CN115057926A - 识别Phomopsis oblonga的单克隆抗体及其杂交瘤细胞株PoF7 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测浙贝母叶斑病病原真菌Phomopsis oblonga的单克隆抗体及其杂交瘤细胞株PoF7，所述识别P.oblonga的单克隆抗体，由保藏编号为：C2022106的杂交瘤细胞株分泌产生；所述杂交瘤细胞株命名为PoF7，于2022年5月5日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：C2022106。该单克隆抗体被用于由P.oblonga侵染引发的植物病害的鉴定、动态监测以及P.oblonga的生物学研究，通过Bal b/c小鼠腹腔注射该细胞株，即可获得大量的该单克隆抗体，与多克隆抗体相比，具有灵敏度高，纯度高，专一性强，重复性好等优点。

Description

识别Phomopsis oblonga的单克隆抗体及其杂交瘤细胞株 PoF7

技术领域

本发明属于动物领域，特别涉及一种检测浙贝母叶斑病病原真菌Phomopsisoblonga 的单克隆抗体及其杂交瘤细胞株PoF7。

背景技术

Phomopsis oblonga属于半知菌类、腔孢纲、球壳孢目，其有性态为间座壳属(Diaporthe)，无性态为拟茎点霉属。P.oblonga是浙贝母叶斑病的病原真菌之一，也是茎溃疡病、叶枯病、果腐病、树脂病等多种病害的致病菌，每年给农业生产造成严重损失。本发明公开的针对P.oblonga的单克隆抗体(单抗)结合酶联免疫吸附试验(ELISA) 由于具有灵敏度高、特异性强、适于大量检测田间P.oblonga的特点，为应用该抗体进行 P.oblonga的鉴定和生物学研究，监测P.oblonga感染的病害等提供技术支持。

发明内容

本发明实施例的第一方面提供了一种识别P.oblonga的单克隆抗体，由保藏编号为： C2022106的杂交瘤细胞株分泌产生。

本发明实施例的第二方面提供了一种识别Phomopsis oblonga的单克隆抗体在检测浙贝母叶斑病中的应用。

本发明实施例的第三方面还提供了一种杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株命名为PoF7，于2022年5月5日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，中国武汉市武汉大学，保藏编号为：CCTCC No：C2022106。

本发明具有如下有益效果：

(1)单抗的特异性强：该单抗与P.oblonga抗原反应强，且不与木贼镰刀菌、茎点霉菌、交链格孢、尖孢镰刀菌、灰葡萄孢、细极链格孢和茄病镰刀菌的抗原发生反应，可用于P.oblonga及其引发的浙贝母叶斑病的检测。

(2)单抗的检测灵敏度高：采用间接ELISA检测结果表明，该单抗对P.oblonga菌丝及孢子制备的抗原的检测灵敏度为10.99ng/mL(即每孔1.099ng)，具有良好的开发应用前景。

(3)单抗的类型为Igκ型的IgM。

附图说明

图1PoF7的效价检测；

图2PoF7与不同真菌抗原的反应；

图3PoF7的检测灵敏度测定；

图4PoF7抗体的类型及亚类鉴定；

图5PoF7抗体结合的P.oblonga目标蛋白；

图6PoF7检测由P.oblonga引起的浙贝母叶斑病灵敏度。

具体实施方式

以下结合附图和实施例进一步解释本发明。

实施例1：杂交瘤细胞株制备

(1)抗原的准备：挑取P.oblonga的单菌落分别接种于PDB培养基中，在25℃下振荡培养4～5d后，用50mL离心管收集孢子和菌丝，6000r/min离心20min，用PBS 洗涤2次后，超声破碎(功率200W，破碎2s，间歇2s)，将破碎液在6000r/min离心 20min，收集上清液，用全波长酶标仪测上清蛋白含量，作为免疫抗原及后期检测用初始抗原，将抗原液少量分装后-80℃冰冻保存。在临用前取少量于-20℃保存。

(2)选取6～8周龄的健康Bal b/c小鼠3只，采用腹腔注射法，每只注射用等量福氏完全佐剂乳化的抗原200μL。3周后免疫使用等量福氏不完全佐剂乳化抗原200μL。再过3周后用不加佐剂的抗原免疫。最后一次免疫后3天，收集抗血清(多克隆抗体)，在无菌条件下取小鼠脾淋巴细胞用于细胞融合。

