CN115060910A - 一种p-Tau181蛋白的检测试剂及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及体外检测技术领域，具体公开了一种p‑Tau181蛋白的检测试剂及试剂盒。一种p‑Tau181蛋白的检测试剂，所述检测试剂包括p‑Tau181蛋白抗体标记磁珠、辣根过氧化物酶标记抗体、生物素化酪胺工作液、发光标记物标记链霉亲和素试剂以及标准品。本申请的检测试剂可用于阿兹海默尔老年痴呆的生物标志物181位点磷酸化的Tau蛋白的检测，其最低检出限为0.022pg/mL，具有很高的灵敏度。

Description

一种p-Tau181蛋白的检测试剂及试剂盒
技术领域
本申请涉及体外检测技术领域，更具体地说，它涉及一种p-Tau181蛋白的检测试剂及试剂盒。
背景技术
体外诊断技术是指在人体之外，通过对机体包括血液、体液及组织等样品进行检测而获取相关的临床诊断信息的技术。化学发光免疫分析技术是将发光分析和免疫反应相结合而建立起来的一种新的检测微量抗原或抗体的新型标记免疫分析技术。
磁微粒(磁珠)化学发光产品是基于化学发光免疫分析技术开发的一类体外诊断试剂。磁珠通常采用羧基或者氨基等活性基团进行表面修饰，通过中间体活化，可与抗体或抗原上的氨基或羧基偶联。磁微粒(磁珠)化学发光技术具有灵敏度高、线性宽以及重复性好的优点，其灵敏度最高能检测出pg/mL浓度的待测物质，能够满足绝大多数临床项目的需求。但是，对于某些项目，例如用于诊断阿兹海默尔老年痴呆的生物标志物181位点磷酸化的Tau蛋白，则要求要检测出fg/mL的待测物。显然，目前的磁微粒发光技术无法满足上述要求。
发明内容
为了提高p-Tau181蛋白检测的灵敏度，本申请提供一种p-Tau181蛋白的检测试剂及试剂盒。
第一方面，本申请提供一种p-Tau181蛋白的检测试剂，采用如下的技术方案：一种p-Tau181蛋白的检测试剂，所述检测试剂包括p-Tau181蛋白抗体标记磁珠、辣根过氧化物酶标记抗体、生物素化酪胺工作液、发光标记物标记链霉亲和素试剂以及标准品。
通过采用上述技术方案，本申请采用酪酰胺信号放大(TSA，Tyramide signalamplification)技术，主要原理是利用酪胺Tyramide的过氧化物酶反应(酪胺盐在HRP催化H202下形成共价键结合位点)，产生大量的酶促产物，该产物能与周围的蛋白残基(包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基)结合，这样在抗原-抗体结合部位就有大量的生物素沉积，与随后加入的标记有发光物的链霉亲和素结合，经几次这样的循环放大，可以使其检测信号得到几何级放大。在进行p-Tau181蛋白的检测时，其最低检出限为0.022pg/mL，具有很高的灵敏度。
优选的，所述生物素化酪胺工作液由生物素化酪胺和工作液组成，所述工作液为过氧化氢工作液、过氧化脲工作液中的一种。
优选的，所述工作液为过氧化氢工作液。
优选的，所述过氧化氢工作液包括硼砂硼酸缓冲液和过氧化氢。
优选的，所述生物素化酪胺工作液中生物素化酪胺的浓度为10μg/mL。
通过采用上述技术方案，当生物素化酪胺工作液为过氧化氢工作液，且缓冲液为硼砂硼酸缓冲液时，检测结果具有较高的灵敏度。
优选的，所述发光标记物为吖啶酯。
优选的，所述p-Tau181蛋白抗体标记磁珠为羧基磁珠，其粒径为0.1-10μm。
第二方面，本申请提供一种试剂盒的制备方法，包含p-Tau181蛋白的检测试剂。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
本申请采用酪酰胺信号放大(TSA，Tyramide signal amplification)技术，主要原理是利用酪胺Tyramide的过氧化物酶反应(酪胺盐在HRP催化H202下形成共价键结合位点)，产生大量的酶促产物，该产物能与周围的蛋白残基(包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基)结合，这样在抗原-抗体结合部位就有大量的生物素沉积，与随后加入的标记有吖啶酯发光物的链霉亲和素结合，经几次这样的循环放大，可以使其检测信号得到几何级放大。在进行p-Tau181蛋白的检测时，其最低检出限为0.022pg/mL，具有很高的灵敏度。在进行p-Tau181蛋白的检测时，其最低检出限为0.022pg/mL，具有很高的灵敏度。
具体实施方式
以下结合实施例对本申请作进一步详细说明。
实施例
实施例1：一种p-tau181蛋白的检测试剂，包括如下组成：
1、1.5μm羧基磁珠，购自JSR，按照其说明书操作将兔抗人p-tau181抗体标记在磁珠上，该抗体采购自ADX公司，工作浓度为0.25mg/mL。
