CN115039770A - 一种用于松材线虫防治的pH响应型自荧光纳米农药载体及制备方法、纳米农药和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于松材线虫防治的pH响应型自荧光纳米农药载体及制备方法、纳米农药和应用，属于松材线虫病防治技术领域。所述纳米农药载体由G3.0PAMAM和介孔二氧化硅组成。采用本发明提供的纳米农药载体制备的纳米农药具有pH响应和自荧光双重性质，有效解决了松材线虫病防治过程中人工钻孔成本高、操作费时、孔洞不利于树木正常生长以及传统农药制剂功能单一、利用效率低、对松材线虫防治效果差等问题，实现用于松材线虫病防治药剂的pH响应释放和可视化追踪，达到农药减施增效，降低农药残留和环境污染的目的。

Description

一种用于松材线虫防治的pH响应型自荧光纳米农药载体及制 备方法、纳米农药和应用

技术领域

本发明属于松材线虫病防治技术领域，尤其涉及一种用于松材线虫防治的pH响应型自荧光纳米农药载体及制备方法、纳米农药和应用。

背景技术

松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)是中国第一大林业检疫性有害生物，作为松树枯萎病的主要诱因之一，给松林带来毁灭性灾害，严重危害林业生产和生态环境，造成了巨大的经济损失。松材线虫病已成为世界上最严重的森林病害之一，目前分布于美国、加拿大、墨西哥、日本、韩国、中国、葡萄牙和西班牙。在欧洲，到2030年松材线虫病可能蔓延到8-34％的地区，如果得不到控制，森林蓄积物损失累计价值估计将达到220亿欧元。由于松材线虫隐蔽性强，防治难度大，一直以来没有十分有效的防治措施。目前主动防治措施是采用阿维菌素、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐等进行树干注药，但其人工钻孔成本高、操作费时且孔洞不利于树木正常生长。而植保无人机喷药效率高达4.00-6.67hm²/h，速度快、效果好，节省劳动力且成本低，适于大面积松林施药作业。除此之外还有一个关键问题，在农药喷施过程中只有0.1％的农药到达了目标害虫，而99.9％的药剂泄漏到周围环境中。同时，由于松材线虫在树体内的隐蔽性而导致施药后无法直观感知施药杀灭效果，从而导致重复施药、农药滥用、药剂运输效率低、水土污染、松材线虫抗性增强、生物多样性丧失以及关键物种(如蜜蜂)灭绝等负面影响。为了适应植保无人机施药且满足农药减施增效并能可视化追踪施药效果的需求，我们需要开发一种新型的智能农药来防治松材线虫。

纳米控释农药是一种比传统剂型更优越的技术，可以通过对农药的包埋吸附作用来提高载药效果，实现农药控制释放并延长持效期。与传统剂型相比，纳米材料的小尺寸、大比表面积，能够增大农药的叶面附着、滞留与覆盖性能，提高有效利用率。纳米材料不仅可以改善疏水农药的水基化分散特性，提高生物利用率，还能改善对靶标害虫的作用方式、虫体侵入途径和效率，增强生物活性与杀灭效果。纳米控释农药将农药投放到特定靶点并精确释放，以保持高效和降低环境毒性。其控释配方涉及对生物(谷胱甘肽酶) 或非生物刺激(pH、温度、光照和水)按需或定点响应释放，可减少农药的用量、提高药效和克服农药的损失。由于树体环境本身呈弱酸性及松材线虫侵染松树后产生代谢酸，因此可以通过构建pH酸性敏感的载体负载农药，在减量施用的前提下又能有效地控制松材线虫。

荧光标记技术是指将荧光标记试剂通过共价结合或物理吸附等方式标记于所研究分子的某个基团上，用其荧光特性来反映研究对象的信息。具有非放射性、操作简便、稳定性高、灵敏度高和选择性好等特点，广泛用于细胞内外物质检测、组织及活体动物标记成像、药物分析、病理模型研究及疾病早期诊断等。由于松材线虫在树体内危害有很强的隐蔽性，农药在树体内的运输及防治效果很难直观显示，亟待可视化追踪来满足防治需求。但是引入荧光标记很有可能会潜在地改变农药活性分子的生化性质，因此亟待研发自荧光纳米农药实现可视化追踪的目的。

