CN115058429A - 靶标为碱性磷酸酶异源二聚体的核酸适体及其衍生物和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了靶标为碱性磷酸酶异源二聚体的核酸适体及其衍生物和应用。该核酸适体为如下任一种:(1)将核酸适体BG2核苷酸序列第8位和/或第25‑28位进行核苷酸取代,得到与所述核酸适体BG2具有相同功能的核酸适体;(2)将核酸适体BG2核苷酸序列末端连接至少一个核苷酸残基,到与所述核酸适体BG2具有相同功能的核酸适体等;核酸适体BG2为序列表中序列1所示的单链DNA分子。该核酸适体具有更高亲和力、更强的耐核酸酶性能以及更好的稳定性的特点;并且可以对不同部位进行修饰和取代,且序列稳定,易于保存等。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及靶标为碱性磷酸酶异源二聚体的核酸适体及其衍生物和应用。
背景技术
碱性磷酸酶是一种质膜结合的糖蛋白,存在于多种组织中,催化磷酸酯的水解,在发育过程中与细胞分化潜能和干性有关。碱性磷酸酶广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织经肝脏向胆外排出,可直接参与磷代谢,在钙、磷的消化、吸收、分泌及骨化的过程发挥了重要作用。这种酶能催化核酸分子脱掉5’磷酸基团,从而使DNA或RNA片段的5’-P末端转换成5’-OH末端。但它不是单一的酶,而是一组同功酶。目前已知人类同工酶包括:组织非特异性碱性磷酸酶(TNAP),肠型碱性磷酸酶(IAP),胎盘型碱性磷酸酶(PALP)和类胎盘型碱性磷酸酶(GCAP)。正常人血清中的碱性磷酸酶主要来自肝和骨骼,碱性磷酸酶测定主要用于诊断肝胆和骨骼系统疾病,是反映肝外胆道梗阻、肝内占位性病变和佝偻病的重要指标。据报道,碱性磷酸酶同工酶,胎盘型碱性磷酸酶和肠型碱性磷酸酶在多能胚胎干细胞和癌细胞中过表达,被认为是癌症免疫毒素治疗的靶点。
蛋白质的二聚化是生物体内一种重要的生理现象,蛋白的二聚体往往是蛋白质发挥生物学功能的重要形式。碱性磷酸酶异源二聚体,是肠型碱性磷酸酶(IAP)与胎盘型碱性磷酸酶(PALP)或类胎盘型碱性磷酸酶(GCAP)形成的蛋白复合物,在结直肠癌、乳腺癌、肝细胞癌、宫颈癌等肿瘤组织中高表达。游离的碱性磷酸酶异源二聚体、含有碱性磷酸酶异源二聚体的外泌体或循环肿瘤细胞可以从原发性肿瘤或转移病灶释放到血流中。因此,检测游离的碱性磷酸酶异源二聚体、外泌体或循环肿瘤细胞将有助于肿瘤的早期诊断和筛查、监测术后患者肿瘤的复发与转移、评估抗肿瘤药物的敏感性与患者预后以及选择个体化治疗的策略。
核酸适体是一种单链DNA或者RNA,一般由20-60个核苷酸组成。核酸适体与靶标的特异性结合是主要是通过分子内折叠形成独特的空间结构进而特异性识别的。单链DNA或者RNA经互补配对或折叠形成带有内环、茎、T-连接、G-四链体、发夹等二级或三级结构使其具有结合功能,这些结构使核酸适体拥用固定的空间形态,促进了核酸适体与其靶标之间的氢键、静电作用、和π-π堆积相互作用的形成,并且这样形成的核酸适体与靶分子之间拥有较大的接触面积,与靶分子的结合更加紧密,因此具有很高的亲和力和特异性,核酸适体的解离常数通常在微摩至皮摩的范围内,这与抗体的检测范围相当,核酸适体又被称为“化学抗体”。
尽管核酸适体与抗体相比具有很多优势,但核酸适体在实际应用中仍有很多缺陷。限制核酸适体发展的主要缺陷是核酸酶稳定性和热稳定性不高,以及亲和力不足。但在获得核酸适体后,对其进行序列优化和修饰可改善这些不足。核酸适体的优化方法一般包括:非结合部位截短、化学修饰、碱基突变以及多价适体构建。截短一般是截掉适体中不参与结合或结构形成的区域。化学修饰是指用化学的方法在核酸适体的指定位置修饰官特定能团,适体的化学修饰可以提高其抗核酸酶降解的能力、热稳定性、肾清除率以及适体的亲和力与特异性等问题。多价适体相互作用指的是多个适体连接在一起与一个或者多个受体相结合,与单价适体相比,多价适体表现出更高的亲和力、构象稳定性和核酸酶抗性。突变是指在适体的某个位置改变、删除、或者增加一个或多个碱基。
基于上述特点,核酸适体作为新型的仿生识别元素,已在众多领域得到了广泛的应用,但仍有一些不足需要优化改进。
发明内容
本发明的目的之一是提供具有高特异性和高亲和力识别碱性磷酸酶异源二聚体的核酸适体及其衍生物。
本发明提供了核酸适体,为如下任一种:
(1)将核酸适体BG2核苷酸序列第8位和/或第25-28位进行核苷酸取代,得到与所述核酸适体BG2具有相同功能的核酸适体;
(2)将核酸适体BG2核苷酸序列末端连接至少一个核苷酸残基,到与所述核酸适体BG2具有相同功能的核酸适体;
(3)包括核酸适体BG2、所述核酸适体(1)和/或所述核酸适体(2)的多价核酸适体;
(4)将核酸适体BG2、所述核酸适体(1)、所述核酸适体(2)或所述核酸适体(3)进行核苷酸修饰,得到与所述核酸适体BG2具有相同功能的核酸适体;
(5)将核酸适体BG2、所述核酸适体(1)、所述核酸适体(2)、所述核酸适体(3)或所述核酸适体(4)的末端或中间连接信号分子(如荧光素FITC,FAM,罗丹明B)、活性分子(如生物素、氨基、羧基、酶)、功能基团和/或放射性核素,得到与所述核酸适体BG2具有相同功能的核酸适体;
核酸适体BG2(下述也称为核酸适体1)为序列表中序列1所示的单链DNA分子。
可选地,根据上述的核酸适体,
所述核酸适体(1)的核苷酸序列为序列表中序列2-6任一所示;
所述核酸适体(2)的核苷酸序列为序列表中序列14所示;
