病、紊乱或病症选自:病毒感染、幽门螺杆菌感染、HTLV、器官排斥、移植物抗宿主病、自身免疫性甲状腺疾病、多发性硬化症、过敏、哮喘、神经退行性疾病,例如阿尔茨海默病、系统性红斑狼疮(SLE)、自体炎症疾病、炎性肠病(IBD)、克罗恩病、糖尿病、软骨炎、关节炎、类风湿性关节炎、幼年关节炎、幼年类风湿性关节炎、幼年类风湿性关节炎、多关节型幼年类风湿性关节炎、幼年类风湿性关节炎全身发作、幼年强直性脊柱炎、幼年肠病性关节炎、幼年反应性关节炎、幼年瑞特氏综合征、SEA综合征、幼年皮肌炎、幼年银屑病关节炎、幼年硬皮病、幼年系统性红斑狼疮、幼年血管炎、少关节型类风湿性关节炎、多关节型类风湿性关节炎、类风湿性关节炎全身发作、强直性脊柱炎、肠病性关节炎、反应性关节炎、瑞特氏综合征、SEA综合征、银屑病、银屑病关节炎、皮炎(湿疹)、剥脱性皮炎或特应性皮炎、毛发红糠疹、酒渣鼻糠疹、类银屑病、苔癣样糠疹、扁平苔藓、光泽苔藓、鱼鳞病样皮肤病、皮肤角化病、皮肤病、斑秃、坏疽性脓皮病、白癜风、类天疱疮、荨麻疹、角化病、类风湿性关节炎;脂溢性皮炎、日光性皮炎;脂溢性角化病、老年性角化病、光化性角化病、光诱导性角化病、毛囊角化病;寻常痤疮;瘢痕瘤;痣;疣,包括疣、湿疣或尖锐湿疣,以及人乳头状瘤病毒(HPV)感染。
附图简要说明
结合附图,通过以下详述更好地理解本发明。需要强调,按照惯例,附图的各个特征不成比例。相反,各种特征的尺寸被任意放大或者缩小以清楚显示。附图部分包括如下的附图。
图1提供了用含有指示的IL2突变蛋白(和对照)的293T转染上清处理的NKL细胞中所测pSTAT5水平的图形表示,如实施例中所述。纵轴表示根据实施例测量的IL2活性水平,各柱表示与构建体相关的特定IL2肽的活性水平,如实施例中所述,由其3字母缩写确定。
图2提供了用含有指示的IL2突变蛋白(和对照)的293T转染上清处理的CD25阳性和CD25阴性YT细胞中pSTAT5活性的比较,如实施例中所述。纵轴是选择性的测量,计算为在CD25阳性YT细胞上观察到的pSTAT5活性水平除以在CD25阴性YT细胞上测得的pSTAT5活性水平的比率,各柱表示被评估的特定IL2肽的活性水平,由其3字母缩写确定,如实施例中所述。
图3A-3F提供了与hIL2突变蛋白接触的3F8细胞的细胞增殖有关的数据,更全面地描述于说明书和实施例8中。
具体实施方式
为了使本发明更容易被理解,下文以及整个说明书中对某些术语和短语进行了定义。本文提供的定义是非限制性的,应根据本领域技术人员的知识阅读。
在描述本发明的方法和组合物之前,应理解,本发明不限于所述的方法或组合物,因为它们当然可能变化。还应理解,本文中使用的术语仅意在描述特定实施方式,并不旨在进行限制。
提供数值范围时,也应视作具体公开了该范围的上限和下限之间以下限单位十分之一为间隔的各中间数值,除非上下文另有明确说明。本发明还包括设定范围内任何设定数值或中间数值和该设定范围内任何其它设定数值或中间数值之间的较小范围。取决于设定范围内任何明确排除的限值,所述范围可独立地包含或排除这些较小范围的上下限,本发明也包括这些较小范围不包含限值、包含任一或两个限值的各范围。设定范围包含一个或两个限值时,本发明也包括排除所述限值之一个或两个的范围。
除非另有说明,本文所用的所有科技术语与本发明所属领域普通技术人员所理解的通常含义相同。虽然也可采用与本文所述类似或等同的任何方法和材料实施或测试本发明,但在此描述一些潜在和优选的方法和材料。本文提及的所有出版物均通过引用纳入本文,以公开和描述与所引用出版物相关的方法和/或材料。
应注意,本文和所附权利要求书所用的单数形式"一个"、"一种"和"所述"包括复数含义,除非上下文另有明确说明。因此,例如,提到"细胞"包括多个这样的细胞,提到"所述肽"包括本领域技术人员已知的一或多个肽及其等同物,例如多肽,等等。
提供本文讨论的出版物仅针对其在本申请提交日之前的公开。本文中所有内容均不应解释为承认本发明不能凭借在先发明而先于这些出版物。此外,所提供的出版日期可能与实际公开日期不同,这可能需要单独确认。
除非另有说明,份数是重量份数,分子量是重均分子量,温度是摄氏度(℃),压力是大气压或接近大气压。使用标准缩写,包括下述:bp=碱基对;kb=千碱基;pl=皮升;s或sec=秒;min=分钟;h或hr=小时;AA或aa=氨基酸;kb=千碱基;nt=核苷酸;pg=皮克;ng=纳克;μg=微克;mg=毫克;g=克;kg=千克;dl或dL=分升;μl或μL=微升;ml或mL=毫升;l或L=升;μM=微摩尔;mM=毫摩尔;M=摩尔;kDa=千道尔顿;i.m.=肌肉内(经肌肉内);i.p.=腹膜内(经腹膜内);SC或SQ=皮下(经皮下);QD=每日一次;BID=每日两次;QW=每周一次;QM=每月一次;HPLC=高效液相色谱;BW=体重;U=单元;ns=无统计学显著性;PBS=磷酸盐缓冲盐水;PCR=聚合酶链式反应;;HSA=人血清白蛋白;MSA=小鼠血清白蛋白;DMEM=达氏改良伊氏培养基;;EDTA=乙二胺四乙酸。
应理解,在本公开内容中,根据单字母或三字母代码提及氨基酸。为了方便阅读者,单字母和三字母氨基酸代码在下表1中提供:
科学文献中描述了分子生物学的标准方法(参见,例如,Sambrook和Russell(2001)《分子克隆》(Molecular Cloning),第3版,冷泉港实验室出版社(Cold SpringHarbor Laboratory Press),纽约冷泉港;和Ausubel,等(2001)《新编分子生物学指南》(Current Protocols in Molecular Biology),卷1-4,约翰威利父子公司(John Wileyand Sons,Inc.)纽约州纽约,其描述了在细菌细胞中克隆和DNA定点诱变(卷1)、哺乳动物细胞中和酵母中的克隆(卷2)、糖偶联物和蛋白质表达(卷3),以及生物信息学(卷4))。科学文献描述了用于蛋白质纯化的方法,包括免疫沉淀、层析、电泳、离心和结晶,以及化学分析、化学修饰、翻译后修饰、融合蛋白的生产和蛋白糖基化(参见,例如,Coligan,等(2000)《新编蛋白质科学方案》(Current Protocols in Protein Science),卷.1-2,约翰威利父子公司(John Wiley and Sons,Inc.),纽约州)。
除非另有说明,下述术语意在具有如下含义。在整个说明书中定义了其他术语。
定义:
激活:本文所用术语“激活”用于指受体或受体复合物以反映激动剂配体与受体结合的生物学效应。激活剂是指增加、激活、促进、增强激活、敏化或上调的分子,例如,基因、蛋白质、配体、受体或细胞。例如,IL2激动剂与IL2受体(如高亲和力的CD25/CD122/CD132受体复合物)的结合“激活”受体的信号转导,以产生一种或多种胞内生物学效应(例如STAT5的磷酸化)。
活性:如本文所用术语“活性”是针对分子而言,以描述分子在测试系统或生物学功能方面的特性,例如该分子结合至另一分子的程度。这种生物学功能的例子包括但不限于生物剂的催化活性、刺激胞内信号转导的能力、基因表达、细胞增殖、调节免疫学活性(如炎症反应)的能力。“活性”通常表示为每个单元的给予试剂的生物活性,例如[催化活性]/[mg蛋白]、[免疫活性]/[mg蛋白],活性的国际单位(IU),[STAT5磷酸化]/[mg蛋白]、[T-细胞增殖]/[mg蛋白]、噬斑形成单位(plaque forming units)(pfu)等。
给药/给予:术语“给予”和“给药”在本文中可互换使用,指的是接触对象的行为,包括用试剂与对象体外、体内和/或离体的细胞、组织、器官或生物流体接触(例如,IL-2突变蛋白或其药物制剂)。药剂的给予可以通过任何多种本领域认可的方法实现,包括但不限于局部、血管内注射(包括静脉或动脉内输注)、皮内注射、皮下注射、肌内注射、腹膜内注射、颅内注射、瘤内注射、结内注射、经皮、经粘膜、离子渗透递送(iontophoreticdelivery)、淋巴管内注射、(Senti和Kundig(2009)《新编过敏和临床免疫学观点》
(Current Opinions in Allergy and Clinical Immunology)9(6):537-543),胃内输注、前列腺内注射、膀胱内输注(如:膀胱)、呼吸道吸入器(包括喷雾器)、眼内注射、腹内注射、病灶内注射、卵巢内注射、脑内输注或注射、脑室内注射(ICVI)等。术语“给予”包括试剂与细胞、组织或器官的接触,以及试剂与液体的接触,其中液体与细胞接触。术语“给予”包括细胞(或细胞群)的离体接触,可以从对象分离出该细胞(或细胞群)并与药剂接触,该细胞(或细胞群)被给予同一对象(如自体细胞转移)或不同对象(如同种异体细胞转移)。
不良事件:如本文所用,术语“不良事件”是指与在对象中使用治疗性或预防性试剂有关的任何不期望的经历。不良事件不一定是由给予治疗或预防试剂(例如IL2突变蛋白)引起的,也可能由无关的情况引起。不良事件通常被分为轻度、中度或严重。如本文所使用的不良事件的分类符合美国卫生与公众服务部、国家卫生研究院和国家癌症研究所于2017年11月27日公布的不良事件通用术语标准v5.0(CTCAE)。
亲和力:如本文所用术语“亲和力”是指第一分子(例如配体)特异性结合至第二分子(例如受体)的程度,并通过以Kd表示的结合动力学衡量,其为分子与其靶标之间的解离常数(Koff)和分子与其靶标之间的缔合常数(Kon)的比率。
激动剂:如本文所用,术语“激动剂”是指特异性结合至第二分子(“靶标”)并与靶标相互作用以引起或促进靶标激活的增加的试剂。激动剂是调节细胞激活、增强激活、使细胞对第二试剂的激活敏感,或上调的激活剂,例如,基因、蛋白质、配体、受体、生物途径(包括细胞中的免疫检查点途径)或细胞增殖。在一些实施方式中,激动剂是结合至受体并改变受体状态,导致生物学反应的试剂。该反应模拟受体的内源性激活剂的效果。术语“激动剂”包括部分激动剂、完全激动剂和超级激动剂。当激动剂导致所研究的受体诱发的完全反应(即与天然存在的配体/受体结合相互作用有关的反应)时,可将这种激动剂描述为“完全激动剂”,或者,激动剂也可以被描述为部分激动剂。与激动剂相反,拮抗剂可以特异性地结合至受体,但不导致通常由受体启动的信号级联,并且可以改变激动剂在该受体上的作用。反向激动剂是指产生与激动剂方向相反的药理反应的药剂。"超级激动剂"是能够产生大于靶受体的内源性激动剂的最大反应的激动剂,因此具有超过100%的效力。在比较试验中以类似的浓度评估时,本发明的IL2超级激动剂可以具有WHO国际标准(NIBSC编码:86/500)的野生型成熟人IL2的活性的大于110%、或者大于120%、或者大于130%、或者大于140%、或者大于150%、或者大于160%、或者大于170%的活性。
拮抗剂:如本文所用,术语“拮抗剂”或“抑制剂”是指与激动剂一种或多种作用相对的分子。拮抗剂可以防止、减少、抑制或中和激动剂的活性,而且拮抗剂也可以防止、抑制或减少靶标(如靶受体)的组成型活性,即使没有鉴定的激动剂。抑制剂是减少、阻断、防止、延迟激活、失活、脱敏或下调的分子,例如,基因、蛋白质、配体、受体、生物学通路或细胞。
抗体:如本文所用,术语“抗体”统称指:(a)糖基化的和非糖基化的免疫球蛋白(包括但不限于哺乳动物免疫球蛋白类别IgG1、IgG2、IgG3和IgG4),它们特异性结合至靶分子,和(b)免疫球蛋白衍生物,其包括但不限于IgG(1-4)ΔCH2、F(ab’)2、Fab、ScFv、VH、VL、四抗、三抗、双抗、dsFv、F(ab’)3、scFv-Fc和(scFv)2,它们与其来源的免疫球蛋白竞争结合至靶分子。术语抗体不限于来自任何特定哺乳动物物种(包括小鼠、人、马、骆驼)的免疫球蛋白、抗体、人抗体。术语抗体包括所谓的“重链抗体”或“VHH”或 通常获取自骆驼科(包括骆驼、美洲驼和羊驼)的免疫(参见,例如Hamers-Casterman,等(1993)Nature 363:446-448)。具有给定特异性的抗体也可以来源于非哺乳动物来源,例如从软骨鱼(包但不限于鲨鱼)的免疫中获得的VHH。术语“抗体”包括可从天然来源或用抗原免疫后从动物身上分离的抗体,以及工程改造抗体,包括单克隆抗体、双特异性抗体、三特异性、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、CDR移植的、饰面(veneered)的或去免疫化的(例如,去除T细胞表位)抗体。术语“人抗体”包括从人获得的抗体,以及从包含人免疫球蛋白基因的转基因哺乳动物中获得的抗体,使得,在抗原刺激后,转基因动物产生包含人产生的抗体的氨基酸序列特征的抗体。该术语包括亲本抗体及其衍生物,如亲和成熟的、饰面的、CDR移植的(包括CDR移植的VHH)、人源化的、骆驼源化的(在非骆驼衍生的VHH的情况下),或非免疫球蛋白支架中包的抗体的结合结构域(如CDR)的结合分子。术语"抗体"不限于任何特定的合成方式,包括可从天然来源分离的天然存在的抗体,以及通过"重组"手段制备的工程改造抗体分子,所述工程改造的抗体分子包括从转人免疫球蛋白基因的转基因动物或由其制备的杂交瘤分离的抗体,从转化了导致抗体表达的核酸构建体的宿主细胞中分离出的抗体,从组合抗体文库(包括噬菌体展示文库)中分离出的或化学合成(例如固相蛋白合成)的抗体。在一个实施方式中,“抗体”是哺乳动物的免疫球蛋白。在一些实施方式中,该抗体是“全长抗体”,其包括提供结合和效应功能的可变和恒定结构域。在大多数情况下,全长抗体包括两条轻链和两条重链,各轻链包括可变区和恒定区。在一些实施方式中,术语“全长抗体”用于指传统的IgG免疫球蛋白结构,包括两条轻链和两条重链,各轻链包括提供结合和效应功能的可变区和恒定区。术语抗体包括抗体偶联物,其包括为延长作用时间而进行的修饰,例如融合蛋白或与偶联至聚合物(如PEG化的),在下文更详细地描述。
生物样品:如本文所用术语“生物样品”或“样品”表示获自或源自对象的样品。举例而言,生物样品包括选自下组的材料:体液、血液、全血、血浆、血清、粘液分泌物、唾液、脑脊液(CSF)、支气管肺泡灌洗液(BALF)、眼液(如玻璃体液、房水)、淋巴液、淋巴结组织、脾脏组织、骨髓,以及来自这些组织中一个或多个组织的免疫球蛋白富集部分。在一些实施方式中,样品获取自已经暴露于包括IL2突变蛋白的药物制剂的治疗方案的对象,例如重复暴露于同一IL2突变蛋白。在其他实施方式中,样本获取自最近没有暴露于IL2突变蛋白的对象,或在计划给予IL2突变蛋白之前从对象处获得。
“CAR”或“嵌合抗原受体”:如本文所用,术语“嵌合抗原受体”和“CAR”可互换使用,指的是包含多个功能结构域的嵌合多肽,其从氨基端到羧基端的序列依次排列为:(a)包含抗原结合结构域(ABD)的胞外结构域(ECD)和“铰链”结构域;(b)跨膜结构域(TD);和(c)一个或多个胞质信号转导结构域(CSD),其中上述结构域可以任选地由一个或多个间隔子结构域连接。CAR还可进一步包括信号肽序列,其通常在翻译后处理过程中被去除,并在用包含编码CAR的核酸序列的表达载体转化的细胞表面呈递CAR。CAR可以按照本领域众所周知的原理制备。参见,例如,Eshhaar等,美国专利号7,741,465 B1,2010年6月22日授权;Sadelain,等(2013)Cancer Discovery 3(4):388-398;Campana和Imai(美国专利号8,399,645,2013年3月19日授权)Jensen和Riddell(2015)《新编免疫学观点》(Current Opinionsin Immunology)33:9-15;Gross,等(1989)PNAS(USA)86(24):10024-10028;Curran,等(2012)J Gene Med 14(6):405-15;Brogdon,等(美国专利10.174,095,2019年1月8日授权)Guedan,等(2019)嵌合抗原受体的工程改造和设计(Engineering and Design ofChimeric Antigen Receptors)(2019)Molecular Therapy:Methods&ClinicalDevelopment第12卷:145-156。
CAR-T细胞:如本文所用,术语“嵌合抗原受体T-细胞”和“CAR-T细胞”可互换使用,指的是经过重组修饰以表达嵌合抗原受体的T细胞。市售可得CAR-T细胞产品的例子包括阿基伦赛(axicabtagene ciloleucel)(从吉利德制药公司(Gilead Pharmaceuticals)以名称市售可得)和替沙伦赛(tisagenlecleucel)(从诺华(Novartis)以名称市售可得)。
CD25:如本文所用,术语“CD25”、“IL2受体α”、“IL-2Rα”、“IL2Ra”和“p55”可互换使用指55kD的多肽,其在Treg细胞中组成型表达,并在其他T细胞上诱导型表达,以反应(例如,被CD3CD25,其在文献中也被称为"低亲和力"的IL-2受体)激活。人CD25的核酸和蛋白序列可分别在Genbank登录号NM__000417和NP_0004Q8中找到。人CD25表达为272个氨基酸的前蛋白,其包含21个氨基酸的信号序列,信号序列在翻译后被去除,以产生251个氨基酸的成熟蛋白质。氨基酸22-240(成熟蛋白的氨基酸1-219)对应于胞外结构域。氨基酸241-259(成熟蛋白的氨基酸220-238)对应于跨膜结构域。氨基酸260-272(成熟蛋白的氨基酸239-251)对应于胞内结构域。hCD25的成熟形式的氨基酸序列为:
ELCDDDPPEIPHATFKAMAYKEGTMLNCECKRGFRRIKSGSLYMLC
TGNSSHSSWDNQCQ
CTSSATRNTTKQVTPQPEEQKERKTTEMQSPMQPVDQASLPGHCRE
PPPWENEATERIYH
FVVGQMVYYQCVQGYRALHRGPAESVCKMTHGKTRWTQPQLICT
GEMETSQFPGEEKPQA
SPEGRPESETSCLVTTTDFQIQTEMAATMETSIFTTEYQVAVAGCVF
LLISVLLLSGLTW
QRRQRKSRRTI
(SEQ ID NO:.1)
CD122:如本文所用,术语“CD122”、“白细胞介素-2受体β”、“IL2Rb”、“IL2Rβ”、“IL15Rβ”和“p70-75”可互换使用,指人CD122跨膜蛋白。人CD122(hCD122)表达为551个氨基酸的蛋白质,前26个氨基酸包括信号序列,其在成熟的525个氨基酸的蛋白质中翻译后被裂解。氨基酸27-240(成熟蛋白的氨基酸1-214)对应于胞外结构域,氨基酸241-265(成熟蛋白的氨基酸225-239)对应于跨膜结构域,氨基酸266-551(成熟蛋白的氨基酸240-525)对应于胞内结构域。如本文所用,术语CD122包括CD122蛋白的天然存在的变体,其包括S57F和D365E(按照成熟的hCD122蛋白的编号)。hCD122在UniProtKB数据库中被引为条目P14784。人CD122的核酸和蛋白序列可分别在Genbank登录号NM_000878和NP_000869中找到。成熟hCD122蛋白的氨基酸序列为:
AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRW
NQTCELLPVSQASWAC
NLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRL
MAPISLQVVHVETH
RCNISWEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTWEEAPLLTLKQKQEWI
CLETLTPDTQYEF
QVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDTIPWLGHLLVGLS
GAFGFIILVYLLIN
CRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSF
SPGGLAPEISPLE
VLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSSNHSLTSCFTNQGYFFFHLPDAL
EIEACQVYFTYDP
YSEEDPDEGVAGAPTGSSPQPLQPLSGEDDAYCTFPSRDDLLLFSPS
LLGGPSPPSTAPG
GSGAGEERMPPSLQERVPRDWDPQPLGPPTPGVPDLVDFQPPPELV
LREAGEEVPDAGPR
EGVSFPWSRPPGQGEFRALNARLPLNTDAYLSLQELQGQDPTHLV
(SEQ ID NO:2)
hCD122的胞外结构域的氨基酸序列为:
AVNGTSQFTCFYNSRANISCVWSQDGALQDTSCQVHAWPDRRRW
NQTCELLPVSQASWAC
NLILGAPDSQKLTTVDIVTLRVLCREGVRWRVMAIQDFKPFENLRL
MAPISLQVVHVETH
RCNISWEISQASHYFERHLEFEARTLSPGHTWEEAPLLTLKQKQEWI
CLETLTPDTQYEF
QVRVKPLQGEFTTWSPWSQPLAFRTKPAALGKDT
(SEQ ID NO:3)
CD132:如本文所用,术语“CD132”、“IL2受体γ”、“IL2Rg、“IL2Rγ”是1型细胞因子受体,被IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21的受体复合物共有,因此被称为“共有”γ链。人CD132(hCD132)表达为369个氨基酸的前蛋白,包括22个氨基酸的N-末端信号序列。氨基酸23-262(成熟蛋白的氨基酸1-240)对应于细胞外结构域,氨基酸263-283(成熟蛋白的氨基酸241-262)对应于21个氨基酸的跨膜结构域,氨基酸284-369(成熟蛋白的氨基酸262-347)对应于胞内结构域。hCD132在UniProtKB数据库中被引为条目P31785。人CD132的核酸和蛋白质序列可分别在Genbank登录号NM_000206和NP_000197中找到。成熟hCD132蛋白的氨基酸序列为:
LNTTILTPNGNEDTTADFFLTTMPTDSLSVSTLPLPEVQCFVFNVEY
MNCTWNSSSEPQP
TNLTLHYWYKNSDNDKVQKCSHYLFSEEITSGCQLQKKEIHLYQTF
VVQLQDPREPRRQA
TQMLKLQNLVIPWAPENLTLHKLSESQLELNWNNRFLNHCLEHLV
QYRTDWDHSWTEQSV
DYRHKFSLPSVDGQKRYTFRVRSRFNPLCGSAQHWSEWSHPIHWGS
NTSKENPFLFALEA
VVISVGSMGLIISLLCVYFWLERTMPRIPTLKNLEDLVTEYHGNFSA
WSGVSKGLAESLQ
PDYSERLCLVSEIPPKGGALGEGPGASPCNQHSPYWAPPCYTLKPET
(SEQ ID NO:4)
