CN115029394A - 苏氨酸母液分离提取工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物发酵行业发酵废液处理领域，公开了苏氨酸母液分离提取工艺，其包括如下步骤：步骤1）母液的获得，步骤2）母液的分离提取，步骤3）酶解干蛋白。本发明工艺将母液处理和菌体蛋白的提取二者相结合，把氨基酸废液的价值发挥到最大，实现了工业清洁生产的目标。
Description
技术领域
本发明属于生物发酵行业发酵废液处理领域，具体涉及苏氨酸母液分离提取工艺。
背景技术
目前，苏氨酸的生产方法主要有发酵法、蛋白质水解法和化学合成法三种，其中微生物发酵法已经成为生产苏氨酸的主流方法。发酵法生产苏氨酸需经过发酵、膜过滤、浓缩结晶、离心分离、干燥、筛分、包装等工艺操作，浓缩液离心分离后将产生大量的苏氨酸母液，其成分包括苏氨酸、杂质氨基酸、蛋白质、残糖、无机盐等物质。
苏氨酸的分离纯化通常采用离子交换法，离子交换树脂加膜过滤提取解决了产品纯度、收率低、污水难处理等问题，也是氨基酸提取常用的一种方法。离子交换法加膜滤提取法是将陶瓷膜除菌后的滤清液下调pH值至2～4.5，用强酸树脂将氨基酸和阳离子吸附，废液排出至污水处理，最后用氨水将吸附的氨基酸洗脱下来，但是洗脱液中的阳离子与氨基酸无法有效的分离，致使苏氨酸的纯度较低。另一方面母液中含有的大量菌体，它是一种单细胞蛋白，含有丰富的蛋白质，对干燥后菌体蛋白的化学成分进行分析发现废弃菌体中蛋白质的含量高达80％以上。其氨基酸种类和配比都比较齐全，并且含有丰富的维生素、核酸、多糖等其他营养物质。这些有用物质白白排放，造成大量的损失。
氨基酸废液处理技术一直是研究的热点和难点,最近几年,我国氨基酸生产行业的建设发展较快,已经成为外资投资和中国经济增长的热点，因此，水资源污染等环境问题已经成为制约氨基酸生产行业可持续发展的关键。如何对氨基酸废弃母液进行最大化优化处理是我们需要不断解决的技术问题。目前废液中蛋白的提取方法主要以下四种工艺，特点如下。
各种工艺技术的主要特点
各种工艺技术的比较
综上所述，絮凝沉淀法是最常用的菌体蛋白提取方法，工业上大多数使用聚丙烯酸钠。但是采用聚丙烯酸钠作为絮凝剂存在以下问题，聚丙烯酸钠成本相对较高，而且少量聚丙烯酸钠会掺入到蛋白中，不能将蛋白回用于氨基酸发酵培养基中，会造成增加发酵产品分离难度。
发明内容
为了解决现有技术存在的技术问题，本发明提供了苏氨酸母液分离提取工艺。
本发明是通过如下技术方案来实现的。
苏氨酸母液分离提取工艺，其包括如下步骤：
步骤1）母液的获得，步骤2）母液的分离提取，步骤3）酶解干蛋白。
进一步地，所述工艺包括如下步骤：
步骤1）母液的获得：苏氨酸发酵液经过过滤器过滤收集滤液A和固体纤维物质；滤液A经微滤膜过滤，分别收集截留物和滤液B；然后将滤液B继续进行超滤膜过滤，收集浓缩液和滤液C；滤液C经过蒸发器浓缩至原液体积的四分之一，然后结晶，最后离心收集苏氨酸晶体和废液；合并上述截留物、浓缩液和废液，得到苏氨酸母液；
步骤2）母液的分离提取：
苏氨酸母液进入到降糖池中，经过12h缓冲，对母液中的残糖、残酸进行降解后，缓缓加入浓硫酸调节pH为3.5，再将调整后的氨基酸发酵废液打入蛋白提取罐中并加入絮凝剂，升温至60℃，保温条件下，100rpm搅拌5min，再静置30min，使固体蛋白最大程度析出提取出的湿蛋白通过压滤机压缩后进一步提取出固体湿蛋白，将压滤出的湿蛋白进行烘干得到干蛋白，提取蛋白后的废水经浓缩处理后进行喷浆造粒制肥；