噻虫嗪是第二代烟碱类高效低毒的农药，与烟碱乙酰胆碱受体结合而起作用，其杀虫谱广、安全性好、活性高、作用速度快、持效期长。用于叶面喷雾及土壤灌根，施药后迅速被根、茎、叶吸收，并在木质部向顶传导到植株各部位，可防治蚜虫、叶蝉、粉虱、线虫、地面甲虫等，有内吸、触杀和胃毒活性。又能激活植物抗逆性蛋白，使茎杆和根系更加健壮，促进植株生长。但由于其疏水性、利用率低，且易受温度、光照、pH的影响，导致对松材线虫的防治效果一般。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于松材线虫防治的pH响应型自荧光纳米农药载体及制备方法、纳米农药和应用。采用本发明提供的纳米农药载体制备的纳米农药具有pH响应和自荧光双重性质，有效解决了松材线虫防治过程中人工钻孔成本高、操作费时、孔洞不利于树木正常生长以及传统农药制剂功能单一、利用率低、对松材线虫防治效果差等问题。实现用于松材线虫病防治药剂的pH响应释放和可视化追踪，达到农药减施增效，降低农药残留和环境污染的目的。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种用于松材线虫防治的pH响应型自荧光纳米农药载体，所述纳米农药载体由G3.0 PAMAM和介孔二氧化硅组成；所述G3.0 PAMAM的接枝率为17.3％；

所述纳米农药载体的比表面积为296.849m²/g，孔容为0.312cm³/g，孔径为3.428nm，粒径为91.1nm。

本发明还提供了一种上述技术方案所述的pH响应型自荧光纳米农药载体纳米农药载体的制备方法，包括以下步骤：

1)将十六烷基三甲基溴化铵与水、氢氧化钠混合、溶解后，在80℃下边搅拌边滴加四乙氧基硅烷，滴加后继续搅拌反应2h，依次经过滤、洗涤、真空干燥和煅烧，得到介孔二氧化硅；

2)将所述步骤1)得到的介孔二氧化硅分散在N,N-二甲基甲酰胺溶液中，得到介孔二氧化硅悬浮液；

3)将所述G3.0 PAMAM分散在N,N-二甲基甲酰胺溶液中，得到树枝悬浮液；

4)将所述步骤2)得到的介孔二氧化硅悬浮液与步骤3)得到的树枝悬浮液混合，在80℃氮气氛围中回流反应12h，依次经离心、洗涤和真空干燥，得到纳米农药载体。

优选的，所述步骤1)十六烷基三甲基溴化铵的质量与水的体积、氢氧化钠的质量比为1g:480mL:0.28g；

所述十六烷基三甲基溴化铵的质量与四乙氧基硅烷的体积比为 1g:5.3mL；

所述煅烧的条件包括：温度为600℃，时间为8h。

优选的，所述介孔二氧化硅与G3.0 PAMAM的质量比为4:1。

本发明还提供了一种用于松材线虫防治的pH响应型自荧光纳米农药，将防治松材线虫的农药负载在上述技术方案所述的纳米农药载体上，得到纳米农药。

具体地，所述农药包括噻虫嗪、噻虫胺或吡虫啉。

优选的，所述纳米农药中噻虫嗪的负载量为19.7～21.8wt％。

优选的，所述纳米农药的制备方法包括：将所述纳米农药载体、农药分散于溶剂中，在25～30℃、黑暗条件下搅拌48h，依次经离心、洗涤和真空干燥，得到纳米农药。

本发明还提供了上述技术方案所述的纳米农药在防治松材线虫中的应用。

优选的，所述应用包括：将所述纳米农药分散于水中，将得到的纳米农药溶液采用无人机喷洒；所述纳米农药溶液的浓度为50～200μg/mL。

本发明的有益效果为：

(1)本发明首次以纳米MSNs@PAMAM为载体负载农药噻虫嗪，制备得到多功能纳米控释农药；MSNs@PAMAM纳米粒子形状规则，粒径均匀稳定；内部为介孔结构，具有较大的比表面积和孔容，载药量高；并且具有 pH控释和自荧光效果。