CDR.如本文所用,术语“CDR”或“互补决定区”意指在重链和轻链免疫球蛋白多肽二者(或在VHH的情况下,重链)的可变区内发现的非连续抗原结合位点。CDR已由Kabat等,J.Biol.Chem.252,6609-6616(1977);Kabat等,(1991)U.S.美国卫生及公共服务部,“免疫学热门蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)”(本文中也称为“Kabat1991”);Chothia等,(1987)J.Mol.Biol.196:901-917;以及MacCallum等,J.Mol.Biol.262:732-745(1996)描述,其中定义包括当彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。在本发明的上下文中,CDR位置的编号是根据Kabat编号法提供的。
相当的:如本文所用,术语“相当的”用于描述可评价的定量或定性参数的两个测量结果的差异程度。例如,当可评价的定量参数(例如通过CTLL-2增殖或磷酸化-STAT5试验确定的IL-2活性水平)的第一测量结果和该可评价参数的第二测量结果没有偏离本领域技术人员将会认为两个结果之间不会产生统计学显著性差异的范围,那么这两个测量将被视为“相当的”。在一些情况下,如果一个测量结果偏离另一个测量结果少于30%、或者少于25%、或者少于20%、或者少于15%、或者少于10%、或者少于7%、或者少于5%、或者少于4%、或者少于3%、或者少于2%或者少于1%,则测量结果可被视为“相当的”。在特定的实施方式中,如果一个测量结果偏离参考标准少于15%、或者少于10%、或者少于5%,则该测量结果与参考标准是相当的。
来源于:如本文所用术语“来源于”,在氨基酸序列或多核苷酸序列的上下文中(例如氨基酸序列“来源于”IL-2多肽)意为表示多肽或核酸具有基于参考多肽或核酸的序列(例如天然存在的IL-2多肽或编码IL-2的核酸),不意在被限制为制备蛋白质或核酸的来源或方法。举例而言,术语“来源于”包括参考氨基酸或DNA序列的同源物或变体。
富集的:本文所用的术语“富集的”是指对样品进行非天然操作,使感兴趣的分子以以下存在:(a)比分子在起始样品(如生物样品)中的浓度高(例如,至少高3倍、或者至少高5倍、或者至少高10倍、或者至少高50倍、或者至少高100倍、或者至少高1000倍);或(b)浓度高于制备该分子的环境(例如,在重组修饰的细菌或哺乳动物细胞中)。
胞外结构域:如本文所用术语“胞外结构域”或其缩写“ECD”是指细胞质膜外侧的细胞表面蛋白质部分(例如细胞表面受体)。术语“ECD”可以包括跨膜蛋白的胞质外部分或细胞表面的胞质外部分(或膜关联蛋白)。
同一性:对于多肽或DNA序列本文所用的的术语"同一性"是指两个分子之间的亚单位序列同一性。当两个分子中的亚单位位置被相同的单体亚单位(即相同的氨基酸残基或核苷酸)占据时,那么这两个分子在该位置是相同的。两个氨基酸或两个核苷酸序列之间的相似性是相同位置的量的直接函数。通常,比对序列以获得最高阶匹配。如有必要,可以用已公开的技术和广泛使用的计算机程序来计算同一性,如GCS程序包(Devereux等,Nucleic Acids Res.12:387,1984)、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul等,J.MolecularBiol.215:403,1990)。可以用序列分析软件测量序列同一性,如威斯康星大学生物技术中心(the University of Wisconsin Biotechnology Center)遗传学计算机组的序列分析软件包(1710大学大道(University Avenue),威斯康星州麦迪逊53705),使用其默认参数
IL-2:如本文所用,术语“白细胞介素-2”或"IL-2"是指具有IL-2活性的天然存在的IL-2多肽。在一些实施方式中,IL-2是指成熟的野生型人IL-2。成熟的野生型人IL-2(hIL2)是133个氨基酸的成熟多肽(减去由额外的20个N-末端氨基酸组成的信号肽),如Fujita,等,PNAS USA,80,7437-7441(1983)所述。成熟的野生型人IL-2(hIL2)的天然存在的变体的氨基酸序列是:
APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA
TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE
TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT
(SEQ ID NO:5)
如本文所用,hIL2突变蛋白的残基的编号是基于hIL2序列UniProt ID P60568,不包括与SEQ ID NO:5的相同的信号肽。
IL2活性:术语“IL2活性”是指对细胞与有效量的IL2多肽接触反应的细胞上的一个或多个生物学效应。可以测量IL2活性,例如,在细胞增殖试验中使用CTLL-2小鼠细胞毒性T细胞,基本按照Gearing,A.J.H.和C.B.Bird(1987)在《淋巴因子和干扰素:实用方法》(Lymphokines and Interferons,A Practical Approach.)Clemens,M.J.等(编):IRLPress.295中的教导。重组人IL-2(rhIL2)的比活性约为2.1x 104IU/μg,其为针对重组人IL2 WHO国际标准(NIBSC编码:86/500)校对的。IL2活性可以表示为STAT5磷酸化的水平,其可以通过本领域已知的流式细胞术方法确定(Bitar,等(2019)评估STAT5磷酸化:作为评估T细胞增殖的手段(Evaluating STAT5Phosphorylation As A Mean to Assess T CellProliferation)(2019)Frontiers In Immunology第10卷,文章722,第1-11页。
IL-2突变蛋白:如本文所用,术语"IL-2突变蛋白"是指从天然存在形式的IL2中衍生突变蛋白,其包含对IL2分子的氨基酸序列的修饰。IL-2突变蛋白特征在于天然亲本IL-2多肽链的一个或多个位点或其他残基上的氨基酸插入、缺失、取代和修饰。在一些实施方式中,本发明的IL2突变蛋白保留了CD122的结合活性,当在比较试验中以类似浓度的评估时,与WHO国际标准(NIBSC编码:86/500)野生型成熟人IL-2的活性相当。示例性的突变蛋白可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多氨基酸的取代。
足以产生变化的量:如本文所使用的短语“足以产生变化的量”是指足以使之前(如基线水平)和施用测试试剂之后测量的指标水平之间产生可检测的差异的测试试剂的量,如在基于细胞的试验中评估对给予一定量的测试试剂的反应生物学功能。“足以产生变化的量”可以是足以治疗有效的量,但“足以产生变化的量”可能多于或少于治疗有效量。
需要治疗的:本文所用术语“需要治疗的”是指医生或其他护理人员对对象作出的判断,关于对象和对象需要或将有可能从治疗中受益。这种判断是基于医生或护理人员的专业知识领域中的多种因素作出的。
需要预防的:本文所用术语“需要预防的”是指医生或其他护理人员对对象作出的判断,关于对象其对象需要或将有可能从预防护理中受益。这种判断是基于医生或护理人员的专业知识领域中的多种因素作出的。
抑制剂:如本文所用术语“抑制剂”是减少、阻断、防止、延迟激活、失活、脱敏或下调的分子,例如,基因、蛋白质、配体、受体或细胞。抑制剂也可以被定义为减少、阻断或失活细胞或生物体的组成型活性的分子。
分离的:
如本文所使用的术语“分离的”是指感兴趣的多肽,如果是天然存在的,其环境与它可能天然存在的环境不同。“分离的”意指包括在样品中的多肽,其基本上富集了感兴趣的多肽和/或感兴趣的多肽被部分或基本上纯化了。如果多肽不是天然存在的,“分离的”表示该多肽已经从其通过合成或重组手段制备的环境中分离出来。
Kabat编号:本文所用的术语"Kabat编号"是抗体工程改造领域公认的术语,指的是对免疫球蛋白的重链和轻链区域中比其他氨基酸残基更可变的氨基酸残基(例如,高变残基(hypervariable residues))进行编号的系统(Kabat,等,(1971)Ann.NYAcad.Sci.190:382-93;Kabat,等,(1991)《免疫学感兴趣的蛋白质的序列》(Sequences ofProteins of Immunological Interest),第五版,美国卫生与公共服务部,NIH出版号91-3242)。出于本公开的目的,本文所述的抗体可变区域中CDR的定位遵循Kabat编号或简称为"Kabat"。
配体:如本文所用,术语“配体”是指表现出特异性结合至受体并导致受体生物活性改变从而使其所结合的受体的活性发生改变的分子。在一个实施方式中,术语“配体”是指可以作为受体的激动剂或拮抗剂的分子或其复合物。如本文所用,术语“配体”包括天然和合成的配体。“配体”也包括小分子,例如细胞因子的肽模拟物和抗体的肽模拟物。配体和受体的复合物被称为“配体-受体复合物”。
修饰的IL-2突变蛋白:如本文所用的术语“修饰的IL-2突变蛋白”用于指包括一个或多个附加进一步修饰(即在IL2突变蛋白的核心氨基酸序列之外的修饰)的IL-2突变蛋白,例如聚乙二醇化、糖基化(N-和O-连接)、酰基化或多聚唾液酸化或通过与其他多肽运载体分子偶联(无论是化学还是融合蛋白),包括但不限于白蛋白融合多肽,其包含血清白蛋白(例如人血清白蛋白(HSA)或牛血清白蛋白(BSA)或和Fc-融合蛋白,或具有靶向部分(例如包含IL2正交多肽融合蛋白的IgG),靶向IL-2突变蛋白多肽,例如ScFv-IL2突变蛋白多肽融合蛋白和VHH-IL-2突变蛋白多肽融合蛋白。可以制备修饰的IL2突变蛋白,以增强一种或多种特性,例如,调节免疫原性;增加水溶性、生物利用度、血清半衰期和/或治疗半衰期的方法;和/或调节生物活性。某些修饰也可用于,例如,提高用于检测试验的抗体(例如,表位标签)和提供便于蛋白质纯化。在一些实施方式中,修饰的IL-2突变蛋白与SEQ ID NO:5至少95、96、97、98或99%的同一性,并具有表2中所列的相对于SEQ ID NO:5的三种修饰的组合之一。适合测定序列同一性百分数和序列相似性百分数的算法是BLAST和BLAST 2.0算法,分别描述于Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul等(1977)NucleicAcids Res.25:3389-3402。进行BLAST分析的软件可从国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)(NCBI)网站公开获得。此算法包括:首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字来鉴定高评分序列对(HSP),与数据库序列中长度相同的字比对时它们能匹配或满足一些正值的阈值评分T。T称为相邻字评分阈值(Altschul等,同上)。这些初始相邻字命中(word hit)用作启动搜索的种子,以便找到含有它们的较长HSP。然后,沿各序列在两个方向上延伸该字命中,直到提高累积的比对评分。就核苷酸序列而言,采用参数M(一对匹配残基的奖励评分;总是>0)和N(错配残基的罚分;总是<0)计算累积评分。就氨基酸序列而言,用评分矩阵计算累积评分。出现以下情况时中止字命中在各个方向上的延伸:累积比对评分比其最大获得值降低X;由于一个或多个负评分残基比对的累积,累积评分变为零或零以下;或者达到任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定该比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)采用的默认值如下:字长(W)28,期望值(E)10,M=1,N=-2,以及比较两条链。对氨基酸序列而言,BLASTP程序使用的默认值为:字长(W)为3,期望值(E)为10,BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989))。
调节:如本文所用,术语“调节”、“调制”等是指测试试剂在系统(包括生物系统或生化途径)中影响反应的能力,可以是积极或消极的,也可以是直接或间接的。
突变蛋白:如本文所用,术语“突变蛋白”是指野生型多肽的修饰形式,包括对这种多肽的一级结构(即氨基酸序列)的修饰。术语突变蛋白可以指多肽本身、包含多肽的组合物或编码其的核酸序列。在一些实施方式中,突变蛋白多肽相对于亲本多肽包括约1至约10个氨基酸修饰,或者相对于亲本的约1至约5个氨基酸修饰,或者相对于亲本的约1至约3个氨基酸修饰,或者相对于亲本的1至2个氨基酸修饰,或者相对于亲本的单一氨基酸修饰。突变蛋白可以与亲本多肽至少有约99%的同一性,或者至少约98%的同一性、或者至少约97%的同一性、或者至少约95%的同一性、或者至少约90%的同一性。
N-末端:如本文在多肽结构的上下文中使用,“N-末端”(或“氨基末端”)和“C-末端”(或“羧基末端”)分别指多肽的极氨基端和羧基端,而术语“N-末端的”和“C-末端的”分别指多肽的氨基酸序列中朝向N-末端和C-末端的相对位置,并可分别包括N-末端和C-末端残基。“近邻N-末端的”或“近邻C-末端的”是指第一氨基酸残基相对于第二氨基酸残基的位置,其中第一和第二氨基酸残基共价结合以提供连续的氨基酸序列。
核酸:术语“核酸”、“核酸分子”、“多核苷酸”等在本文中可互换使用,并且是指任何长度的核苷酸的聚合形式,即脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸,或其类似物。多核苷酸的非限制性例子包括线性和环形核酸、信使RNA(mRNA)、互补DNA(cDNA)、重组多核苷酸、载体、探针、引物等。
根据IL-2编号:如本文所用术语"根据IL-2编号"是指特定氨基酸的位置的鉴定参考在成熟野生型hIL-2的成熟序列中天然存在的氨基酸所在位置,例如R81是指在SEQ IDNO:5存在的第81位氨基酸,精氨酸。
可操作地连接:术语“可操作地连接”在本文中是指编码不同功能的核酸序列在组合成单个核酸序列时的关系,该核酸在被引入细胞时,提供能够在细胞中实现特定核酸序列的转录和/或翻译的核酸。例如,如果它被表达为参与多肽分泌的前蛋白,信号序列的DNA可操作地连接至多肽的DNA;如果它影响序列的转录,启动子或增强子可操作地连接至编码序列;或如果它被定位以促进翻译,核糖体结合位点可操作地连接至编码序列。通常,"可操作地连接"意为被连接的DNA序列是连续的,而且在分泌型前导的情况下,是连续的并且处于阅读段。然而,某些遗传元件,如增强子,不需要与它们产生作用的序列连续。
亲本多肽:如本文所用术语,“亲本多肽”,“亲本蛋白质”,“前体多肽”或“前体蛋白质”可互换使用以指随后被修饰以产生变体多肽或突变蛋白的未修饰多肽。亲本多肽可以是野生型(天然)多肽。
部分激动剂:如本文所用,术语“部分激动剂”是指特异性结合结合至并激活给定受体的分子,但相对于完全激动剂,它只具有部分激活受体。部分激动剂可以同时表现激动和拮抗作用。例如,当完全激动剂和部分激动剂同时存在时,部分激动剂作为竞争性拮抗剂,通过与完全激动剂竞争对受体的结合,相对于在不存在部分激动剂的情况下受体与完全激动剂的接触,导致受体激活净减少。临床上,当内源性配体存在的数量不足时,部分激动剂可用于激活受体,以提供所需的亚最大反应,或者当内源性配体数量过多时,它们可减少对受体的过度刺激。部分激动剂产生的最大反应(E最大)被称为其固有活性,当完全激动剂产生100%的反应时,可以用百分比表示其固有活性。在比较试验中以类似的浓度评估时,本发明的IL2部分激动剂可以具有WHO国际标准(NIBSC编码:86/500)的野生型成熟人IL2的活性的大于10%、或者大于20%、或者大于30%、或者大于40%、或者大于50%、或者大于60%、或者大于70%。
PEG-IL2突变蛋白:如本文所用的术语“PEG-IL2突变蛋白”是指共价结合至至少一个聚乙二醇(PEG)分子的IL2突变蛋白,至少一个PEG分子共价附接至IL-2突变蛋白的至少一个氨基酸残基。PEG化的多肽还可以称为单聚乙二醇化、二聚乙二醇化、三聚乙二醇化(等),以表示分别包含附接至IL-2突变蛋白的一个、两个、三个(或更多)PEG部分的PEG-IL2突变蛋白。在一些实施方式中,PEG可以直接地共价附接至IL-2突变蛋白(例如,通过赖氨酸侧链、半胱氨酸的巯基或N-末端胺)或任选地在PEG和IL-2突变蛋白之间采用接头。在一些实施方式中,PEG-IL2突变蛋白包含多于一个的PEG分子,每个分子附接至不同的氨基酸残基上。在一些实施方式中,PEG-IL2突变蛋白来源于序列ID NO:2(天然存在的hIL2)。IL2的PEG化形式和IL2多肽的PEG化方法在本领域是众所周知的(例如,见Katre,等,美国专利4,931,544,1990年6月5日授权;Katre,等,美国专利5,206,344,1993年4月27日授权;和Bossard,等,美国专利第9,861,705号,2018年1月9日授权)。在一些实施方案中,IL2突变蛋白可通过纳入具有非天然氨基酸侧链的非天然氨基酸进行修饰,以促进位点特异性PEG化,如2017年12月28日公开的Ptacin等的美国专利申请公开US20170369871A1所述。在其他实施方式中,可以在IL2分子内的不同位置纳入半胱氨酸残基,以促进通过半胱氨酸侧链的位点特异性PEG化,如Greve等的PCT国际专利申请号PCT/US2015/044462,2016年2月18日以WO2016/025385公开。
多肽:如本文所用术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用,并且指任何长度的氨基酸的聚合形式,其可以包括遗传编码的或非遗传编码的氨基酸,化学或生物化学修饰的或衍生的氨基酸,和具有修饰的多肽主链的多肽。这些术语包括融合蛋白,包括但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白;具有异源和同源前导序列的融合蛋白;具有或不具有N-末端甲硫氨酸残基的融合蛋白;具有免疫学标签蛋白的融合蛋白;免疫学活性蛋白(例如抗原性白喉或破伤风毒素片段)的融合蛋白等等。
防止:本文所用的术语“预防”、“防止”等是指在对象疾病、紊乱、病症或其症状发生之前启动的行动过程,使得暂时或永久地预防、减轻、抑制或减少对象患某种疾病、紊乱、病症或类似疾病的风险(例如通过没有临床症状来确定),或推迟其发作,一般是在对象由于遗传、经验或环境因素而易患某种特定疾病、紊乱或病症的情况下。在某些情况下,术语“预防”、“防止”也被用来指减缓疾病、紊乱或病症从目前的状态向更有害的状态发展。
受体:如本文所用,术语“受体”是指具有特异性结合配体的结构域的多肽,该配体的结合导致该多肽的至少一种生物学特性的改变。在一些实施分数中,受体是“可溶性”受体,不与细胞表面关联。hCD25的可溶性形式是特异性结合hIL2的可溶性受体的例子。在一些实施方式中,受体是细胞表面受体,其包括胞外结构域(ECD)和膜关联结构域,后者用于将ECD锚定至细胞表面。在细胞表面受体的一些实施方式中,受体是跨膜多肽,其包括由通常称为跨膜结构域(transmembrane domain)(TM)的跨膜的结构域(membrane spanningdomain)连接的胞内结构域(ICD)和胞外结构域(ECD)。配体结合至受体导致受体的构象变化,从而产生可测量的生物学效应。在一些情况下,如果受体是包括ECD、TM和ICD的跨膜多肽,配体结合至ECD导致由ICD的一个或多个结构域介导的可测量的胞内生物学效应,以反应于配体结合至ECD。在一些实施方式中,受体是多组分复合物的组分,以促进胞内信号转导。例如,配体可以结合细胞表面分子,该分子不单独与任何胞内信号转导相关联,但在配体结合后促进异源多聚体(包括异二聚体(例如中等亲和力CD122/CD132 IL2受体)、异三聚体(例如高亲和力CD25/CD122/CD132 hIL2受体)或同源多聚体(例如同二聚体、同三聚体、同四聚体)复合物的形成,导致胞内信号转导级联(例如Jak/STAT途径)的激活。
重组:如本文所用,术语重组的是指使用重组DNA技术产生的多肽。重组DNA技术的技术和方案在本领域中是众所周知的。
反应:如本文所用,术语“反应”、“响应”是指,例如,细胞、组织、器官或生物体的反应,包括生化或生理行为的变化,例如,浓度、密度、粘附性或生物隔室内的迁移、基因表达率或分化状态,其中该变化与激活、刺激或处理相关,或与内部机制如遗传编程相关。在某些情况下,术语“激活”、“刺激”等是指由内部机制以及外部或环境因素调节的细胞激活;而术语“抑制”、“下调”等则是指相反的效果。
选择性:如本文所用,术语“选择性”用于是指某一物质基于某种细胞的群的某种特性而优先结合至和/或激活该特定细胞类型的特性。在一些实施方式中,本发明提供了具有CD25选择性的突变蛋白,即相对于表达CD132受体的细胞,这种突变蛋白显示出对表达CD25和/或CD25/CD122受体的细胞的优先激活。通常在对配体/受体结合反应诱导的活性的表征试验中通过活性测量评估选择性。在一些实施方式中,选择性的IL2突变蛋白表现出显著减少的结合。在一些实施方式中,选择性的度量通过表达CD25的细胞(例如YTCD25POS或YTCD25+细胞)的激活对比表现出显著更低(优选不可检测的)的CD25水平的细胞(例如YTCD25NEG或YTCD25-细胞)的激活来进行。在一些实施方式中,选择性的度量通过表达CD25的T细胞(例如Treg)的激活对比CD25水平低的T细胞(非刺激的CD8+或CD4+ T细胞)的激活来进行。在一些实施方式中,在同一试验中,本发明的IL2突变蛋白在CD25+对比CD25-细胞上测量的EC50中具有至少3倍、至少5倍、或者至少10倍、或者至少20倍、或者至少30倍、或者至少40倍、或者至少50倍、或者至少100倍、或者至少200倍的差异。
显著减少的结合:如本文所用,术语"表现出显著减少的结合"用于指示,相对于修饰的配体的天然存在形式对同源受体的结合而言,这种配体(如IL2突变蛋白或修饰的IL2突变蛋白)对这种受体的结合亲和力。如果IL2突变蛋白对受体的天然形式的结合为天然存在的配体的小于40%、或小于约30%、或小于约20%、或小于约10%、或小于约5%、或小于约2%、或小于约1%,则IL2突变蛋白表现出显著的结合减少。
