CN115047100A - 一种大豆低聚肽质量控制方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种大豆低聚肽质量控制方法，涉及低聚肽质量控制方法技术领域。本发明公开了一种大豆低聚肽质量控制方法，包括以下步骤：(1)配制多肽VV和多肽VN标准品溶液；(2)配制大豆低聚肽样品溶液；(3)用液相色谱对标准品溶液、大豆低聚肽样品溶液进行组分分离，得到盐性组分和非盐性组分；(4)对液相色谱分离的非盐性组分进行质谱定性和定量分析。本发明以多肽VV和多肽VN作为质量控制目标建立质控方法，可在分子层面直接、准确地描述低聚肽原料中已知低聚肽的变化情况，且这种基于已知低聚肽的质量控制方法大大提升了低聚肽原料的造假难度和生产稳定性质量控制技术水平。

Description

一种大豆低聚肽质量控制方法
技术领域
本发明涉及低聚肽质量控制方法技术领域，尤其是一种大豆低聚肽质量控制方法。
背景技术
现有技术对大豆低聚肽或者其他多肽原料的质量控制方法大多采用水解度、氨基酸、分子量分布等方式或方法，其中水解度主要通过电位滴定或pH滴定法测定样品中的游离氨基酸态总氮含量；氨基酸含量主要通过氨基酸色谱仪、液相色谱仪等测定样品中的各项氨基酸组成；分子量分布主要利用凝胶色谱的分子筛作用测定样品中的多肽大致分子量组成或分布情况。
食源性植物低聚肽是植物蛋白经过生物酶解或发酵处理后所得的一种富含低聚肽(2-10肽)的蛋白质酶解产物。因食源性蛋白酶大多为粗酶，纯度较低且酶作用位点广泛，食源性蛋白酶解产物的多肽组成通常极为复杂，包含成千上万种多肽，一直是质量分析与控制的难点。现有技术方案通过水解度、氨基酸、分子量分布来实现对大豆低聚肽的质量控制存在诸多不足之处。其中，水解度和氨基酸测定的直接对象为蛋白序列在酶解过程中产生的游离氨基酸总量及游离氨基酸组成，虽能在一定程度上间接描述酶解产物特征，但无法直接对产物形成准确描述，在生产实践中可简单通过添加氨基酸实现原料造假；分子量分布可在宏观上有效描述低聚肽的分子量组成特点，但由于其描述主要停留于宏观层面，对微观层面的描述不够，因而质量控制的效力不足，在生产实践中难以非常灵敏的反映低聚肽原料质量变化。
发明内容
基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种大豆低聚肽质量控制方法。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案为：一种大豆低聚肽质量控制方法，包括以下步骤：
(1)配制多肽VV和多肽VN标准品溶液；
(2)配制大豆低聚肽样品溶液；
(3)用液相色谱对标准品溶液、大豆低聚肽样品溶液进行组分分离，得到盐性组分和非盐性组分；
(4)对液相色谱分离的非盐性组分进行质谱定性和定量分析。
本发明提供了一种大豆低聚肽质量控制方法，主要是基于两种二肽(多肽序列为Val-Val和Val-Asn)，采用液质联用分析技术，结合MRM多反应离子检测方法对大豆低聚肽原料实行分子层面的质量控制。
与水解度、分子量分布、氨基酸分析等现有技术手段相比，本发明以多肽VV和多肽VN作为质量控制目标建立质控方法，可在分子层面直接、准确地描述低聚肽原料中已知低聚肽的变化情况，且这种基于已知低聚肽的质量控制方法大大提升了低聚肽原料的造假难度和生产稳定性质量控制技术水平。
优选地，所述步骤(1)中，多肽VV和多肽VN标准品溶液的质量浓度为10-100ng/mL。
优选地，所述步骤(2)中，大豆低聚肽样品溶液的质量浓度为10-1500μg/mL；进一步优选地，所述大豆低聚肽样品溶液的配制方法为：将大豆低聚肽样品充分分散于超纯水中，搅拌后离心，经过滤膜后得到大豆低聚肽样品溶液。
优选地，所述步骤(2)中，搅拌的温度为40-55℃，搅拌的时间为30-60min，离心的时间为5-25min，离心的转速为4000-10000r/min，离心的温度为0-25℃，滤膜为水系滤膜、有机滤膜中的至少一种。
优选地，所述步骤(3)中，所述液相色谱为常压液相色谱、超高效液相色谱、超高压液相色谱、超快速液相色谱中的一种。
优选地，所述液相色谱为常压液相色谱时，流动相流速为0.5-1.5mL/min，标准品进样当量0.2-2.0ng，样品进样当量0.2-2.0μg；所述液相色谱为超高效液相色谱、超高压液相色谱、超快速液相色谱中的一种时，流动相流速为0.1-0.3mL/min，标准品进样当量0.05-0.35ng，样品进样当量0.02-0.2μg。
优选地，所述步骤(3)中，所述液相色谱的检测条件为：色谱柱：C18色谱柱或其衍生色谱柱；柱温箱温度30-50℃；流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A为含0.05-0.3％(v/v)甲酸的水溶液，流动相B为乙腈溶液，洗脱梯度为：0-1.00min 5.0％B，1.00-1.50min5.0-10.0％B，1.50-7.50min 10.0-40.0％B，7.50-8.50min 40.0-90.0％B，8.50-10.00min90％B，10.00-10.50min 90.0-5.0％B，10.50-15.00min，5.0％B。
优选地，所述液相色谱的检测条件为：色谱柱：可耐受100％水相的亲水性C18色谱柱。
优选地，所述步骤(3)中，对样品中的盐性组分进行阀切换去除，去除办法选用自动或手动阀切换去除；优选地，在液相色谱死体积出峰处左右0.1-0.5min内设置阀切换流向为废液；进一步优选地，切换阀采用4通阀、6通阀或8通阀，驱动方式为电动、气动或手动。
优选地，所述步骤(4)中，所用质谱为三重四级杆质谱、QTOF飞行时间质谱中的至少一种；所述质谱配备ESI电喷雾离子源，离子源工作模式为正离子模式；质谱检测模式为MRM多反应离子监测模式，一级前体离子和二级碎裂离子监测设置分别为VV(一级217.1m/z，二级118.1、171.4mz)、VN(一级232.1m/z，二级133.1、72.1mz)，去簇电压设置为75-85V，离子碎裂轰击能量为18-20eV,质谱扫描速率设置为50-300Da/s。
优选地，所述步骤(4)中，采用外标法以峰面积对目标多肽VV(离子对217.1/118.1或217.1/171.4，m/z)及VN(232.1/133.1或232.1/72.1，m/z)进行定量分析。
本发明所述方法采用液相色谱质谱联用分析方法，结合MRM多反应离子监测模式对低聚肽原料进行质量控制，具有分析特异性强、重现性好、准确度高等多种特点，同时方法操作简单，分析速度快。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明所述方法具有特异性强、重现性好、准确度高等优良特点，可更有利于对大豆低聚肽原料的质量控制，更进一步保障原料的稳定性和真实性。现有技术手段中，氨基酸态氮的测定需较长时间滴定，且操作繁琐，特异性较低；氨基酸分析需复杂的柱前衍生或其他处理，且操作繁琐、分析时间长，重现性和特异性较差；分子量分布分析时间较长，特异性较差，且分析结果受分子量标准品类型和流动相组成影响较大，准确性较低。而本发明中，直接对大豆低聚肽原料中的已知寡肽进行检测分析，特异性大大增强，且本发明具有重现性好、准确度高等多种特点，同时方法操作简单，分析速度快，是一种非常有效且优质的大豆低聚肽原料质量控制手段。
附图说明
图1为标准品(0.25ng/mL)质谱检测图；
图2为样品A质谱检测图；
图3为样品B质谱检测图；
图4为样品C质谱检测图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；
1、实施例1不同来源大豆低聚肽中VV和VN的含量测定
一种大豆低聚肽质量控制方法，包括以下步骤：
(1)配制多肽VV和多肽VN标准品溶液；
标准品制备：分别精密称取一定量人工化学合成的多肽Val-Val和Val-Asn分析标准品(纯度不低于95％，购于吉尔生化(上海)上海有限公司)，使用超纯水配置浓度50ng/mL标准品溶液；
(2)配制大豆低聚肽样品溶液；
样品制备：将待测大豆低聚肽样品A(购于完美(广东)日用品有限公司)、样品B(购于广州某实业有限公司)和样品C(实验室自制，制备工艺简述如下：称取大豆分离蛋白(购于临沂山松生物)配置成1％(g/w)蛋白溶液，加入蛋白质总量1％的Alcalase蛋白酶，充分混合均匀，于55℃下恒温震荡水浴酶解12h后，水浴煮沸15min灭酶，冷却至室温在8000r/min下离心25min,取上清液浓缩喷雾干燥，即得大豆低聚肽)充分分散于超纯水中，配置成适宜浓度(150μg/mL)的待测样液，50℃恒温搅拌30min，在4000r/min 4℃下离心10min去除不溶性大颗粒成分，再过0.22μm水系滤膜，去除不溶性物质，制得待测上机样品；
(3)用液相色谱对标准品溶液、大豆低聚肽样品溶液进行组分分离，得到盐性组分和非盐性组分；
所述液相色谱为超高压液相色谱(美国AB公司)进行组分分离；所用色谱柱为HSST3(美国Waters)色谱柱；流动相由甲酸水(甲酸添加量0.1％，记为A)溶液和乙腈(记为B)组成；洗脱梯度为：0-1.00min 5.0％B，1.00-1.50min 5.0-10.0％B，1.50-7.50min 10.0-40.0％B，7.50-8.50min 40.0-90.0％B，8.50-10.00min 90％B，10.00-10.50min 90.0-5.0％B，10.50-15.00min，5.0％B；流动相流速为0.1mL/min(超高压液相色谱)；标准品进样当量分别为0、0.05、0.15、0.25、0.35ng；样品进样当量0.15μg(超高压液相色谱)；柱温箱温度40℃；
其中，盐性组分进行阀切换去除，对样品在液相色谱中的盐性组分(如NaCl、KCl等)进行去除，去除办法选用电动6通切换阀(美国AB公司)在液相色谱死体积出峰处左右0.1min内设置阀切换流向为废液；
(4)对液相色谱分离的非盐性组分进行质谱定性和定量分析；
样品通过液相色谱洗脱的非盐性组分依次进行质谱定性和定量分析，采用三重四级杆质谱(美国AB公司)进行分析，配备ESI电喷雾离子源，离子源工作模式为正离子模式；质谱检测模式为MRM多反应离子监测模式，一级前体离子和二级碎裂离子监测设置分别为VV(一级217.1m/z，二级118.1、171.4mz)、VN(一级232.1m/z，二级133.1、72.1mz)，去簇电压设置为80V，离子碎裂轰击能量为18.5eV，质谱扫描速率设置为200Da/s，使用外标法以峰面积对目标多肽VV(离子对217.1/118.1，m/z)及VN(232.1/133.1，m/z)进行定量分析。
由实施例1测试结果可知，标准品(0.25ng/mL)质谱检测图见图1；样品A检测结果图见图2；实施例1中，理论塔板数按照VV(图1)计算为4343，分离效率较高，符合系统适应性要求；样品A中(见图2)在标准品出峰处可同时观察到VV及VN的两个二级碎片，可以此对结果进行定性分析，值得注意的是，样品A中在其他洗脱时间处存在同分异构体，可通过保留时间或另一种碎片不完整的依据进行排除；按照外标法定量标准曲线方程为y＝4704.7x+94.1(VV，离子对217.1/118.1m/z，R2＝0.9956)，y＝24489x-510.5(VN，离子对232.1/133.1m/z，R2＝0.9990)，线性表现良好，测定样品A中VV和VN的含量分别为0.077±0.004％和0.080±0.005％，样品B中VV和VN的含量分别为0.016±0.003％和0.022±0.002％，样品C中VV和VN的含量分别为0.133±0.006％和0.120±0.001％，依据VV和VN的含量差别可较好区分上述三种大豆低聚肽原料。
2、实施例2不同批次大豆低聚肽中VV和VN的含量测定
一种大豆低聚肽质量控制方法，包括以下步骤：
(1)配制多肽VV和多肽VN标准品溶液；
标准品制备：分别精密称取一定量人工化学合成的多肽Val-Val和Val-Asn分析标准品(纯度不低于95％，购于吉尔生化(上海)上海有限公司)，使用超纯水配置浓度50ng/mL标准品溶液；
(2)配制大豆低聚肽样品溶液；
样品制备：获取大豆低聚肽在生产线中的四个重复批次制备产物样品P1-4(购于完美(广东)日用品有限公司)，充分将上述样品分散于超纯水中，配置成适宜浓度(150μg/mL)的待测样液，45℃恒温搅拌60min，在8000r/min 4℃下离心5min去除不溶性大颗粒成分，再过0.22μm有机滤膜，去除不溶性物质，制得待测上机样品；