2、辣根过氧化物酶标记抗体，小鼠抗人总tau抗体购自ADX公司，辣根过氧化物酶标记试剂盒购自Seracare公司，按照说明书进行标记，工作浓度为0.25μg/mL。
3、生物素化酪胺工作液，生物素化酪胺工作液由生物素化酪胺和过氧化氢工作液组成。生物素化酪胺购自MCE公司，生物素化酪胺浓度为10μg/mL。过氧化氢工作液中，缓冲液为0.1M pH＝8.5硼砂硼酸缓冲液，过氧化氢的浓度为0.1wt％。
4、吖啶酯标记链霉亲和素试剂，链霉亲和素购自prozyme公司，吖啶酯NSP-SA-NHS购自厦门赫利森生物科技有限公司，按照说明书进行标记，工作浓度为0.2μg/mL。
5、标准品，标准品为含一系列浓度的p-Tau181蛋白抗原，p-Tau181蛋白采购自CST公司，用1wt％的BSA稀释至2500pg/mL、500pg/mL、100pg/mL、20pg/mL、4pg/mL、1pg/mL、0.2pg/mL、0pg/mL。
反应模式为：吸取50μl标准品加入反应杯内，然后依次加入50μl标记有抗体的磁珠、50μl辣根过氧化物酶标记的抗体，在37℃的温度下反应15min；清洗3遍后，加入100μl生物素化酪胺工作液，在37℃的温度下反应5min；清洗3遍后，加入100μl吖啶酯标记链霉亲和素试剂，在37℃的温度下反应5min；清洗3遍后，加入100μl预激发液和100μl激发液，进行光计数。
实施例2
本实施例与实施例1的不同之处在于生物素化酪胺工作液，本实施例中的生物素化酪胺工作液由生物素化酪胺和过氧化氢工作液组成。生物素化酪胺购自MCE公司，生物素化酪胺浓度为10μg/mL。过氧化氢工作液中，缓冲液为0.1M pH＝8.5硼酸盐缓冲液，过氧化氢的浓度为0.1wt％。
实施例3
本实施例与实施例1的不同之处在于生物素化酪胺工作液，本实施例中的生物素化酪胺工作液由生物素化酪胺和过氧化氢工作液组成。生物素化酪胺购自MCE公司，生物素化酪胺浓度为10μg/mL。过氧化氢工作液中，缓冲液为0.1M pH＝8.5Tris-Hcl缓冲液，过氧化氢的浓度为0.1wt％。
实施例4
本实施例与实施例1的不同之处在于生物素化酪胺工作液，本实施例中的生物素化酪胺工作液由生物素化酪胺和过氧化脲工作液组成。生物素化酪胺购自MCE公司，生物素化酪胺浓度为10μg/mL。过氧化脲工作液中，缓冲液为0.1M pH＝8.5硼酸盐缓冲液，过氧化脲的浓度为0.1wt％。
对比例
对比例1：一种p-tau181蛋白的检测试剂，包括如下组成：
1、1.5μm羧基磁珠，购自购自JSR，按照其说明书操作将兔抗人p-tau181抗体标记在磁珠上，该抗体采购自ADX公司，工作浓度为0.25mg/mL。
2、吖啶酯抗体，小鼠抗人总tau抗体购自ADX公司，吖啶酯NSP-SA-NHS购自厦门赫利森生物科技有限公司，按照说明书进行标记，工作浓度为0.25μg/mL。
3、标准品，标准品为含一系列浓度的p-Tau181蛋白抗原，p-Tau181蛋白采购自CST公司，用1wt％的BSA稀释至2500pg/mL、500pg/mL、100pg/mL、20pg/mL、4pg/mL、1pg/mL、0.2pg/mL、0pg/mL。
反应模式为：吸取50μl标准品加入反应杯内，然后依次加入50μl标记有抗体的磁珠、50μl吖啶酯抗体，在37℃的温度下反应15min；清洗3遍后，加入100μl预激发液和100μl激发液，进行光计数。
性能测试
按照反应模式的方法，采用化学发光免疫分析仪测定不同浓度的p-Tau181蛋白标准品的发光强度值，将测试结果记录于表1。
表1实施例1-4以及对比例1对标准品的发光值测试表
p-tau181标准品浓度 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 对比例1
2500pg/mL 19014572 16875457 1574123 20296521 524572
500pg/mL 4253620 3542311 456325 4236520 136875
100pg/mL 884756 685472 125422 865745 27625
20pg/mL 186336 156930 26217 172663 4936
4pg/ml 41921 34554 5158 41598 969
1pg/mL 11369 8121 1210 13256 213
0.2pg/mL 2983 1759 529 2903 135
0pg/mL 796 1481 425 1581 128
结合实施例1-3以及表1数据可以看出，缓冲体系为0.1M pH＝8.5硼砂硼酸缓冲液时，检测的灵敏度最高，因此优选硼砂硼酸缓冲液。结合实施例1、4以及表1数据可以看出，比较过氧化氢和过氧化脲两种过氧化物，2500～0.2pg/ml标准品发光值两者相差无几，但是过氧化氢的0pg/ml标准品背景值更低，因此优选过氧化氢。
综上所述，当生物素化酪胺工作液为过氧化氢工作液，且缓冲液为0.1M pH＝8.5硼砂硼酸缓冲液，过氧化氢的浓度为0.1wt％时，检测结果具有较高的灵敏度。
结合实施例1、对比例1以及表1数据可以看出，实施例1的反应模式中4pg/ml发光值为41921，0pg/ml的发光值为796，信/噪＝52.6；而0.2pg/ml发光值为2983，0pg/ml的发光值为796，信/噪＝3.75，说明本申请实施例1的试剂的最低定量限在0.2pg/mL左右。对比例1的标准品的反应模式中4pg/ml发光值为969，0pg/ml的发光值为128，信/噪＝7.57；而1pg/ml发光值为213，0pg/ml的发光值为128，信/噪＝1.66，说明对比例1的试剂的最低定量限在4pg/mL左右。可见，对比例1的检测试剂的灵敏度远低于本申请实施例1的检测试剂的灵敏度，本申请的检测试剂的灵敏度相较于现有检测试剂的灵敏度提高了20倍。
为了验证实施例1的检测实际的最低检测限以及精密度，分别进行如下测试。
1.最低检测限
在同一次实验中重复测定零浓度工作标准品20次，计算其平均值(M)加两倍标准差(S)。根据零浓度标准品与相邻标准品之间的浓度-RLU值结果进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2S的RLU值代入上述方程中，求出对应的浓度值，即为最低检测限。将检测限检测数据记录于表2。
表2检测限数据表
序号 发光值 序号 发光值
0pg/mL-第1次 994 0pg/mL-第11次 900
0pg/mL-第2次 797 0pg/mL-第12次 878
0pg/mL-第3次 847 0pg/mL-第13次 665
0pg/mL-第4次 985 0pg/mL-第14次 680
0pg/mL-第5次 895 0pg/mL-第15次 606
0pg/mL-第6次 976 0pg/mL-第16次 630
0pg/mL-第7次 705 0pg/mL-第17次 957
0pg/mL-第8次 987 0pg/mL-第18次 871
0pg/mL-第9次 659 0pg/mL-第19次 959
0pg/mL-第10次 714 0pg/mL-第20次 701
根据表2数据可知，M+2S＝1036，带入0pg/mL与0.2pg/mL标准品之间的浓度-RLU值拟合得的一次方程后计算出最低检出限为0.022pg/mL。
2.精密度
重复检测浓度在20pg/mL和1pg/mL区间的样品10次，根据剂量反应曲线计算其浓度值，并计算其均值(M)和标准差(S)，计算变异系数(CV)，CV＝S/(M×100％)。将重复性测定数据记录于表3。
表3重复性测定结果
Figure BDA0003682463350000051
Figure BDA0003682463350000061
根据表3数据可知，检测20pg/mL浓度的样本10次的重复性CV＝4.2％；检测1pg/mL浓度的样本10次的重复性CV＝8.9％，说明结果满足重复性能的要求。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (8)

1.一种p-Tau181蛋白的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包括p-Tau181蛋白抗体标记磁珠、辣根过氧化物酶标记抗体、生物素化酪胺工作液、发光标记物标记链霉亲和素试剂以及标准品。
2.根据权利要求1所述的一种p-Tau181蛋白的检测试剂，其特征在于，所述生物素化酪胺工作液由生物素化酪胺和工作液组成，所述工作液为过氧化氢工作液、过氧化脲工作液中的一种。
3.根据权利要求2所述的一种p-Tau181蛋白的检测试剂，其特征在于，所述工作液为过氧化氢工作液。
4.根据权利要求3所述的一种p-Tau181蛋白的检测试剂，其特征在于，所述过氧化氢工作液包括硼砂硼酸缓冲液和过氧化氢。
5.根据权利要求2所述的一种p-Tau181蛋白的检测试剂，其特征在于，所述生物素化酪胺工作液中生物素化酪胺的浓度为10μg/mL。
6.根据权利要求1所述的一种p-Tau181蛋白的检测试剂，其特征在于，所述发光标记物为吖啶酯。
7.根据权利要求1所述的一种p-Tau181蛋白的检测试剂，其特征在于，所述p-Tau181蛋白抗体标记磁珠为羧基磁珠，其粒径为0.1-10μm。
8.一种试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1-7任意一项所述的p-Tau181蛋白的检测试剂。
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