特异性结合:本文所用的术语“特异性结合”是指一个分子结合至另一个分子的选择性或亲和性的程度。在结合对(如配体/受体、抗体/抗原、抗体/配体、抗体/受体结合对)的上下文中,当结合对的第一分子不以显著量结合至样品中存在的其他组分时,就称作结合对的第一分子特异性结合至结合对的第二分子。当结合对的第一分子对第二分子的亲和力比第一分子对样品中存在的其他组分的亲和力至少大2倍、或至少大5倍、或至少大10倍、或至少大20倍、或至少大100倍时,结合对的第一分子被称为特异性结合至结合对的第二分子。在结合对中的第一分子是抗体的特定实施方式中,如果结合对的抗体和第二分子之间的平衡解离常数大于约106M、或者大于约108M、或者大于约1010M、或者大于约1011M、或者大于约1010M、或者大于约1012M,例如通过Scatchard分析确定,则该抗体特异性结合至结合对中的第二分子(例如,蛋白质、抗原、配体或受体)(Munsen,等1980Analyt.Biochem.107:220-239)。在其中配体是IL2突变蛋白,受体包括正交CD122 ECD的一个实施方式中,如果IL2突变蛋白/正交CD122 ECD的平衡解离常数大于约105M、或大于约106M、或大于约107M、或大于约108M、或大于约109M、或大于约1010M、或大于约1011M,则该IL2突变蛋白特异性结合。特异性结合可使用本领域已知的技术进行评估,包括但不限于竞争ELISA、放射性配体结合试验(例如,饱和结合、斯卡查德图(Scatchard plot)、非线性曲线拟合程序和竞争结合试验);非放射性配体结合试验(例如,荧光偏振(fluorescence polarization)(FP)、荧光共振能量转移(FRET)和表面等离子体共振试验(参见,例如,Drescher等,Methods Mol Biol493:323-343(2009),使用商购自GE医疗生命科学公司(GE Healthcare Bio-Sciences)的仪器,例如Biacore 8+、Biacore S200、Biacore T200(GE医疗生命科学公司,地址:100Results Way,Marlborough MA 01752));液相配体结合试验(例如,实时聚合酶链式反应(RT-qPCR)和免疫沉淀);和固相配体结合试验(例如,多孔板试验、珠上配体结合试验、柱上配体结合试验和过滤试验)。
对象:术语“受体”、“个体”、“对象”和“患者”在本文中可互换使用,并指任何需要诊断、处理或治疗的哺乳动物对象,特别是人。用于治疗目的的“哺乳动物”是指被分类为哺乳动物的任何动物,包括人、家养和农场动物、非人灵长类动物,以及动物园、运动或宠物动物,例如狗、马、猫、奶牛、绵阳、山羊、猪等。在一些实施方式中,哺乳动物为人。
患有:如本文所用,术语“患有”是指医生根据本领域公认的鉴定疾病、紊乱或病症的现有信息(包括但不限于X-射线、CT-扫描、常规实验室诊断测试(例如血细胞计数等)、基因组数据、蛋白质表达数据、免疫组织化学)对对象做出的其需要或将受益于治疗的判断。术语患有通常与特定的疾病状态结合使用,例如“患有炎症性、感染性或自身免疫性疾病、紊乱或病症疾病”是指对象被诊断为存在炎症性、感染性或自身免疫性疾病、紊乱或病症。
基本上纯的:如本文所用术语“基本上纯的”表示组分(例如多肽)占该组合物总含量的大于约50%,通常占多肽总含量的大于约60%。更通常地,“基本上纯的”是指组合物中总组合物的至少75%、至少85%、至少90%或更多是感兴趣的组分。在一些情况下,多肽将占到组合物总含量的大于约90%,或大于约95%。
T-细胞:如本文所用术语“T-细胞”或“T细胞”以其常规意义使用,是指在胸腺中分化的淋巴细胞,拥有特定细胞表面抗原受体,包括一些控制细胞介导的免疫和体液免疫和其他裂解携带抗原的细胞的起始或抑制的。在一些实施方式中,T细胞包括但不限于幼稚CD8+T细胞、细胞毒性CD8+T细胞、幼稚CD4+T细胞、辅助T细胞,例如TH1、TH2、TH9、TH11、TH22、TFH;调节性T细胞,例如TR1、Treg、诱导型Treg;记忆性T细胞,例如中心记忆T细胞、效应记忆T细胞、NKT细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和此类T细胞的工程改造变体,包括但不限于CAR-T细胞、重组修饰TIL和TCR工程改造细胞。
治疗有效量:本文使用的短语“治疗有效量”是指向对象给予试剂,单独地或作为药物组合物或治疗方案的一部分,以单剂量或作为系列剂量的一部分,以能够对疾病、紊乱或病症的任何症状、方面或特征产生任何可检测的、积极影响的量。治疗有效量可以通过测量相关的生理效应来确定,并且可以结合给药方案和对对象病情的诊断分析等来调整。用于确定试剂的治疗有效量的评估参数由医生使用公认的诊断标准确定,包括但不限于指标例如年龄、体重、性别、总体健康状况、ECOG评分、可观察到的生理参数、血液浓度、血压、心电图、计算机断层扫描、X-射线等。或者或此外,还可以监测临床情境中通常评估的其他参数,以确定是否对对象给予了治疗有效量的试剂,如体温,心率,血液化学的正常化,血压的正常化,胆固醇水平的正常化,或疾病、紊乱或病症的任何症状、方面或特征,生物标志物(如炎症细胞因子、IFN-γ、颗粒酶等),血清肿瘤标志物的减少,实体瘤反应评估标准(RECIST)的改善、免疫相关缓解标准(irRC)的改善、生存期的延长、无进展生存期的延长、进展时间的延长、治疗失败时间的延长、无事件生存期的延长、下次治疗时间的延长、客观缓解率的改善、缓解持续时间的改善、肿瘤负担的减轻、完全缓解、部分缓解、稳定的疾病等,本领域的临床医生基于这些评估对象对给予试剂的反应的状况改善。如本文所用,涉及靶病灶的术语“完全缓解(CR)”、“部分缓解(PR)”、“稳定的疾病(SD)”和“进展性疾病(PD)”,涉及非靶病灶的术语“完全缓解(CR)”、“不完全缓解/稳定的疾病(SD)”和“进展性疾病(PD)”,应理解为RECIST标准中所定义。如本文所用术语“免疫相关完全缓解(irCR)”、“免疫相关部分缓解(irPR)”、“免疫相关进展性疾病(irPD)”和“免疫相关稳定的疾病(irSD)”如根据免疫相关缓解标准(irRC)定义。如本文所用,术语“免疫相关缓解标准(irRC)”是指用于评估免疫治疗的缓解的体系,如描述于Wolchok,等(2009)评估实体瘤中免疫治疗活性的指南:免疫相关缓解标准(Guidelines for the Evaluation of Immune TherapyActivity in Solid Tumors:Immune-Related Response Criteria),Clinical CancerResearch 15(23):7412-7420。在对象疗程期间,可以根据给药方案和/或对象病情的评估及前述因素的变化调整治疗有效量。在一个实施方式中,治疗有效量是在哺乳动物对象给药过程中当单独使用或与另一试剂组合使用时不导致不可逆的严重不良事件的试剂的量。
跨膜结构域:术语"跨膜结构域"或"TM"是指跨膜多肽(如CD122或CD132或CAR等跨膜多肽)的结构域,当该跨膜多肽与细胞膜相关联时,该结构域嵌入细胞膜中,并与跨膜多肽的胞外结构域(ECD)和胞内结构域(ICD)以肽基键连接(peptidyl linkage)。跨膜结构域可以与胞外和/或胞内结构域中的一个或两个同源(天然相关联)或异源(不天然相关联)。在一些实施方式中,跨膜结构域是与衍生正交受体的同源受体的ECD结构域天然相关联的跨膜结构域。在一些实施方式中,跨膜结构域是与衍生正交受体的同源受体的ICD结构域天然相关联的跨膜结构域。在一些实施方式中,跨膜结构域是与增殖信号转导结构域天然相关联的跨膜结构域。在一些实施方式中,跨膜结构域是与不同蛋白质天然相关联的跨膜结构域。或者,受体的跨膜结构域可以是跨越质膜的人工氨基酸序列。在一些实施方式中,在受体是包括源自第一亲本受体的胞内结构域和源自第二不同亲本受体的第二胞外结构域的嵌合受体的情况下,嵌合受体的跨膜结构域是通常与衍生嵌合受体的亲本受体的ICD或ECD相关联的跨膜结构域。
治疗:术语“治疗”、“疗法”、“处理”等是指在诊断、观察到对象的疾病、紊乱或病症或其症状后,起始的行动过程(例如给予IL-2突变蛋白或包含其的药物组合物)或类似情况,以便暂时或永久地消除、减少、抑制、减轻或改善困扰对象的这种疾病、紊乱或病症的至少一个根本原因,或与这种疾病、紊乱或病症相关的至少一个症状。治疗包括对患有疾病的对象采取的行动过程,其中该行动过程导致对象的疾病被抑制(例如,阻止疾病、紊乱或病症的发展或改善与此相关的一个或多个症状)。
Treg细胞或调节性T细胞。本文所用的术语“调节性T细胞”或“Treg细胞”是指CD4+T细胞的类型,其能够抑制其他T细胞的反应,包括但不限于效应T细胞(Teff)。Treg细胞特征在于表达CD4、IL-2受体的a亚基(CD25)和转录因子叉头盒P3(FOXP3)(Sakaguchi,AnnuRev Immunol 22,531-62(2004)。“常规CD4+ T细胞”意指除调节性T细胞以外的CD4+T细胞。
变体:术语"蛋白质变体"或"变体蛋白质"或"变体多肽"在本文中可互换使用,指的是由于至少一个氨基酸修饰而与亲本多肽不同的多肽。该亲本多肽可以是天然存在的或野生型(WT)多肽,也可以是WT多肽的修饰形式(即,突变蛋白)。
野生型:“野生型”或“WT”或“天然”在本文中是指在自然界中存在的氨基酸序列或核苷酸序列,包括等位基因变异。野生型蛋白质,多肽,抗体,免疫球蛋白,IgG等具有未经人工修饰的氨基酸序列或核苷酸序列。
在一些实施方式中,本发明的IL2突变蛋白提供修饰,其修饰IL2突变蛋白对其他蛋白质的结合,尤其是CD25、CD122和CD132以及这些蛋白质的组合,例如CD122/CD132(“中等亲和力IL2受体”)、CD25(“低亲和力IL2受体”)和CD25/CD122/CD132(“高亲和力IL2受体”)。
本发明提供了治疗和/或预防炎症性、感染性或自身免疫性疾病、紊乱或病症的方法和组合物,其通过给予治疗有效量的人IL-2突变蛋白,该IL-2突变蛋白对CD132的结合亲和力减少,而保留了与野生型人IL-2的活性相当的对CD122和/或CD25的显著的结合亲和力。
在一些实施方式中,IL-2突变蛋白对hCD132的胞外结构域的结合亲和力下降(例如,<50%的野生型hIL2的亲和力、或<45%的野生型hIL2的亲和力、或<40%的野生型IL2的亲和力、或<35%的野生型hIL2的亲和力、或<25%的野生型hIL2的亲和力、或<20%的野生型hIL2的亲和力、或<15%的野生型IL2的亲和力、或<10%的野生型IL2的亲和力、或<5%的野生型IL2的亲和力),同时保留对野生型人CD122受体的胞外结构域的基本亲和力(例如,20%的野生型hIL2的亲和力、或>30%的野生型hIL2的亲和力、或>40%、或>50%的野生型hIL2的亲和力、或>60%的野生型hIL2的亲和力、或>65%的野生型hIL2的亲和力、或>70%的野生型hIL2的亲和力、或>75%的野生型hIL2的亲和力、或>80%的野生型hIL2的亲和力、或>85%的野生型hIL2的亲和力、或>90%的野生型IL2的亲和力、或>90%的野生型IL2的亲和力、或>95%的野生型IL2的亲和力、或>100%的野生型IL2的亲和力、或>105%的野生型hIL2的亲和力、或>110%的野生型IL2的亲和力、或>115%的野生型hIL2的亲和力、或>125%的野生型IL2的亲和力、或>150%野生型hIL2的亲和力)。
在一些实施方式中,在本发明的方法的实践中有用的对CD132受体的结合亲和力降低的IL-2突变蛋白进一步包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多增加CD122结合亲和力的突变。在某些实施方式中,在本公开的方法的实践中有用的主体IL-2突变蛋白相对于野生型IL-2(例如,SEQ ID NO:5)包含至少一个突变(例如,1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个氨基酸残基的缺失、添加或取代),且以高于野生型IL-2的亲和力结合CD122。在某些实施方式中,IL-2突变蛋白结合CD122的亲和力比野生型IL-2大至少1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。IL-2突变蛋白的结合亲和力也可以表示为对CD122的亲和力比野生型hIL-2大1.2、1.4、1.5、2、5、10、15、20、25、50、100、200、250或更多倍。
在一些实施方式中,IL-2突变蛋白对hCD132的胞外结构域的结合亲和力下降(例如,<50%的野生型hIL2的亲和力、或<45%的野生型hIL2的亲和力、或<40%的野生型hIL2的亲和力、或<35%的野生型hIL2的亲和力、或<25%的野生型hIL2的亲和力、或<20%的野生型hIL2的亲和力、或<15%的野生型hIL2的亲和力、或<10%的野生型hIL2的亲和力、或<5%野生型hIL2的亲和力),同时保留对hCD25/hCD122受体复合物的基本亲和力(例如,>50%的野生型hIL2的亲和力、或>60%的野生型hIL2的亲和力、或>65%的野生型hIL2的亲和力、或>70%的野生型hIL2的亲和力、或>75%的野生型hIL2的亲和力、或>80%的野生型hIL2的亲和力、或>85%的野生型hIL2的亲和力、或>90%的野生型hIL2的亲和力、或>90%的野生型hIL2的亲和力、或>95%的野生型hIL2的亲和力、或>100%的野生型hIL2的亲和力、或>105%的野生型hIL2的亲和力、或>110%的野生型hIL2的亲和力、或>115%的野生型hIL2的亲和力、或>125%的野生型hIL2的亲和力、或>150%的野生型IL2的亲和力)。在某些实施方式中,本发明的IL2突变蛋白对CD132的亲和力降低。在一些实施方式中,这种IL2突变蛋白纳入了对野生型IL2一级结构的修饰,在按照野生型hIL-2编号的第18、22和126位上纳入了一个或多个修饰。
在一些实施方式中,IL-2突变蛋白对CD132的结合亲和力下降,同时保留了对hCD25的基本结合亲和力(例如>50%的野生型hIL2的亲和力、或>60%的野生型hIL2的亲和力、或>65%的野生型hIL2的亲和力、或>70%的野生型hIL2的亲和力、或>75%的野生型hIL2的亲和力、或>80%的野生型hIL2的亲和力、或>85%的野生型hIL2的亲和力、或>90%的野生型hIL2的亲和力、或>90%的野生型IL2的亲和力、或>95%的野生型hIL2的亲和力、或>100%的野生型IL2的亲和力、或>105%的野生型hIL2的亲和力、或>110%的野生型hIL2的亲和力、或>115%的野生型hIL2的亲和力、或>125%的野生型hIL2的亲和力、或>150%的野生型hIL2的亲和力、或>200%的野生型hIL2的亲和力、或>300%的野生型IL2的亲和力、或>400%的野生型hIL2的亲和力、或>500%的野生型IL2的亲和力)。
一方面,本发明提供hIL-2突变蛋白,与野生型人IL-2(hIL-2)相比,其表现出对hCD25显著或增强的结合亲和力,和对hCD132受体的胞外结构域降低的结合亲和力。
在一些实施方式中,IL-2突变蛋白包括一个或多个氨基酸取代,这降低了CD132受体结合亲和力,所述取代选自第18、22和126位氨基酸,根据成熟野生型hIL-2编号。
在一些实施方式中,在本发明的方法的实践中有用的作为部分激动剂的主体IL-2突变蛋白与野生型IL-2相比,具有一种或多种减少的功能。
在某些实施方式中,在本发明的方法的实践中有用的IL-2突变蛋白破坏CD122与CD132的缔合,使得该CD122/CD132的相互作用相对于野生型hIL-2减少了约2%、约5%、约10%、约15%、约20%、约50%、约75%、约90%、约95%或更多。在一些实施方式中,减少IL-2突变蛋白对CD132的结合亲和力的一个或多个突变是氨基酸取代。在一些实施方式中,与野生型IL-2(SEQ ID NO:5)相比,主体hIL-2突变蛋白具有仅1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸取代。
在某些实施方式中,在本发明方法的实践中有用的IL2突变蛋白是CD8+ T细胞中IL-2和/或IL-15磷酸化的抑制剂。在一些实施方式中,该突变蛋白是IL-2和/或IL-15诱导的CD8+ T细胞增殖的抑制剂。在一些实施方式中,该突变蛋白是IL-2依赖性、TCR诱导的细胞增殖的抑制剂。
在某些实施方式中,在本发明方法的实践中有用的IL2突变蛋白是IL-2依赖性自然杀伤(NK)细胞激活的抑制剂。NK细胞的IL-2激活可以通过本领域已知的任何合适的方法来测量,例如,通过测量IL-2诱导的CD69表达和/或细胞毒性,如本文所述。
在本发明的一些实施方式中,IL-2突变蛋白是部分激动剂。在某些实施方式中,在本发明方法的实践中有用的IL-2突变蛋白是部分激动剂,其刺激一种或多种依赖CD122/CD132异二聚化的信号转导通路的能力降低。在一些实施方式中,与野生型hIL-2相比,主体IL-2突变蛋白刺激CD122+细胞中磷酸化的能力降低。在一些实施方式中,IL-2突变蛋白在IL-2RP+细胞中刺激STAT5磷酸化的水平是野生型IL-2在相同细胞中刺激STAT5磷酸化的水平的1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更低。在一些实施方式中,IL-2Rp+细胞是T细胞。在特定的实施方式中,T细胞是CD8+ T细胞。在一些实施方式中,CD8+ T细胞是新鲜分离的CD8+ T细胞。在其他实施方式中,CD8+ T细胞是激活的CD8+ T细胞。在其他实施方式中,CD122+细胞是自然杀伤(NK)细胞。
在一些实施方式中,在本发明方法的实践中有用的IL2突变蛋白是部分激动剂,与野生型hIL-2相比,其刺激CD122+细胞中的信号转导的能力降低。在一些实施方式中,IL-2突变蛋白在CD122+细胞中刺激pERK1/ERK2信号转导的水平是野生型IL-2在相同细胞中刺激pERK1/ERK2信号转导的水平的1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更低。在一些实施方式中,CD122+细胞是T细胞。在特定的实施方式中,CD122+ T细胞是CD8+ T细胞。在一些实施方式中,CD122+ CD8+ T细胞是从对象分离的CD122+ CD8+ T细胞。在其他实施方式中,CD8+ T细胞T细胞是激活的CD122+ CD8+ T细胞。在其他实施方式中,CD122+细胞是自然杀伤(NK)细胞。STAT5和ERK1/2信号转导可以被测量,例如,通过使用本领域已知的任何合适的方法对STAT5和ERK1/2进行磷酸化。例如,STAT5和ERK1/2的磷酸化可以用这些分子的磷酸化形式的特异性抗体来测量。
在某些实施方式中,在本发明方法的实践中有用的突变蛋白是部分激动剂,与野生型hIL-2相比,其诱导淋巴细胞增殖的能力降低。在一些实施方式中,淋巴细胞是T细胞。在特定的实施方式中,淋巴细胞是原代CD8+ T细胞。在其他实施方式中,淋巴细胞是激活的CD8+ T细胞。细胞增殖可以使用任何本领域公知的合适方法进行测定。例如,淋巴细胞增殖可以用羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺二酯(carboxyfluorescein diacetatesuccinimidyul diester)(CFSE)稀释试验或通过[31-1]-胸苷纳入测量,如本文所述。在一些实施方式中,本发明的IL-2突变蛋白诱导淋巴细胞增殖的水平是野生型hIL-2诱导淋巴细胞增殖的水平的1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更低。
在一些实施方式中,本发明的IL-2突变蛋白是部分激动剂,与野生型IL-2相比,其激活CD25表达的能力降低。在一些实施方式中,IL-2突变蛋白在淋巴细胞中激活IL-2Ra表达的水平是野生型IL-2在相同细胞中激活CD25表达的水平的1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更低。在一些实施方式中,淋巴细胞是CD8+ T细胞。在一些实施方式中,CD8+ T细胞是新鲜分离的CD8+ T细胞。在其他实施方式中,CD8+ T细胞是激活的CD8+ T细胞。
在本发明的一些实施方式中,IL-2突变蛋白是完全激动剂。
在本发明的一些实施方式中,IL-2突变蛋白是超级激动剂。
在一些实施方式中,本发明的治疗和/或预防炎症性、感染性或自身免疫性疾病、紊乱或病症疾病的方法和组合物,其通过给予治疗有效量的人IL-2突变蛋白且给予补充剂与之组合,该IL-2突变蛋白对CD132的结合亲和力减少,但保留了与野生型hIL-2的活性相当的对CD122和/或CD25的显著的结合亲和力,所述补充剂包括但不限于化疗、免疫检查点调节剂、放疗和/或物理干预治疗(如手术)中的一个或多个。
在一些实施方式中,本发明提供了人白细胞介素-2(IL-2)突变蛋白,其提供了对一种或多种IL2受体的修饰的结合特性,用于治疗炎症性、感染性或自身免疫性疾病、紊乱或病症。
在多种实施方式中,本发明提供包括根据下式1的氨基酸序列的多肽:
其中:
a、b、c、d、e、f、g、h和i各自单独地选自0或1;
AA1是A(野生型,a=1)或缺失(a=0);
AA2是P(野生型,b=1)或缺失(b=0);
AA3是T(野生型,c=1)、C、A、G、Q、E、N、D、R、K、P或缺失(c=0);
AA4是S(野生型,d=1)或缺失(d=0);
AA5是S(野生型,e=1)或缺失(e=0);
AA6是S(野生型,f=1)或缺失(f=0);
AA7是T(野生型,g=1)或缺失(g=0);
AA8是K(野生型,h=1)或缺失(h=0);
AA9是K(野生型,i=1)或缺失(i=0);
AA18是L(野生型)或R、L、G、M、F、E、H、W、K、Q、S、V、I、Y、H、D或T;
AA22是Q(野生型)或F、E、G、A、L、M、F、W、K、S、V、I、Y、H、R、N、D、T或F;
AA35是K(野生型)或E;
AA38是R(野生型)、W或G;
AA39是M(野生型)、L或V;
AA55是H(野生型)或Y;
AA69是V(野生型)或A;
AA74是Q(野生型)、P、N、H、S;
AA80是L(野生型)、F或V;
AA81是R(野生型)、I、D或T;
AA85是L(野生型)或V;
AA86是I(野生型)或V;
AA89是I(野生型)或V;
AA92是I(野生型)或F;
AA97是K(野生型)或Q;
AA104是M(野生型)或A;
AA109是D(野生型)、C或具有激活的侧链的非天然氨基酸;
AA113是T(野生型)或N;
AA125是C(野生型)、A或S;
AA126是Q(野生型)或H、M、K、C、D、E、G、I、R、S或T;和
AA130是S(野生型)、T、G或R;和
前提是如果AA18是R且AA22是E,则AA126不是H、M、K、C、D、E、G、I、R、S或T。
在某些实施方式中,本发明提供IL2突变蛋白,其包括以下突变:
AA18选自下组:L(野生型)或R、L、G、M、F、E、H、W、K、Q、S、V、I、Y、H、D或T;
AA22选自下组:Q(野生型)或F、E、G、A、L、M、F、W、K、S、V、I、Y、H、R、N、D、T或F;和
AA126选自下组:Q(野生型)或H、M、K、C、D、E、G、I、R、S或T,
前提是如果AA18是R且AA22是E,则AA126不是H、M、K、C、D、E、G、I、R、S或T。
在某些实施方式中,本发明提供IL2突变蛋白,其包括以下突变:
a=0;
AA18选自下组:L(野生型)或R、L、G、M、F、E、H、W、K、Q、S、V、I、Y、H、D或T;
AA22选自下组:Q(野生型)或F、E、G、A、L、M、F、W、K、S、V、I、Y、H、R、N、D、T或F;和
AA126选自下组:Q(野生型)或H、M、K、C、D、E、G、I、R、S或T。
前提是如果AA18是R且AA22是F或V,那么AA126不是H、M、K、C、D、E、G、I、R、S或T。
在一些实施方式中,本发明提供IL-2突变蛋白,其包括在按照野生型hIL-2编号的第18、22和126位的氨基酸处的氨基酸取代,如下表2所述。应注意,特定的IL2突变蛋白的三字母缩写反映了具有第18、22和126位突变的IL2突变蛋白,例如,“FEH”是包含L18F、Q22E和Q126H取代的IL2突变蛋白的速记术语。特别是本发明的IL2突变蛋白包括在第18位和/或第22位以及第126位的氨基酸取代,如下表2所述:
制备表2的上述IL2突变蛋白并基本根据本文所述实施例测试。实验的结果在附图的图1和2中提供。如图1所说明,本发明的IL2突变蛋白保留了显著的IL2活性。如图2所说明,与野生型IL2相比,本发明的IL2突变蛋白表现出对表达CD25细胞的显著优选活性。
IL2突变蛋白还可以在野生型IL-2氨基酸序列中包含多于一个的取代、缺失或插入。本文使用以下命名法以表示取代、缺失或插入。在本文中残基可以用一个字母或三个字母的氨基酸代码指定,后接IL-2氨基酸位置,例如“Cys125”或“C125”是指SEQ ID NO:5的第125位的半胱氨酸残基。在本文中指定取代,通过一个字母的氨基酸代码,后接IL-2氨基酸位置,后接取代的一个字母氨基酸代码,例如“K35A”是指用丙氨酸(A)残基取代SEQ ID NO:5的第35位的赖氨酸(K)残基。缺失被称为“des”,后接缺失的氨基酸残基及其在SEQ ID NO:5中的位置。例如术语“des-Ala1”或“desA1”是指SEQ ID NO:5的多肽的第1位的丙氨酸缺失。
增加CD122亲和力的突变
在本发明的一些实施方式中,IL2突变蛋白可以包含增强CD122结合亲和力的氨基酸取代。增强CD122结合亲和力的氨基酸取代的例子包括但不限于Q74N、Q74H、Q74S、L80F、L80V、R81D、R81T、L85V、I86V、I89V和/或I92F或其组合。在某些实施方式中,增加CD122结合亲和力的氨基酸取代包括:L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在一些实施方式中,增加CD122结合亲和力的氨基酸取代包括:N74Q、L80F、R81D、L85V、I86V、I89V和I92F。在一些实施方式中,增加CD122结合亲和力的氨基酸取代包括:Q74N、L80V、R81T、L85V、I86V和I92F。在某些实施方式中,增加CD122结合亲和力的氨基酸取代包括:Q74H、L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在一些实施方式中,增加CD122结合亲和力的氨基酸取代包括:Q74S、L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在某些实施方式中,增加CD122结合亲和力的氨基酸取代包括:Q74N、L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在某些实施方式中,增加CD122结合亲和力的氨基酸取代包括:Q74S、R81T、L85V和I92F。
在一些实施方式中,IL2突变蛋白被亲和成熟以增强其对CD25和/或CD122的亲和力。“亲和成熟的”多肽是在一个或多个残基上具有一个或多个改变的多肽,与不拥有这些一个或多个改变的亲本多肽相比,这导致正交多肽对同源正交受体的亲和力改进,或反之亦然。与“亲本”多肽相比,进行亲和成熟增加IL2突变蛋白的结合亲和力至少约10%、或至少约50%、或至少约100%、或至少约150%、或1-5倍。
增加CD25亲和力的突变:
在一些实施方式中,IL-2突变蛋白在IL-2序列的位置中包含一个或多个突变,其或接触CD25或改变接触CD25的其他位置的取向,导致IL2突变蛋白对于CD25的亲和力增加。在一些实施方式中,本发明的IL2突变蛋白包括一个或多个取代V69A和Q74P,其已被描述为增加IL2对CD25的结合亲和力。
去除Thr3糖基化位点
本发明的IL2突变蛋白可以还提供或任选地提供Thr3位的O-糖基化位点的消除,以在哺乳动物细胞(例如CHO或HEK细胞)中表达IL2突变蛋白时促进非糖基化IL2突变蛋白的产生。因此,在某些实施方式中IL2突变蛋白还包含消除IL-2的对应于人IL-2的残基3位置的O-糖基化位点的修饰。在一些实施方式中所述消除IL-2的对应于人IL-2的残基3位置的O-糖基化位点的修饰是氨基酸修饰。示例性的氨基酸取代包括T3A、T3G、T3Q、T3E、T3N、T3D、T3R、T3K、T3S、T3C和T3P,其去除位置3处的糖基化位点而没有消除生物学活性(参见美国专利号5,116,943;Weiger等,(1989)Eur.J.Biochem.,180:295-300)。在特定的实施方式中,所述修饰是氨基酸取代T3A。
最小化血管渗漏综合征
在本发明的一些实施方式中,IL2突变蛋白可以包含氨基酸取代以避免血管渗漏综合征,血管渗漏综合征是在人中使用IL2疗法的实质性负面和剂量限制性的副作用,而不会出现效力上的实质性损失。参见,Epstein,等,美国专利号7,514,073B2,2009年4月7日授权。本发明的IL2突变蛋白中包含的这种修饰的例子包括一个或多个R38W、R38G、R39L、R39V、F42K和H55Y。
抗氧化性M104A
本文公开的IL2突变蛋白可以任选地进一步包含M104位处的修饰,在一个实施方式中用丙氨酸残基取代甲硫氨酸104(M104A)以提供更抗氧化的IL2突变蛋白(参见Koths,等,美国专利4,752,585,1988年6月21日授权)。
Cys125
在一些实施方式中,第125位的半胱氨酸被用丙氨酸或丝氨酸取代(C125A或C125S),以如本文所述在细菌中重组表达和从包涵体中分离时最小化蛋白的潜在错误折叠。
N末端缺失
当在细菌表达系统中重组生产时,在没有前导序列的情况下,内源性蛋白酶导致N-末端Met-Ala1残基缺失,以提供“desAla1”IL2突变蛋白。在一些实施方式中,本发明提供hIL2突变蛋白,其为hIL2多肽,包括以下几组氨基酸修饰之一:
IL2突变蛋白可以包含头两个氨基酸的缺失(desAla1-desPro2),以及用半胱氨酸残基取代Thr3糖基化以促进选择性N-末端修饰,特别是半胱氨酸的巯基基团的聚乙二醇化(参见,例如,Katre,等美国专利号5,206,344,授权于1993年4月27日)。
IL2突变蛋白可进一步包括在第1-9位(上式中a、b、c、d、e、f、g、h和i均为零的化合物)、或在第1-8位(上式中a、b、c、d、e、f、g和h均为零的化合物)、或在第1-7位(上式中a、b、c、d、e、f和g均为零的化合物)、或在第1-6位(上式中a、b、c、d、e和f均为零的化合物)、或在第1-5位(上式中a、b、c、d和e均为零的化合物)、或在第1-4位(a、b、c和d均为零的化合物)、或des1-3位(上式中a、b和c均为零的化合物)、或在第1-2位(上式中a和b均为零的化合物)中的一或多者处消除N末端氨基酸,同时保留IL2活性。
保守氨基酸取代
在一些实施方式中,本发明的IL2突变蛋白可以进一步包含在野生型IL-2氨基酸序列中的一个更保守的氨基酸取代。这种保守取代包括那些由Dayhoff描述于《蛋白质序列和结构图册5》(The Atlas of Protein Sequence and Structure 5)(1978),以及由Argos描述于EMBO J.,8:779-785(1989)。
通常根据表3中示出的以下表格进行保守取代。
通过选择比表3中示出的那些更不保守的氨基酸取代,可以进行功能或免疫学特性中的实质性改变。例如,可以进行更显著地影响多肽骨架结构或破坏二级或三级元件的取代,包括用大电荷的大侧链(天冬酰胺)取代具有小的无电荷侧链的氨基酸(例如甘氨酸)。特别是那些参与与CD25、CD122和/或CD123的一个或多个相互作用的IL2残基的取代,这可以从IL2与其描述的受体相缔合的晶体结构中看出
延长体内持久性的修饰
如上所述,本发明的组合物包括已经被修饰以提供用于延长体内寿命和/或延长在对象中的作用时间的IL2突变蛋白。
一级序列修饰
在一些实施方式中,IL2突变蛋白可以包含某些氨基酸取代,其导致延长体内寿命。例如,Dakshinamurthi,等(International Journal of Bioinformatics Research(2009)1(2):4-13)描述在IL2多肽中一个或多个取代V91R、K97E和T113N将产生拥有增强的稳定性和活性的IL2变体。在一些实施方式中,本发明的IL2突变蛋白包含一个、两个或全部三个V91R、K97E和T113N修饰。
偶联物和运载体分子
在一些实施方式中IL2突变蛋白被修饰,以在对象中提供延长的作用时间,这可以通过偶联至运载体分子以提供所需的药理学特性(例如延长的半衰期)来实现。在一些实施方式中,IL2突变蛋白可以共价地连接至IgG的Fc结构域、白蛋白或其他分子以延长其半衰期,例如,通过本领域已知的聚乙二醇化、糖基化、脂肪酸酰化等。在一些实施方式中,IL-2偶联物在人对象体内的血浆半衰期大于4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、或30天。
白蛋白融合
在一些实施方式中,IL2突变蛋白被表达为与白蛋白分子(例如人血清白蛋白)的融合蛋白质,其在本领域中是已知的,以促进延长体内暴露。
在本发明的实施方式中,hIL2类似物被偶联至白蛋白,在本文中称为“IL2突变蛋白白蛋白融合体”。在hIL2类似物白蛋白融合体的上下文中使用术语“白蛋白”时,包含白蛋白,例如人血清白蛋白(HSA)、食蟹猴血清白蛋白(cyno serum albumin)和牛血清白蛋白(BSA)。在一些实施方式中,相对于野生型HAS序列,该HAS包含C34S或K573P氨基酸取代。根据本发明,白蛋白可以被偶联至IL2突变蛋白,在羧基末端、氨基末端、羧基及氨基末端和内部(参见,例如,美国专利号5,876,969和美国专利号7,056,701)。在本公开所预期的HSA-hIL2突变蛋白多肽偶联物中,可以使用多种形式的白蛋白,例如白蛋白分泌前序列(albumin secretion pre-sequence)及其变体、其片段和变体和HSA变体。这种形式通常具有一种或多种所需的白蛋白活性。在其他实施方式中,本发明涉及包含hIL2类似物多肽直接或间接融合至白蛋白、白蛋白片段和白蛋白变体等的融合蛋白,其中融合蛋白比未融合的药物分子具有更高的血浆稳定性和/或融合蛋白保留了未融合药物分子的治疗活性。在一些实施方式中,直接融合是通过接头实现的,例如肽接头或其修饰的版本,如下文更充分地讨论的。
或者,hIL2类似物白蛋白融合体包含IL2突变蛋白,其为包含白蛋白结合结构域(ABD)多肽序列和IL2突变蛋白多肽的融合蛋白。如上所述,包含白蛋白结合结构域(ABD)多肽序列和hILI2类似物多肽的融合蛋白能够,例如,通过遗传操作实现,使得编码HSA的核酸或其片段被接合至编码一种或多种IL2突变蛋白序列的核酸。在一些实施方式中,白蛋白结合肽包括氨基酸序列DICLPRWGCLW(SEQ ID NO:6)。
IL2突变蛋白多肽还可以偶联至大的、缓慢代谢的大分子,例如蛋白质;多糖,例如琼脂糖(sepharose)、琼脂糖(agarose)、纤维素或纤维素珠;聚氨基酸,例如聚谷氨酸或聚赖氨酸;氨基酸共聚物;灭活的病毒颗粒;灭火的细菌毒素,例如来自白喉、破伤风、霍乱的类毒素或白细胞毒素分子;灭活的细菌、树突细胞、甲状腺球蛋白;破伤风类毒素;白喉类毒素;聚氨基酸例如聚(D-赖氨酸:D-谷氨酸);轮状病毒VP6多肽;流感病毒血蓝蛋白(hemaglutinin)、流感病毒核蛋白;钥孔戚血蓝素(Keyhole Limpet Hemocyanin)(KLH);和乙肝病毒核心蛋白和表面抗原。如果需要,这种偶联形式可用于产生针对本公开的多肽的抗体。
在一些实施方式中,IL2突变蛋白与XTEN偶联(通过化学方式或以融合蛋白形式),其提供了延伸的类似于聚乙二醇化的延长的持续时间,可在大肠杆菌中以重组融合蛋白形式生产。适合与本发明的IL2突变蛋白偶联的XTEN聚合物提供于Podust,等(2016)“通过XTEN蛋白聚合物延长生物活性分子的体内半衰期(Extension of in vivo half-life ofbiologically active molecules by XTEN protein polymers)”,J Controlled Release240:52-66和Haeckel等(2016)“XTEN作为PEG化的生物学替代方案,允许完全表达基于蛋白酶可激活的杀伤性细胞抑制剂(XTEN as Biological Alternative to PEGylationAllows Complete Expression of a Protease-Activatable Killin-BasedCytostatic)”PLOS ONE|DOI:10.1371/journal.pone.0157193,2016年6月13日。XTEN聚合物融合蛋白可以在XTEN多肽和IL2突变蛋白之间纳入蛋白酶敏感裂解位点,例如MMP-2裂解位点。
其他用于偶联的候选组分和分子包括其他适于分离或纯化的组分和分子。特定的非限制性例子包括结合分子,例如生物素(生物素-亲和素特异性结合对)、抗体、受体、配体、凝集素或包含固体支持物(包括,例如塑料或聚苯乙烯珠、板或珠、磁珠、测试条和膜)的分子。
PEG化:
在一些实施方式中,IL2突变蛋白偶联至一个或多个水溶性聚合物。在本发明实践中有用的水溶性聚合物的例子包括聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、多糖(聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚(氧乙基化多元醇)、聚烯烃醇(polyolefinic alcohol)、多糖、聚-α-羟基酸、聚乙烯醇(PVA)、聚磷腈、聚噁唑啉(polyoxazoline)(POZ)、聚(N-丙烯酰吗啉),或其组合。
在一些实施方式中,IL2突变蛋白偶联至一个或多个聚乙二醇分子或“聚乙二醇化/PEG化”。尽管PEG附接至IL2突变蛋白的方法或位点可能不同,在某些实施方式中聚乙二醇化不改变或仅在最小程度上改变IL2突变蛋白的活性。
在一些实施方式中,半胱氨酸可以被取代为第3位的苏氨酸(3TC)以促进使用特定化学方法的N-末端聚乙二醇化。
在一些实施方式中,IL2突变蛋白的选择性PEG化(例如通过纳入具有侧链的非天然氨基酸以促进选择性PEG偶联化学反应,如描述于Ptacin,等(2018年8月3日提交的PCT国际申请号PCT/US2018/045257,并于2019年2月7日作为国际公开号WO 2019/028419Al公开)可用于产生对IL2受体复合物的一个或多个亚基(如CD25、CD132)的亲和力降低的IL2突变蛋白。例如,其中在IL2的经鉴定为与CD25相互作用的那些序列或残基(包括氨基酸34-45、61-72和105-109)处纳入具有可PEG化的特定部分的非天然氨基酸的hIL2突变蛋白通常能提供对CD25结合性减弱的IL2突变蛋白。相似地,其中在IL2的经鉴定为与hCD132相互作用的那些序列或残基(包括氨基酸18、22、109、126或119-133)处纳入具有可PEG化的特定部分的非天然氨基酸的hIL2突变蛋白通常能提供对hCD132结合性减弱的IL2突变蛋白。
在某些实施方式中,半衰期的增加大于生物学活性的任何减少。适合偶联至多肽序列的PEG通常在室温溶于水,并且具有通式
R(O-CH2-CH2)nO-R,其中R是氢或保护基团,例如烷基或烷醇基,其中n是1-1000的整数。当R是保护基团时,其通常具有1-8个碳。偶联至多肽序列的PEG可以是直链的或支链的。本发明考虑了支化PEG衍生物,“星形-PEG(star-PEG)”和多臂PEG。
本发明中使用的PEG的分子量不限于任何特定范围。PEG-IL2突变蛋白的PEG组分可以具有大于约5kDa、大于约10kDa、大于约15kDa、大于约20kDa、大于约30kDa、大于约40kDa、或大于约50kDa的分子量。在一些实施方式中,分子量为约5kDa至约10kDa,约5kDa至约15kDa,约5kDa至约20kDa,约10kDa至约15kDa,约10kDa至约20kDa,约10kDa至约25kDa或约10kDa至约30kDa。直链或支链PEG分子的分子量从约2,000至约80,000道尔顿,或者约2,000至约70,000道尔顿,或者约5,000至约50,000道尔顿,或者约10,000至约50,000道尔顿,或者约20,000至约50,000道尔顿,或者约30,000至约50,000道尔顿,或者约20,000至约40,000道尔顿,或者约30,000至约40,000道尔顿。在本发明的一个实施方式中,PEG为包含两个20kD臂的40kD支链PEG。
本公开还考虑了偶联物的组合物,其中PEG具有不同的n值,因此在特定的比率下存在多种不同的PEG。例如,一些组合物包含偶联物的混合物,其中n=1、2、3和4。在一些组合物中,n=1的偶联物的百分比为18-25%,n=2的偶联物的百分比为50-66%,n=3的偶联物的百分比为12-16%,n=4的偶联物的百分比多达5%。这种组合物可以通过本领域已知的反应条件和纯化方法生产。层析可用于分辨偶联物的馏分,然后鉴定包含具有例如附接所需数量的PEG的偶联物的馏分,从未修饰的蛋白质序列和具有附接其他数量PEG的偶联物中纯化出来。
适合偶联至多肽序列的PEG通常在室温溶于水,并且具有通式R(O-CH2-CH2)nO-R,其中R是氢或保护基团,例如烷基或烷醇基,其中n是1-1000的整数。当R是保护基团时,其通常具有1-8个碳。
两种广泛使用的第一代激活的单甲氧基PEG(mPEG)是琥珀酰亚胺基碳酸酯PEG(SC-PEG;参见,例如,Zalipsky,等(1992)Biotehnol.Appl.Biochem 15:100-114)和苯并三唑甲酯PEG(BTC-PEG;参见,例如Dolence,等美国专利号5,650,234),其优选与赖氨酸残基反应以形成氨基甲酸酯连接,但也已知与组氨酸和酪氨酸残基反应。使用PEG-醛接头通过还原性胺化靶向多肽的N-末端单个位点。
聚乙二醇化经常发生在多肽N-末端的α-氨基基团,赖氨酸残基侧链上的ε氨基基团和组氨酸残基侧链上的咪唑基团。由于大多数重组多肽具有单个α基团和若干ε基团和咪唑基团,根据接头的化学性质,可以产生许多位置异构体。本领域中已知的一般聚乙二醇化策略可本文中应用。
PEG可以通过末端反应性基团(“间隔子")结合至本发明的IL2突变蛋白,该基团在一个或多个多肽序列的游离氨基或羧基与聚乙二醇之间介导结合。具有可结合至游离氨基基团的间隔子的PEG包括N-羟基琥珀酰亚胺聚乙二醇,它可以通过用N-羟基琥珀酰亚胺激活聚乙二醇的琥珀酸酯来制备。
在一些实施方式中,通过纳入带有独特侧链的非天然氨基酸以促进特定位点的PEG化来促进IL2突变蛋白的PEG化。将非天然氨基酸纳入多肽以提供功能部分以实现此类多肽的位点特异性聚乙二醇化是本领域中已知的。参见,例如Ptacin,等,(PCT国际申请号PCT/US2018/045257,2018年8月3日提交并公开于2019年2月7日,国际公开号WO 2019/028419Al。在一个实施方式中,本发明的IL2突变蛋白在IL2突变蛋白的D109位纳入非天然氨基酸。在本发明的一个实施方式中,IL2突变蛋白是IL2突变蛋白的109位PEG化的,PEG分子分子量约为20kD,或约30kD,或约40kD。
偶联至多肽序列的PEG可以是直链的或支链的。本发明考虑了支化PEG衍生物,“星形-PEG(star-PEG)”和多臂PEG。本发明的实践中有用的具体实施方式PEG包括10kDa直链PEG-醛(例如,ME-100AL、NOF美国公司(NOF America Corporation),北百老汇(One North Broadway),纽约州白原市(White Plains,NY)10601USA)、10kDa直链PEG-NHS酯(例如,ME-100CS,ME-100AS,ME-100GS,ME-100HS,NOF)、20kDa直链PEG-醛(例如ME-200AL,NOF、20kDa直链PEG-NHS酯(例如,ME-200CS,ME-200AS,ME-200GS,ME-200HS,NOF)、20kDa 2-臂支链PEG-醛,该20kDA PEG-醛,其包含两个10kDA直链PEG分子(例如,GL2-200AL3,NOF)、20kDa 2-臂支链PEG-NHS酯,该20kDA PEG-NHS酯,其包含两个10kDA直链PEG分子(例如,GL2-200TS,GL200GS2,NOF)、40kDa 2-臂支链PEG-醛,该40kDA PEG-醛,其包含两个20kDA直链PEG分子(例如,GL2-400AL3)、40kDa 2-臂支链PEG-NHS酯,该40kDA PEG-NHS酯,其包含两个20kDA直链PEG分子(例如,GL2-400AL3,GL2-400GS2,NOF)、直链30kDa PEG-醛(例如,ME-300AL)和直链30kDa PEG-NHS酯。
如前所述,PEG可以直接或通过接头分子附接至IL2突变蛋白。合适的接头包括“柔性接头”,其长度通常足以允许修饰的多肽序列与连接的组分和分子之间有一些移动。接头分子通常约6-50个原子长。接头分子也可以是,例如,芳基乙炔、含有2-10个单体单元的乙二醇寡聚物、二胺、二酸、氨基酸或其组合。合适的接头可以容易地选择,可以是任何合适的长度,例如1个氨基酸(如Gly)、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10-20、20-30、30-50或超过50个氨基酸。柔性接头的例子包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和其他柔性接头。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物是相对非结构化的,因此可以用作组分之间的中性系链(tether)。柔性接头的其他例子包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物、甘氨酸-丝氨酸聚合物。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物是相对非结构化的,因此可以用作组分之间的中性系链(tether)。这些接头序列的多聚体(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10-20、20-30或30-50)可以连接在一起,以提供柔性接头,可用于将异源氨基酸序列偶联至本文公开的多肽。