(3)用液相色谱对标准品溶液、大豆低聚肽样品溶液进行组分分离，得到盐性组分和非盐性组分；
用超高压液相色谱(美国AB公司)进行组分分离；所用色谱柱为HSS T3(美国Waters)色谱柱；流动相由甲酸水(甲酸添加量0.1％，记为A)溶液和乙腈(记为B)组成；洗脱梯度为：0-1.00min 5.0％B，1.00-1.50min 5.0-10.0％B，1.50-7.50min 10.0-40.0％B，7.50-8.50min 40.0-90.0％B，8.50-10.00min 90％B，10.00-10.50min 90.0-5.0％B，10.50-15.00min，5.0％B；流动相流速为0.1mL/min(超高压液相色谱)；标准品进样当量分别为0、0.05、0.15、0.25、0.35ng；样品进样当量0.15μg(超高压液相色谱)；柱温箱温度35℃；
其中，盐性组分进行阀切换去除，对样品在液相色谱中的盐性组分(如NaCl、KCl等)进行去除，去除办法选用电动6通切换阀(美国AB公司)在液相色谱死体积出峰处左右0.1min内设置阀切换流向为废液；
(4)对液相色谱分离的非盐性组分进行质谱定性和定量分析；
样品通过液相色谱洗脱的非盐性组分依次进行质谱定性和定量分析，采用三重四级杆质谱(美国AB公司)进行分析，配备ESI电喷雾离子源，离子源工作模式为正离子模式；质谱检测模式为MRM多反应离子监测模式，一级前体离子和二级碎裂离子监测设置分别为VV(一级217.1m/z，二级118.1、171.4mz)、VN(一级232.1m/z，二级133.1、72.1mz)，去簇电压设置为80V,离子碎裂轰击能量为20eV,质谱扫描速率设置为300Da/s，使用外标法以峰面积对目标多肽VV(离子对217.1/118.1，m/z)及VN(232.1/133.1，m/z)进行定量分析。
不同批次样品中VV及VN的检测结果如下表1。
表1不同生产批次大豆低聚肽中VV及VN的含量检测结果
Figure BDA0003660674240000071
由表可知实施例2中各重复批次大豆低聚肽中VV、VN的含量水平趋于稳定，其中VV为0.080-0.084％、VN为0.076-0.090％，反映本方法在同种原料不同批次产品中可具有较好的质量控制效果，对大豆低聚肽原料的生产稳定性质量控制具有重要的实践意义。
3、方法学研究分析
(1)仪器精密度测试：配置单一多肽浓度为250ng/mL的VV、VN混合多肽标准品，连续进样4次，测定VV(217.1/118.1，217.1/171.4)、VN(232.1/133.1，232.1/72.1)等各成分离子对峰面积的RSD值分别为(1.45％，1.59％)、(1.94％，2.15％)，基本均接近或小于2％，说明仪器精密度良好。
(2)重复性试验测试：配置同浓度样品(样品D-2，150μg/mL)5份，按上述方法测定样品中VV(217.1/118.1，217.1/171.4)、VN(232.1/133.1，232.1/72.1)的含量分别为(0.0883％，0.0766％)、(0.0861％，0.0826％)，对应的RSD值分别为(0.74％，1.57％)、(0.48％，1.11％)，表明方法日内重现性良好，此外，样品中基于各离子对所得的各成分含量检测结果彼此偏差较小，说明离子对的选取较为理想，可较好的获取检测结果。
(3)稳定性评价：配置同浓度同一样品(样品D-2，150μg/mL)，按上述检测分析方法，分别在0、6、18、24、48h下进样测定峰面积评价方法稳定性，结果显示VV(217.1/118.1，217.1/171.4)、VN(232.1/133.1，232.1/72.1)两种成分的RSD值分别为(2.70％，0.87％)、(0.64％，0.85％)，均小于3.0％，表明样品及目标多肽在48h内稳定性良好。
(4)回收率试验：取已测知2种多肽含量的样品(样品D-2)共6份，精密加入VV、VN标准品物质，测定其回收率结果见下表2。由表可知，多肽VV和VN的回收率处于95-105％范围内，且RSD均小于2.2％，反映多肽VV和VN在样品中具有良好的稳定性和线性变化关系，具有良好的定量检测效果。
表2回收率试验结果
Figure BDA0003660674240000081
Figure BDA0003660674240000091
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (9)

1.一种大豆低聚肽质量控制方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)配制多肽VV和多肽VN标准品溶液；
(2)配制大豆低聚肽样品溶液；
(3)用液相色谱对标准品溶液、大豆低聚肽样品溶液进行组分分离，得到盐性组分和非盐性组分；
(4)对液相色谱分离的非盐性组分进行质谱定性和定量分析。
2.如权利要求1所述的大豆低聚肽质量控制方法，其特征在于，所述步骤(1)中，多肽VV和多肽VN标准品溶液的质量浓度为10-100ng/mL。
3.如权利要求1所述的大豆低聚肽质量控制方法，其特征在于，所述步骤(2)中，大豆低聚肽样品溶液的质量浓度为10-1500μg/mL；优选地，所述大豆低聚肽样品溶液的配制方法为：将大豆低聚肽样品充分分散于超纯水中，搅拌后离心，经过滤膜后得到大豆低聚肽样品溶液。
4.如权利要求3所述的大豆低聚肽质量控制方法，其特征在于，搅拌的温度为40-55℃，搅拌的时间为30-60min，离心的时间为5-25min，离心的转速为4000-10000r/min，离心的温度为0-25℃，滤膜为水系滤膜、有机滤膜中的至少一种。
5.如权利要求1所述的大豆低聚肽质量控制方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述液相色谱为常压液相色谱、超高效液相色谱、超高压液相色谱、超快速液相色谱中的一种。
6.如权利要求5所述的大豆低聚肽质量控制方法，其特征在于，所述液相色谱为常压液相色谱时，流动相流速为0.5-1.5mL/min，标准品进样当量0.2-2.0ng，样品进样当量0.2-2.0μg；所述液相色谱为超高效液相色谱、超高压液相色谱、超快速液相色谱中的一种时，流动相流速为0.1-0.3mL/min，标准品进样当量0.05-0.35ng，样品进样当量0.02-0.2μg。
7.如权利要求5所述的大豆低聚肽质量控制方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述液相色谱的检测条件为：色谱柱：C18色谱柱或其衍生色谱柱；柱温箱温度30-50℃；流动相由流动相A和流动相B组成，流动相A为含0.05-0.3％(v/v)甲酸的水溶液，流动相B为乙腈溶液，洗脱梯度为：0-1.00min 5.0％B，1.00-1.50min 5.0-10.0％B，1.50-7.50min 10.0-40.0％B，7.50-8.50min 40.0-90.0％B，8.50-10.00min 90％B，10.00-10.50min 90.0-5.0％B，10.50-15.00min，5.0％B。
8.如权利要求1所述的大豆低聚肽质量控制方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所用质谱为三重四级杆质谱、QTOF飞行时间质谱中的至少一种；所述质谱配备ESI电喷雾离子源，离子源工作模式为正离子模式；质谱检测模式为MRM多反应离子监测模式，一级前体离子和二级碎裂离子监测设置分别为：VV：一级217.1m/z，二级118.1、171.4mz；VN：一级232.1m/z，二级133.1、72.1mz；去簇电压设置为75-85V，离子碎裂轰击能量为18-20eV，质谱扫描速率设置为50-300Da/s。
9.如权利要求1所述的大豆低聚肽质量控制方法，其特征在于，所述步骤(4)中，采用外标法以峰面积对目标多肽VV及VN进行定量分析；VV：离子对217.1/118.1或217.1/171.4，m/z；VN：离子对232.1/133.1或232.1/72.1，m/z。
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