步骤3）酶解干蛋白：按照1g：10ml的比例添加浓度为0.6M的柠檬酸水溶液，搅拌均匀，添加酸性蛋白酶，添加量为5000U/g干物质，酶解时间为8h，然后调整pH为7.0，温度为50℃，再添加沙雷肽酶，添加量为1000U/g干物质，酶解时间为6h，最后100℃灭酶5min，得到蛋白水解液，可作为氨基酸发酵培养基的氮源使用。
优选地，所述絮凝剂选用细菌膜蛋白。
优选地，所述步骤2）中，按照1g絮凝剂：1L废液的比例添加絮凝剂。
优选地，所述柠檬酸水溶液的浓度为0.6M。
更优选地，所述细菌膜蛋白选用大肠杆菌膜蛋白。
所述大肠杆菌膜蛋白，提取方法可采用常规的蔗糖密度梯度离心法，也可采用TritonX-114 去污剂法（具体可见“医药前言，2017年12月，TritonX-114去污剂法提取大肠杆菌膜蛋白”）。
本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：
在氨基酸发酵行业中，母液处理和菌体蛋白的提取，只有二者相结合，也就是治理和利用相结合的方法，才能把氨基酸废液的价值发挥到最大，只有这样才能为社会创造良好的经济效益，实现工业清洁生产的目标。
母液中的菌体蛋白含有丰富的蛋白质和其它营养物质，为开发新的原料资源提供依据。不仅可以去除废液中的一部分有机物，减轻废液对环境污染负荷，同时又生产出高质量的产品。该项产品的开发，将会具有一定经济和社会效益。对谷氨酸废水资源的再利用研究具有重要意义。
本发明采用新型絮凝剂大肠杆菌膜蛋白，不但能够与蛋白进行物理结合，还可以通过物理吸附固定在收集容器底部，提高了絮凝效果，并且无污染，絮凝得到的蛋白回用于氨基酸发酵培养基中，工业价值高；而聚丙烯酸钠等常规絮凝剂的絮凝效果一般，蛋白颗粒细且碎，而且用量大，蛋白收率偏低，还存留于蛋白产品中，无法作为高价值的产品投入使用。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本发明进行更加清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
利用谷氨酸发酵废液验证絮凝剂的絮凝效果。
（一）菌体蛋白提取实验研究
絮凝剂选用大肠杆菌膜蛋白，添加量为1g絮凝剂：1L废液；实验结果及分析
谷氨酸尾液提取菌体蛋白实验结果如下表1：
表1
| 样品编号 | 温度°c | 婆美°Be | 谷氨酸含量g/dL | 蛋白收率g/dL | 蛋白絮凝效果 |
| 原样 | ———— | 21 | 2.98 | ———— | ———— |
| 1# | 30 | ———— | ———— | ———— | 絮凝效果差 |
| 2# | 40 | 17.5 | 2.5 | 7.09 | 絮凝效果好 |
| 3# | 50 | 17.5 | 2.6 | 7.15 | 絮凝效果好 |
| 4# | 60 | 17.8 | 2.7 | 7.81 | 絮凝效果好 |
| 5# | 70 | 17.9 | 2.8 | 8.07 | 絮凝效果好 |
备注：样品的婆美、谷氨酸含量是指提取菌体蛋白后滤波的婆美和谷氨酸含量。蛋白收率是指100ml谷氨酸尾液中提取出来的绝干蛋白含量。以下表中的数据同此表。在30℃时，加入不同浓度夫人絮凝剂均不絮凝，当加入10％的絮凝剂时，才有所絮凝，但絮凝效果不好，蛋白颗粒细且碎。
絮凝剂选用大肠杆菌膜蛋白，添加量为2g絮凝剂：1L废液；实验结果及分析谷氨酸尾液提取菌体蛋白实验结果如下表2：
表2
| 样品编号 | 温度°c | 婆美°Be | 谷氨酸含量g/dL | 蛋白收率g/dL | 蛋白絮凝效果 |