此外,这种接头可用于将IL2突变蛋白连接至本文所述的其他异源多肽组分,异源氨基酸序列可以是信号序列和/或融合伴侣,例如,白蛋白、Fc序列等。
酰化
在一些实施方式中,本发明的IL2突变蛋白可以是通过偶联至脂肪酸分子酰化的,如描述于Resh(2016)《脂质研究进展》(Progress in Lipid Research)63:120–131。可被偶联的脂肪酸的例子包括肉豆蔻酸、棕榈酸和棕榈油酸。肉豆蔻酸通常被连接至N-末端甘氨酸,但赖氨酸也可以被肉豆蔻酰化。棕榈酰化通常通过对游离的半胱氨酸-SH基团的酶促修饰来实现,例如DHHC蛋白催化S-棕榈酰化。丝氨酸和苏氨酸残基的棕榈酰化通常通过使用PORCN酶酶促实现。
乙酰化
在一些实施方式中,IL-2突变蛋白在N-末端通过与N-末端乙酰转移酶和,例如,乙酰CoA的酶促反应被乙酰化。替代或除了N-末端乙酰化之外,IL-2突变蛋白在一个或多个赖氨酸残基处乙酰化,例如通过与赖氨酸乙酰转移酶的酶促反应。参见,例如,Choudhary等(2009)Science 325(5942):834L2 ortho840。
Fc融合体
在一些实施方式中,IL2融合蛋白可以纳入来源于IgG抗体亚类的Fc区,其缺乏IgG重链可变区。"Fc区"可以是天然存在或合成的多肽,其与用木瓜蛋白酶消化IgG产生的IgGC-末端结构域同源。IgG Fc的分子量约为50kDa。突变的IL-2多肽可以包含整个Fc区,或保留延长其作为嵌合多肽的部分的循环半衰期能力的较小部分。此外,全长或片段的Fc区可以是野生型分子的变体。即,它们可以包含可能影响或不影响多肽功能的突变;正如下文进一步描述的那样,在所有情况下都不需要或不希望有天然活性。在某些实施方式中,IL-2突变蛋白融合蛋白(如本文所述的IL-2部分激动剂或拮抗剂)包括IgGl、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区。示例性Fc区可以包括抑制补体固定和Fc受体结合的突变,或者它可以是裂解性的,即能够结合补体或通过另一种机制如抗体依赖性补体裂解(ADCC)来裂解细胞。
在一些实施方式中,IL2突变蛋白包含Fc融合体嵌合多肽分子的功能域。Fc融合体偶联物已被证明可以增加生物药物的全身半衰期,因此,生物药物产品可以不需要频繁给药。Fc结合至衬垫在血管的内皮细胞中的新生Fc受体(FcRn),结合后,Fc融合分子被保护,不被降解并重新释放到循环中,使分子在循环中保持更长的时间。这种Fc结合被认为是内源性IgG保持其长血浆半衰期的机制。最近的Fc融合体技术将一份生物药物的单拷贝连接至抗体的Fc区,与传统的Fc融合体偶联物相比,优化了生物药物的药代动力学和药效动力学特性。用于制备Fc融合体的"Fc区"可以是天然存在或合成的多肽,其与用木瓜蛋白酶消化IgG产生的IgG C-末端结构域同源。IgG Fc的分子量约为50kDa。IL2突变蛋白可以提供整个Fc区,或保留延长其作为嵌合多肽的循环半衰期能力的较小部分。此外,全长或片段的Fc区可以是野生型分子的变体。在一个典型的呈现中,二聚体Fc的每个单体携带异源多肽,异源多肽是相同或不同的。
在一些实施方式中,当IL2突变蛋白要以Fc融合体的形式给予时,特别是在那些偶联至Fc二聚体的各个亚单位的多肽链不同的情况下,Fc融合体可以被工程改造为具有“杵臼(knob-into-hole)修饰”。杵臼修饰更全面地描述于Ridgway,等(1996)《蛋白质工程改造》(Protein Engineering)9(7):617-621和1998年3月24日授权的美国专利号5,731,168。杵臼修饰是指在CH3结构域中两个免疫球蛋白重链之间界面的修饰,其中:i)在第一条重链的CH3结构域中,氨基酸残基被具有较大侧链的氨基酸残基(例如,酪氨酸或色氨酸)替代,从表面产生突起(“杵”)和ii)在第二条重链的CH3结构域中,氨基酸残基被具有较小侧链的氨基酸残基(如丙氨酸或苏氨酸)替代,从而在第二CH3结构域的界面内产生空腔(“臼”),其中第一CH3结构域的突出侧链(“杵”)被第二CH3结构域中的空腔接收。在一个实施方式中,“杵臼修饰”包括抗体重链之一中的氨基酸取代T366W和任选地氨基酸取代S354C,和另一个抗体重链中的氨基酸取代T366S、L368A、Y407V和任选地Y349C。此外,Fc结构域可以通过在S354和Y349位置引入半胱氨酸残基进行修饰,从而在Fe区的两个抗体重链之间产生稳定的二硫键(Carter,等(2001)Immunol Methods 248,7-15)。杵臼形式用于促进在具有“杵”修饰的第一Fc单体上第一多肽(如IL2突变蛋白)的表达和在具有“臼”修饰的第二Fc单体上的第二多肽的表达,以促进异二聚体多肽偶联物的表达。
Fc区可以是"溶解性"或"非溶解性"的,但通常是非溶解性的。非溶解性Fc区通常缺乏高亲和力Fc受体结合位点和Clq结合位点。鼠IgG Fc的高亲和力Fc受体结合位点包括IgG Fc第235位的Leu残基。因此,Fc受体结合位点可以通过突变或缺失Leu 235而被抑制。例如,用Glu取代Leu235抑制Fc区结合至高亲和力Fc受体的能力。通过突变或缺失IgG的Glu318、Lys 320和Lys 322残基,可以在功能上破坏鼠Clq结合位点。例如,用Ala残基取代Glu 318、Lys 320和Lys 322,使IgG1 Fc不能引导抗体依赖性补体裂解。与此相反,溶解性IgG Fc区具有高亲和力Fc受体结合位点和Clq结合位点。高亲和力的Fc受体结合位点包括IgG Fc的235位Leu残基,而Clq结合位点包括IgG 1的Glu 318、Lys 320和Lys 322残基。溶解性IgG Fc在这些位点具有野生型残基或保守的氨基酸取代。溶解性IgG Fc可以针对细胞进行抗体依赖性细胞毒性或补体定向细胞溶解(CDC)。人IgG的适当突变也是已知的(参见,例如,Morrison等,The Immunologist2:119-124,1994;和Brekke等,The Immunologist 2:125,1994)。
在某些实施方式中,本发明的IL2突变蛋白的氨基或羧基末端可与免疫球蛋白Fc区(如人Fc)融合,形成融合体偶联物(或融合分子)。Fc融合体偶联物已被证明可以增加生物药物的全身半衰期,因此,生物药物产品可以不需要频繁给药。Fc结合至衬垫在血管的内皮细胞中的新生Fc受体(FcRn),结合后,Fc融合分子被保护,不被降解并重新释放到循环中,使分子在循环中保持更长的时间。这种Fc结合被认为是内源性IgG保持其长血浆半衰期的机制。最近的Fc融合体技术将一份生物药物的单拷贝连接至抗体的Fc区,与传统的Fc融合体偶联物相比,优化了生物药物的药代动力学和药效动力学特性。
在一些实施方式中,Fc结构域单体包括相对于野生型人IgG1、IgG2或IgG4 Fc区域的至少一个突变,如美国专利号US10259859B2所述,其全部教导通过引用纳入本文。如本文所公开的,Fc结构域单体包括:
相对于野生型人IgG1的下列氨基酸取代之一:
T366W、T366S、L368A、Y407V、T366Y、T394W、F405W、Y349T、Y349E、Y349V、L351T、L351H、L351N、L351K、P353S、S354D、D356K、D356R、D356S、E357K、E357R、E357Q、S364A、T366E、L368T、L368Y、L368E、K370E、K370D、K370Q、K392E、K392D、T394N、P395N、P396T、V397T、V397Q、L398T、D399K、D399R、D399N、F405T、F405H、F405R、Y407T、Y407H、Y407I、K409E、K409D、K409T或K409I;
或
(b)(i)N297A突变,相对于人IgG1 Fc区;
(ii)L234A、L235A和G237A突变,相对于人IgG1 Fc区;
(iii)L234A、L235A、G237A和N297A突变,相对于人IgG1 Fc区;
(iv)N297A突变,相对于人IgG2 Fc区;
(v)A330S和P331S突变,相对于人IgG2 Fc区;
(vi)A330S、P331S和N297A突变,相对于人IgG2 Fc区;
(vii)S228P、E233P、F234V、L235A和delG236突变,相对于人IgG4Fc区;或
(viii)S228P、E233P、F234V、L235A、delG236和N297A突变,相对于人IgG4 Fc区。
在一些实施方式中,Fc结构域单体包括:
相对于野生型人IgG1的下列氨基酸取代之一:T366W、T366S、L368A、Y407V、T366Y、T394W、F405W、Y349T、Y349E、Y349V、L35IT、L351H、L351N、L351K、P353S、S354D、D356K、D356R、D356S、E357K、E357R、E357Q、S364A、T366E、L368T、L368Y、L368E、K370E、K370D、K370Q.K392E、K392D、T394N、P395N、P396T、V397T、V397Q、L398T、D399K、D399R、D399N、F405T、F405H、F405R、Y407T、Y407H、Y407I、K409E、K409D、K409T或K409I;
以及
(b)Fc结构域单体进一步包括
(i)N297A突变,相对于人IgG1 Fc区;
(ii)L234A、L235A和G237A突变,相对于人IgG1 Fc区;
(iii)L234A、L235A、G237A和N297A突变,相对于人IgG1 Fc区;
(iv)N297A突变,相对于人IgG2 Fc区;
(v)A330S和P331S突变,相对于人IgG2 Fc区;
(vi)A330S、P331S和N297A突变,相对于人IgG2 Fc区;
(vii)S228P、E233P、F234V、L235A和delG236突变,相对于人IgG4Fc区;或
(viii)S228P、E233P、F234V、L235A、delG236和N297A突变,相对于人IgG4 Fc区。
在一些实施方式中,与具有野生型人IgG Fc区的多肽相比,该多肽在吞噬试验中表现出吞噬作用的降低。在一些实施方式中,Fc结构域单体连接至包含第二Fc结构域单体的第二多肽,形成Fc结构域二聚体。
嵌合多肽/融合蛋白
在一些实施方式中,IL2突变蛋白可以包含嵌合多肽的功能域。本发明的IL2突变蛋白融合蛋白可以通过本领域已知的技术通过重组DNA方法容易地生产,通过构建重组载体,该载体包含核酸序列,该核酸序列包括在框内的编码IL2突变蛋白的核酸序列与编码IL2突变蛋白的N-末端或C-末端融合伴侣的核酸序列,该序列可任选地进一步包括在框内的编码接头或间隔子多肽的核酸序列。
在一些实施方式中,IL2突变蛋白被(通过化学方式,或在多肽试剂的情况下(例如抗体或疫苗的情况下)以融合蛋白形式)偶联至其他化学或生物试剂,其包括治疗性化合物,例如抗炎、抗微生物或抗病毒化合物,或在治疗自身免疫疾病中有用的其他试剂,包括生物制剂(例如依那西普(entaracept))、单克隆抗体。抗微生物剂包括氨基糖苷类(包括庆大霉素),抗病毒化合物,例如利福平(rifampicin)、3′-叠氮-3′-脱氧胸苷(AZT)和阿昔洛韦(acyclovir),抗真菌剂,例如唑类,包括氟康唑(fluconazole)、大环内酯类(plyremacrolide),例如两性霉素B和杀念菌素(candicidin),抗寄生生物化合物,例如含锑剂(antimonial)等。IL2突变蛋白可以被偶联至其他细胞因子如CSF、GSF、GMCSF、TNF、促红细胞生成素(erythropoietin),免疫调节剂或细胞因子,例如干扰素或白细胞介素,神经肽,生殖激素,例如HGH、FSH或LH,甲状腺激素,神经递质,如乙酰胆碱,激素受体,例如雌激素受体。还包括非甾体抗炎药,例如吲哚美辛、醋酸水杨酸、布洛芬、舒林酸、吡罗昔康和萘普生,以及麻醉剂或镇痛剂。还包括放射性同位素,如那些对成像以及治疗有用的放射性同位素。
IL-2突变蛋白也可以被偶联至皮质类固醇(包括但不限于强的松、布地奈德、泼尼松龙(prednilisone))、Janus激酶抑制剂(包括但不限于托法替尼钙调磷酸酶抑制剂(包括但不限于环孢菌素和他克莫司)、mTor抑制剂(包括但不限于西罗莫司和依维莫司)、IMDH抑制剂(包括但不限于硫唑嘌呤、来氟米特和霉酚酸酯(mycophenolate))。IL-2突变蛋白也可以被偶联至生物制剂,例如阿巴西普(abatcept)或依那西普(etanercept)IL-2突变蛋白还可以被偶联至治疗性抗体,例如抗-CD25抗体(例如达克珠单抗和巴利昔单抗)、抗-VLA-4抗体(例如那他珠单抗),抗-CD52抗体(例如阿仑单抗),抗-CD20抗体(例如利妥昔单抗、奥瑞珠单抗),抗-TNF抗体(例如,英夫利昔单抗和阿达木单抗),抗-IL-6R抗体(例如托珠单抗),抗-TNFα抗体(例如阿达木单抗戈利木单抗和英夫利昔单抗),抗-整合素-α4β7抗体(例如维多珠单抗),抗-IL-17a抗体(例如布达鲁单抗(brodalumab)或苏金单抗),抗-IL-4Rα抗体(例如达必妥(dupilumab)),抗-RANKL(例如),抗体IL-6R抗体,抗-IL-1β抗体(例如卡那基单抗),抗-CD11a抗体(例如依法利珠单抗),抗-CD3抗体(例如莫罗单抗(muramonab)),抗-IL5抗体(例如美泊珠单抗(mepolizumab)、瑞利珠单抗),抗-BLyS抗体(例如贝利单抗);和抗-IL-12/IL-23抗体(例如乌司奴单抗)。
IL-2突变蛋白还可以被偶联至,例如,HSV疫苗,百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis),大肠杆菌疫苗,肺炎球菌疫苗(pneumococcal vaccine),其包括多价肺炎球菌疫苗例如13,白喉类毒素(diptheria toxoid),破伤风类毒素和百日咳疫苗(包括组合疫苗例如)和),水痘疫苗,B型流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae type B)(HIB)疫苗,人乳头瘤病毒(HPV)疫苗例如小儿麻痹症,钩端螺旋体病疫苗(Leptospirosis vaccines),组合呼吸道疫苗,莫拉氏菌(Moraxella)疫苗,以及减毒或灭活病毒产品,例如牛呼吸道疾病疫苗(RSV),人流感疫苗例如和Quadravlent),猫白血病病毒疫苗(feline leukemia vaccine),传染性肠胃炎疫苗和狂犬病疫苗。
本发明的IL2突变蛋白可以使用众所周知的化学偶联方法化学偶联至这种其他试剂。双功能交联剂例如本领域已知的同功能和异功能交联剂可用于此目的。使用的交联剂的类型取决于将要偶联至IL-2突变蛋白的分子的性质,本领域技术人员可以很容易地确定。或者或另外,IL2突变蛋白和/或意在与之偶联的分子可以被化学衍生化,使得二者在单独地反应中被偶联,这也是本领域众所周知的。
Flag标签
在其他的实施方式中,IL2突变蛋白可以被修饰为包括功能为抗原标签的其他多肽序列,例如FLAG序列。如本文所述,FLAG序列可被生物素化、高特异性的抗-FLAG抗体识别(参见例如,Blanar等(1992)Science256:1014和LeClair,等(1992)PNAS-USA 89:8145)。在一些实施方式中,IL2突变蛋白多肽进一步包括C-末端的c-myc表位标签。
His标签
在一些实施方式中,本发明的IL2突变蛋白(包括这种IL2突变蛋白的融合蛋白)被表达为具有一个或多个过渡金属螯合多肽序列的融合蛋白。纳入这种过渡金属螯合结构域促进纯化固定化金属亲和层析(IMAC),如Smith等1986年2月11日授权的美国专利第4,569,794号所述。在本发明的实践中有用的过渡金属螯合多肽的例子描述于Smith等(同上)以及Dobeli等的1995年5月10日授权的美国专利第5,320,663号,其中的全部教导通过引用纳入此处。在本发明的实践中有用的具体过渡金属螯合多肽是包含3-6个连续的组氨酸残基的肽,例如6-组氨酸肽(His)6,在本领域经常被称为“His-标签”。
靶向部分:
在一些实施方式中,IL2突变蛋白以融合蛋白提供,其与促进选择性结合至表达细胞表面分子的特定细胞类型或组织的多肽序列(“靶向结构域”)融合,所述细胞表面分子特异性结合至这种靶向结构域。在一些实施方式中,靶向结构域是特异性结合至选自下组的蛋白质的表面蛋白的抗体(特别是单结构域抗体,scFv或VHH)或配体:BLyS、CD11a、CD20、CD25、CD3、CD52、IgEIL-12/IL-23、IL-17a、IL-1β、IL-4Rα、IL-5、IL-6R、整合素-α4β7、RANKL、TNFα、VEGF-A、VLA-4。
IL2突变蛋白的制备
IL2突变蛋白可以通过用于构建多肽的常规方法生产,包括重组或固相合成。
化学合成:
除了通过已经通过重组分子生物技术替换的核酸分子的表达产生突变多肽之外,主体IL-2突变蛋白可以化学合成。化学合成多肽可以由本领域技术人员常规地生产。化学合成包括通过化学方式进行的编码表现出所述特性的IL-2突变蛋白的蛋白质序列的肽的直接合成。该方法可以在影响IL2和CD25、CD122和CD132的相互作用的位置纳入天然和非天然的氨基酸。
在一些实施方式中,本发明的IL2突变蛋白可以通过化学合成制备。IL2突变蛋白的化学合成可以通过液相或固相进行。固相肽合成(SPPS)允许纳入非天然氨基酸和/或肽/蛋白质骨架修饰。可用于合成本发明的IL2突变蛋白的SPPS的多种形式是本领域已知的(例如,Ganesan A.(2006)Mini Rev.Med.Chem.6:3-10;和Camarero等,(2005)Protein PeptLett.12:723-8)。在化学合成的过程中,α官能团和任何反应性侧链可以用酸不稳定或碱不稳定基团保护,其在进行连接酰胺键的条件下是稳定的,但在不损害已形成的肽链的情况下容易被裂解。
在固相合成中,N-末端或C-末端氨基酸可以被偶联至合适的支持材料。合适的支持材料是那些对合成过程中逐步缩合和裂解反应的试剂盒反应条件惰性的材料,并且不溶解于正在使用的反应介质。市售可得的支持材料的例子包括用活性基团和/或聚乙二醇修饰的苯乙烯/二乙烯基苯共聚物;氯甲基化的苯乙烯/二乙烯基苯共聚物;羟甲基化或氨基甲基化的苯乙烯/二乙烯基苯共聚物等。被保护氨基酸的连续偶联可以根据肽合成中的常规方法进行,通常在自动肽合成仪中进行。
在固相合成结束时,从支持材料上将肽裂解下来,同时裂解侧链保护基团。所获得的肽可以通过多种层析方法纯化,包括但不限于疏水吸附层析、离子交换层析、分配层析、高压液相色谱和反相HPLC。
重组生产:
或者,通过重组DNA技术生产本发明的IL2突变蛋白。在多肽的重组生产的典型实践中,编码所需多肽的核酸序列被纳入适合用于将要完成表达的宿主细胞的表达载体中,核酸序列被可操作地连接至该载体编码的一个或多个表达控制序列,并在目标宿主细胞中发挥功能。如果在多肽中纳入分泌前导序列(信号肽),重组蛋白可以通过破坏宿主细胞或从细胞介质中回收。重组蛋白可以被纯化和浓缩用于进一步用途,包括纳入。IL2多肽的重组生产的过程是本领域已知的,描述于Fernandes和Taforo,美国专利号4,604,377,1986年8月5日授权,以及IL2突变蛋白描述于Mark等美国专利号4,512,584,1985年5月21日授权,Gillis,美国专利号4,401,756,1983年8月30日授权,其全部教导通过引用纳入本文。
编码IL2突变蛋白的核酸序列的构建
在一些实施方式中,IL突变蛋白通过重组方法生产,使用编码IL2突变蛋白(或包含IL2突变蛋白的融合蛋白)的核酸序列。编码所需IL-2突变蛋白的核酸序列可以替代地使用寡核苷酸合成仪通过化学方式合成。
核酸序列不限于编码多肽的序列;也可以包括位于编码序列(例如,IL-2的编码序列)的上游或下游的部分或全部非编码序列。分子生物学的本领域技术人员熟知用于分离核酸分子的常规操作。例如,他们可以用限制性核酸内切酶处理基因组DNA或通过进行聚合酶链式反应(PCR)产生。如果核酸分子是核糖核酸(RNA),分子可以,例如,通过体外转录产生。
编码IL2突变蛋白的核酸分子(及其融合体)可以包含天然存在的序列或不同于天然存在序列的序列,但由于遗传密码的简并性,其编码相同的多肽。这些核酸分子可以由以下组成:RNA或DNA(例如基因组DNA、cDNA或合成DNA,例如通过基于亚磷酰胺的合成(phosphoramidite-based synthesis)产生的)或这些类型核酸内核苷酸的组合或修饰。此外,核酸分子可以是双链的或单链的(即正义链或反义链)。
编码IL突变蛋白的核酸序列可以获取自提供定制核酸序列的多种商业来源。生产本发明的IL2突变蛋白的IL多肽的氨基酸序列变体是基于本领域众所周知的遗传密码将合适的核苷酸变化纳入编码序列来制备的。这种变体表示所指出的残基的插入、取代和/或特异性缺失。插入、取代和/或特异性缺失的任何组合都可以得到最终的构建体,只要最终的构建体拥有本文定义的所需生物活性。
构建编码IL-2突变蛋白的DNA序列和在合适的转化的宿主中表达这些序列的方法包括但不限于使用PCR-辅助诱变技术。也可以用标准重组技术向IL-2多肽中制造由氨基酸残基缺失或添加组成的突变。如果缺失或添加,编码IL-2的核酸分子任选地用合适的限制性核酸内切酶消化。所得片段可以直接表达,或通过,例如,连接至第二片段来进一步操作。如果核酸分子的两个末端包含相互重叠的互补核苷酸,则可以促进连接,但也可以连接平末端片段。PCR产生的核酸也可以用于产生多种突变序列。