(3)采用聚乙二醇(PEG-4000)作融合剂，小鼠骨髓瘤细胞系为SP 2/0。整个过程在无菌条件下操作。将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞放入50mL离心管中，混合离心(1200 r/min，2min)后，吸尽上清液，以手指弹匀细胞。将离心管置于37℃水浴预温的盛水烧杯中，在1min内缓慢加入细胞融合剂(50％PEG，pH调制9.0)0.7mL。静止1min后，逐渐加入已经预温至37℃的RMPI-1640培养基40mL，使PEG稀释而失去作用。离心后(1000r/min，2min)弃上清液。将沉淀的细胞悬于40mL HAT培养基后，分装于事先加有饲养细胞的96孔细胞培养板中，置于5％(V/V)，37℃的CO₂培养箱中培养。4天后更换一半HAT培养基，5天后再换一次HAT培养基，再5天改用HT培养基继续培养，此时亲本均已死去，如有细胞生长即为杂交瘤细胞。

(4)当小孔中细胞生长到覆盖孔底面积四分之一时，即可吸取上清液用间接ELISA检测抗体。选出强阳性且不与是木贼镰刀菌、茎点霉菌、交链格孢、尖孢镰刀菌、灰葡萄孢、细极链格孢和茄病镰刀菌的抗原发生反应的细胞株，用有限稀释法进行多次克隆化培养，直至所有孔均为阳性为止，获得分泌单抗的细胞株PoF7，细胞株PoF7进一步扩大培养，用于制备单抗腹水和液氮冻存。该杂交瘤细胞于2022年5月5日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，中国武汉市武汉大学，保藏编号为：C2022106。

实施例2：单抗的产生

取8周龄左右Bal b/c小鼠，腹腔注射0.2mL降植烷，7天后腹腔注射0.2mL含有 5-10×10⁵个杂交瘤细胞的细胞悬液，注射后7-10天可见小鼠腹腔明显膨胀，取腹水，12000r/min离心3min，收集上清液，即为腹水型单抗。Protein A柱层析纯化单抗，-80℃保存。PoF7细胞株制备得到的单抗，即为可专一识别P.oblonga的单抗。

实施例3：单抗的效价检测实验

采用间接ELISA方法测定抗体的效价。将1000μg/mL的P.oblonga抗原用包被液稀释后(2μg/mL)包被整块酶标板，4℃过夜，使其吸附于聚苯乙烯板孔，PBST洗涤三次后用脱脂奶封闭60min。将单抗PoF7倍比稀释加入包被孔，每孔加100μL，37℃，1h，PBST 洗涤三次后加入按说明书稀释5000倍的辣根过氧化酶标记羊抗鼠(佰奥通公司)100μL 孔，37℃，1h，PBST洗涤后加OPD底物显色液显色，使用50μL 2M的H₂SO₄终止反应后，用酶标仪读取OD₄₉₀，以与阴性比值大于2为阳性测定单抗腹水效价。

经检测，确定PoF7的效价为稀释2.56×10⁴倍，确定PoF7稀释6400倍用于其他检测实验(如图1)。

实施例4：单抗的特异性检测实验

检测对象分别是木贼镰刀菌、茎点霉属真菌、交链格孢、P.oblonga、尖孢镰刀菌、灰葡萄孢、细极链格孢和茄病镰刀菌，将上述抗原用包被液稀释至2μg/mL后包被酶标板。以包被液为空白对照，用间接ELISA法检测单抗的特异性，其中单抗稀释6400倍，酶标二抗稀释5000倍。

经上述检测该抗体和上述真菌的抗原均不发生交叉反应，但该抗体与P.oblonga抗原反应强烈，可以明显判别是否存在P.oblonga抗原(图2)。

实施例5：单抗的灵敏度检测实验

采用间接ELISA方法测定单抗的灵敏度。将9000μg/mL的P.oblonga抗原用碳酸盐包被液倍比稀释为1:100×2⁰～1:100×2¹⁴，包被在酶标板上，浓度由上到下从高到低。重复3次，以仅用包被液包被为阴性对照。单抗稀释6400倍，酶标二抗稀释5000倍。

通过检测得9000μg/mL的P.oblonga抗原的最大稀释倍数为819200倍，即检测灵敏度为：9000μg/mL÷819200＝10.99ng/mL，即每孔1.099ng(图3)。

实施例6：单抗的类型及亚类检测实验

采用小鼠单抗亚类鉴定试剂盒(佰奥通实验材料中心，批号：20200809)对单抗进行鉴定。取1000μg/mL的P.oblonga抗原用包被液稀释1000倍后包被酶标板，100μL/孔，重复16孔，置37℃温育2h或4℃放罝12h，甩去包被液后用PBST洗涤1次。取100μL用PBST 稀释6400倍的单抗加入酶标板各孔，置37℃温育30min，用PBST洗涤5次，取试剂盒中8 种检测抗体Ig类型及亚类的酶标抗体各100μL，分别加入各孔，每种酶标抗体设2个重复，置37℃温育30min，PBST洗涤5次，加TMB显色液避光显色15min，用50μL 2M的H₂SO₄终止反应。酶标仪检测OD₄₅₀，阳性孔所对应的抗体Ig类型及亚类即为该单抗的抗体类型及亚类。本实验采用的小鼠单抗Ig类型及亚类鉴定试剂盒，其可检测Ig类型及亚类外，还可鉴定其为何种轻链类型。根据轻链恒定区结构及免疫原性的不同，可将Ig分为两型，分别是Igκ型和Igλ型。

经检测，确定PoF7的抗体类型为Igκ型的IgM(图4)。

实施例7：单抗结合蛋白的检测实验

采用SDS-PAGE及Western blot技术对抗体结合蛋白进行检测，步骤如下：

(1)制备5％(M/V)的浓缩胶和10％(M/V)的分离胶。

(2)取80μL P.oblonga抗原(1000μg/mL)和20μL的5×样品缓冲液混合于1.5mL 离心管中，100℃金属浴5min后立即放入冰浴中3min，然后12000r/min离心5min。

(3)用微量加样器将样品加入加样孔，每样加2个孔，同时加5μL预染的蛋白Marker于另一个加样孔。

(4)电泳：先80V恒压，待溴酚蓝指示剂进入分离胶后，再改为120V恒压，当溴酚蓝指示剂移到凝胶板下口约1cm时停止电泳。

(5)将凝胶用半干转印法在25V恒压下转印30min，转移蛋白至硝酸纤维素膜上。

(6)转印后的膜用PBST洗涤4次，每次5min。

(7)将膜浸入3％(M/V)脱脂奶中，室温封闭1h。

(8)将膜浸入用3％(M/V)脱脂奶稀释6400倍的单抗溶液中，室温下75r/min摇动1h后，4℃孵育过夜。

(9)同(6)洗涤。

(10)将膜浸入用3％(M/V)BSA稀释8000倍的辣根过氧化物酶标记抗体，室温75 r/min摇动1h。

(11)同(6)洗涤。

(12)将膜浸入10mL新配制的DAB显色液中，避光缓慢摇动直到显色，用蒸馏水终止显色反应。膜上显色的条带即为抗体所结合的特异性蛋白，根据蛋白Marker计算结合蛋白的相对分子量。

经检测，抗体与P.oblonga相对分子量约108kDa和103kDa的蛋白特异性结合(图5)。

实施例8：单抗用于浙贝母叶斑病检测的灵敏度实验

采用间接ELISA方法测定单抗的浙贝母叶斑病检测灵敏度。取浙贝母组培苗，超声破碎(功率200W，破碎2s，间歇2s)10min，6000r/min离心10min，取上清液，用包被液稀释100倍备用。将9000μg/mL的P.oblonga抗原用上述浙贝母稀释液倍比稀释为1:100×2⁰～1:100×2¹⁴，包被在酶标板上，浓度由上到下从高到低。重复6次，以不加P. oblonga抗原的健康浙贝母组培苗稀释液包被为阴性对照。单抗稀释6400倍，酶标二抗稀释5000倍。通过间接ELISA方法检测得浙贝母叶斑病的P.oblonga抗原的最大稀释倍数为204800倍，即检测灵敏度为：9000μg/mL÷204800＝43.95ng/mL(图6)。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上事实例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种识别Phomopsis oblonga的单克隆抗体，由保藏编号为C2022106的杂交瘤细胞株分泌产生。

2.一种识别Phomopsis oblonga的单克隆抗体在检测浙贝母叶斑病中的应用。

3.一种杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株命名为PoF7，于2022年5月5日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC No：C2022106。

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