CN115040430B - 一种含ebselen的防晒化妆品及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种含ebselen的防晒产品，所述防晒产品中含有ebselen、胶原多肽‑ebselen复合物中的一种或两种的组合，以ebselen量计，防晒产品中ebselen含量为0.5‑1.5%。优选的，还包括防晒剂0.5‑15份、基质60‑80份和辅料10‑20份，所述辅料包括保湿剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、香精。本发明提供的含ebselen的防晒产品具有良好的防晒效果，SPF值最高可达到43.7。此外，本发明通过细胞实验验证得到胶原多肽‑ebselen复合物对紫外线照射具有良好的防护效果，并且对紫外线造成的细胞损伤具有修复作用。

Description

一种含ebselen的防晒化妆品及其制备方法
技术领域
本发明属于化妆品领域，具体涉及一种含ebselen的防晒化妆品及其制备方法。
背景技术
紫外线会导致皮肤衰老，或者可以说紫外线是导致脸上出现皱纹以及衰老的最大元凶。紫外线主要分为短波紫外线、中波紫外线和长波紫外线三种，三种紫外线中造成人体伤害的主要是中波紫外线和长波紫外线。中波紫外线的穿透力不强，容易被阻挡，只要避免直接暴晒，中波紫外线对人体的伤害不大。长波紫外线的穿透力非常强，可以深入真皮以下组织破坏胶原蛋白，能使皮肤里结合水的透明质酸含量减少，令皮肤干燥，加速黑色素在皮肤表层的沉积，使皮肤变黑，产生色块，色斑，加速皱纹的生成，使皮肤衰老。
目前市场上的防晒产品主要以防晒霜为主，其防晒原理主要是在皮肤表面形成一层防护层，阻挡紫外线直射。但是防晒霜在使用感受欠佳，皮肤闷感明显，而且防晒霜会因为皮肤出汗或者与外界摩擦而脱落，此时皮肤依然会暴露在紫外线下，防晒持久性不好。此外，防晒霜只是简单的防止紫外线直射于皮肤，而对于因为紫外线造成的皮肤衰老没有再修复或者抵抗效果。因此，有必要提供一种即可防晒也可对因为紫外线引起的皮肤衰老有修复作用的防晒产品。
关于具有抗氧化抗衰老功效的活性成分，现在关注度较高的是谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和超氧化物歧化酶(SOD)。GPX是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶，它能催化谷胱甘肽与过氧化物之间的氧化还原反应，使过氧化物还原成低毒性的羟基化合物，从而保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害。SOD是一类重要的抗氧化酶，具有特殊的生理活性，是超氧阴离子的唯一清除剂，能将其转化为H2O2，继而被GPX分解为H2O，从而达到清除ROS的目的。
专利文献CN202010794085.0重组谷胱甘肽过氧化物酶及其双功能抗氧化酶在抗氧化抗衰老方面的应用，公开了一种将谷胱甘肽过氧化物酶添加到已有的防晒剂或晒后修复剂中，制备得到复合型抗氧化抗衰老防晒剂或晒后修复剂。但是，外源性药物难以透过生物膜进入细胞导致其利用率很低。
发明内容
在上述背景之下，发明人发现谷胱甘肽过氧化物酶模拟物ebselen分子量小，与谷胱甘肽过氧化物酶相比更易透过细胞，以ebselen替代谷胱甘肽过氧化物酶用于抗氧化化妆品的作用效果更好。
ebselen，结构式为是一种有机硒杂环化合物。研究表明，ebselen具有抗生物氧化作用，能抑制多种诱发条件下微粒体的脂质过氧化作用，保护机体免受过氧化作用的损伤。此外，ebselen还具有抗炎症和免疫调节作用，对肝脏的保护作用，抑制细胞凋亡作用，对动脉粥样硬化的防治作用，减轻脑神经的损伤等。
本发明在防晒化妆品中添加ebselen，发明人发现防晒产品中添加ebselen对皮肤具有很好的修复作用。进一步，将ebselen与胶原蛋白或胶原多肽复合得到ebselen复合物，不仅有助于皮肤吸收，还能提升防晒化妆品的防晒效果。
本发明的一个目的是提供一种含ebselen的防晒产品，本发明的另一个目的是提供一种含ebselen的防晒产品的制备方法。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
第一方面，本发明提供一种含ebselen的防晒产品，所述防晒产品中含有ebselen、胶原多肽-ebselen复合物中的一种或两种的组合。以ebselen量计，所述防晒产品中ebselen含量为0.5-1.5％。
本发明提供的ebselen含量根据如下方法推算得到：在先文献记载的ebselen使用量为200-400mg/天(NCT Number:03325790)，按照人体表面积为1.6m2计算，ebselen的皮肤使用剂量为12.5-25.0μg/cm2。按照皮肤外用产品的标准使用量为2mg/cm2可以推算出皮肤外用产品中ebselen的含量为0.625-1.25％。因为在先文献公开的均是口服剂量，在外用时可适量放宽剂量范围，经过验证，本发明提供的防晒产品中ebselen含量优选为0.5-1.5％。
优选的，所述防晒产品中还包括防晒剂0.5-15份、基质60-80份和辅料10-20份，所述辅料包括保湿剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、香精。
在本发明提供的优选实施方式中，所述防晒产品包括如下质量份数的组分ebselen或者胶原多肽-ebselen复合物0.5-3份、防晒剂8-12份、基质65-75份、保湿剂10-15份、增稠剂0.5-2份、表面活性剂2-3份、防腐剂0.1-1份、香精0-1份。
所述防晒剂选自二氧化钛、氧化锌、甲氧基肉桂酸乙基己酯、水杨酸乙基乙酯中的一种或两种以上的组合。
所述基质为油相基质和水相基质的组合，油相基质选自十六十八醇、聚二甲基硅氧烷、丙二醇二辛酸酯、棕榈酸异丙酯，水相基质选自水、醇类中的任一种或两种的组合。
所述保湿剂选自甘油、丙二醇、山梨醇、聚乙二醇中的一种或两种的组合。
所述增稠剂选自卡波姆、黄原胶或者聚丙烯酸钠。
所述表面活性剂选自PEG-100硬脂酸酯、皂角苷、辛基十二醇中的一种或两种以上的组合。
所述防腐剂选自丁基羟基茴香醚、叔丁基羟基甲苯、对羟基苯乙酮、羟苯甲酯中的一种或两种以上的组合。
所述香精可选自麝香、玫瑰精油等。
本发明所述的ebselen为市售产品，可根据需要配置成不同浓度。例如，浓度为2.5mg/mL ebselen溶液可根据如下方法配置得到：取100μL 25.0mg/mL的ebselen储备液加到400μLPEG300中混合均匀，向体系中加入50μL Tween-80混合均匀，继续加入450μL生理盐水定容至1mL，获得2.5mg/mL ebselen溶液。
本发明所述的胶原多肽-ebselen复合物通过如下方法制备得到：
将胶原多肽加入2倍体积的去离子水混匀，加入等体积浓度为2.5mg/mL ebselen溶液，混合，30-35℃水浴恒温40-60分钟，冷却至室温后4℃冷藏，冻干，备用。
为了精确计算ebselen的剂量，本发明在络合后不采用离心浓缩的方法，而直接冷冻干燥，默认加入的ebselen与胶原多肽全部络合，在一个反应体系中加入的ebselen量没有损失。
在本发明的最优选实施方式中，所述胶原多肽-ebselen复合物的制备方法具体操作如下：
S1：将胶原多肽加入2倍体积的去离子水混匀，取1mL加入EP管；
S2：取100μL 25.0mg/mL的ebselen储备液加到400μL PEG300中混合均匀，向体系中加入50μL Tween-80混合均匀，继续加入450μL生理盐水定容至1mL，获得2.5mg/mLebselen澄清溶液，取1mL加入到步骤S1体系中，涡旋混合；
S3：在35℃水浴恒温40分钟，冷却至室温后4℃冷藏2小时，冻干。
本发明所述的胶原多肽根据如下方法制备得到：
(1)将鱼皮切碎，与NaOH溶液混合震荡过夜，去除杂蛋白；
(2)将步骤(1)中的鱼皮冲洗干净，与正丁醇溶液混合震荡过夜，去除脂肪；
(3)将步骤(2)中的鱼皮冲洗干净，进行冻干处理；
(4)将冻干的鱼皮捣碎，加入去离子水溶胀，调节溶液pH值为中性，在37-40℃温度下加入蛋白酶进行酶解，时间为40-60分钟；
(5)酶解后采用1-3K超滤膜进行超滤，得到胶原多肽。
本发明使用的蛋白酶为风味蛋白酶，用量为5000-6000u/g干重鱼皮。
步骤(1)中所述的鱼皮包括但不限于罗非鱼、鲟鱼、海鲈鱼的皮。
所述步骤(5)中的超滤膜分别为1K、2K、3K；优选使用2K超滤膜进行超滤。
第二方面，本发明提供一种含ebselen的防晒产品的制备方法，所述方法包括：按照质量比向油相基质中加入保湿剂、表面活性剂和防腐剂作为组分A，向水相基质中加入甘油和增稠剂作为组分B；将A组分加入B组分中高速搅拌，再加入ebselen或者胶原多肽-ebselen复合物，均质，得到防晒产品。
本发明提供的含ebselen的防晒产品的防晒产品具有以下技术优势：
1，Ebselen是一种市售的含硒抗氧化剂，属于GPX模拟物，已报道的ebselen使用方法均为口服，外用鲜有报道，本发明技术人员预料不到的发现，将ebselen添加到防晒产品中对由于紫外线引起的皮肤损伤具有保护作用，虽然发明人分析其作用原理是已知的抗生物氧化作用，但本发明的技术方案为ebselen的外用奠定了基础；
2，更进一步的，为了提高ebselen的分散效果，发明人选择胶原多肽与ebselen先复合，再加入至防晒产品中。发明人发现，复合物对提升防晒露的防晒效果具有显著增效作用，分析原因认为，胶原多肽可能使防晒露成膜性更好。
3，此外，细胞实验能证明胶原多肽-ebselen复合物对紫外线造成的细胞损伤保护作用更好，可能是因为胶原多肽有助于细胞对ebselen的摄取，并且胶原多肽本身也具有较好的皮肤修复效果。
附图说明
图1效果例1-1细胞存活率图
图2效果例1-2细胞存活率图
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
风味蛋白酶，货号：F8250-25，酶活≥20u/mg，水分≤8.0％，购自北京索莱宝科技有限公司；ebselen，CAS No:60940-34-3，购自MCE公司。
胶原多肽的制备
制备例1
S1：将罗非鱼皮切成3-5cm的块状，将浓度为0.4％的NaOH溶液与罗非鱼鱼皮按5:1的体积比混合振荡洗涤过夜，去除杂蛋白；
S2：步骤S1的罗非鱼鱼皮冲洗干净，将质量分数为10％的正丁醇溶液与罗非鱼鱼皮按5:1的体积比混合振荡洗涤过夜，去除脂肪；
S3：步骤S2的罗非鱼鱼皮冲洗干净，进行冻干处理；
S4：将冻干的鱼皮捣碎，加入去离子水溶胀，调节溶液pH值为中性，在37℃下加入风味蛋白酶酶解60分钟，酶用量为6000u/g干重鱼皮；
S5：将酶解产物用1K超滤膜超滤3次，得到胶原多肽1。
制备例2
制备方法和制备原料同制备例1，区别仅在于步骤S5中采用2K超滤膜进行超滤，得到胶原多肽2。
制备例3
制备方法和制备原料同制备例1，区别仅在于步骤S5中采用3K超滤膜进行超滤，得到胶原多肽3。
胶原多肽-ebselen复合物的制备
制备例4
S1：将制备例1得到的胶原多肽加入2倍体积的去离子水混匀，取1mL加入EP管中；
S2：取100μL 25.0mg/mL的ebselen储备液加到400μL PEG300中混合均匀，向体系中加入50μL Tween-80混合均匀，继续加入450μL生理盐水定容至1mL，获得2.5mg/mLebselen澄清溶液，取1mL加入到步骤S1体系中，涡旋混合；
S3：在35℃水浴恒温40分钟，冷却至室温后4℃冷藏2小时，冻干，称重为5.7mg，复合物中ebselen的含量为43.9％。
制备例5
S1：将制备例2得到的胶原多肽加入2倍体积的去离子水混匀，取1mL加入EP管中；
S2：取2.5mg/mL ebselen澄清溶液1mL加入到步骤S1体系中(制备方法同制备例4)，涡旋混合；
S3：在35℃水浴恒温40分钟，冷却至室温后4℃冷藏2小时，冻干，称重为5.2mg，复合物中ebselen的含量为48.1％。
制备例6
S1：将制备例3得到的胶原多肽加入2倍体积的去离子水混匀，取1mL加入EP管中；
S2：取2.5mg/mL ebselen澄清溶液1mL加入到步骤S1体系中(制备方法同制备例4)，涡旋混合；
S3：在35℃水浴恒温40分钟，冷却至室温后4℃冷藏2小时，冻干，称重为4.7mg，复合物中ebselen的含量为53.2％。
含ebselen的防晒露的制备
实施例1-4
以ebselen的含量计，所述防晒露中ebselen的含量为0.5％，实施例1-4中分别加入游离ebselen、制备例4-6制备得到的胶原多肽-ebselen复合物。具体组分及含量如下表所示：
表1
制备方法为：按照质量份数将十六十八醇、丙二醇二辛酸酯、PEG-100硬脂酸酯、辛基十二醇、羟苯甲酯、二氧化钛、氧化钛混合均匀作为A组分；将甘油和黄原胶加入水中混合均匀作为B组分；将A组分加入B组分中以1000r/min搅拌，加入ebselen或者胶原多肽-ebselen复合物均质2分钟，得到防晒露。
实施例5-8
以ebselen的含量计，所述防晒露中ebselen的含量为1.0％，实施例5-8中分别加入游离ebselen、制备例4-6制备得到的胶原多肽-ebselen复合物，具体组分及含量如下表所示：
表2
实施例9-12
以ebselen的含量计，所述防晒露中ebselen的含量为1.5％，实施例9-12中分别加入游离ebselen、制备例4-6制备得到的胶原多肽-ebselen复合物，具体组分及含量如下表所示：
表3
效果例1验证胶原多肽-ebselen复合物对紫外线损伤的保护效果
1、针对紫外线损伤的保护作用
实验方法：
S1：将HaCaT细胞接种在96孔板上，没空细胞数量约为50000个，以96孔板一列为一组，设置游离ebselen组、胶原多肽-ebselen复合物组、胶原多肽组、紫外照射组、对照组，放入37℃，含5％CO2及饱和湿度的培养箱中培养24h；
S2：以DMEM培养基为溶剂配制ebselen溶液(ebselen浓度为10μM)、胶原多肽-ebselen复合物溶液(复合物由制备例5得到，ebselen浓度为10μM)、胶原多肽溶液(胶原多肽由制备例2得到，加入量与复合物中胶原多肽加入量一致)；
S3：细胞培养24h后用移液枪将旧培养基吸出，分别对应加入步骤S2配制的药品200μL，紫外照射组和对照组加等体积DMEM培养基，继续培养24小时；
S4：用移液枪将旧培养基吸出，每孔分别加200μL生理盐水，将96孔板置于距紫外光光源垂直距离为10cm的地方进行照射，照射功率为500μW/cm2，照射时间1分钟，对照组不给予照射，照射后将生理盐水吸出，每孔加入200μL DMEM培养基，培养24小时；
S5：用无菌PBS配制成浓度为5mg/mL的MTT溶液，每孔加入20μL MTT溶液，在培养箱中孵育4h，避免将细胞吸走，用无菌注射器将旧培养基吸出，再每孔加入150μL DMSO，孵育10min；
S6：选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。细胞活力＝试验组A值/对照孔A值计算出不同实验组的细胞活力。
结果如图1所示，紫外对照组的细胞存活率最低，为43.76±4.38％，胶原多肽-ebselen复合物组的细胞存活率最高，为92.35±3.14％。游离ebselen组的细胞存活率为74.67±5.76％，胶原多肽组的细胞存活率为90.04±4.49％。从数据可以分析得到，游离ebselen对紫外损伤的防护效果并不明显，甚至没有游离胶原多肽优秀，但是将ebselen与胶原多肽复合后对紫外损伤会产生较好的防护效果。
2、针对紫外线损伤后的修复作用
方法同上，另外平行操作一个96孔板，区别在于步骤S4，照射后不是加培养基继续培养，而是对应加入步骤S2配制的药品200μL，紫外照射组和对照组加等体积DMEM培养基，继续培养24小时；MTT检测方法同上。
结果如图2所示，紫外对照组细胞存活率为41.91±5.81％，胶原多肽组的细胞存活率为88.99±5.65％，这两组数据与图1的数据差异并不大，说明胶原多肽对于紫外线损伤的细胞修复效果很薄弱。相比较之下，游离ebselen组的细胞存活率从74.67±5.76％上升至现在的81.42±5.63％，细胞活力有明显的恢复趋势；胶原多肽-ebselen复合物组的细胞存活率由92.35±3.14％上升至99.47±4.62％，细胞活力也有明显的提高。说明游离的ebselen和胶原多肽-ebselen复合物对紫外线损伤的细胞都有较明显的修复作用，原因可能与ebselen的抗生物氧化作用有关，但是将ebselen与胶原多肽结合效果更佳。
效果例2防晒露的防晒性能测试
采用体外SPF值测定方法，测定防晒化妆品的紫外线吸光度或透过率来评价防晒化妆品的防晒效果，试验仪器为UV2000S型防晒系数分析仪。
试验方法：将实施例1-3和对比例1-9的防晒露A-L以2mg/cm2的量涂敷在PMMA板上，干燥15分钟，使用UV2000S测量仪器测量，平行测3次取平均值。结果如下表所示：
表4
SPF值 SPF值 SPF值
实施例1 27.8 实施例5 27.9 实施例9 27.8
实施例2 33.6 实施例6 35.1 实施例10 39.5
实施例3 37.5 实施例7 39.4 实施例11 43.7
实施例4 34.4 实施例8 36.3 实施例12 39.9
根据上表数据，实施例1、实施例5和实施例9的区别在于游离ebselen的含量分别为0.5％、1.0％、1.5％，其测得的SPF值基本没有变化，说明在防晒露中添加游离ebselen对防晒露的防晒指数几乎不产生影响。与游离ebselen相比，在防晒露中添加胶原多肽-ebselen复合物后，防晒露的SPF值有显著提升。比较实施例2-4的防晒指数发现实施例3制备的防晒露防晒效果最好。因为实施例2-4的区别在于制备胶原多肽时超滤膜孔径不同，说明2K的超滤膜制备得到的胶原多肽更适于制备防晒产品。原因可能在于这个分子量分布的胶原多肽与防晒露中的成膜组分协同产生更好的成膜性。对比实施例3、实施例7和实施例11的SPF值数据可以发现，当防晒露中胶原多肽的含量增加，防晒露的防晒效果也同步增加，验证了上面分析的胶原多肽有助于成膜的分析。
效果例3人体安全性测试
测试办法：取3层纱布裁剪成5cm×5cm大小，将纱布沾湿后紧贴于受试者皮肤表面，外覆一层塑料薄膜，24小时后揭去纱布观察受试者皮肤局部反应。
测试结果是，所有参与试验的受试者皮肤均没有出现红斑、水肿等不良反应，说明本发明制备的ebselen含量为0.5-1.5％的防晒露对皮肤的安全性良好。
以上具体实施方式只是对本发明内容的示意性说明，不代表本发明内容的限制。本领域技术人员可以想到的是本发明中具体结构可以有其它的变化形式。

Claims (3)

1.一种含ebselen的防晒产品，其特征在于，所述防晒产品包括如下质量份数的组分：胶原多肽-ebselen复合物 0.5-3份、防晒剂8-12份、基质65-75份、保湿剂10-15份、增稠剂0.5-2份、表面活性剂2-3份、防腐剂0.1-1份、香精0-1份；
所述防晒剂选自二氧化钛、氧化锌、甲氧基肉桂酸乙基己酯、水杨酸乙基乙酯中的一种或两种以上的组合；所述基质为油相基质和水相基质，所述油相基质选自十六十八醇、聚二甲基硅氧烷、丙二醇二辛酸酯或棕榈酸异丙酯，水相基质为水；所述保湿剂选自甘油、丙二醇、山梨醇、聚乙二醇中的一种或两种的组合；所述表面活性剂选自PEG-100硬脂酸酯、皂角苷、辛基十二醇中的一种或两种以上的组合；
所述胶原多肽-ebselen复合物的制备方法操作如下：
S1：将胶原多肽加入2倍体积的去离子水混匀，取1mL加入EP管；
S2：取 100 μL 25.0 mg/mL 的ebselen混合液加到 400 μL PEG-300 中混合均匀，向体系中加入50 μL Tween-80混合均匀，继续加入 450 μL生理盐水定容至 1 mL，获得2.5mg/mL ebselen澄清溶液，取1mL加入到步骤S1体系中，涡旋混合；
S3：在35℃水浴恒温40分钟，冷却至室温后4℃冷藏2小时，冻干；
所述的胶原多肽根据如下方法制备得到：
（1）将鱼皮切碎，与NaOH溶液混合震荡过夜，去除杂蛋白，鱼皮包括罗非鱼、鲟鱼、海鲈鱼的皮；
（2）将步骤（1）中的鱼皮冲洗干净，与正丁醇溶液混合震荡过夜，去除脂肪；
（3）将步骤（2）中的鱼皮冲洗干净，进行冻干处理；
（4）将冻干的鱼皮捣碎，加入去离子水溶胀，调节溶液pH值为中性，在37-40℃温度下加入蛋白酶进行酶解，时间为40-60分钟，所述蛋白酶为风味蛋白酶，用量为5000-6000 U/g干重鱼皮；
（5）酶解后采用截留分子量为1-3 kDa的超滤膜进行超滤，得到胶原多肽。
2.根据权利要求1所述的含ebselen的防晒产品，其特征在于，所述增稠剂选自卡波姆、黄原胶或者聚丙烯酸钠；所述防腐剂选自丁基羟基茴香醚、叔丁基羟基甲苯、对羟基苯乙酮、羟苯甲酯中的一种或两种以上的组合；所述香精选自麝香或玫瑰精油。
3.根据权利要求1所述的含ebselen的防晒产品，其特征在于，所述步骤（5）采用截留分子量为2 kDa的超滤膜进行超滤。
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