本发明的IL2突变蛋白不仅可以直接重组生产,而且可以与异源多肽(例如信号序列或其他在成熟IL2突变蛋白的N-末端或C-末端具有特定裂解位点的多肽)的融合多肽形式生产。通常,信号序列可以是载体的组分,也可以是插入到载体中的编码序列的部分。所选择的异源信号序列优选是被宿主细胞识别和处理(即被信号肽酶裂解)的序列。在一些实施方式中,信号序列是与IL2突变蛋白天然相关联的信号序列(即人IL2信号序列)。信号序列的包含取决于其是否需要从制备的重组细胞分泌IL-2突变蛋白。如果所选细胞是原核细胞,通常优选DNA序列不编码信号序列。如果所选细胞是真核细胞,通常优选编码信号序列,最优选使用野生型IL-2信号序列。或者,异源哺乳动物信号序列也是合适的,例如来自相同或相关物种的分泌多肽的信号序列,以及病毒分泌前导序列,例如单纯疱疹gD信号。当重组宿主细胞是酵母细胞,例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)时,可以使用α交配因子分泌信号序列(alpha mating factor secretion signal sequence)以实现IL2突变蛋白的胞外分泌,进入培养基,如描述于Singh,美国专利号7,198,919B1,2007年4月3日授权。
如果要表达的IL2突变蛋白待以嵌合体(chimera)形式表达(例如包含IL2突变蛋白和异源多肽序列的融合蛋白),则嵌合蛋白可以由杂交核酸分子编码,其包含编码所有或部分IL-2突变蛋白的第一序列和编码所有或部分异源多肽的第二序列。例如,本文所述的主体IL-2突变蛋白可以被融合至六-组氨酸标签,以促进细菌表达的蛋白的纯化,或融合至血凝素标签,以促进真核细胞中表达的蛋白的纯化。所谓第一和第二,不应理解为限制融合蛋白的元件取向,异源多肽可以被连接至IL2突变蛋白的N-末端和/或C-末端。例如,N-末端可以被连接至靶向部分,C-末端连接至六-组氨酸标签)纯化柄。
要表达的多肽(或融合体/嵌合体)的完整氨基酸序列可以被用于构建回译基因(back-translated gene)。可以合成含有编码IL-2突变蛋白的核苷酸序列的DNA寡聚物。例如,可以合成编码部分所需多肽的一些小寡核苷酸,然后连接。单个的寡核苷酸通常包含5’或3’突出端用于互补组装。
密码子优化:
在一些实施方式中,编码IL2突变蛋白的核酸序列可以是“密码子优化”的以促进在特定宿主细胞类型中的表达。在多种表达系统,包括哺乳动物、酵母和细菌宿主细胞中密码子优化的技术是本领域众所周知的,且有在线工具以提供用于在多种宿主细胞类型中表达的密码子优化的序列。参见例如,Hawash,等(2017)9:46-53和Mauro和Chappell在《哺乳 动物细胞中重组蛋白表达:方法和方案》(Recombinant Protein Expression in Mammalian Cells:Methods and Protocols),David Hacker编(胡马纳出版社(HumanPress)纽约)。此外,有多种基于网络的在线软件可以免费使用,以协助制备密码子优化的核酸序列。
表达载体的构建:
组装(通过合成、定点诱变或另一方式)后,编码IL-2突变蛋白的核酸序列将被插入表达载体。可以使用用于多种宿主细胞中的多种表达载体,通常是基于用于表达的宿主细胞选择。表达载体通常包含但不限于以下一个或多个:复制起点,一个或多个标志物基因,增强子元件、启动子和转录终止序列。载体包括病毒载体、质粒载体、整合载体等。质粒是非病毒载体的例子。
为了促进重组多肽的高效表达,要表达的编码多肽序列的核酸序列被可操作地连接至在所选的表达宿主中发挥功能的转录和翻译调控序列。
可选择标志物:
表达载体通常包含选择基因,也被称为可选择标志物。该基因编码转化的宿主细胞在选择性培养基中生长的存活或生长所必需的蛋白质。未用含有选择基因的载体转化的宿主细胞无法在培养基中存活。典型的选择基因编码蛋白质,其将(a)赋予对抗生素或其他毒素例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素的抗性;(b)弥补营养缺陷型缺陷;或(c)提供无法从复合培养基中获得的关键营养素。
调控序列:
用于本发明的IL2突变蛋白的表达载体包含调节序列,其被宿主生物体识别且可操作地连接至编码IL2突变蛋白的核酸序列。术语“调控序列”、“调节序列”或“表达控制序列”在本文中可互换使用,指启动子、增强子和其他表达控制元件(例如聚腺苷酸化信号)。参见,例如Goeddel(1990)于《基因表达技术:酶学方法》(Gene Expression Technology:Methods in Enzymology)185(学术出版社(Academic Press),美国加利福尼亚州圣地亚哥。调节序列包括在许多类型的宿主细胞中引导组成型表达的核苷酸序列,和仅在某些宿主细胞中引导表达的核苷酸序列(例如,组织特异性调节序列)。本领域技术人员将理解,表达载体的设计可能取决于例如要转化的宿主细胞的选择,所需蛋白质的表达水平等因素。在表达控制序列的选择中,本领域技术人员理解将要考虑多种因素。这些包括,例如,序列的相对强度、它的可控性,以及它与编码主体IL-2突变蛋白的实际DNA序列的相容性,特别是关于潜在的二级结构。
启动子:
在一些实施方式中,调节序列是启动子,其选择基于,例如,寻求在其中表达的细胞类型。启动子是位于结构基因起始密码子上游(5')的非翻译序列(通常在约100到1000bp内),其控制与其可操作地连接的特定核酸序列的转录和翻译。这种启动子通常分为两类,诱导型的和组成型的。诱导型启动子是对培养条件的某些变化(如营养物的存在或不存在或温度的变化)反应,从其控制下的DNA启动增加转录水平的启动子。多种潜在的宿主细胞所识别的大量启动子是众所周知的。
在细菌中可以使用T7启动子,在昆虫细胞中可以使用多角体蛋白启动子,在哺乳动物细胞中可以使用巨细胞病毒或金属硫蛋白(metallothionein)启动子。另外,在高等的真核细胞的情况下广泛使用组织特异性和细胞特异性启动子。这些启动子以其在给定的体内组织或细胞类型中核酸分子的指导表达的能力而命名。技术人员知晓许多可用于核酸的指导表达的启动子和其他调节元件。
哺乳动物宿主细胞中载体的转录可以被控制,由,例如,从病毒基因组中获得的启动子,例如多瘤病毒、牛痘病毒、腺病毒(如人类腺病毒血清型5)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒(如鼠干细胞病毒)、乙肝病毒和最理想的猿猴病毒40(SV40),来自异源哺乳动物的启动子,例如,肌动蛋白启动子、PGK(磷酸甘油酸激酶)或免疫球蛋白启动子,来自热休克启动子,只要这些启动子与宿主细胞系统相容。SV40病毒的早期和晚期启动子可方便地以SV40限制性片段形式获得,该片段也含有SV40病毒的复制起点。
增强子:
高等真核生物的转录通常通过在载体中插入增强子序列来增加。增强子是DNA的顺式作用元件,通常约为10至300bp,它作用于启动子以增加其转录。增强子的取向和位置相对独立,在转录单元的5'和3'处、内含子内以及编码序列本身内都有发现。现在已经从哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)中得知了许多增强子序列。然而,通常人们会使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括复制起点后侧的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点后侧的多瘤增强子和腺病毒增强子。增强子可以被剪接到表达载体中编码序列的5'或3'的位置,但优选是位于离启动子5'的位置。用于真核宿主细胞的表达载体还将包含用于终止转录和用于稳定化mRNA所必需的序列。这种序列通常可以从真核生物或病毒DNA或cDNA的5',偶尔3'非翻译区获得。含有一个或多个上述组分的合适载体的构建采用了标准技术。
除了促进插入核酸分子的转录的序列之外,载体可以包含复制起点和其他编码可选择标志物的基因。例如,新霉素-抗性(neoR)基因赋予其表达细胞G418抗性,因而允许对转染的细胞进行表型选择。标志物或报告基因的其他例子包括β-内酰胺酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、腺苷脱氨酶(ADA)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、潮霉素-B-磷酸转移酶(HPH)、胸苷激酶(TK)、lacZ(编码β-半乳糖苷酶)和黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT)。本领域技术人员可以容易地确定给定的调节元件或可选择标志物适合或不适合用于特定表达环境。
表达载体的正确组装可以通过核酸测序、限制性图谱和在合适宿主中生物活性多肽的表达来确认。
宿主细胞:
本发明进一步提供原核或真核细胞,其包含和表达编码IL-2突变蛋白的核酸分子。本发明的细胞是转染的细胞,即核酸分子进入的细胞,例如已经通过重组DNA技术引入编码突变IL-2多肽的核酸分子的。这种细胞的子代也被认为在本发明的范围内。
通常根据它们与所选表达载体的相容性、本发明DNA序列编码的产物的毒性、它们的分泌特性、它们正确折叠多肽的能力、它们的发酵或培养要求、以及DNA序列编码的产物的纯化难易程度来选择宿主细胞。用于克隆或表达本文载体中DNA的合适宿主细胞是上述的原核细胞、酵母或高等真核细胞。
在一些实施方式中重组IL-2突变蛋白或其生物活性变体也可以在真核细胞中制备,例如酵母或人细胞。合适的真核宿主细胞包括昆虫细胞(例如在培养的昆虫细胞中可用于蛋白表达的杆状病毒载体(例如Sf9细胞)包括pAc系列(Smith等(1983)Mol.CellBiol.3:2156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)Virology 170:31-39));酵母细胞(例如用于在酵母啤酒酵母(S.cerenvisiae)(包括pYepSecl)中表达的载体(Baldari等(1987)EMBO J.6:229-234),pMFa(Kurjan和Herskowitz(1982)Cell 30:933-943),pJRY88(Schultz等(1987)Gene 54:113-123),pYES2(英杰公司(Invitrogen Corporation),加利福尼亚州圣地亚哥)和pPicZ(英杰公司,加利福尼亚州圣地亚哥));或哺乳动物细胞(哺乳动物表达载体包括pCDM8(Seed(1987)Nature 329:840)和pMT2PC(Kaufman等(1987)EMBOJ.6:187:195))。
有用的哺乳动物宿主细胞系的例子为,小鼠L细胞(L-M[TK-],ATCC号CRL-2648)、由SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7,ATCC CRL 1651);人胚胎肾细胞系(HEK293或HEK293细胞亚克隆,在悬浮培养中生长;幼仓鼠肾细胞(BHK,ATCC CCL 10);中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO);小鼠塞尔托利氏细胞(TM4);猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70);非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCC CRL-1 587);人宫颈癌细胞(HELA,ATCC CCL 2);犬肾细胞(MDCK,ATCC CCL34);水牛鼠肝细胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442);人肺细胞(W138,ATCC CCL 75);人肝细胞(Hep G2,HB 8065);小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562,ATCC CCL51);TRI细胞;MRC 5细胞;FS4细胞;和人肝癌细胞系(Hep G2)。在哺乳动物细胞中,表达载体的控制功能通常通过病毒调控元件提供。例如,常用的启动子源自多瘤病毒、腺病毒2型、巨细胞病毒和猿猴病毒40。
IL-2突变蛋白可以在原核宿主中,例如细菌大肠杆菌,或在真核宿主中,例如昆虫细胞(例如Sf21细胞)或哺乳动物细胞(例如COS细胞、NIH 3T3细胞或HeLa细胞)中生产。这些细胞可以从许多来源获得,包括美国典型培养物保藏中心(弗吉尼亚州马萨纳斯)。在选择表达系统时,最重要的是各组分之间相容。本领域技术人员能够做这种决定。此外,如果在选择表达系统时需要指导,本领域技术人员可以查阅Ausubel等(《新编分子生物学方案》(Current Protocols in Molecular Biology),John Wiley和Sons,纽约州纽约,1993)和Pouwels等(《克隆载体:实验室手册》(Cloning Vectors:A Laboratory Manual),1985增刊1987)。
在一些实施方式中,获得的IL-2突变蛋白是糖基化的或未糖基化的,取决于用于生产突变蛋白的宿主生物体。如果选择细菌作为宿主,那么生产的IL-2突变蛋白将是未糖基化的。另一方面,真核细胞将糖基化该IL-2突变蛋白,虽然或许与天然-IL-2糖基化的方式不同。
关于用于原核和真核细胞的其他表达系统,参见Sambrook等(1989)《分子克隆:实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(第2版,冷泉港实验室出版社,纽约州普莱恩维尤)的第16和17章。参见,Goeddel(1990)于《基因表达技术:酶学方法》(GeneExpression Technology:Methods in Enzymology)185(学术出版社,加利福尼亚州圣地亚哥)。
转染:
该表达构建体可以被引入宿主细胞以从而生产本文公开的IL-2突变蛋白,或以生产其生物学活性突变蛋白。载体DNA可以通过常规转化或转染技术被引入原核或真核细胞。关于用于转化或转染宿主细胞的合适的方法可以在Sambrook等(1989)《分子克隆:实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(第2版,冷泉港实验室出版社,纽约州普莱恩维尤)中和其他标准分子生物学实验手册中找到。
为了促进目标细胞的转染,可以在有利于摄取非病毒载体的条件下使目标细胞直接暴露于非病毒载体。促进哺乳动物细胞摄取外源核酸的条件的例子在本领域是众所周知的,包括但不限于化学手段(例如赛默飞世尔科技(Thermo-FisherScientific)),高盐和磁场(电穿孔)。
细胞培养:
细胞可以在被改良为适合用于诱导启动子、选择转化子或扩增编码所需序列的基因的常规营养培养基中培养。哺乳动物宿主细胞可以在多种培养基中培养。市售可得的培养基如汉姆氏F10(Ham's F10)(西格玛(Sigma))、最小必需培养基((MEM),西格玛)、RPMI1640(西格玛)和达氏改良的伊氏培养基((DMEM),西格玛)都适合培养宿主细胞。任何这些培养基可根据需要补充激素和/或其他生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐类(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(如HEPES)、核苷(如腺苷和胸苷)、抗生素、微量元素和葡萄糖或等同的能量来源。任何其他必需的补充剂也可以以本领域技术人员已知的适当浓度包含。培养条件,如温度、pH值等,是以前用于选择表达的宿主细胞的条件,对普通技术人员来说是显而易见的。
重组蛋白回收:
如果使用分泌前导序列,重组生产的IL2突变蛋白多肽可以以分泌多肽形式从培养基中回收。或者,IL2突变蛋白多肽也可以从宿主细胞裂解物中回收。蛋白酶抑制剂,例如苯基甲基磺酰氟(PMSF)可以在从细胞裂解物种回收阶段中使用,以抑制纯化过程中的蛋白酶降解,并可包括抗生素以防止外源污染物的生长。
纯化:
各种纯化步骤是本领域已知的,并且可以寻用,例如亲和层析。亲和层析利用了通常存在于生物大分子中的高度特异性结合位点,根据分子与特定配体结合的能力将其分离。共价键将配体附接至不溶性的多孔支持介质上,使配体明显地呈现在蛋白质样品上,从而利用一种分子种类的天然特异性结合,从混合物中分离和纯化第二种类。抗体通常用于亲和层析。也可以使用尺寸选择步骤,例如,凝胶过滤层析(也被称为尺寸排阻或分子筛层析)用于根据蛋白质的尺寸进行分离。在凝胶过滤中,蛋白质溶液通过由半透性多孔树脂填充的柱。半透性树脂具有孔径范围,决定了可以用该柱分离的蛋白质的大小。
由转化的宿主生产的IL-2突变蛋白可以根据任何合适的方法纯化。用于纯化IL-2的各种方法是已知的。参见,例如《新编蛋白质科学方案》
(Current Protocols in Protein Science),卷2.编者:John E.Coligan,BenM.Dunn,Hidde L.Ploehg,David W.Speicher,Paul T.Wingfield,第6.5单元(1997,约翰威利父子公司(John Wiley and Sons,Inc.)版权所有。IL-2突变蛋白可以从大肠杆菌中产生的包涵体中分离出来,或从生产特定突变蛋白的哺乳动物或酵母培养物的条件培养基中,使用阳离子交换、凝胶过滤和或反相液相色谱分离出来。
重组多肽的基本纯化形式可以用常规的生化程序从表达系统中纯化出来,并可以如本文所述,作为治疗剂使用。
IL-2突变蛋白的生物学活性可以通过任何合适的本领域已知方法评估,并且可以作为基本纯化形式评估,或者当使用分泌前导序列表达时作为细胞裂解物或细胞培养基的部分评估。这种活性试验包括CTLL-2增殖、T细胞中磷酸化-STAT5(pSTAT5)活性的诱导、PHA-原始增殖(PHA-blast proliferation)和NK细胞增殖。
制剂
为了治疗性应用,突变蛋白可以被给予哺乳动物。给予可以是静脉内的,以推注或通过一段时间内连续输注的方式给予。给予的替代性途径包括肌肉内、腹膜内、脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径。IL2突变蛋白还可以适合地通过瘤内、癌旁、病灶内、结内或病灶周围途径给予,或给予淋巴以发挥局部以及全身治疗作用。
在一些实施方式中,主体IL-2突变蛋白(和/或核酸可以被纳入组合物,包括药物组合物。这种组合物通常包括多肽或核酸分子和药学上可接受的运载体。制备药物组合物以相容于其意在给予的途径,且相容于治疗用途,用于给予需要治疗或预防的对象IL2突变蛋白。
肠胃外制剂:
本发明的突变的IL-2多肽可以口服,但更可能通过肠胃外途径给予.肠胃外途径的示例包括,例如静脉内、皮内、皮下、透皮(局部)、经粘膜和直肠给药。肠胃外制剂包括用于肠胃外应用的溶液或悬浮液,可以包括载剂和缓冲剂。适于肠胃外给药的药物制剂包括无菌水性溶液(水溶性时)或分散液,以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。
运载体:运载体包括无菌稀释剂,例如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂。运载体可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散介质。可以维持合适的流动性,例如通过使用诸如卵磷脂的涂覆材料、分散液情况下通过保持所需粒度以及通过使用表面活性剂,例如十二烷基硫酸钠。对于静脉内给药,合适的运载体包括生理盐水、抑菌水、CremophorELTM(巴斯夫(BASF),新泽西州帕西潘尼)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
缓冲剂:术语缓冲剂包括缓冲剂,例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐,以及用于调节张性的试剂,例如氯化钠或右旋糖。pH可以用酸或碱调整,例如单-和/或双-碱基磷酸钠、盐酸或氢氧化钠(例如至pH约为7.2-7.8,例如7.5)。
分散体:通常,将活性活化物掺入含有碱性分散介质和上述其它所需成分的无菌载剂中制备分散液。在制备无菌注射液的无菌粉剂时,优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥,由之前无菌过滤的溶液得到活性组分和任何其它所需组分的粉末。
防腐剂:用于肠胃外给予对象的药物制剂应当是无菌的并且应当是流动的以促进易注射性。它应当在制造和储存条件下稳定,并且被保存时抵抗污染。防止微生物的作用可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂来实现,例如,例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯;抗氧化剂,例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠;螯合剂,例如乙二胺四乙酸、对羟基苯甲酸酯类(parabens)、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。可将所需量的活性化合物和一种上述组分或其组合根据需要掺入合适溶剂后过滤灭菌,从而制备无菌溶液。
张力剂:在许多情况下,组合物中可优选地包含等张剂,例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇、氯化钠。
口服组合物:如果使用口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用运载体。对于口服治疗给药目的,可用赋形剂将活性化合物掺入并以片剂、含片或胶囊的形式使用,例如明胶胶囊。口服组合物也可以使用液体运载体制备以用作漱口水。可以包含药学上相容的粘合剂和/或佐剂材料作为组合物的部分。片剂、丸剂、胶囊、含片等可含有任何以下成分或具有相似特性的化合物:粘合剂例如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶;赋形剂例如淀粉或乳糖,崩解剂例如海藻酸、羧甲基淀粉(PrimogelTM)或玉米淀粉;润滑剂例如硬脂酸镁或完全氢化植物油(SterotesTM);助流剂例如二氧化硅胶体;甜味剂例如蔗糖或糖精;或调味剂例如薄荷、水杨酸甲酯、或橙调味剂。
吸入制剂:在通过吸入给药的情况下,主体IL-2突变蛋白或编码它的核酸以来自含合适推进剂(例如,如二氧化碳气体)或喷雾剂的受压容器或分配器的气雾剂喷雾形式递送。这类方法包括描述于美国专利号6,468,798中的那些。
粘膜和透皮:也可以通过经粘膜或透皮方法全身给予主体IL-2突变蛋白或核酸。对于经粘膜或透皮给药,在制剂中采用适合渗透屏障的渗透剂。这类渗透剂通常为本领域已知,并包括例如用于经粘膜给药的去污剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。经粘膜给药可以通过使用鼻腔喷雾剂或栓剂栓剂(例如使用常规的栓剂基料,如可可油或其它甘油酯)或滞留灌肠剂的形式制备化合物用于直肠递送。对于透皮给药,将活性化合物配制成药膏、软膏、凝胶或霜剂,如本领域通常已知的那样,并可纳入渗透促进剂,如乙醇或羊毛脂。.