(2)本发明所制备的纳米农药制剂由于其纳米尺寸，可以穿透树皮在松树体内传导；同时由于树体环境本身呈弱酸性及松材线虫侵染松树后产生代谢酸，可以促使纳米载体MSNs@PAMAM快速释放噻虫嗪，达到农药精准控制释放的目的，对松材线虫有很好的杀灭效果，实现农药减施增效，降低农药残留和环境污染的效果。

(3)本发明所制备的纳米农药由于其自荧光特性，可以可视化追踪药剂在树体内的运输，实现对松材线虫病智能、有效的防治。

(4)本发明所制备的纳米农药由于尺寸小、比表面积大，润湿性和黏附性好，提高农药有效利用率。用于无人机洒药，有效解决了松材线虫防治过程中人工钻孔成本高、操作费时、孔洞不利于树木正常生长等问题。

附图说明

图1为实施例1制备的介孔二氧化硅SEM和TEM图；

图2为实施例1制备的MSNs@PAMAM(左)和MSNs@PAMAM@THI(右) 纳米颗粒SEM图；

图3为实施例1制备的MSNs(左)、MSNs@PAMAM(中)和 MSNs@PAMAM@THI(右)粒径图；

图4为实施例1制备的MSNs、MSNs@PAMAM和 MSNs@PAMAM@THI的红外表征图；

图5为实施例1制备的MSNs、MSNs@PAMAM的氮吸附脱吸附等温线图；

图6为实施例1制备的MSNs、MSNs@PAMAM的孔径分布图；

图7为实施例1制备的MSNs、MSNs@PAMAM和 MSNs@PAMAM@THI的TG热重分析图；

图8为实施例1制备的MSNs、MSNs@PAMAM和 MSNs@PAMAM@THI的药剂荧光图；

图9为实施例1制备的MSNs、MSNs@PAMAM和 MSNs@PAMAM@THI的药剂水溶液荧光图；

图10为实施例1制备的pH响应型自荧光纳米农药在不同pH下的释放曲线图；

图11为实施例1制备的pH响应型自荧光纳米农药在不同pH释放的 Ritger-Peppas方程拟合曲线图；

图12为实施例1制备的pH响应型自荧光纳米农药与市售25％噻虫嗪水分散粒剂在pH 7.0 25℃条件下的累计释放效果比较图；

图13为实施例1制备的pH响应型自荧光纳米农药在不同温度下的释放曲线图；

图14为实施例1制备的pH响应型自荧光纳米农药与市售25％噻虫嗪水分散粒剂对光降解效果比较图；

图15为实施例1制备的pH响应型自荧光纳米载体与纳米农药对油松松枝不同时间的接触角测量图；

图16为实施例1制备的pH响应型自荧光纳米载体与纳米农药对油松松枝的接触角和黏附功变化图；

图17为油松健康树和松材线虫为害的病树间pH差异图。

具体实施方式

本发明提供了一种用于松材线虫防治的pH响应型自荧光纳米农药载体，所述纳米农药载体由G3.0 PAMAM和介孔二氧化硅组成；所述G3.0 PAMAM的接枝率为17.3％；所述纳米农药载体的比表面积为296.849m²/g，孔容为0.312cm³/g，孔径为3.428nm，粒径为91.1nm。

本发明还提供了一种上述技术方案所述的纳米农药载体的制备方法，包括以下步骤：

1)将十六烷基三甲基溴化铵与水、氢氧化钠混合、溶解后，在80℃下边搅拌边滴加四乙氧基硅烷，滴加后继续搅拌反应2h，依次经过滤、洗涤、真空干燥和煅烧，得到介孔二氧化硅；

2)将所述步骤1)得到的介孔二氧化硅分散在N,N-二甲基甲酰胺溶液中，得到介孔二氧化硅悬浮液；

3)将所述G3.0 PAMAM分散在N,N-二甲基甲酰胺溶液中，得到树枝悬浮液；

4)将所述步骤2)得到的介孔二氧化硅悬浮液与步骤3)得到的树枝悬浮液混合，在80℃氮气氛围中回流反应12h，依次经离心、洗涤和真空干燥，得到纳米农药载体。

本申请将十六烷基三甲基溴化铵与水、氢氧化钠混合、溶解后，在80℃ 600rpm下边搅拌边滴加四乙氧基硅烷，滴加后继续在400rpm搅拌反应2h，依次经过滤、洗涤、真空干燥和煅烧，得到介孔二氧化硅(以下简称MSNs)。在本发明中，所述十六烷基三甲基溴化铵的质量与水的体积、氢氧化钠的质量比优选为1g:480mL:0.28g。在本发明中，所述十六烷基三甲基溴化铵的质量与四乙氧基硅烷的体积比优选为1g:5.3mL。在本发明中，所述煅烧的条件优选包括：温度为600℃，时间为8h。本发明对过滤没有特殊限定，本领域技术人员依据常规操作即可。本发明优选依次使用水和甲醇洗涤2次。在本发明中，所述真空干燥的条件优选包括80℃干燥12h。

本发明将得到的介孔二氧化硅分散在N,N-二甲基甲酰胺溶液中，得到 10mg/mL介孔二氧化硅悬浮液。本发明对N,N-二甲基甲酰胺溶液的用量没有特殊限定，能将介孔二氧化硅分散即可。

本发明将所述G3.0 PAMAM分散在N,N-二甲基甲酰胺溶液中，得到树枝悬浮液。本发明对N,N-二甲基甲酰胺溶液的用量没有特殊限定，能将G3.0 PAMAM分散即可。

本发明将得到的介孔二氧化硅悬浮液与得到的树枝悬浮液混合，在80℃氮气氛围中回流反应12h，依次经离心、洗涤和真空干燥，得到纳米农药载体。在本发明中，所述介孔二氧化硅与G3.0 PAMAM的质量比为4:1。在本发明中，所述回流反应的温度优选为80℃。本发明对所述离心没有特殊限定，本领域技术人员按照常规操作即可，如10000rpm离心15min。本发明优选依次使用水和甲醇洗涤2次。在本发明中，所述真空干燥的条件优选包括80℃干燥12h。

本发明还提供了一种用于松材线虫防治的pH响应型自荧光纳米农药，将防治松材线虫的农药负载在上述技术方案所述的纳米农药载体上，得到纳米农药。

在本发明中，所述农药优选为噻虫嗪、噻虫胺或吡虫啉。在本发明中，所述纳米农药中噻虫嗪的负载量优选为19.7～21.8wt％。

在本发明中，所述纳米农药的制备方法优选包括：将所述纳米农药载体、农药分散于溶剂中，在25～30℃、黑暗条件下搅拌48h，依次经离心、洗涤和真空干燥，得到纳米农药。本发明对所述离心没有特殊限定，本领域技术人员按照常规操作即可，如10000rpm离心15min。本发明优选依次使用水和甲醇洗涤2次。在本发明中，所述真空干燥的条件优选包括60℃干燥。

本发明还提供了上述技术方案所述的纳米农药在防治松材线虫中的应用。在本发明中，所述应用优选包括：将所述纳米农药分散于水中，将得到的纳米农药溶液采用无人机喷洒；所述纳米农药溶液的浓度优选为 50～200μg/mL。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

21.8％噻虫嗪pH响应型自荧光纳米农药的组成及制备方法；

(1)1g十六烷基三甲基溴化铵溶于480mL蒸馏水中，加入0.28g氢氧化钠，搅拌溶解后升温至80℃。随后，边剧烈搅拌，边往混合液中滴加5.3mL 四乙氧基硅烷，继续在80℃搅拌反应2h。最后，过滤，依次用水和甲醇洗涤2次，真空干燥后，600℃焙烧8h，得到产品MSNs(介孔二氧化硅)。

(2)将200mg MSNs超声水浴分散在20mLN,N-二甲基甲酰胺溶液中成悬浮液，得到第一溶液。将50mg G3.0 PAMAM树枝体超声水浴分散在5mL N,N-二甲基甲酰胺溶液中，得到第二溶液；将第二溶液加入到第一溶液中，于80℃氮气氛围中回流反应12h，然后10000rpm15min离心分离，依次用水和甲醇洗涤2次，真空干燥得到MSNs@PAMAM(纳米农药载体)。

(3)将3.6mg/mL MSNs@PAMAM甲醇悬浮液9mL与130mg/mL噻虫嗪(THI)甲醇悬浮液1mL混合，在室温黑暗条件下搅拌48h，然后10000rpm 离心15min，依次用水和甲醇洗涤2次，最后真空干燥，得到21.8％ MSNs@PAMAM@THI纳米颗粒(纳米农药)。

pH响应型自荧光纳米农药的结构表征：

pH响应型自荧光纳米农药及载体的微观形貌和粒径大小如图1、2和3 所示，MSNs呈均匀球形，孔道结构清晰，平均粒径约为88.0nm；用PAMAM 对MSNs进行修饰后，纳米粒子的形状和粒径并没有明显改变， MSNs@PAMAM的平均粒径约为91.1nm；载药后的MSNs@PAMAM@THI 的平均粒径约为99.4nm。

pH响应型自荧光纳米农药的红外谱图如图4所示，MSNs@PAMAM在 1655cm^-1处出现一个新的吸收峰，归属为酰胺I峰C＝O，PAMAM已成功键接。MSNs@PAMAM@THI在1521cm^-1和1350cm^-1处出现两个新的吸收峰，可归属为硝基2个氧原子的吸收峰，1602cm^-1处吸收峰加强是PAMAM的酰胺峰与噻虫嗪芳香类官能团吸收峰相叠加，THI已经成功负载。

pH响应型自荧光纳米农药的氮吸附脱吸附等温线和孔径分布如图5所示，合成的MSNs是介孔材料典型的IV等温线，修饰PAMAM后介孔材料的特性没有变化，可将THI负载到介孔里。MSNs比表面积582.837m²/g，孔容0.424cm³/g，孔径3.50nm。MSNs@PAMAM比表面积296.849m²/g，孔容0.312cm³/g，孔径3.428nm。PAMAM成功接枝在MSNs表面，比表面积、孔容和孔径降低，可能是PAMAM会与孔道内硅羟基反应，导致孔容和孔径降低，但对吸附和储存THI依然有利。

pH响应型自荧光纳米农药的TG热重分析如图6所示，纳米载体表面接枝了17.3wt％的PAMAM；噻虫嗪THI负载量为21.8wt％。

pH响应型自荧光纳米农药的性能表征：

pH响应型自荧光纳米农药药剂荧光如图7所示，在365nm紫外光照射下，MSNs无荧光现象，MSNs@PAMAM、MSNs@PAMAM@THI均有明显的荧光。

pH响应型自荧光纳米农药药剂水溶液荧光如图8所示，MSNs水溶液(左) 在365nm紫外光下没有荧光发射现象，而MSNs@PAMAM(中)和载药后的 MSNs@PAMAM@THI(右)分别发出天蓝色、深蓝色的荧光。

在25℃，通过体外释放实验，研究了纳米颗粒负载噻虫嗪后在不同pH 值下的释放情况，如图9所示。MSNs@PAMAM@THI释放噻虫嗪对pH敏感，在低pH值时14d内的释放量明显高于高pH值时14d内的释放量。用 Ritger-Peppas模型研究释药动力学，n表示释放机制，在不同pH值下的释放n值均小于0.43，表明噻虫嗪从纳米粒子中释放遵循Fickian扩散。

pH响应型自荧光纳米农药与市售25％噻虫嗪水分散粒剂在pH 7.0 25℃条件下的累计释放效果比较，如图10所示。市售25％噻虫嗪水分散粒剂存在突释现象，而本实施例制备的MSNs@PAMAM@THI能够实现噻虫嗪的长效缓慢释放。

pH响应型自荧光纳米农药在不同温度下的释放曲线，如图11所示。pH 响应型自荧光纳米农药在不同温度下的累计释放量比较稳定。

pH响应型自荧光纳米农药与市售25％噻虫嗪水分散粒剂对光降解效果比较，如图12所示。与市售25％噻虫嗪水分散粒剂相比，MSNs@PAMAM 纳米粒子的外壳保护了大量的噻虫嗪，减缓噻虫嗪在紫外降解速率。因此，噻虫嗪在自然环境中的作用可以延长。

pH响应型自荧光纳米载体与纳米农药对油松松枝的接触角与黏附功效果图，如图13所示。农药载体MSNs@PAMAM溶液在30s后与松枝接触角 CA为0°，对松枝表现为完全润湿。纳米农药MSNs@PAMAM@THI药液60s 时与松枝接触角CA为44.2°，对松枝润湿性能好。MSNs@PAMAM溶液在 30s后与松枝的黏附功AW为132.36×10^-3J/m²，MSNs@PAMAM@THI药液60s时与松枝的黏附功AW为123.63×10^-3J/m²，纳米载体与纳米农药溶液均表现出对松枝有很好的黏附性，本实施例制备的纳米农药适合无人机喷洒。

实施例2

19.7％噻虫嗪pH响应型自荧光纳米农药的组成及制备方法；

(1)1g十六烷基三甲基溴化铵溶于480mL蒸馏水中，加入0.28g氢氧化钠，搅拌溶解后升温至80℃。随后，边剧烈搅拌，边往混合液中滴加5.3mL 四乙氧基硅烷，继续在80℃搅拌反应2h。最后，过滤，依次用水和甲醇洗涤2次，真空干燥后，600℃焙烧8h，得到产品MSNs(介孔二氧化硅)。

(2)将20mL 10mg/mL MSNs超声水浴分散在N,N-二甲基甲酰胺溶液中成悬浮液，得到第一溶液。将5mL 10mg/mL G3.0 PAMAM树枝体超声水浴分散在N,N-二甲基甲酰胺溶液中，得到第二溶液；将第二溶液加入到第一溶液中，于80℃氮气氛围中回流反应12h，然后10000rpm 15min离心分离，依次用水和甲醇洗涤2次，真空干燥得到MSNs@PAMAM(纳米农药载体)。

(3)将1.8mg/mL MSNs@PAMAM甲醇悬浮液18mL与65mg/mL噻虫嗪THI甲醇悬浮液2mL混合，在室温黑暗条件下搅拌48h，然后10000rpm 离心15min，依次用水和甲醇洗涤2次，最后真空干燥，得到19.7％ MSNs@PAMAM@THI纳米颗粒(纳米农药)。

实施例3

21.3％噻虫嗪pH响应型自荧光纳米农药的组成及制备方法；

1)1g十六烷基三甲基溴化铵溶于480mL蒸馏水中，加入0.28g氢氧化钠，搅拌溶解后升温至80℃。随后，边剧烈搅拌，边往混合液中滴加5.3mL 四乙氧基硅烷，继续在80℃搅拌反应2h。最后，过滤，依次用水和甲醇洗涤2次，真空干燥后，600℃焙烧8h，得到产品MSNs(介孔二氧化硅)。

(2)将20mL 10mg/mL MSNs超声水浴分散在N,N-二甲基甲酰胺溶液中成悬浮液，得到第一溶液。将5mL 10mg/mL G3.0 PAMAM树枝体超声水浴分散在N,N-二甲基甲酰胺溶液中，得到第二溶液；将第二溶液加入到第一溶液中，于80℃氮气氛围中回流反应12h，然后10000rpm 15min离心分离，依次用水和甲醇洗涤2次，真空干燥得到MSNs@PAMAM(纳米农药载体)。

(3)将7.2mg/mL MSNs@PAMAM甲醇悬浮液4.5mL与260mg/mL噻虫嗪THI甲醇悬浮液0.5mL混合，在室温黑暗条件下搅拌48h，然后10000rpm 离心15min，依次用水和甲醇洗涤2次，最后真空干燥，得到21.3％ MSNs@PAMAM@THI纳米颗粒(纳米农药)。

实施例4

室内毒性试验：

将适量的松材线虫培养物浸泡在水中以释放线虫。24h后，在显微镜下观察含有松材线虫的悬浮液以记录数量，然后用水稀释至100头/mL。将悬浮液(2mL)和实施例1制备的21.8％MSNs@PAMAM@THI稀释溶液(2mL) 在10mL烧杯中混合。5种噻虫嗪浓度(8、4、2、1、0.5μg/mL)重复3次。烧杯用保鲜膜密封，并置于25℃的培养箱中(空白对照：清水)。24h后，如果线虫在显微镜下的视野中保持静止3s，则认为已死亡。记录死亡数计算杀线虫毒性。同时测定原药噻虫嗪THI(少量丙酮溶解后用水稀释至相应浓度)、25％噻虫嗪水分散粒剂(清水)对松材线虫的毒性作对照。试验结果见表1。

表1各制剂对松材线虫室内毒性试验效果

药剂处理	LC<sub>5</sub>(95％CI)μg/mL	斜率±标准误	χ<sup>2</sup>(df)	相对毒力指数
					THI原药	4.53(3.98-5.25)	1.77±0.12	4.38(3)	1
25％THI水分散粒剂	2.49(1.78-3.66)	1.73±0.11	9.62(3)	1.82
					21.8％MSNs@PAMAM@THI	1.15(0.83-1.49)	1.99±0.12	7.19(3)	3.94

由表1可以看出：21.8％MSNs@PAMAM@THI纳米颗粒对松材线虫有很好的毒性，提高了噻虫嗪THI的控制效果，与传统制剂相比具有应用潜力。

实施例5

野外药效试验；

在陕西省柞水县松材线虫危害的病油松进行试验，在林区选择胸径约 20cm，高约7m病松树为试验对象，在不同高度0-1、1-2、2-3、3-4、4-5、5-6和6-7m取样(除去外层树皮，从向阳面3-5cm深度取出20g组织)，检测各高度现有线虫量，每个处理3棵树。然后用实施例1制备的21.8％ MSNs@PAMAM@THI(200μg/mL，0.5L)无人机喷药处理，3d后在不同高度前处理旁继续取样，检测处理前后的松材线虫量。收集木屑，用贝尔曼漏斗法提取松材线虫，并用显微镜鉴定。用25％THI水分散粒剂为药剂对照，未用药剂处理为空白对照。将分离得到的线虫悬液滴在线虫计数板上，在解剖镜下计数松材线虫的数量，然后将分离材料烘干(130℃、6h左右)，待样品恒量后，称量，换算出1g干材中松材线虫含量。虫口减退率和防治效果计算方法如下：

试验结果见表2。

表2各制剂对松材线虫野外药效试验效果

由表2可以看出：喷洒21.8％MSNs@PAMAM@THI纳米农药在病树 7-5m的高度对松材线虫的虫口减退率和防治效果均要优于市售25％THI水分散粒剂，能满足防治松材线虫的需要。

实施例6

野外树体药剂运输试验：

用实施例1、2、3制备的MSNs@PAMAM@THI(200μg/mL，0.5L； 100μg/mL，1L；50μg/mL，2L)，在林区选择生长良好、树势均匀、胸径约 20cm、高约7m的油松为试验对象，每个浓度3棵树。用无人机进行喷药， 3d后分别在0-1、1-2、2-3、3-4、4-5、5-6和6-7m处取样(除去外层树皮，从1-3cm的深度取出10g组织)，用潮湿的土壤堵住洞，以保护松树。用紫外分光光度计测定不同部位噻虫嗪含量，使用市售25％THI水分散粒剂进行对比。试验结果见表3。

表3各制剂野外树体运输试验效果

由表3可以看出，实施例1、2、3各浓度纳米药剂在树干中的传输效率更快，当噻虫嗪浓度为200μg/mL时，喷施药剂3d后，经树体各部位吸收，市售25％THI水分散粒剂检测到运输至距地面高度5m的位置(7-5m)，但实施例1、2、3制备的纳米农药均已有效运输到4m的位置(7-4m)；当噻虫嗪浓度为50μg/mL时，市售25％THI水分散粒剂运输至距地面高度4m的位置，但实施例1、2、3制备的纳米农药均已运输到3m的位置。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于松材线虫防治的pH响应型自荧光纳米农药载体，其特征在于，所述纳米农药载体由G3.0 PAMAM和介孔二氧化硅组成；所述G3.0PAMAM的接枝率为17.3％；

所述纳米农药载体的比表面积为296.849m²/g，孔容为0.312cm³/g，孔径为3.428nm，粒径为91.1nm。

2.一种权利要求1所述的pH响应型自荧光纳米农药载体纳米农药载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将十六烷基三甲基溴化铵与水、氢氧化钠混合、溶解后，在80℃下边搅拌边滴加四乙氧基硅烷，滴加后继续搅拌反应2h，依次经过滤、洗涤、真空干燥和煅烧，得到介孔二氧化硅；

2)将所述步骤1)得到的介孔二氧化硅分散在N,N-二甲基甲酰胺溶液中，得到介孔二氧化硅悬浮液；

3)将所述G3.0 PAMAM分散在N,N-二甲基甲酰胺溶液中，得到树枝悬浮液；

4)将所述步骤2)得到的介孔二氧化硅悬浮液与步骤3)得到的树枝悬浮液混合，在80℃氮气氛围中回流反应12h，依次经离心、洗涤和真空干燥，得到纳米农药载体。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)十六烷基三甲基溴化铵的质量与水的体积、氢氧化钠的质量比为1g:480mL:0.28g；

所述十六烷基三甲基溴化铵的质量与四乙氧基硅烷的体积比为1g:5.3mL；

所述煅烧的条件包括：温度为600℃，时间为8h。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述介孔二氧化硅与G3.0 PAMAM的质量比为4:1。

5.一种用于松材线虫防治的pH响应型自荧光的纳米农药，其特征在于，将防治松材线虫的农药负载在权利要求1所述的纳米农药载体上，得到纳米农药。

6.根据权利要求5所述的纳米农药，其特征在于，所述农药包括噻虫嗪、噻虫胺或吡虫啉。

7.根据权利要求6所述的纳米农药，其特征在于，所述纳米农药中噻虫嗪的负载量为19.7～21.8wt％。

8.根据权利要求5所述的纳米农药，其特征在于，所述纳米农药的制备方法包括：将所述纳米农药载体、农药分散于溶剂中，在25～30℃、黑暗条件下搅拌48h，依次经离心、洗涤和真空干燥，得到纳米农药。

9.权利要求5～8任一项所述的纳米农药在防治松材线虫中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用包括：将所述纳米农药分散于水中，将得到的纳米农药溶液采用无人机喷洒；所述纳米农药溶液的浓度为50～200μg/mL。

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