CN115060570A - 一种适用于类器官等微小组织的包埋方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种适用于类器官等微小组织的包埋方法，步骤包括：用超纯水和琼脂糖粉剂制备琼脂糖溶液；将琼脂糖溶液制备成设置有微孔的琼脂糖微孔胶；将预包埋微小组织置于多聚甲醛中混合；将琼脂糖微孔胶嵌入培养皿内；将含有预包埋微小组织的多聚甲醛加载至琼脂糖微孔胶上；静置使得预包埋微小组织沉降至微孔底部；进行石蜡包埋和切片。该适用于类器官等微小组织的包埋方法通过琼脂糖微孔胶分布的微孔来固定预包埋微小组织，使得类器官微小组织均匀分布固定于同一水平下再进行石蜡包裹，使得微小组织在切片时不易丢失漏切，能够在同一水平切面可切到多个类器官微小组织，也能更容易切到类器官的最大径面。
Description
技术领域
本发明涉及一种包埋方法，尤其是一种适用于类器官等微小组织的包埋方法。
背景技术
类器官是再生医学、药理学、毒理学常用实验工具，是目前生物医学领域的研究热点，但是由于类器官组织体积往往较小，其包埋切片中往往容易出现丢失样本、切裂、无法切到完整的类器官或是无法切到类器官最大直径面等诸多问题。目前，很多较小的类器官(100-1000um)包埋中，往往采用以量取胜使用大量的类器官(>＝20个)聚集在一起后使用塑料包裹后再进行包埋，但是也依然容易出现以上问题。因此有必要设计出一种适用于类器官等微小组织的包埋方法，可以使得类器官在一个水平面均匀地固定在微孔胶内再进行包埋，使得切片时不容易丢失类器官，更容易切到类器官的最大直径，也更容易在一个切面切到多个类器官，从而更好地全面评估大量类器官样本。
发明内容
发明目的：提供一种适用于类器官等微小组织的包埋方法，使得切片时不容易丢失类器官，更容易切到类器官的最大直径，也更容易在一个切面切到多个类器官，从而更好地全面评估大量类器官样本。
技术方案：本发明所述的适用于类器官等微小组织的包埋方法，包括如下步骤：
步骤1，用超纯水和琼脂糖粉剂制备2％～5％溶度的琼脂糖溶液；
步骤2，将琼脂糖溶液制备成琼脂糖微孔胶，且在琼脂糖微孔胶的上侧面中部分布设置有各个微孔；
步骤3，将预包埋微小组织置于4％多聚甲醛中混合；
步骤4，将琼脂糖微孔胶嵌入培养皿内，且使得琼脂糖微孔胶上的各个微孔朝上；
步骤5，将含有预包埋微小组织的4％多聚甲醛加载至琼脂糖微孔胶的上侧面上，且保持上样量不溢出；
步骤6，在4℃下静置24～26小时，使得预包埋微小组织沉降至琼脂糖微孔胶上的微孔底部；
步骤7，在4℃下保存琼脂糖微孔胶5～7天，再对琼脂糖微孔胶进行石蜡包埋；
步骤8，对石蜡包埋的琼脂糖微孔胶进行切片，并对切片进行染色。
进一步的，步骤1中，制备的琼脂糖溶液的溶度为2％，且在制备时先对琼脂糖粉末进行加热形成匀质的液态，再将液态的琼脂糖溶于超纯水中。
进一步的，步骤2中，制备琼脂糖微孔胶的具体步骤为：
将琼脂糖溶液通过移液枪滴加至模具中部的成型凹槽内，在成型凹槽内设置有长方形凸台，用于在琼脂糖微孔胶上形成用于加载溶液的长方形凹槽，在长方形凸台上设置有小圆柱阵列，用于在长方形凹槽内形成用于加载预包埋组织的微孔，且微孔直径为1.8～2.2mm；
在琼脂糖溶液凝固形成琼脂糖微孔胶后，从模具中部的成型凹槽中取出琼脂糖微孔胶，并放置于PBS中4℃保存。
进一步的，步骤2中，在方形凸台上设置有5行7列的小圆柱阵列，用于在琼脂糖微孔胶上形成35个用于加载预包埋组织的微孔。
进一步的，步骤3中，将预包埋微小组织置于4％多聚甲醛中时：
根据琼脂糖微孔胶上长方形凹槽的容积大小设置预包埋微小组织与4％多聚甲醛的混合总体积，且预包埋微小组织的任意切面上两点最长距离在100um-1mm范围内。
进一步的，步骤4中，培养皿选择与琼脂糖微孔胶体积相适应的24孔培养皿。
进一步的，步骤5中，加载的含有预包埋微小组织的4％多聚甲醛为60ul，且预包埋微小组织的浓度为35个组织/60ul。
进一步的，步骤6中，在静置的过程中，需要通过肉眼或显微镜对预包埋微小组织是否沉淀进入圆形微孔内进行观察，确保预包埋微小组织完全沉淀于圆形微孔内。
进一步的，步骤7中，在保存琼脂糖微孔胶前，用移液枪在培养皿内缓慢加入1ml的4％多聚甲醛，且移液枪的枪头偏离琼脂糖微孔胶并贴近培养皿的内底部。
进一步的，步骤8中，对石蜡包埋的琼脂糖微孔胶进行切片时，切片的厚度设置为3um；对切片的染色包括HE染色和免疫荧光染色。
本发明与现有技术相比，其有益效果是：本发明通过琼脂糖微孔胶分布的微孔来固定预包埋微小组织，从而可使得类器官微小组织均匀分布固定于同一水平下再进行石蜡包裹，使得微小组织在切片时不易丢失漏切，能够在同一水平切面可切到多个类器官微小组织，也能更容易切到类器官的最大径面，使切面更完整，同时低浓度的琼脂糖胶(2％琼脂糖)不会影响染色背景。
附图说明
图1为本发明的方法流程图；
图2为本发明的制备琼脂糖微孔胶的模具结构图；
图3为本发明的琼脂糖微孔胶实物视图；
图4为本发明的琼脂糖微孔胶嵌入培养皿内视图；
图5为本发明的琼脂糖微孔胶包埋后的蜡块视图；
图6为本发明的琼脂糖微孔胶包埋后的3um厚度切片视图；
图7为本发明的琼脂糖微孔胶包埋方法对睾丸类器官包埋切片后进行HE染色视图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。
实施例1：
如图1-7所示，本发明提供的适用于类器官等微小组织的包埋方法，包括如下步骤：
步骤1，用超纯水和琼脂糖粉剂制备2％～5％琼脂糖溶液，优先为2％琼脂糖溶液，可将1.5g的琼脂糖粉剂溶解于100ml超纯水中进行制备；按照所需包埋样本所需数量，可适当调整制备琼脂糖溶液体积，每块胶约需400ul琼脂糖溶液，亦可适当调整琼脂糖微孔胶琼脂浓度但不宜超过5％；琼脂糖粉末不能在常温下完全速溶于超纯水，因此在制备时先对琼脂糖粉末进行加热形成匀质的液态，再将液态的琼脂糖溶于超纯水中，形成匀质的液态，加热时使用高压釜或者微波炉等加热溶解为宜；琼脂糖溶液凝固后可再次加热溶解，故一次可制备大量凝胶，可放置于PBS中4℃保存1月备用。
步骤2，将琼脂糖溶液制备成琼脂糖微孔胶，且在琼脂糖微孔胶的上侧面中部分布设置有各个微孔；在制备琼脂糖微孔胶时，将琼脂糖溶液通过1ml移液枪滴加至模具中部的成型凹槽内，模具结构如图2所示，在成型凹槽内设置有长方形凸台，用于在琼脂糖微孔胶上形成用于加载溶液的长方形凹槽，在长方形凸台上设置有小圆柱阵列，用于在长方形凹槽内形成用于加载预包埋组织的微孔，具体的，在方形凸台上设置有5行7列的小圆柱阵列，用于在琼脂糖微孔胶上形成35个用于加载预包埋组织的微孔，微孔直径为1.8～2.2mm，优选为2mm；在琼脂糖溶液凝固形成琼脂糖微孔胶后，从模具中部的成型凹槽中取出琼脂糖微孔胶，并放置于PBS中4℃保存，制备成的琼脂糖微孔胶如图3所示。
步骤3，将预包埋微小组织置于4％多聚甲醛中混合，具体的，根据琼脂糖微孔胶上长方形凹槽的容积大小设置预包埋微小组织与4％多聚甲醛的混合总体积，混合总体积不超过60微升，否则在加样时容易溢出琼脂糖胶的长方形凹槽导致样本丢失，且预包埋微小组织的任意切面上两点最长距离在100um-1mm范围内,不宜超过1.5mm。
步骤4，将琼脂糖微孔胶嵌入培养皿内，如图4所示，且使得琼脂糖微孔胶上的各个微孔朝上，培养皿选择与琼脂糖微孔胶体积相适应的24孔培养皿，方便使用4％多聚甲醛固定，且在预包埋样本沉淀至微孔底部后可再进一步添加1ml的4％多聚甲醛，从而更好地进行样本固定。
步骤5，将含有预包埋微小组织的4％多聚甲醛加载至琼脂糖微孔胶的上侧面上，且保持上样量不溢出，以免预包埋样本丢失；琼脂糖微孔胶的上侧面上的35个微孔，是预包埋组织的上样加载区，是该包埋方法的关键所在；适当的液体量混合预包埋微小组织，易于微小组织沉淀更好地加载至微孔底部，但是过多的液体也会导致微小组织溢出长方形凹槽，加载的含有预包埋微小组织的4％多聚甲醛为60ul，且预包埋微小组织的浓度为35个组织/60ul。
步骤6，在4℃下静置24～26小时，优选为24小时，在静置的过程中，需要通过肉眼或显微镜对预包埋微小组织是否沉淀进入圆形微孔内进行观察，确保预包埋微小组织完全沉淀于圆形微孔内，若组织样本最大包络球的直径接近1mm，可通过肉眼直接观察，若组织样本最大包络球的直径小于1mm，则可通过显微镜观察确定其是否沉淀如圆形微孔内，最终尽可能使得预包埋微小组织沉降至琼脂糖微孔胶上的微孔底部。
步骤7，在4℃下保存琼脂糖微孔胶5～7天，优选为7天，再对琼脂糖微孔胶进行石蜡包埋，包埋后的蜡块如图5所示，在保存琼脂糖微孔胶前，用移液枪在培养皿内缓慢加入1ml的4％多聚甲醛，且移液枪的枪头偏离琼脂糖微孔胶并贴近培养皿的内底部，以免将加载于圆形微孔底部的预包埋组织冲出，枪头应缓慢加样。
步骤8，对石蜡包埋的琼脂糖微孔胶进行切片，并对切片进行染色，对石蜡包埋的琼脂糖微孔胶进行切片时，切片的厚度设置为3um，3um厚度切片如图6所示；对切片的染色包括HE染色和免疫荧光染色，HE染色如图7所示，其中右侧图是左侧图的一个局部放大图；对琼脂糖微孔胶进行石蜡包埋时，应注意琼脂糖微孔胶避免抖动洒落其中包埋组织，微孔胶与蜡块底部保持平行易于切片时能切到更多组织，因组织团块相对微小，石蜡包埋中透明时间应该相对缩短，以5分钟/次左右为宜。
如上所述，尽管参照特定的优选实施例已经表示和表述了本发明，但其不得解释为对本发明自身的限制。在不脱离所附权利要求定义的本发明的精神和范围前提下，可对其在形式上和细节上作出各种变化。
Claims (10)
1.一种适用于类器官等微小组织的包埋方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，用超纯水和琼脂糖粉剂制备2％～5％溶度的琼脂糖溶液；
步骤2，将琼脂糖溶液制备成琼脂糖微孔胶，且在琼脂糖微孔胶的上侧面中部分布设置有各个微孔；
步骤3，将预包埋微小组织置于4％多聚甲醛中混合；
步骤4，将琼脂糖微孔胶嵌入培养皿内，且使得琼脂糖微孔胶上的各个微孔朝上；
步骤5，将含有预包埋微小组织的4％多聚甲醛加载至琼脂糖微孔胶的上侧面上，且保持上样量不溢出；
步骤6，在4℃下静置24～26小时，使得预包埋微小组织沉降至琼脂糖微孔胶上的微孔底部；
步骤7，在4℃下保存琼脂糖微孔胶5～7天，再对琼脂糖微孔胶进行石蜡包埋；
步骤8，对石蜡包埋的琼脂糖微孔胶进行切片，并对切片进行染色。
2.根据权利要求1所述的适用于类器官等微小组织的包埋方法，其特征在于，步骤1中，制备的琼脂糖溶液的溶度为2％，且在制备时先对琼脂糖粉末进行加热形成匀质的液态，再将液态的琼脂糖溶于超纯水中。
3.根据权利要求1所述的适用于类器官等微小组织的包埋方法，其特征在于，步骤2中，制备琼脂糖微孔胶的具体步骤为：
将琼脂糖溶液通过移液枪滴加至模具中部的成型凹槽内，在成型凹槽内设置有长方形凸台，用于在琼脂糖微孔胶上形成用于加载溶液的长方形凹槽，在长方形凸台上设置有小圆柱阵列，用于在长方形凹槽内形成用于加载预包埋组织的微孔，且微孔直径为1.8～2.2mm；
在琼脂糖溶液凝固形成琼脂糖微孔胶后，从模具中部的成型凹槽中取出琼脂糖微孔胶，并放置于PBS中4℃保存。
4.根据权利要求3所述的适用于类器官等微小组织的包埋方法，其特征在于，步骤2中，在方形凸台上设置有5行7列的小圆柱阵列，用于在琼脂糖微孔胶上形成35个用于加载预包埋组织的微孔。
5.根据权利要求3所述的适用于类器官等微小组织的包埋方法，其特征在于，步骤3中，将预包埋微小组织置于4％多聚甲醛中时：
根据琼脂糖微孔胶上长方形凹槽的容积大小设置预包埋微小组织与4％多聚甲醛的混合总体积，且预包埋微小组织的任意切面上两点最长距离在100um-1mm范围内。
6.根据权利要求1所述的适用于类器官等微小组织的包埋方法，其特征在于，步骤4中，培养皿选择与琼脂糖微孔胶体积相适应的24孔培养皿。
7.根据权利要求1所述的适用于类器官等微小组织的包埋方法，其特征在于，步骤5中，加载的含有预包埋微小组织的4％多聚甲醛为60ul，且预包埋微小组织的浓度为35个组织/60ul。
8.根据权利要求1所述的适用于类器官等微小组织的包埋方法，其特征在于，步骤6中，在静置的过程中，需要通过肉眼或显微镜对预包埋微小组织是否沉淀进入圆形微孔内进行观察，确保预包埋微小组织完全沉淀于圆形微孔内。
9.根据权利要求1所述的适用于类器官等微小组织的包埋方法，其特征在于，步骤7中，在保存琼脂糖微孔胶前，用移液枪在培养皿内缓慢加入1ml的4％多聚甲醛，且移液枪的枪头偏离琼脂糖微孔胶并贴近培养皿的内底部。
10.根据权利要求1所述的适用于类器官等微小组织的包埋方法，其特征在于，步骤8中，对石蜡包埋的琼脂糖微孔胶进行切片时，切片的厚度设置为3um；对切片的染色包括HE染色和免疫荧光染色。
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|---|---|---|---|---|
| CN116106108A (zh) * | 2023-02-13 | 2023-05-12 | 杭州瑞普晨创科技有限公司 | 一种细胞蜡块及少量细胞冰冻切片包埋方法 |
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| CN116106108A (zh) * | 2023-02-13 | 2023-05-12 | 杭州瑞普晨创科技有限公司 | 一种细胞蜡块及少量细胞冰冻切片包埋方法 |
| CN116106108B (zh) * | 2023-02-13 | 2024-04-05 | 杭州瑞普晨创科技有限公司 | 一种细胞蜡块及少量细胞冰冻切片包埋方法 |
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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