延长释放和储库制剂:在一些实施方式中,IL2突变蛋白以制剂形式给予,以提供IL2突变蛋白剂的延长释放。可注射组合物的延长释放制剂的例子可以通过在组合物中包含延迟吸收的试剂(如单硬脂酸铝和明胶)来实现。在一个实施方式中,用运载体制备主体IL-2突变蛋白或核酸,其将保护所述化合物不被身体快速清除,如控释制剂,包括植入和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物,例如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。可以使用标准技术制备这种制剂。所述材料还可购自阿尔扎公司(Alza Corporation)和诺华制药股份有限公司(Nova Pharmaceuticals,Inc.)。脂质体悬浮液(包含用单克隆抗体对病毒抗原靶向感染的细胞的脂质体)还可以用作药学上可接受的运载体。这些可按本领域技术人员已知的方法制备,例如,如美国专利号4,522,811中所述。
编码IL2突变蛋白的核酸的给予(基因治疗):在一些实施方式中,化合物(主体IL-2突变蛋白或核酸)也可以通过转染或感染给予,使用本领域已知的方法,包括但不限于描述于McCaffrey等(Nature 418:6893,2002),Xia等(Nature Biotechnol.20:1006-1010,2002),或Putnam(Am.J.Health Syst.Pharm.53:151-160,1996,erratum于Am.J.HealthSyst.Pharm.53:325,1996)中的方法。在一些实施方式中,IL2突变蛋白通过重组表达载体的药学上可接受的制剂的给予被给予对象。在一些实施方式中,重组表达载体是病毒载体。在一些实施方式中,重组载体是重组病毒载体。在一些实施方式中重组病毒载体是重组腺相关病毒(rAAV)或重组腺病毒(rAd),特别是源自人腺病毒血清型3和/或5的复制缺陷的腺病毒。在一些实施方式中,复制缺陷的腺病毒具有一个或多个对E1区的修饰,这干扰病毒在人细胞中启动细胞循环和/或凋亡途径的能力。复制缺陷的腺病毒载体可以任选地在E3结构域中包含缺失。在一些实施方式中,腺病毒是复制能力型腺病毒。在一些实施方式中腺病毒是复制能力型重组病毒,其被工程改造为选择性地在淋巴细胞中复制。
在一个实施方式中,提供IL2突变蛋白制剂,根据Fernandes和Taforo,美国专利号4,604,377,1986年8月5日授权,其教导通过引用纳入本文。和Yasui,等美国专利号4,645,830。
胃肠外制剂可封装在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。在一个实施方式中,在用于肠胃外给予的预先填充的注射器中提供制剂。
使用方法
本发明还提供了治疗患有疾病紊乱或病症的对象的方法,通过给予治疗有效量的本发明的IL2突变蛋白(或编码IL2突变蛋白的核酸,包括编码IL2突变蛋白的重组病毒)。在这种疾病的治疗中,本发明的IL-2突变蛋白可以被纳入修饰以提供有利的特性,例如减少的血管渗漏综合征。适用本发明的IL-2突变蛋白(包括包含IL2突变蛋白和/或编码其的核酸分子的药学上可接受的制剂,包括编码这种IL2突变蛋白的重组病毒)治疗的紊乱包括炎症或自身免疫疾病,包括但不限于病毒感染(例如,AIDS、流感、慢性HCV、慢性病毒性乙型、丙型或丁型肝炎)、幽门螺杆菌感染、HTLV、器官排斥、移植物抗宿主病、自身免疫性甲状腺疾病、多发性硬化、过敏、哮喘、神经退行性疾病,其包括阿尔兹海默病、系统性红斑狼疮(SLE)、自体炎症疾病、炎性肠病(IBD)、克罗恩病、糖尿病,包括1型或2型糖尿病、炎症、自身免疫疾病、特应性疾病、癌旁自身免疫疾病、软骨炎、关节炎、类风湿性关节炎、幼年关节炎、幼年类风湿性关节炎、幼年类风湿性关节炎、多关节型幼年类风湿性关节炎、幼年类风湿性关节炎全身发作、幼年强直性脊柱炎、幼年肠病性关节炎、幼年反应性关节炎、幼年瑞特氏综合征、SEA综合征(血清阴性接骨点病变关节病综合征(Seronegativity EnthesopathyArthropathy Syndrome))、幼年皮肌炎、幼年银屑病性关节炎、幼年硬皮病、幼年系统性红斑狼疮、幼年血管炎、少关节型类风湿性关节炎、多关节型类风湿关节炎、类风湿性关节炎全身发作、强直性脊柱炎、肠病性关节炎、反应性关节炎、瑞特氏综合征、SEA综合征(血清阴性、接骨点病变、关节病综合征)。
适用本发明的IL-2突变蛋白(包括包含IL2突变蛋白和/或编码其的核酸分子的药学上可接受的制剂,包括编码这种IL2突变蛋白的重组病毒)治疗的增殖性和/或分化性紊乱的其他例子包括,但不限于皮肤病。皮肤病可能涉及真皮、表皮或下皮层(hypodermallayer)的一个或一组细胞或层的异常活动,或真皮-表皮连接处的异常。例如,皮肤病可能涉及角质形成细胞(如过度增殖的基底和紧靠上基底的角质形成细胞)、黑素细胞、朗格汉斯细胞、默克尔细胞、免疫细胞和发现于一个或多个表皮层(如基底层(生发层)、棘层、颗粒层、透明层或角质层)的其他细胞的异常活动。在其他实施方式中,该紊乱可能涉及真皮细胞的异常活性,例如真皮内皮细胞、成纤维细胞、免疫细胞(例如肥大细胞或巨噬细胞),其发现于真皮层,例如乳头层或网状层。
皮肤病的例子包括银屑病、银屑病关节炎、皮炎(湿疹)、剥脱性皮炎或特应性皮炎、毛发红糠疹、酒渣鼻糠疹、类银屑病、苔癣样糠疹、扁平苔藓、光泽苔藓、鱼鳞病样皮肤病、皮肤角化病、皮肤病、斑秃、坏疽性脓皮病、白癜风、类天疱疮(例如眼部瘢痕性类天疱疮或大疱性类天疱疮)、荨麻疹、角化病、类风湿性关节炎,其涉及关节囊内衬上皮相关细胞的过度增殖和炎症;皮炎例如脂溢性皮炎和日光性皮炎;角化病例如脂溢性角化病、老年性角化病、光化性角化病、光诱导性角化病和毛囊角化病;寻常痤疮;瘢痕瘤和瘢痕瘤形成的预防;痣;疣,包括疣、湿疣或尖锐湿疣,以及人乳头状瘤病毒(HPV)感染,例如性病湿疣;黏膜白斑病;扁平苔藓和角膜炎。皮肤病可以是皮炎,例如特应性皮炎或过敏性皮炎,如银屑病。
本发明的组合物(包括包含IL2突变蛋白和/或编码其的核酸分子的药学上可接受的制剂,包括编码这种IL2突变蛋白的重组病毒)也可以给予患有(或可能患有)银屑病或银屑病疾病的患者。术语"银屑病"旨在具有其医学含义,即主要累及皮肤并产生隆起、增厚、脱屑、非疤痕性病灶的疾病。病灶通常是界限分明的红斑性丘疹,覆盖着重叠的发亮鳞屑。鳞屑通常呈银色或略带乳白色。指甲经常受累,导致点蚀、指甲分离、增厚和变色。银屑病有时与关节炎相关联,可能会造成严重后果。角质形成细胞过度增殖是银屑病表皮增生的一个关键特征,同时还有表皮炎症和角质形成细胞分化减少。人们引用多种机制来解释银屑病特有的角质形成细胞过度增殖。紊乱的细胞免疫也被认为与银屑病的发病机制有关。银屑病疾病的例子包括慢性静止型银屑病、斑块型银屑病、中度至重度斑块型银屑病、寻常型银屑病、发疹型银屑病、银屑病红皮病、泛发性脓疱型银屑病、环状脓疱型银屑病或局部脓疱型银屑病。
在某些实施方式中,如本文所述的功能为IL-2拮抗剂的主体IL-2突变蛋白用于治疗一种或多种病症,其中抑制一种或多种IL-2和/或IL-15依赖性功能是有用的。在某些实施方式中,本文所述的IL-2突变蛋白用于治疗一种或多种疾病或病症,其中CD122/CD132异二聚体化和下游信号转导的抑制是有用的(例如GVDH或白血病)。在一个实施方式中,该治疗方法是用于治疗移植物抗宿主病(GVHD)。在一些实施方式中,该治疗包括向患有GVHD的对象给予治疗有效量的IL-2突变蛋白(包括包含IL2突变蛋白和/或编码其的核酸分子的药学上可接受的制剂,包括编码这种IL2突变蛋白的重组病毒)的步骤。
IL2突变蛋白与其他治疗剂的组合用于自身免疫疾病:
本发明提供了本发明的IL2突变蛋白与一种或多种其他活性剂(“补充剂”)组合用于治疗自身免疫疾病的用途。如本文所用,术语“补充剂”包括可分别给予或引入的试剂,例如,为单独给予而单独配制的试剂(例如,可在试剂盒中提供)和/或可与IL2突变蛋白组合给予或引入的治疗。
如本文所用,术语"与……组合"在指给予对象多种试剂时是指给予对象第一试剂至少一种其它(即第二、第三、第四、第五,等)试剂。出于本发明的目的,如果在给予第二试剂时,因给予第一试剂而产生的生物学效应在对象体内持续,使第一试剂和第二试剂的治疗作用叠加,则认为一种试剂(例如IL2突变蛋白)与第二试剂(例如治疗性自身免疫抗体,如)组合给予。例如,治疗性抗体有时通过IV输注每两周给予一次(如治疗克罗恩病的阿达木单抗),而本公开的IL2突变蛋白可以更频繁地给予,如每天、BID或每周。然而,第一试剂(如依那西普(entaercept))的给药在较长的时间内提供治疗作用,第二试剂(如IL2突变蛋白)的给予在第一试剂的治疗作用仍在进行时提供其治疗作用,因此第二试剂被认为是与第一试剂组合给予,即使第一试剂可能是在离第二试剂给予时间很远的时间点(如几天或几周)进行的。在一个实施方式中,如果第一和第二试剂同时(在彼此的30分钟内)、同期或依次给予,则认为一种试剂与第二试剂组合给予。在一些实施方式中,如果第一试剂和第二试剂在彼此约24小时内,优选在彼此约12小时内,优选在彼此约6小时内,优选在彼此约2小时内,或优选在彼此约30分钟内给予,则第一试剂被视为与第二试剂“同期”给予。术语“与……组合”也应理解为适用于第一试剂和第二试剂共同配制在单一药学上可接受的制剂中并将该共同制剂给予对象的情况。在某些实施方式中,IL2突变蛋白和一种或多种补充剂是依次给予或应用的,例如,在给予一种试剂后给予一个或多个其他试剂。在其他实施方式中,IL2突变蛋白和一种或多种补充剂同时给予,例如,在同一时间或大约同一时间给予两种或多种试剂;这两种或多种试剂可以存在于两种或多种分别的制剂中,或组合成单一制剂(即共同制剂)。无论这些试剂是依次或同时给予,出于本发明的目的,它们都被认为是组合给予的。
在一些实施方式中,补充剂是一种或多种选自下组的皮质类固醇的试剂(包括但不限于强的松、布地奈德、泼尼松龙(prednilisone))、Janus激酶抑制剂(包括但不限于托法替尼钙调磷酸酶抑制剂(包括但不限于环孢菌素和他克莫司)、mTor抑制剂(包括但不限于西罗莫司和依维莫司)、IMDH抑制剂(包括但不限于硫唑嘌呤、来氟米特和霉酚酸酯
(mycophenolate)),生物制剂例如阿巴西普(abatcept)或依那西普(etanercept)和治疗性抗体。可以作为补充剂与本发明的IL2突变蛋白组合给予以治疗自身免疫疾病的治疗性抗体包括但不限于抗-CD25抗体(例如达克珠单抗和巴利昔单抗)、抗-VLA-4抗体(例如那他珠单抗),抗-CD52抗体(例如阿仑单抗),抗-CD20抗体(例如利妥昔单抗、奥瑞珠单抗),抗-TNF抗体(例如,英夫利昔单抗和阿达木单抗),抗-IL-6R抗体(例如托珠单抗),抗-TNFα抗体(例如阿达木单抗戈利木单抗和英夫利昔单抗),抗-整合素-α4β7抗体(例如维多珠单抗),抗-IL-17a抗体(例如布达鲁单抗(brodalumab)或苏金单抗),抗-IL-4Rα抗体(例如达必妥(dupilumab)),抗-RANKL抗体,IL-6R抗体,抗-IL-1β抗体(例如卡那基单抗),抗-CD11a抗体(例如依法利珠单抗),抗-CD3抗体(例如莫罗单抗(muramonab)),抗-IL5抗体(例如美泊珠单抗(mepolizumab)、瑞利珠单抗),抗-BLyS抗体(例如贝利单抗);和抗-IL-12/IL-23抗体(例如乌司奴单抗)。
许多治疗性抗体已被批准用于对抗自身免疫疾病的临床使用。表4提供了美国食品药品监督管理局(FDA)批准的用于治疗患有自身免疫疾病的对象的抗体的例子,这些抗体可作为补充剂与本公开的IL2突变蛋白(以及任选地额外补充剂)组合给予,以治疗指示的自身免疫疾病。
在本发明的方法的实践中作为补充剂有用的前述抗体可以单独给予或以任何抗体药物偶联物(ADC)的形式给予,其包括抗体、接头和一种或多种药物(如1、2、3、4、5、6、7或8种药物)或以修饰形式(如PEG化)。
在一些实施方式中,该补充剂是疫苗。根据Doyle,等的美国专利第5,800,819号(1998年9月1日授权)的教导,本发明的IL2突变蛋白可与疫苗组合给予对象作为佐剂以增强对疫苗的免疫反应。可以与本发明的IL-2突变蛋白组合的疫苗的例子包括HSV疫苗,百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis),大肠杆菌疫苗,肺炎球菌疫苗(pneumococcalvaccine),其包括多价肺炎球菌疫苗例如13,白喉,破伤风和百日咳疫苗(包括组合疫苗例如)和),水痘疫苗,B型流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae type B)疫苗,人乳头瘤病毒疫苗例如小儿麻痹症,钩端螺旋体病疫苗(Leptospirosis vaccines),组合呼吸道疫苗,莫拉氏菌(Moraxella)疫苗,以及减毒或灭活病毒产品,例如牛呼吸道疾病疫苗(RSV),多价人流感疫苗例如和Quadravlent),猫白血病病毒疫苗(feline leukemia vaccine),传染性肠胃炎疫苗和狂犬病疫苗。
剂量
这种主体IL-2突变蛋白或核酸化合物的剂量、毒性和疗效可以通过标准制药程序在细胞培养物或实验动物中确定。从细胞培养试验和动物研究中获得的数据可用于制定用于人类的剂量范围。这种化合物的剂量优选在循环浓度范围内,其包括具有最小可接受毒性的ED50。该剂量可根据所用的剂型和所用的给药途径在此范围内变化。对于本发明方法中使用的任何化合物,治疗性有效剂量可以从细胞培养试验中初步估计。可以在动物模型中配制剂量,以达到循环血浆浓度范围,其中包括在细胞培养中确定的IC50(即达到半最大症状抑制的测试化合物的浓度)。可利用这类信息更精确地确定人用剂量。血浆中的水平可以通过例如高效液相色谱来测量。
如本文定义,主体IL-2突变蛋白的治疗有效量(即有效剂量)取决于所选择的多肽。例如,可以给予约0.001至0.1mg/kg患者体重的单剂量;在一些实施方式中,可以给予约0.005、0.01、0.05mg/kg。在一些实施方式中,给予600,000IU/kg(IU可由淋巴细胞增殖生物测定法确定,并以世界卫生组织第一代白细胞介素-2(人)国际标准确立的国际单位(IU)表示)。
在一些实施方式中,按照Klatzman等的美国专利号9,669,071和10,293,028B2所述的“低剂量”治疗方案,将发明的IL2突变蛋白的药学可接受形式给予对象,其全部教导通过引用纳入本文。其他低剂量方案描述于Smith,K.A.(1993)Blood 81(6):1414-1423,He,等(2016)Nature Medicine22(9):991-993。
根据本发明的另一方面,提供了通过给予本发明的IL-2突变蛋白刺激动物免疫系统的方法。该方法对于治疗宿主免疫反应不足的疾病状态是有用的。在治疗对象时,给予治疗有效剂量的化合物(即活性成分)。治疗有效剂量是指产生改善症状或延长对象生存期的活性成分的量。有效剂量将随将要给予的IL-2突变蛋白的特征、待治疗对象的身体特征、疾病或病症的性质等而变化。单次给予可从约50,000IU/kg到约1,000,000IU/kg或更多,更典型的是约600,000IU/kg。这可以每天重复几次(例如,每天2-3次),持续几天(例如,大约连续3-5天),然后可以在休息一段时间(例如,大约7-14天)后重复一次或多次。因此,有效剂量可包括仅一单词给予或在一段时间内多次给予(例如,在约10-20天内给予约20-30次单独给予,每次约600,000IU/kg)。
该组合物可以每日一次或数次,至每周一次或数次给予,包括每隔一天一次。本领域技术人员还将理解的是,某些因素可能影响有效治疗对象所需的剂量和时间,包括但不限于,疾病或失调的严重程度,之前的治疗,对象的年龄和/或一般健康情况,以及存在的其他疾病。另外,用治疗有效量的主体IL-2突变蛋白治疗对象可包括一次治疗或一系列治疗。在一个实施方式中,组合物每8小时给予一次,持续5天,随后休息2-14天,例如,9天,随后每8小时给予一次,再持续5天。在另一个实施方式中,组合物在至少6天的时间段内隔日给予,任选地至少10天,任选地至少14天,任选地至少30天,任选地至少60天。本领域技术人员将认识到,该疗法可用于治疗慢性病症和防止慢性病症状的再次发生,例如自身免疫疾病(例如银屑病、IBD等)。
这些药物组合物可与给药说明书一同包括在容器、包装或分配器内。
虽然可以使用展现出毒性副作用的试剂,但是设计递送系统时需注意,所述递送系统将这种化合物靶向受影响组织的位点为了使对未转染细胞的潜在损伤最小化,从而降低副作用。IL-2突变蛋白的毒性和疗效可以通过标准制药程序在细胞培养物或实验动物中确定。细胞培养试验和动物研究可用于确定LD50(对50%的群体致死的剂量)和ED50(对50%的群体有治疗作用的剂量)。毒性和治疗作用之间的剂量比率是治疗指数,它可以表示为LD50/ED50的比率。优选表现出大的治疗指数的IL-2突变体。从细胞培养试验和动物研究中获得的数据适用于制定用于人类的剂量范围。这种突变体的剂量优选在循环浓度范围内,其包括几乎或没有毒性的ED50。该剂量可根据多种因素变化,例如所用的剂型、所用的给药途径、对象的病症等,在此范围内变化。
治疗有效剂量可以通过确定IC50而从细胞培养试验中初步估计出来。然后可以在动物模型中配制剂量,以实现循环血浆浓度范围,包括在细胞培养中确定的IC50。可利用这类信息更精确地确定人用剂量。血浆中的水平可以通过例如HPLC来测量。具体制剂、给药途径和剂量可以由单个医师根据患者的状况来选择。
用IL-2突变蛋白和任选地补充剂治疗的患者的主治医生将知道如何以及何时因毒性、器官功能障碍等原因终止、中断或调整给药。相反,如果临床反应不充分(排除毒性),主治医师还将知晓将治疗调整到更高的水平。在感兴趣的紊乱的管理中,给药剂量的大小将随待治疗的病症的严重程度、给药途径等而变化。例如,病症的严重程度可以部分地通过标准的预后评估方法进行评估。此外,剂量和可能的剂量频率也将根据个别病人的年龄、体重和反应而变化。
本发明的IL-2突变体可以作为药物制剂单独给予个体,其配制为适合于给药途径和所治疗的病症。合适的途径可包括:口服,直肠,透皮,阴道,透粘膜,或肠道给药;胃肠外给药,包括肌内,皮下,髓内注射,以及鞘内,直接心室内,静脉内,腹膜内,鼻内或眼内注射等。对于经粘膜给药,在适合于待渗透屏障的制剂中采用渗透剂。这种渗透剂通常是本领域已知的。
IL-2突变体可与一种或多种药学上可接受的运载体或赋形剂制成制剂,这在本领域是众所周知的。用于配制和给予的技术可在“雷明顿药物科学”(Remington'sPharmaceutical Sciences)(第18版,宾夕法尼亚州伊斯顿米德出版公司)中找到。IL-2制剂的具体例子描述于美国专利号4,604,377和4,766,106中。IL-2突变体可被配制成液体,其运载体可包括缓冲液和或盐,如磷酸盐缓冲盐水。或者,IL-2突变体可以被配制成固体,其运载体或填充剂,如乳糖,粘合剂如淀粉,和/或润滑剂如滑石粉或硬脂酸镁,以及,任选地,稳定剂。
试剂盒
本发明还考虑了包含药物组合物IL2突变蛋白及其药物组合物的试剂盒。该试剂盒通常为容纳各种成分的物理结构形式,如下文所述,并可用于例如实施上述方法。试剂盒可以包括IL2突变蛋白,其形式为适合给予对象的药物组合物,其可以是现成的,或需要制备的形式,例如,在给予前解冻、重建或稀释。当IL2突变蛋白是需要由使用者重建的形式时,试剂盒还可以包括无菌容器,提供包括缓冲剂、药学上可接受的赋形剂等的重建介质。
本发明的试剂盒除了其他组分外,还可进一步包括一种或多种补充剂。
本发明的试剂盒可以设计为适当维持其中所含组分的必要条件(例如,冷藏或冷冻)。
试剂盒可进一步包含标签或包装插页,包括其中的组分的鉴定信息和使用说明。试剂盒中的各组分可以被封装在单独的容器中,所有的各种容器可以在一个单独包装中。标签或插页可以包括制造商信息,如批号和失效日期。标签或包装插页可以,例如,整合到容纳组分的物理结构中,分别地包含在物理结构中,或固定在试剂盒的组分上(例如,安瓿、注射器或小瓶)。标签或插页可以以物理形式或计算机可读介质提供。在一些实施方式中,实际说明书并不存在于试剂盒中,而是试剂盒提供了从远程获得说明书的方法,例如,通过互联网网站,包括通过提供符合政府法规(例如,HIPAA)的密码(或可扫描的代码,如IL2突变蛋白或包含试剂盒的容器上的条形码或QR码)的安全访问。
实施例
提供下面的实施例以描述本发明的某些实施方式,不应解释为限制性的。
实施例1:人IL2表达载体pcDNA3.1/hygro(+)-huIL2的产生
人IL2 DNA开放阅读框(“ORF”)(Genbank NM_000586.3)被合成(生命技术公司(Life Technologies)GeneArt服务,加利福尼亚州卡尔斯巴德)并通过PCR使用PlatinumSuperFi II DNA聚合酶试剂盒(市售可得,目录号12361050,赛默飞世尔(ThermoFisher))基本按制造商的方案扩增,使用引物5’TATAGTCAGCGCCACcCATGTACAGGATGCAACTCCTGTC 3’,其纳入NheI限制性位点,和5’TATAGGGCCCTATCAAGTCAGTGTTGAGATG3’,其纳入ApaI限制性位点。PCR片段在1%的琼脂糖凝胶(货号#54803,隆萨公司(Lonza),缅因州洛克兰(Rockland,ME))上可视化,从凝胶上切除并纯化,使用QIAquick PCR纯化试剂盒(市售可得,目录号28106,凯杰公司(Qiagen),德国),根据制造商的方案。
纯化的PCR片段和哺乳动物表达载体pcDNA 3.1/Hygro(+)(市售可得,目录号V87020,赛默飞世尔加利福尼亚州卡尔斯巴德)用NheI和ApaI(市售可得,目录号R0111S和目录号R0114L,新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs),马萨诸塞州伊普斯维奇)限制酶消化。表达载体用快速去磷酸化试剂盒(市售可得,目录号M0508L,新英格兰生物实验室公司)根据制造商的方案进一步处理。PCR片段被连接至pcDNA 3.1/Hygro(+),使用快速DNA连接试剂盒(市售可得,目录号11635379001,西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich),密苏里州圣路易斯),基本根据制造商的方案,转化到One Shot TOP10化学感受态的大肠杆菌(市售可得,目录号C404006,生命技术公司,加利福尼亚州卡尔斯巴德)中,接种到LB琼脂板上,其含有100ug/ml羧苄青霉素(市售可得,目录号L1010,Teknova,加利福尼亚州霍利斯特)并在37C生长过夜。
次日,挑出单菌落并用于在含有100ug/ml氨苄青霉素(市售可得,目录号A9626,Teknova)的LB肉汤(编号10855-001,生命技术公司)中开始3ml细菌培养。培养物在37C下生长过夜。次日,沉淀大肠杆菌(6,000rpm,10分钟,台式离心机,编号5424,市售可得,商品目录Eppendorf,纽约州霍波格),以及使用QIAprep Spin小抽试剂盒(编号27106,凯杰公司)分离DNA表达载体。质粒DNA经过序列验证(MCLab,加利福尼亚州南旧金山)。
实施例2.人IL2 REH表达载体pcDNA3.1/hygro(+)-huIL2-REH的产生