| 原样 | ———— | 21 | 2.98 | ———— | ———— |
| 6# | 30 | ———— | ———— | ———— | 基本不絮凝 |
| 7# | 40 | 17 | 2.5 | 6.86 | 絮凝效果好 |
| 8# | 50 | 17 | 2.5 | 7.50 | 絮凝效果好 |
| 9# | 60 | 17.2 | 2.5 | 7.69 | 絮凝效果好 |
| 10# | 70 | 17.5 | 2.6 | 8.05 | 絮凝效果好 |
加入1‰与加入2‰的絮凝剂蛋白絮凝效果基本接近。因此加入1‰的絮凝剂能够充分发挥絮凝剂的絮凝效果，不至于使絮凝剂过剩。
絮凝剂选用大肠杆菌膜蛋白，添加量为0.5g絮凝剂：2L废液；实验结果及分析
谷氨酸尾液提取菌体蛋白实验结果如下表3：
表3
| 样品编号 | 温度°C | 婆美°Be | 谷氨酸含量g/dL | 蛋白收率g/dL | 蛋白絮凝效果 |
| 原样 | ———— | 21 | 2.98 | ———— | ———— |
| 11# | 40 | 17 | 2.5 | 5.58 | 絮凝效果差 |
| 12# | 50 | 17 | 2.5 | 6.08 | 絮凝效果好 |
| 13# | 60 | 17 | 2.5 | 6.30 | 絮凝效果好 |
| 14# | 70 | 17 | 2.6 | 6.38 | 絮凝效果好 |
由于絮凝剂浓度太低，所以需要把谷氨酸尾液加热到60℃以上，才能絮凝出菌体蛋白，此实验消耗的能量高，而且加入到谷氨酸尾液中的水较多，增加后道工序废水处理量。
结果与讨论
通过实验可以看出，随着温度的升高，达到絮凝效果的絮凝剂的加入量减少。随着温度的升高，达到絮凝效果后的蛋白提取收率在增加。絮凝剂浓度为1‰和2‰的蛋白絮凝效果基本接近，把絮凝剂配成1‰的浓度较好。发酵尾液的温度太低，蛋白絮凝效果差,絮凝剂的加入量也大，温度过高，能耗提高，所以通过实验可以看出发酵尾液的温度在60℃组偶有为最佳。
（二）不同絮凝剂对蛋白提取的影响
采用聚丙烯酸钠、大肠杆菌全蛋白、大肠杆菌膜蛋白进行比较。
选择温度为60℃，婆美17°Be，pH为4，添加量均为1g絮凝剂：1L废液，提取菌体蛋白实验结果如下表4：
表4
| 样品编号 | 蛋白收率g/dL | 蛋白絮凝效果 |
| 原样 | ———— | ———— |
| 聚丙烯酸钠 | 7.12 | 絮凝效果一般 |
| 大肠杆菌全蛋白 | 6.98 | 絮凝效果一般 |
| 大肠杆菌膜蛋白 | 7.83 | 絮凝效果好 |
结论：大肠杆菌膜蛋白能够与菌体蛋白进行物理结合，还可以通过物理吸附固定在收集容器底部，提高了絮凝效果，并且无污染，絮凝得到的蛋白回用于氨基酸发酵培养基中，工业价值高；而聚丙烯酸钠和大肠杆菌全蛋白的絮凝效果一般，蛋白颗粒细且碎，而且蛋白收率偏低。
实施例2
大肠杆菌膜蛋白作为絮凝剂应用于苏氨酸母液的分离提取。
母液的获得：
苏氨酸发酵液（苏氨酸含量10g/100ml）经过孔径为1mm的过滤器，收集滤液A和固体纤维物质；滤液A经微滤膜过滤，分别收集截留物和滤液B；然后将滤液B继续进行超滤膜过滤，收集浓缩液和滤液C；滤液C经过蒸发器浓缩至原液体积的四分之一，然后结晶，最后离心收集苏氨酸晶体和废液；合并上述截留物、浓缩液和废液，得到苏氨酸母液；其中，微滤膜为无机陶瓷膜，截留分子量为3000MW，微滤温度为36℃；超滤膜截留分子量为300MW，超滤温度为36℃；
母液的处理：
苏氨酸母液进入到降糖池中，经过12h缓冲，对母液中的残糖、残酸进行降解后，缓缓加入浓硫酸调节pH在3.5，再将调整后的废液打入蛋白提取罐中并加入絮凝剂（大肠杆菌膜蛋白），按照1g絮凝剂：1L废液的比例添加絮凝剂，升温至60℃，保温条件下，100rpm搅拌5min，再静置30min，使固体蛋白最大程度析出，蛋白收率为8.27g/dL，蛋白提取率为98.8%，提取出的湿蛋白通过压滤机压缩后进一步提取出固体湿蛋白，将压滤出的湿蛋白进行烘干得到干蛋白，提取蛋白后的废水经浓缩处理后进行喷浆造粒制肥；
酶解干蛋白：按照1g：10ml的比例添加浓度为0.6M的柠檬酸水溶液，搅拌均匀，添加酸性蛋白酶，添加量为5000U/g干物质，酶解时间为8h，然后调整pH为7.0，温度为50℃，再添加沙雷肽酶，添加量为1000U/g干物质，酶解时间为6h，最后100℃灭酶5min，得到蛋白水解液，可作为氨基酸发酵培养基的氮源使用。
絮凝剂对照：
使用聚丙烯酸钠作为对照，操作方式同上，
蛋白收率为7.94g/dL，蛋白提取率为94.9%，而且絮凝得到的蛋白中由于残留聚丙烯酸钠，无法回用于氨基酸发酵培养基中，产品附加值大幅降低。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例公开如上，然而，并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当然会利用揭示的技术内容作出些许更动或修饰，成为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
Claims (6)
1.苏氨酸母液分离提取工艺，其包括如下步骤：
步骤1）母液的获得，步骤2）母液的分离提取，步骤3）酶解干蛋白。
2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述工艺包括如下步骤：
步骤1）母液的获得：苏氨酸发酵液经过过滤器过滤收集滤液A和固体纤维物质；滤液A经微滤膜过滤，分别收集截留物和滤液B；然后将滤液B继续进行超滤膜过滤，收集浓缩液和滤液C；滤液C经过蒸发器浓缩至原液体积的四分之一，然后结晶，最后离心收集苏氨酸晶体和废液；合并上述截留物、浓缩液和废液，得到苏氨酸母液；
步骤2）母液的分离提取：
苏氨酸母液进入到降糖池中，经过12h缓冲，对母液中的残糖、残酸进行降解后，缓缓加入浓硫酸调节pH为3.5，再打入蛋白提取罐中并加入絮凝剂，升温至60℃，保温条件下，100rpm搅拌5min，再静置30min，通过压滤机压缩提取出固体湿蛋白，将压滤出的湿蛋白进行烘干得到干蛋白，提取蛋白后的废水经浓缩处理后进行喷浆造粒制肥；
步骤3）酶解干蛋白：按照1g：10ml的比例添加浓度为0.6M的柠檬酸水溶液，搅拌均匀，添加酸性蛋白酶，添加量为5000U/g干物质，酶解时间为8h，然后调整pH为7.0，温度为50℃，再添加沙雷肽酶，添加量为1000U/g干物质，酶解时间为6h，最后100℃灭酶5min，得到蛋白水解液，可作为氨基酸发酵培养基的氮源使用。
3.根据权利要求2所述的工艺，其特征在于，所述絮凝剂选用细菌膜蛋白。
4.根据权利要求2所述的工艺，其特征在于，所述步骤2）中，按照1g絮凝剂：1L废液的比例添加絮凝剂。
5.根据权利要求2所述的工艺，其特征在于，所述柠檬酸水溶液的浓度为0.6M。
6.根据权利要求3所述的工艺，其特征在于，所述细菌膜蛋白选用大肠杆菌膜蛋白。
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