所述核酸适体(3)的核苷酸序列为序列表中序列7所示。
上述核苷酸序列为序列表中序列2-6任一所示的核酸适体依次命名为核酸适体2-6,可依据核酸适体1利用Re-SELEX技术优化突变得到的,序列具有高度的保守性。
核酸适体2-6具体如下。
核酸适体2(BG15):
5’-CAAGGAAAAGGGGTCGGTGTGGGTGGTTATGATTGGCTTCCTTG-3’;是将核酸适体1从5’端的第8位替换为A得到;见序列表序列2。
核酸适体3(BG16):
5’-CAAGGAAAAGGGGTCGGTGTGGGTAAGAATGATTGGCTTCCTTG-3’;是将核酸适体1从5’端的第8位替换为A,25-28位替换为AAGA得到;见序列表序列3。
核酸适体4(BG8):
5’-CAAGGAAAAGGGGTCGGTGTGGGTAGGGATGATTGGCTTCCTTG-3’;是将核酸将核酸适体1从5’端的第8位替换为A,25-28位替换为AGGG得到;见序列表序列4。
核酸适体5(BG26):
5’-CAAGGAAAAGGGGTCGGTGTGGGTGGGGATGATTGGCTTCCTTG-3’;是将核将核酸适体1从5’端的第8位替换为A,25-28位替换为GGGG得到;见序列表序列5。
核酸适体6(BG12):
5’-CAAGGAAAAGGGGTCGGTGTGGGTGGTGATGATTGGCTTCCTTG-3’;将核酸适体1从5’端的第8位替换为A,25-28位替换为GGTG得到;见序列表序列6。
可选地,根据上述的核酸适体,所述核苷酸修饰为磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化。
可选地,根据上述的核酸适体,所述核酸适体(5)为在核酸适体BG2、所述核酸适体(1)、所述核酸适体(2)、所述核酸适体(3)或所述核酸适体(4)的末端或中间连接荧光基团、生物素(Biotin)、Biotin-TEG基团、Biotin-TEG-spacer18基团和/或spacer 9基团。
荧光基团可为荧光素FAM。Biotin-TEG基团可为由生物素和TEG(类似四个连续的乙二醇,修饰序列由上海生工公司合成)组成的linker链。Biotin-TEG-spacer18基团可为由生物素和TEG以及6个连续的乙二醇组成的linker链。spacer 9基团可为三个连续的乙二醇组成的linker链。
可选地,根据上述的核酸适体,所述核酸适体(5)为如下任一种:
(501)将序列如序列表中序列7所示的核酸适体3’端连接生物素,5’端连接荧光素FAM得到的核酸适体;
(502)将核酸适体BG2的从5’端的第14位替换为标记了荧光素FAM的碱基T得到的核酸适体;
(503)将核酸适体BG2的从5’端的第20位替换为标记了荧光素FAM的碱基T得到的核酸适体;
(504)将核酸适体BG2的从5’端的第28位替换为标记了荧光素FAM的碱基T得到的核酸适体;
(505)将序列如序列表中序列5所示的核酸适体5’端修饰Biotin-TEG基团,3’端修饰荧光素FAM得到的核酸适体;
(506)将核酸适体BG2的5’端修饰Biotin-TEG基团,3’端修饰荧光素FAM得到的核酸适体;
(507)将核酸适体BG2的5’端以及3’端分别修饰生物素得到的核酸适体;
(508)将序列如序列表中序列14所示的核酸适体5’端修饰生物素得到的核酸适体;
(509)将核酸适体BG2的5’端修饰Biotin-TEG基团得到的核酸适体;
(510)将核酸适体BG2的5’端修饰Biotin-TEG基团,3’端修饰spacer9基团得到的核酸适体;
(511)将核酸适体BG2的5’端修饰Biotin-TEG-spacer18基团得到的核酸适体。
上述核酸适体(501)可为核酸适体7(BG2di3bf):5’-CAAGGAATAGGGGTCGGTGTGGGTGGTTATGATTGGCTTCCTTGtCAAAAGATAGGGGTCGGTGTGGGTGGTTATGATTGGCTCTTTTGT-3’;是将核酸适体1的3’端最后一个碱基与另一个核酸适体1的5’端第一个碱基中间通过碱基T连接,并在适体的在适体的3’端连接生物素Biotin,5’端连接荧光素FAM得到;见序列表序列7。
上述核酸适体(502)可为核酸适体8(BG2-14t):5′-CAAGGAATAGGGGTCGGTGTGGGTGGTTATGATTGGCTTCCTTG-3′;将核酸适体1的从5’端的第14位替换为标记了荧光素FAM的碱基T得到;见序列表序列8。
上述核酸适体(503)可为核酸适体9(BG2-20t):5′-CAAGGAATAGGGGTCGGTGTGGGTGGTTATGATTGGCTTCCTTG-3′;将核酸适体1的从5’端的第20位替换为标记了荧光素FAM的碱基T得到;见序列表序列9。
上述核酸适体(504)可为核酸适体10(BG2-28t):5′-CAAGGAATAGGGGTCGGTGTGGGTGGTTATGATTGGCTTCCTTG-3′;将核酸适体1的从5’端的第28位替换为标记了荧光素FAM的碱基T得到;见序列表序列10。
上述核酸适体(505)可为核酸适体11(Biotin-TEG-适体5-FAM):5′-CAAGGAAAAGGGGTCGGTGTGGGTGGGGATGATTGGCTTCCTTG-3′;将核酸适体5的5’端的修饰Biotin-TEG基团(由生物素和TEG组成的linker链),3’端修饰荧光素FAM得到;见序列表序列11。
上述核酸适体(506)可为核酸适体12(Biotin-TEG-BG2-FAM):5′-CAAGGAATAGGGGTCGGTGTGGGTGGTTATGATTGGCTTCCTTG-3′;将核酸适体1的5’端的修饰Biotin-TEG基团(由生物素和TEG组成的linker链),3’端修饰荧光素FAM得到;见序列表序列12。
上述核酸适体(507)可为核酸适体13(BG2bibiotin):5′-CAAGGAATAGGGGTCGGTGTGGGTGGTTATGATTGGCTTCCTTG-3′;将核酸适体1的5’端以及3’端分别修饰Biotin基团得到;见序列表序列13。
上述核酸适体(508)可为核酸适体14(BG2-t-biotin):5′-TTTTTTTTTTCAAGGAATAGGGGTCGGTGTGGGTGGTTATGATTGGCTTCCTTG-3′;将核酸适体1的5’端连接10个T碱基得到新的适体,在新的核酸适体的5’端修饰Biotin基团得到;见序列表序列14。
上述核酸适体(509)可为核酸适体15(Biotin-TEG-BG2):5′-CAAGGAATAGGGGTCGGTGTGGGTGGTTATGATTGGCTTCCTTG-3′;将核酸适体1的5’端修饰Biotin-TEG基团(由生物素和TEG组成的linker链)得到;见序列表序列15。
上述核酸适体(510)可为核酸适体16(Biotin-TEG-BG2-spacer9):5′-CAAGGAATAGGGGTCGGTGTGGGTGGTTATGATTGGCTTCCTTG-3′;将核酸适体1的5’端修饰Biotin-TEG基团(由生物素和TEG组成的linker链),3’端修饰spacer9基团(三个连续的乙二醇组成的linker链)得到;见序列表序列16。
上述核酸适体(511)可为核酸适体17(Biotin-TEG-spacer18-BG2):5′-CAAGGAATAGGGGTCGGTGTGGGTGGTTATGATTGGCTTCCTTG-3′;将核酸适体1的5’端修饰Biotin-TEG-spacer18基团(由生物素和TEG以及6个连续的乙二醇组成的linker链)得到;见序列表序列17。
本发明还提供了一种核酸适体,所述核酸适体为如下任一种:
1)与上述核酸适体的核苷酸序列的同源性在60%以上(删除部分或增加部分互补的核苷酸)的核酸适体;
2)与上述核酸适体的核苷酸序列进行杂交的DNA分子;
3)与上述核酸适体的核苷酸序列转录的RNA分子。
本发明还提供了一种核酸适体衍生物,所述衍生物是上述核酸适体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架,或者是上述核酸适体编码的肽核酸。
上述的核酸适体或上述的核酸适体衍生物在如下任一种的应用也属于本发明的保护范围之内:
(1)制备捕获和/或检测碱性磷酸酶异源二聚体的产品;
(2)制各捕获和/或检测待测样本中是否含有表达或高表达碱性磷酸酶异源二聚体的肿瘤或肿瘤细胞的产品;
(3)制备捕获和/或检测待测样本中是否含有表达或高表达碱性磷酸酶异源二聚体的循环肿瘤细胞的产品;
(4)制备捕获和/或检测待测样本中是否含有表达或高表达碱性磷酸酶异源二聚体的外泌体的产品。
可选地,根据上述的应用,所述肿瘤为结直肠癌、乳腺癌、肝细胞癌或宫颈癌。
可选地,根据上述的应用,所述产品为试剂盒、分子探针或靶向介质。
与现有技术相比,本发明的优点在于:本发明通过筛选、碱基突变和构建二价适体得到的核酸适体具有更高亲和力、更强的耐核酸酶性能以及更好的稳定性的特点;并且可以对不同部位进行修饰和取代,且序列稳定,易于保存等。
通过以下的详细说明和所附权利要求书将更明确本发明的其它特征和实施方式。
附图说明
图1为实施例1中核酸适体随筛选轮数的富集过程。
图2为实施例2中核酸适体1-6的解离常数测定曲线。
图3为实施例2中核酸适体2-6对核酸适体1的竞争实验。
图4为实施例3中核酸适体7-12的解离常数测定曲线。
图5为实施例3中核酸适体1、核酸适体9、核酸适体11、核酸适体12的降解图示。
图6为实施例4中核酸适体1、核酸适体7、核酸适体11-17的细胞捕获效率图示。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南,并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验,如无特别说明,均设置三次重复实验,结果取平均值。
结直肠癌细胞(LoVo)购自中国科学院典型培养物保藏委员会。
人急性T淋巴细胞白血病细胞(Jurkat-6E)购自中国医学科学院基础医学研究所细胞培养中心。
实施例1、核酸适体的筛选(RE-SELEX)和制备
结合缓冲溶液(pH=7.4):含137mM NaCl、5mM MgCl2、2.7mM KCl、2mM KH2PO4、10mMNa2HPO4,25mM葡萄糖,1mg/mL BSA,0.1mg/mL鲱鱼精DNA和0.01%(v/v)吐温-80。洗脱缓冲液(pH=8.0):含137mM NaCl、5mM MgCl2、2.7mM KCl、2mM KH2PO4、10mM Na2HPO4和25mM葡萄糖。
一、细胞的培养
所有细胞均用RPMI 1640(含10%胎牛血清、1%青链霉素)培养,均在培养箱中进行常规培养(37℃,5%CO2),每两天传代一次。
二、随机核酸文库的设计
初始核酸文库为突变后的BG2序列的两端分别加上20个固定核苷酸的引物结合区组成,具体随机文库如下:
5′-AAGGAGCAGCGTGGAGGATACAAGGAAnnnnnGTCnnTGTnnGTnnnnATGAnnnnnTTCCTTGCTCATGGACGTGCTGGTGAC-3′;n代表A、T、C或G的随机核苷酸。
BG2(本发明也被称为核酸适体1)序列具体如下:
5′-CAAGGAATAGGGGTCGGTGTGGGTGGTTATGATTGGCTTCCTTG-3′。
三、核酸适体的筛选
1、文库预处理
将3.1nmol随机核酸文库(步骤二中合成)溶于结合缓冲液,95℃变性5min,冰上冷却10min,室温复性放置30min。
2、筛选
将预处理后的ssDNA库(随着筛选压力增加而降低DNA量)加入结直肠癌细胞(LoVo)中,在4℃振荡孵育1h(随筛选轮数增加而逐渐减少孵育时间)。
再用结合缓冲液清洗细胞几次之后,用细胞刮刀将细胞刮下来,加100μL水于95℃加热5min,洗脱结合在结直肠癌细胞(LoVo)上的ssDNA。而后将洗脱下来的ssDNA进行PCR扩增。PCR扩增的引物为:
5′-FAM-AAGGAGCAGCGTGGAGGATA-3′;
5′-Biotin-GTCACCAGCACGTCCATGAG-3
PCR扩增程序:95℃ 150s,95℃ 30s,60℃ 30s,72℃ 30s,10个循环;72℃,5min。
用链霉亲和素琼脂糖球从PCR产物中分离得到FAM标记的单链DNA(ssDNA)序列。将得到的ssDNA用NAP-5柱子(通用电气医疗集团,瑞典)脱盐,真空干燥,用于下一轮的筛选。
为了提高核酸适体的亲和力和特异性,在筛选过程中逐步增加洗涤次数、减少正筛细胞LoVo的数量,以增加筛选的压力。核酸适体随筛选轮数的富集过程如图1所示,与结直肠癌细胞(LoVo)结合的核苷酸序列在第2轮时就得到了明显富集,经过逐步加压后,结合序列在第4轮得到进一步得到富集,该过程说明核酸文库被很快的富集,第五轮筛选较第四轮位移增长速度减弱,且与BG2原始序列位移相近,表现出到达平台的趋势,所以针对第四轮的筛选结果即第五轮的核酸文库进行了高通量测序。
3、候选核酸适体的选择
步骤2得到的核酸适体经过数据分析以及与核酸适体1BG 2序列比对,最终得到的突变的核酸适体序列如下。
核酸适体2:
5’-CAAGGAAAAGGGGTCGGTGTGGGTGGTTATGATTGGCTTCCTTG-3’;是将核酸适体1从5’端的第8位突变为A得到;见序列表序列2。
核酸适体3:
5’-CAAGGAAAAGGGGTCGGTGTGGGTAAGAATGATTGGCTTCCTTG-3’;是将核酸适体1从5’端的第8位突变为A,25-28位突变为AAGA得到;见序列表序列3。
核酸适体4:
5’-CAAGGAAAAGGGGTCGGTGTGGGTAGGGATGATTGGCTTCCTTG-3’;是将核酸适体1从5’端的第8位突变为A,25-28位突变为AGGG得到;见序列表序列4。
核酸适体5:
5’-CAAGGAAAAGGGGTCGGTGTGGGTGGGGATGATTGGCTTCCTTG-3’;是将核将核酸适体1从5’端的第8位突变为A,25-28位突变为GGGG得到;见序列表序列5。
核酸适体6:
5’-CAAGGAAAAGGGGTCGGTGTGGGTGGTGATGATTGGCTTCCTTG-3’;将核酸适体1从5’端的第8位突变为A,25-28位突变为GGTG得到;见序列表序列6。
实施例2、实施例1的核酸适体1-6与结直肠癌细胞LoVo的结合能力以及靶标验证
1、核酸适体与结直肠癌细胞LoVo的结合能力检测
将获得的核酸适体1至核酸适体6在5’端标记荧光素(FAM)分子。从上海生工公司合成上述FAM标记DNA序列,用结合缓冲液溶解各单链DNA,依据紫外吸收标定浓度后,95℃加热5min,冰上放置10min,室温放置30min。变性-再复性后的DNA用结合缓冲液稀释成1.5625nmol/L,2.5nmol/L,5nmol/L,10nmol/L,20nmol/L,50nmol/L,100nmol/L和200nmol/L浓度梯度的DNA溶液。取一皿对数生长期的结直肠癌细胞,用0.2%EDTA消化成单分散细胞悬液后平均分成若干份,与上述分子探针溶液在两个不同温度(4℃/37℃)孵育30min后,用洗涤缓冲液洗涤两遍,用BD公司的FACSCalibur流式细胞仪测定细胞表面的荧光强度。
核酸适体1至核酸适体6对结直肠癌细胞(LoVo)的结合曲线见图2所示。以细胞表面平均荧光强度和核酸适体浓度作图,图2中,横坐标为单链DNA浓度(nmol/L),纵坐标为扣去细胞自发荧光值后的平均荧光强度。利用公式Y=BmaxX(Kd+X)计算核酸适体的平衡解离常数。结果表明,RE-SELEX后的核酸适体的平衡解离常数均在纳摩尔级,且与核酸适体1的解离常数相近甚至更低,说明核酸适体的亲和力较高,该筛选方式得到了亲和力更优的适体。通过对比核酸适体1与核酸适体2-6的序列可知,核酸适体1从5’端的第8位以及25-28位是可以突变优化的区域。
2、适体与BG2的竞争实验验证靶标
将获得的核酸适体1的5’端标记荧光素(FAM)分子,而核酸适体2-6不做任何标记,从上海生工公司合成上述DNA序列,用结合缓冲液溶解各单链DNA,依据紫外吸收标定浓度后,95℃加热5min,冰上放置10min,室温放置30min。将核酸适体1用结合缓冲液稀释成200nmol/L浓度的DNA溶液,而核酸适体2-6配置为5μmol/L浓度的DNA溶液,将核酸适体1分别与核酸适体2-6混合。取一皿对数生长期的结直肠癌细胞,用5m M EDTA消化成单分散细胞悬液后平均分成若干份,与上述分子探针溶液在冰上4℃/37℃孵育30min后,用洗涤缓冲液洗涤两遍,用BD公司的FACSCalibur流式细胞仪测定细胞表面的荧光强度。
核酸适体2至核酸适体6对核酸适体1的竞争情况见图3所示,在4℃和37℃时加入了核酸适体2-6的样品荧光位移较单纯核酸适体1均有不同程度的减弱,表明核酸适体2-6与核酸适体1具有相同的靶标蛋白,因此RE-SELEX的筛选方法没有改变适体的靶标只改变了适体的亲和能力。
实施例3、核酸适体7-12的制备及结合能力与稳定性检测
为了进一步研究突变和修饰对BG2结合与稳定性的影响,制备了核酸适体7-12,研究了核酸适体7-12与结直肠癌细胞LoVo的结合能力以及不同修饰的适体在血清中稳定性。
核酸适体7-12具体如下。
核酸适体7:(BG2di3bf)
5’-CAAGGAATAGGGGTCGGTGTGGGTGGTTATGATTGGCTTCCTTGtCAAAAGATAGGGGTCGGTGTGGGTGGTTATGATTGGCTCTTTTGT-3’;是将核酸适体1的3’端最后一个碱基与另一个核酸适体1的5’端第一个碱基中间通过碱基T连接,并在适体的3’端连接荧光素FAM得到;见序列表序列7。
核酸适体8:(BG2-14t)
5′-CAAGGAATAGGGGTCGGTGTGGGTGGTTATGATTGGCTTCCTTG-3′;将核酸适体1的从5’端的第14位替换为标记了荧光素FAM的碱基T得到;见序列表序列8。
核酸适体9:(BG2-20t)
5′-CAAGGAATAGGGGTCGGTGTGGGTGGTTATGATTGGCTTCCTTG-3′;将核酸适体1的从5’端的第20位替换为标记了荧光素FAM的碱基T得到;见序列表序列9。
核酸适体10:(BG2-28t)
5′-CAAGGAATAGGGGTCGGTGTGGGTGGTTATGATTGGCTTCCTTG-3′;将核酸适体1的从5’端的第28位替换为标记了荧光素FAM的碱基T得到;见序列表序列10。
核酸适体11:(Biotin-TEG-适体5-FAM)
5′-CAAGGAAAAGGGGTCGGTGTGGGTGGGGATGATTGGCTTCCTTG-3′;将核酸适体5的5’端的修饰Biotin-TEG基团(由生物素和TEG组成的linker链),3’端修饰荧光素FAM得到;见序列表序列11。
核酸适体12:(Biotin-TEG-BG2-FAM)
5′-CAAGGAATAGGGGTCGGTGTGGGTGGTTATGATTGGCTTCCTTG-3′;将核酸适体1的5’端的修饰Biotin-TEG基团(由生物素和TEG组成的linker链),3’端修饰荧光素FAM得到;见序列表序列12。
1、结合能力检测
从上海生工公司合成带有荧光素(FAM)的核酸适体7-12。用结合缓冲液溶解各单链DNA,依据紫外吸收标定浓度后,95℃加热5min,冰上放置10min,室温放置30min。变性-再复性后的DNA用结合缓冲液稀释成1.5625nmol/L,2.5nmol/L,5nmol/L,10nmol/L,20nmol/L,50nmol/L,100nmol/L和200nmol/L浓度梯度的DNA溶液。取一皿对数生长期的结直肠癌细胞,用0.2%EDTA消化成单分散细胞悬液后平均分成若干份,与上述分子探针溶液在冰上孵育30min后,用洗涤缓冲液洗涤两遍,用BD公司的FACSCalibur流式细胞仪测定细胞表面的荧光强度。
核酸适体7至核酸适体12对结直肠癌细胞(LoVo)的结合曲线见图4所示。以细胞表面平均荧光强度和核酸适体浓度作图,图4中,横坐标为单链DNA浓度(nmol/L),纵坐标为扣去细胞自发荧光值后的平均荧光强度。利用公式Y=BmaxX(Kd+X)计算核酸适体的平衡解离常数。实施例2中核酸适体1的平衡解离常数为2.298±0.477nmol/L,核酸适体7的平衡解离常数为2.153±0.271nmol/L,核酸适体8的平衡解离常数为191.9±0.399nmol/L,核酸适体9的平衡解离常数为6.27±1.245nmol/L,核酸适体10的平衡解离常数为2.299±0.21nmol/L,核酸适体11的平衡解离常数为0.4682±0.075nmol/L,核酸适体12的平衡解离常数为2.485±0.227nmol/L。结果表明,二价核酸适体7与一价核酸适体1的亲和力相近,而核酸适体8亲和力大大减弱,但仍然具有BG2的结合特性,猜测第14个位置的碱基T参与了结合结构的形成。核酸适体12与核酸适体10解离常数稍有降低,说明修饰一定程度上可以改善结合亲和度。核酸适体11的亲和力较适体5得到了很大的提升,猜测是由于修饰了的PEG提升了其亲和力,说明筛选后的适体可通过修饰提高其性能。
2、稳定性检测
将胎牛血清(FBS)使用纯的1640培养基稀释为20%(体积百分比)、50%(体积百分比)、90%(体积百分比),将分别在3’端和5’端修饰荧光素(FAM)的核酸适体1以及核酸适体9、11、12使用三种浓度的胎牛血清(FBS)稀释至浓度为1μM。立刻移出20μL至新的离心管中并加入1μL0.5M的EDTA溶液,然后95℃放置10min,置于-20℃冰箱保存,剩余溶液放置在37℃温浴。待10min、20min、30min、1h、2h、3h取出20μL、重复上述加入EDTA以及95℃变性10min并置于-20℃保存。
制备20%的尿素-聚丙烯酰胺变性凝胶(denaturing-PAGE),上样前取出样品解冻,并与饱和脲溶液(7M)混匀,95℃变性10min,结束后放置在冰中冷却,加入含有尿素的loading buffer混匀,上样后在200V的电压下电泳1.5h。电泳结束后用Typhoon多功能激光扫描成像仪对凝胶描成像。
核酸适体1、9、11、12在37℃的胎牛血清(FBS)溶液中的降解情况见图5所示,核酸适体分别在不同浓度的不同浓度FBS溶液中孵育0.1min(0.1)、10min(10)、20min(20)、30min(30)、1h、2h以及3h后立即移出,然后电泳分析。图中20%、50%和90%分别为使用20%(体积百分比)、50%(体积百分比)、90%(体积百分比)胎牛血清(FBS)稀释。
结果显示,在3’端标记了荧光素FAM的核酸适体1在不同浓度血清中2h时已经被完全降解;核酸适体9在浓度为90%和50%的胎牛血清请(FBS)中2h几乎完全被降解,在20%的胎牛血清中2h有一部未被降解,3h几乎完全被降解;而核酸适体11在20%血清中降解3h仍约12%的分子保持完整性,在血清浓度50%和90%的血清中也有小部分分子保持完整;核酸适体12表现出与核酸适体11相似的性质。以上现象说明适体的两端修饰有利于延长适体的降解时长,提高适体的核酶耐受性,增加其稳定性。且RE-SELEX后的核酸适体5也具有同样的可修饰性。
实施例4、实施例1的核酸适体1、实施例3的核酸适体7、实施例3的核酸适体11-12、以及核酸适体13-17的细胞捕获率
从上海生工公司合成3’端标记生物素(Biotin)分子的核酸适体1,以及核酸适体7、核酸适体11、核酸适体12、核酸适体13、核酸适体14、核酸适体15、核酸适体16、核酸适体17。
核酸适体13-17具体如下。
核酸适体13:(BG2bibiotin)
5′-CAAGGAATAGGGGTCGGTGTGGGTGGTTATGATTGGCTTCCTTG-3′;将核酸适体1的5’端以及3’端分别修饰Biotin基团得到;见序列表序列13。
核酸适体14:(BG2-t-biotin)
5′-TTTTTTTTTTCAAGGAATAGGGGTCGGTGTGGGTGGTTATGATTGGCTTCCTTG-3′;将核酸适体1的5’端连接10个T碱基得到新的核酸适体,在新的核酸适体的5’端修饰Biotin基团得到;见序列表序列14。
核酸适体15:(Biotin-TEG-BG2)
5′-CAAGGAATAGGGGTCGGTGTGGGTGGTTATGATTGGCTTCCTTG-3′;将核酸适体1的5’端修饰Biotin-TEG基团(由生物素和TEG组成的linker链)得到;见序列表序列15。
核酸适体16:(Biotin-TEG-BG2-spacer9)
5′-CAAGGAATAGGGGTCGGTGTGGGTGGTTATGATTGGCTTCCTTG-3′;将核酸适体1的5’端修饰Biotin-TEG基团(由生物素和TEG组成的linker链),3’端修饰spacer9基团(三个连续的乙二醇组成的linker链)得到;见序列表序列16。
核酸适体17:(Biotin-TEG-spacer18-BG2)
5′-CAAGGAATAGGGGTCGGTGTGGGTGGTTATGATTGGCTTCCTTG-3′;将核酸适体1的5’端修饰Biotin-TEG-spacer18基团(由生物素和TEG以及6个连续的乙二醇组成的linker链)得到;见序列表序列17。
上述Biotin标记的DNA序列,用结合缓冲液溶解各单链DNA,依据紫外吸收标定浓度后,95℃加热5min,冰上放置10min,室温放置30min。
将2μL链酶亲和素磁珠(2.8μm,赛默飞世尔科技(中国)有限公司)悬浮在1mL的结合缓冲液(1mg/mL BSA,0.5mg/mL HS-DNA,PBS)中分别与2pmol生物素标记的核酸适体1,以及核酸适体7、核酸适体11、核酸适体12、核酸适体13、核酸适体14、核酸适体15、核酸适体16、核酸适体17反应,在25℃恒温下连续摇晃30min获得的结合核酸适体的磁珠(适体-MNPS)。然后将获得的适体-MNPS用磁性支架分离,用洗涤缓冲液(1mg/mL BSA,PBS,)洗涤两次以去除多余的未结合的核酸适体,然后使用10μL结合缓冲液重悬适体-MNPS获得适体-MNPS分子探针溶液。
取一皿对数生长期的结直肠癌(LoVo)细胞,用0.2%EDTA消化成单分散细胞悬液并使用结合缓冲液重悬。
根据如下方法分别制备三种样品。
(A)取1000个LoVo细胞置于1mL结合缓冲液中。
(B)Jurkat细胞离心去掉上清,洗涤一次并用结合缓冲液重悬。取1000个LoVo细胞与1×106个Jurkat细胞混合置于1mL结合缓冲液中。
(C)取全血样本100μL置于900μL结合缓冲液中并加入1000个LoVo细胞。
将上述三种样品分别与10μL适体-MNPS分子探针溶液于4℃生化培养箱连续摇晃1h获得孵育好的样品。将孵育好的样品借助磁力架洗涤三次,最后一次离心后去掉多余溶液,并加入120μL显色剂(2mM pNPP,北京华夏远洋科技有限公司)放入37℃水浴锅温浴2h。之后移出100μL上清液于酶标板中,使用酶标仪测定其在405nm处的吸收。并将其与单独LoVo细胞的吸光度对比计算捕获率。
核酸适体1、7、11、12、13、14、15、16、17对于纯的LoVo细胞(方法(A)制备的样品)、Jurkat细胞中的Lovo细胞(方法(B)制备的样品)以及全血中的LoVo细胞(方法(C)制备的样品)捕获率如图6所示,图中每根柱子上方数字为相应实验组的捕获率(%),从左到右分别为对于纯的LoVo细胞、Jurkat细胞中的Lovo细胞以及全血中的LoVo细胞的捕获率。所有核酸适体均具有不同程度的捕获LoVo细胞的能力,说明化学修饰以及RE-SELEX均不会使其丧失捕获细胞的能力。在三种样品中的捕获实验均说明核酸适体11、12、14、16、17的捕获效率均强于未作修饰的核酸适体1,说明适当延长适体结合链的长度以及对适体进行修饰PEG基团和两端修饰可以在一定程度上提高核酸适体的捕获效率。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说,在不脱离本发明的宗旨和范围,以及无需进行不必要的实验情况下,可在等同参数、浓度和条件下,在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例,应该理解为,可以对本发明作进一步的改进。总之,按本发明的原理,本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进,包括脱离了本申请中已公开范围,而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围,可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国科学院化学研究所
<120> 靶标为碱性磷酸酶异源二聚体的核酸适体及其衍生物和应用
<130> 221638
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caaggaatag gggtcggtgt gggtggttat gattggcttc cttg 44
<210> 2
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caaggaaaag gggtcggtgt gggtggttat gattggcttc cttg 44
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caaggaaaag gggtcggtgt gggtaagaat gattggcttc cttg 44
<210> 4
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caaggaaaag gggtcggtgt gggtagggat gattggcttc cttg 44
<210> 5
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caaggaaaag gggtcggtgt gggtggggat gattggcttc cttg 44
<210> 6
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caaggaaaag gggtcggtgt gggtggtgat gattggcttc cttg 44
<210> 7
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caaggaatag gggtcggtgt gggtggttat gattggcttc cttgtcaaaa gataggggtc 60
ggtgtgggtg gttatgattg gctcttttgt 90
<210> 8
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
caaggaatag gggtcggtgt gggtggttat gattggcttc cttg 44
<210> 9
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caaggaatag gggtcggtgt gggtggttat gattggcttc cttg 44
<210> 10
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
caaggaatag gggtcggtgt gggtggttat gattggcttc cttg 44
<210> 11
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
caaggaaaag gggtcggtgt gggtggggat gattggcttc cttg 44
<210> 12
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
caaggaatag gggtcggtgt gggtggttat gattggcttc cttg 44
<210> 13
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
caaggaatag gggtcggtgt gggtggttat gattggcttc cttg 44
<210> 14
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tttttttttt caaggaatag gggtcggtgt gggtggttat gattggcttc cttg 54
<210> 15
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
caaggaatag gggtcggtgt gggtggttat gattggcttc cttg 44
<210> 16
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
caaggaatag gggtcggtgt gggtggttat gattggcttc cttg 44
<210> 17
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
caaggaatag gggtcggtgt gggtggttat gattggcttc cttg 44
Claims (10)
1.核酸适体,其特征在于:为如下任一种:
(1)将核酸适体BG2核苷酸序列第8位和/或第25-28位进行核苷酸取代,得到与所述核酸适体BG2具有相同功能的核酸适体;
(2)将核酸适体BG2核苷酸序列末端连接至少一个核苷酸残基,到与所述核酸适体BG2具有相同功能的核酸适体;
(3)包括核酸适体BG2、所述核酸适体(1)和/或所述核酸适体(2)的多价核酸适体;
(4)将核酸适体BG2、所述核酸适体(1)、所述核酸适体(2)或所述核酸适体(3)进行核苷酸修饰,得到与所述核酸适体BG2具有相同功能的核酸适体;
(5)将核酸适体BG2、所述核酸适体(1)、所述核酸适体(2)、所述核酸适体(3)或所述核酸适体(4)的末端或中间连接信号分子、活性分子、功能基团和/或放射性核素,得到与所述核酸适体BG2具有相同功能的核酸适体;
核酸适体BG2为序列表中序列1所示的单链DNA分子。
2.根据权利要求1所述的核酸适体,其特征在于:
所述核酸适体(1)的核苷酸序列为序列表中序列2-6任一所示;
所述核酸适体(2)的核苷酸序列为序列表中序列14所示;
所述核酸适体(3)的核苷酸序列为序列表中序列7所示。
3.根据权利要求1所述的核酸适体,其特征在于:所述核苷酸修饰为磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化。
4.根据权利要求1所述的核酸适体,其特征在于:所述核酸适体(5)为在核酸适体BG2、所述核酸适体(1)、所述核酸适体(2)、所述核酸适体(3)或所述核酸适体(4)的末端或中间连接荧光基团、生物素、Biotin-TEG基团、Biotin-TEG-spacer18基团和/或spacer9基团。
5.根据权利要求3所述的核酸适体,其特征在于:所述核酸适体(5)为如下任一种:
(501)将序列如序列表中序列7所示的核酸适体3’端连接生物素,5’端连接荧光素FAM得到的核酸适体;
(502)将核酸适体BG2的从5’端的第14位替换为标记了荧光素FAM的碱基T得到的核酸适体;
(503)将核酸适体BG2的从5’端的第20位替换为标记了荧光素FAM的碱基T得到的核酸适体;
(504)将核酸适体BG2的从5’端的第28位替换为标记了荧光素FAM的碱基T得到的核酸适体;
(505)将序列如序列表中序列5所示的核酸适体5’端修饰Biotin-TEG基团,3’端修饰荧光素FAM得到的核酸适体;
(506)将核酸适体BG2的5’端修饰Biotin-TEG基团,3’端修饰荧光素FAM得到的核酸适体;
(507)将核酸适体BG2的5’端以及3’端分别修饰生物素得到的核酸适体;
(508)将序列如序列表中序列14所示的核酸适体5’端修饰生物素得到的核酸适体;
(509)将核酸适体BG2的5’端修饰Biotin-TEG基团得到的核酸适体;
(510)将核酸适体BG2的5’端修饰Biotin-TEG基团,3’端修饰spacer9基团得到的核酸适体;
(511)将核酸适体BG2的5’端修饰Biotin-TEG-spacer18基团得到的核酸适体。
6.核酸适体,其特征在于:所述核酸适体为如下任一种:
1)与权利要求1-5任一所述核酸适体的核苷酸序列的同源性在60%以上的核酸适体;
2)与权利要求1-5任一所述核酸适体的核苷酸序列进行杂交的DNA分子;
3)与权利要求1-5任一所述核酸适体的核苷酸序列转录的RNA分子。
7.核酸适体衍生物,其特征在于:所述衍生物是权利要求1-5任一所述核酸适体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架,或者是权利要求1-5任一所述核酸适体编码的肽核酸。
8.权利要求1-6任一所述的核酸适体或权利要求7所述的核酸适体衍生物在如下任一种的应用:
(1)制备捕获和/或检测碱性磷酸酶异源二聚体的产品;
(2)制备捕获和/或检测待测样本中是否含有表达或高表达碱性磷酸酶异源二聚体的肿瘤或肿瘤细胞的产品;
(3)制备捕获和/或检测待测样本中是否含有表达或高表达碱性磷酸酶异源二聚体的循环肿瘤细胞的产品;
(4)制备捕获和/或检测待测样本中是否含有表达或高表达碱性磷酸酶异源二聚体的外泌体的产品。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于:所述肿瘤为结直肠癌、乳腺癌、肝细胞癌或宫颈癌。
10.根据权利要求8或9所述的应用,其特征在于:所述产品为试剂盒、分子探针或靶向介质。
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CN (1) | CN115058429A (zh) |
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2022
- 2022-06-24 CN CN202210732686.8A patent/CN115058429A/zh active Pending
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