表达载体将三个突变引入人IL2 ORF(L38R、Q42E和Q146H;所有编号基于全长人IL2 ORF NM_000586.3编号,即表达的hIL2,包括信号肽而不是成熟的hIL2分子的20个氨基酸序列)基本按照实施例1的教导组装,除了以下例外:合成用于PCR的初始模板DNA,其含有L38R(成熟蛋白的L18R)、Q42E(成熟蛋白的Q22E)和Q146H(成熟蛋白的Q126H)突变。
实施例3.人IL2 REM表达载体pcDNA3.1/hygro(+)-huIL2-REM的产生
表达载体将三个突变引入人IL2 ORF(L38R、Q42E和Q146M;所有编号基于全长人IL2 ORF NM_000586.3编号),完全按照pcDNA3.1/Hygro(+)中人IL2表达载体所述组装,除了以下例外:合成用于PCR的初始模板DNA,含有L38R、Q42E和Q146M突变。
实施例4.将突变或回复突变引入pcDNA3.1/hygro(+)-huIL2和pcDNA3.1/hygro(+)-huIL2 REH表达载体
所有突变或回复突变(将pcDNA3.1/hygro(+)-huIL2-REH中的突变恢复到与野生型IL2 ORF匹配)被引入pcDNA3.1/Hygro(+)-huIL2或pcDNA3.1/Hygro(+)-huIL2-REH表达载体,使用Quik Change II定点诱变试剂盒(编号200524,安捷伦科技公司(AgilentTechnologies),加利福尼亚州圣克拉拉)基本按照制造商的方案操作。表5和表6列出了产生的突变,引入突变的模板,以及用于引入突变的引物组。将Quik Change PCR反应转化进大肠杆菌中,以及质粒DNA的分离和序列分析,是使用与产生pcDNA3.1/Hygro-huIL2表达载体相同的方案进行的。
实施例5.HEK293细胞中的瞬时转染
所有表达载体被瞬时转染进HEK293细胞(编号CRL-1573,ATCC,弗吉尼亚州马纳萨斯)。约1E6 HEK293细胞被接种到6孔组织培养板的各孔中的补充有10%胎牛血清(编号SH30071.03,Fisher Scientific,美国伊利诺伊州芝加哥)的2ml DMEM(编号10569044,生命技术公司)中,并在37C和5%CO2下生长过夜。第二天用Lipofectamine 3000试剂(编号L3000150,生命技术公司)转染细胞,按照制造商的方案,每次转染使用2.5ug DNA、5ulP3000试剂和7.5ul Lipofectamine 3000。.转染的细胞在37C,5%CO2生长48–72小时然后收获条件培养基。
实施例6.蛋白质表达分析
通过ELISA测量蛋白质表达,使用人IL2 V-PLEX ELISA试剂盒(编号K151QQD-4,Mesoscale Diagnostics,马里兰州巴尔的摩市),按照制造商的方案(转染培养基最初以1:4稀释,然后1:2连续稀释)。在Meso Quickplex SQ120(Mesoscale Diagnostics)上使用制造商为该ELISA试剂盒预设的设置读取平板。该试剂盒中的人IL2标准品被用来计算条件培养基样品中的近似表达水平。
实施例7确定CD25-和CD25+细胞上的IL2活性(STAT5)
经过2-3天的孵育,根据上述实施例5制备含有可溶性IL2蛋白的293T细胞的上清样品,并将其加入YT细胞(CD25NEG)和已经被工程改造为组成型表达CD25的YT(YTCD25POS),持续约20分钟。通过流式细胞术测量磷酸化-STAT5(pSTAT5)的诱导水平。pSTAT5水平的诱导倍数的结果显示在附图2中。IL2蛋白对CD25状态的选择性被计算为CD25+YT细胞上磷酸化-STAT5升高的水平(pSTAT5YTCD25)除以CD25阴性YT细胞中磷酸化-STAT5的水平(pSTAT5YT)。这些实验的结果提供于附图图2中。
从所呈现的数据可以看出,本发明的IL2突变蛋白提供了对CD25阳性细胞上pSTAT5的选择性诱导,并保留了显著的IL2活性。
实施例8.在人T细胞克隆3F8中评估直向同源物的活性
评估一组有代表性的hIL-2突变蛋白在CD4阳性人T细胞克隆3F8细胞中的活性。CD4阳性T细胞克隆3F8是由健康供者的PBMC与EBV转化的B细胞系JY在两轮连续的混合白细胞反应中激活,然后通过有限稀释的单细胞克隆产生的,如描述于(Yssel和Spits(2002)《新编免疫学指南》(Current Protocols in Immunology)7.19.1–7.19.12)CD4阳性T细胞克隆3F8表达CD25和CD122,对IL-2反应增殖并产生IFNγ。
3F8细胞与转染了hIL-2突变蛋白的293T细胞的上清液接触,如下:细胞以每ml 20万个细胞在由Yssel氏培养基(Iscove氏改良的Dulbecco氏培养基(赛默飞世尔)、0.25%w/v%人白蛋白(西格玛)、1%青霉素/链霉素(赛默飞世尔)、1%ITS-X胰岛素、转铁蛋白、硒(吉布可公司(Gibco))、30mg/L转铁蛋白(罗氏公司(Roche))、2mg/L棕榈酸(西格玛)、1%LA-OA-白蛋白亚油酸、油酸(西格玛)、1%人血清(Gemini)组成的生长培养基中生长(Yssel等(1984)J Immunol Methods 72:219–227),50Gy辐照的JY细胞以每孔10万个细胞,40Gy辐照的同种异体PBMC以每mL 100万个细胞。经过六天的培养和用100pM的人IL-2扩增后,细胞被洗涤并接种到黑色透明底的96孔板(科斯塔(Costar))中,每孔5万个细胞,75μl生长培养基。将转染的293T细胞上清在生长培养基中进行五倍的连续稀释,并将75μl各稀释液加入3F8细胞的平板中,设双重复,最终滴定比例从1:2到1:78125。平板被转移到加湿培养箱(赛默飞世尔),在37摄氏度、5%的二氧化碳条件下孵育三天。
将平板从培养箱中取出,在96孔平底板(科斯塔)中收获40μl培养上清液。汇集重复的孔中的上清。根据制造商的说明,每孔加入100μl Celltiterglo(普洛麦格公司(Promega))裂解细胞。细胞裂解物在定轨摇床(VWR科学公司(VWR Scientific))上以300rpm混合两分钟,然后在室温下保持10分钟。3F8细胞裂解物的发光在Envision 2103多标签读板仪(铂金埃尔默(Perkin Elmer))上以每秒计数读取。
IFNγ根据制造商的说明,使用MSD IFNγV-Plex试剂盒(MSD K151QOD)测量培养物上清中IFNγ的产生。简言之,预包被mAb的MSD IFNγ试验板用150μL Tris洗涤缓冲液洗涤3次,在稀释液2中稀释IFNγ标准品。用稀释液2将培养物上清1:1稀释,将50μL样品和标准品加入IFNγ试验板中,并在室温下以300rpm在定轨摇床(VWR科学公司)上孵育120分钟。用Tris洗涤缓冲液洗涤平板3次,并在每个孔中加入25μL稀释液3中的1×检测抗体。室温下,平板在定轨摇床(VWR科学公司)上以300rpm孵育60分钟。用Tris洗涤缓冲液洗板3次,每孔加入150μL 2x读出缓冲液T,用Mesoscale Quickplex SQ120仪器读取发光信号。用MSD软件根据标准曲线计算上清中IFNγ的浓度。
为了比较每种hIL-2突变蛋白对3F8细胞增殖和IFNγ产生的影响,将用上清处理的细胞的CelltiterGlo值和IFNγ浓度与单独用生长培养基、野生型IL-2转染或人REK IL-2转染的上清处理的对照细胞进行比较。这些实验的数据列于表7和图3A-3D。这些数据证明了hIL-2突变蛋白诱导增殖和IFNγ产生的活性之间的关联性。
Claims (19)
1.一种多肽,其包括下式的氨基酸序列:
(AA1)a-(AA2)b-(AA3)c-(AA4)d-(AA5)e-(AA6)f-(AA7)g-(AA8)h-(AA9)i-T10-Q11-L12-Q13-L14-E15-H16-L17-(AA18)-L19-D20-L21-(AA22)-M23-124-L25-N26-G27-128-N29-N30-Y31-K32-N33-P34-(AA35)-L36-T37-(AA38)-(AA39)-L40-T41-F42-K43-F44-Y45-M46-P47-K48-K49-A50-T51-E52-L53-K54-(AA55)-L56-Q57-C58-L59-E60-E61-E62-L63-K64-P65-L66-E67-E68-(AA69)-L70-N71-L72-A73-(AA74)-S75-K76-N77-F78-H79-(AA80-(AA81)-P82-R83-D84-(AA85)-(AA86)-S87-N88-(AA89)-N90-(AA91)-(AA92)-V93-L94-E95-L96-(AA97)-G98-S99-E100-T101-T102-F103-(AA104)-C105-E106-Y107-A108-(AA109)-E110-T111-A112-(AA113)-1114-V115-E116-F117-L118-N119-R120-W121-I122-T123-F124-(AA125)-(AA126)-S127-I128-I129-(AA130)-T131-L132-T133
其中:
·a、b、c、d、e、f、g、h和i各自单独地选自0或1;
·AA1是A(野生型,a=1)或缺失(a=0);
·AA2是P(野生型,b=1)或缺失(b=0);
·AA3是T(野生型,c=1)、C、A、G、Q、E、N、D、R、K、P或缺失(c=0);
·AA4是S(野生型,d=1)或缺失(d=0);
·AA5是S(野生型,e=1)或缺失(e=0);
·AA6是S(野生型,f=1)或缺失(f=0);
·AA7是T(野生型,g=1)或缺失(g=0);
·AA8是K(野生型,h=1)或缺失(h=0);
·AA9是K(野生型,i=1)或缺失(i=0);
·AA18是L(野生型)或R、L、G、M、F、E、H、W、K、Q、S、V、I、Y、H、D或T;
·AA22是Q(野生型)或F、E、G、A、L、M、F、W、K、S、V、I、Y、H、R、N、D、T或F;
·AA35是K(野生型)或E;
·AA38是R(野生型)、W或G;
·AA39是M(野生型)、L或V;
·AA55是H(野生型)或Y;
·AA69是V(野生型)或A;
·AA74是Q(野生型)、P、N、H、S;
·AA80是L(野生型)、F或V;
·AA81是R(野生型)、I、D或T;
·AA85是L(野生型)或V;
·AA86是I(野生型)或V;
·AA89是I(野生型)或V;
·AA92是I(野生型)或F;
·AA97是K(野生型)或Q;
·AA104是M(野生型)或A;
·AA109是D(野生型)、C或具有激活的侧链的非天然氨基酸;
·AA113是T(野生型)或N;
·AA125是C(野生型)、A或S;
·AA126是Q(野生型)或H、M、K、C、D、E、G、I、R、S或T;和
·AA130是S(野生型)、T、G或R;和
前提是如果AA18是R且AA22是E,则AA126不是H、M、K、C、D、E、G、I、R、S或T。
2.如权利要求1所述的多肽,其中
·AA18选自下组:L(野生型)或R、L、G、M、F、E、H、W、K、Q、S、V、I、Y、H、D或T;
·AA22选自下组:Q(野生型)或F、E、G、A、L、M、F、W、K、S、V、I、Y、H、R、N、D、T或F;和
·AA126选自下组:Q(野生型)或H、M、K、C、D、E、G、I、R、S或T。
3.如权利要求1或2所述的多肽,其中a=0。
4.如权利要求1-3中任一项所述的多肽,其中所述多肽包括一组突变,其选自下组:L18R、Q22E和Q126M;L18R、Q22E Q126T;L18R;Q22E;Q126H;L18R和Q126H;Q22E和Q126H;L18G、Q22E和Q126H;L18A、Q22E和Q126H;L18M、Q22E和Q126H;L18F、Q22E和Q126H;L18W、Q22E和Q126H;L18K,Q22E和Q126H;L18Q、Q22E和Q126H;L18E、Q22E和Q126H;L18S、Q22E和Q126H;L18V、Q22E和Q126H;L18I、Q22E和Q126H;L18Y、Q22E和Q126H;L18H、Q22E和Q126H;L18N、Q22E和Q126H;L18D、Q22E和Q126H;L18T、Q22E和Q126H;L18R、Q22G和Q126H;L18R、Q22A和Q126H;L18R、Q22L和Q126H;L18R、Q22M和Q126H;L18R、Q22F和Q126H;L18R、Q22W和Q126H;L18R、Q22K和Q126H;L18R、Q22S和Q126H;L18R、Q22V和Q126H;L18R、Q22I和Q126H;L18R Q22Y和Q126H;L18R Q22H和Q126H;L18R Q22R和Q126H;L18R Q22N和Q126H;L18R Q22D和Q126H;和L18RQ22T和Q126H。
5.如权利要求1-4中任一项所述的多肽,其中所述多肽是PEG化的。
6.如权利要求1-5中任一项所述的多肽,其中所述多肽是PEG化的且所述PEG化多肽的PEG组分的分子量为约10kD至约70kD。
7.如权利要求1-6中任一项所述的多肽,其中所述多肽是融合蛋白。
8.如权利要求7所述的多肽,其中所述融合蛋白包括Fc结构域。
9.一种编码权利要求1-8中任一项所述多肽的核酸。
10.如权利要求9所述的核酸,其中所述核酸是DNA。
11.一种包含如权利要求9或10所述核酸的重组表达载体。
12.如权利要求11所述的载体,其中所述载体是病毒载体。
13.如权利要求11所述的载体,其中所述载体是非病毒载体。
14.一种用权利要求11-13中任一项所述载体转化的宿主细胞。
15.一种包含权利要求1-8中任一项所述多肽、权利要求9和10中任一项所述核酸或权利要求11-13中任一项所述载体的药物制剂。
16.一种治疗患有自身免疫或炎性疾病、紊乱或病症或病毒感染的哺乳动物对象的方法,所述方法包括给予治疗有效量的权利要求15所述药物制剂。
17.如权利要求16所述的方法,其进一步包括给予一种或多种选自下组的补充试剂:类固醇、Janus激酶抑制剂、钙调磷酸酶抑制剂、mTor抑制剂、IMDH抑制剂、生物制剂、疫苗和治疗抗体。
18.如权利要求17所述的方法,其中治疗抗体是结合选自下组的蛋白质的抗体:BLyS、CD11a、CD20、CD25、CD3、CD52,IgEIL-12/IL-23、IL-17a、IL-1β、IL-4Rα、IL-5、IL-6R、整合素-α4β7、RANKL、TNFα、VEGF-A和VLA-4。
19.如权利要求16-18中任一项所述的方法,其中所述疾病、紊乱或病症选自:病毒感染、幽门螺杆菌感染、HTLV、器官排斥、移植物抗宿主病、自身免疫性甲状腺疾病、多发性硬化症、过敏、哮喘、神经退行性疾病,包括阿尔茨海默病、系统性红斑狼疮(SLE)、自体炎症疾病、炎性肠病(IBD)、克罗恩病、糖尿病、软骨炎、关节炎、类风湿性关节炎、幼年关节炎、幼年类风湿性关节炎、幼年类风湿性关节炎、多关节型幼年类风湿性关节炎、幼年类风湿性关节炎全身发作、幼年强直性脊柱炎、幼年肠病性关节炎、幼年反应性关节炎、幼年瑞特氏综合征、SEA综合征、幼年皮肌炎、幼年银屑病关节炎、幼年硬皮病、幼年系统性红斑狼疮、幼年血管炎、少关节型类风湿性关节炎、多关节型类风湿性关节炎、类风湿性关节炎全身发作、强直性脊柱炎、肠病性关节炎、反应性关节炎、瑞特氏综合征、SEA综合征、银屑病、银屑病关节炎、皮炎(湿疹)、剥脱性皮炎或特应性皮炎、毛发红糠疹、酒渣鼻糠疹、类银屑病、苔癣样糠疹、扁平苔藓、光泽苔藓、鱼鳞病样皮肤病、皮肤角化病、皮肤病、斑秃、坏疽性脓皮病、白癜风、类天疱疮、荨麻疹、角化病、类风湿性关节炎;脂溢性皮炎、日光性皮炎;脂溢性角化病、老年性角化病、光化性角化病、光诱导性角化病、毛囊角化病;寻常痤疮;瘢痕瘤;痣;疣,包括疣、湿疣或尖锐湿疣,以及人乳头状瘤病毒(HPV)感染。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US202062960847P | 2020-01-14 | 2020-01-14 | |
US62/960,847 | 2020-01-14 | ||
PCT/US2021/013514 WO2021146481A1 (en) | 2020-01-14 | 2021-01-14 | Il2 muteins |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN115066253A true CN115066253A (zh) | 2022-09-16 |
Family
ID=76863259
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202180009469.XA Pending CN115066253A (zh) | 2020-01-14 | 2021-01-14 | Il2突变蛋白 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20230210951A1 (zh) |
EP (1) | EP4090354A4 (zh) |
JP (1) | JP2023510871A (zh) |
KR (1) | KR20220127866A (zh) |
CN (1) | CN115066253A (zh) |
AU (1) | AU2021207661A1 (zh) |
CA (1) | CA3166009A1 (zh) |
IL (1) | IL294070A (zh) |
MX (1) | MX2022008770A (zh) |
WO (1) | WO2021146481A1 (zh) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IL294659A (en) | 2020-01-14 | 2022-09-01 | Synthekine Inc | Methods and preparations of il2 skewed mutants |
WO2024086739A1 (en) | 2022-10-20 | 2024-04-25 | Synthekine, Inc. | Methods and compositions of il12 muteins and il2 muteins |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9567399B1 (en) * | 2016-06-20 | 2017-02-14 | Kymab Limited | Antibodies and immunocytokines |
AU2017359172A1 (en) * | 2016-11-08 | 2019-05-16 | Delinia, Inc. | IL-2 variants for the treatment of autoimmune diseases |
SG11202004172UA (en) * | 2017-11-10 | 2020-06-29 | Agency Science Tech & Res | Il2rbeta/common gamma chain antibodies |
US20210269497A1 (en) * | 2018-06-22 | 2021-09-02 | Cugene Inc | Interleukin-2 variants and methods of uses thereof |
-
2021
- 2021-01-14 EP EP21741554.6A patent/EP4090354A4/en active Pending
- 2021-01-14 WO PCT/US2021/013514 patent/WO2021146481A1/en unknown
- 2021-01-14 AU AU2021207661A patent/AU2021207661A1/en active Pending
- 2021-01-14 CN CN202180009469.XA patent/CN115066253A/zh active Pending
- 2021-01-14 CA CA3166009A patent/CA3166009A1/en active Pending
- 2021-01-14 KR KR1020227027688A patent/KR20220127866A/ko unknown
- 2021-01-14 MX MX2022008770A patent/MX2022008770A/es unknown
- 2021-01-14 IL IL294070A patent/IL294070A/en unknown
- 2021-01-14 US US17/785,786 patent/US20230210951A1/en active Pending
- 2021-01-14 JP JP2022542897A patent/JP2023510871A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2021146481A1 (en) | 2021-07-22 |
MX2022008770A (es) | 2022-10-07 |
IL294070A (en) | 2022-08-01 |
CA3166009A1 (en) | 2021-07-22 |
EP4090354A4 (en) | 2024-05-22 |
JP2023510871A (ja) | 2023-03-15 |
EP4090354A1 (en) | 2022-11-23 |
US20230210951A1 (en) | 2023-07-06 |
KR20220127866A (ko) | 2022-09-20 |
AU2021207661A1 (en) | 2022-07-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11648296B2 (en) | IL-2 orthologs and methods of use | |
US20230272088A1 (en) | Ifngr binding synthetic cytokines and methods of use | |
WO2022031884A2 (en) | Il2rg binding molecules and methods of use | |
KR102653906B1 (ko) | 편향된 il2 뮤테인 방법 및 조성물 | |
EP4192489A2 (en) | Il2rb binding molecules and methods of use | |
US20230210951A1 (en) | Il2 muteins | |
CN115315273A (zh) | Il-2直向同源物及其使用方法 | |
WO2023102493A2 (en) | Il10 variants and uses thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |