CN115028687A - 从海绵中提取的环肽类化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从海绵中提取的环肽类化合物，结构选自以下化合物1‑4中的一种：

本发明还提供了一种所述环肽类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。所述环肽类化合物对人肺癌细胞NCI‑H460显示较强的生长抑制活性。本发明为研究和开发新抗肿瘤药物提供了新的先导化合物，为开发利用我国的海洋药用资源提供了科学依据。

Description

从海绵中提取的环肽类化合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于药物化学技术领域，具体地说，涉及一种从海绵中提取的环肽类化合物及其制备方法与应用。

背景技术

环肽具有许多不同的生化和治疗特性，已在药物治疗中取得巨大成功。在FDA和EMA批准上市的60多种肽类药物中，三分之二为环肽。值得注意的是，海洋环境孕育了各种结构多样且具生物活性的环肽。Plitidepsin是最具代表性的海洋来源的分子之一，于2018年由EMA批准用于治疗复发/难治性多发性骨髓瘤，且在最近被证实是COVID-19的潜在治疗候选药物。

海绵一直是海洋活性环肽的重要多产来源。文献报道的富含环肽的海绵主要包括Phakellia，Hymeniacidon，Stylissa和Callyspongia等属，对它们化学成分的研究最终产生了phakellistatins，hymenamides，stylissamides和callyaerins等类型的环肽。有趣的是，这些环肽具有共同的结构特征：富含脯氨酸，亮氨酸和(或)异亮氨酸在结构中占较大比重。进一步的构效分析发现，亮氨酸和(或)异亮氨酸常与脯氨酸相连形成Pro-Leu/Ile片段，而具较多Pro-Leu/Ile片段的环肽往往具有更好的细胞毒活性。基于环肽类化合物丢失固定中性碎片离子的特点，借助复合型液相串联三重四极杆质谱(Q-Q-Q)强大的母离子扫描功能，有助于靶向研究和定向获取含Pro-Leu/Ile片段的环肽，从而高效发现潜在的新的抗肿瘤先导化合物，加快海洋药物开发的速度。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种从海绵中提取的环肽类化合物。

本发明的第二个目的是提供一种所述从海绵中提取的环肽类化合物的制备方法。

本发明的第三个目的是提供一种所述从海绵中提取的环肽类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的第一个方面提供了一种从海绵中提取的新的环肽类化合物，结构选自以下化合物1-4中的一种：

所述海绵指的是海绵样本Reniochalina sp.。

本发明的第二个方面提供了一种所述从海绵中提取的环肽类化合物的提取方法，包括以下步骤：

第一步，样本筛选：针对环肽类化合物丢失固定中性碎片的特点，将LC-QTRAP-MS/MS的PI扫描功能与IDA触发的EPI扫描技术相结合，建立选择性识别粗提物中环肽类特征结构的快速定位方法，从海绵样本库中筛选出富含环肽类化合物的海绵样本Reniochalinasp.；

第二步，溶剂提取：将第一步筛选到的海绵样本Reniochalina sp.剪碎成块后，分别加入等体积的MeOH和体积比为1:1的CH₂Cl₂/MeOH先后超声提取至少三次，合并提取液经减压浓缩得到粗提物；

第三步，分步萃取：先将第二步制备的粗提物混悬于90％的甲醇水中，用等体积的石油醚萃取3～5次，再将90％的甲醇水稀释成60％的甲醇水，用等体积的二氯甲烷萃取3～5次，合并萃取液经减压浓缩得到二氯甲烷萃取部分；

第四步，分离富集：将第三步制备的二氯甲烷萃取部分进行Sephadex LH-20凝胶柱层析，第一次以体积比为1:1的CH₂Cl₂/MeOH为洗脱剂，第二次以体积比为4:5:1的n-hexane/CH₂Cl₂/MeOH为洗脱剂，并通过质谱定位追踪的方式，将大分子量的化合物进行富集；采用ODS中压柱色谱分离，用10％-100％的MeOH/H₂O梯度洗脱，采用质谱追踪定位分析，获得一系列含有大分子量环肽类化合物的精细馏分；

第五步，筛选目标化合物：以m/z 211(C₁₁H₁₉N₂O₂)作为Pro-Leu/Ile片段的特征碎片离子，采用母离子扫描质谱法分析第四步制备的含有大分子量环肽类化合物的精细馏分，筛选出含Pro-Leu/Ile片段的目标化合物，结合分子量信息和色谱保留行为，通过质谱分析追踪定位目标化合物所在的精细馏分；

第六步，质谱导向分离：采用质谱导向的半制备高液相色谱法对第五步制备的精细馏分进行分离，从而得到目标化合物。

所述第六步中，质谱导向的半制备高液相色谱法的分离条件：化合物1，50-60％乙腈-水，流速6.0mL/min，在正离子模式下检测分子离子m/z 941.59；化合物2和化合物3，20-23％乙腈-水，流速6.0mL/min，在正离子模式下检测分子离子m/z 724.37和770.41；化合物4，28-35％乙腈-水，流速6.0mL/min，在正离子模式下检测分子离子m/z 794.48。

本发明的第三个方面提供了一种所述从海绵中提取的环肽类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

所述肿瘤为肺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌。

所述肿瘤细胞为人卵巢癌细胞A2780、人结肠癌细胞HCT-8、人肺癌细胞NCI-H460、人结肠癌细胞SW480、人肺癌细胞PC-9、人肝癌细胞HepG2。

所述环肽类化合物对人肺癌细胞NCI-H460显示出很强的抑制活性，因此可用于制备抗肿瘤药物。

由于采用上述技术方案，本发明具有以下优点和有益效果：

本发明的药源材料为寻常纲(Demospongiae)软海绵目(Halichondrid)轴海绵科(Axinellidae)的海绵Reniochalina sp.，其独特的生存环境使其能够产生结构新颖、活性显著的次级代谢产物。本发明提供的环肽类化合物来自海绵Reniochalina sp.，通过母离子扫描质谱法和LC-MS导向的程序性分离手段进行分离，制备方法高效简单。本发明的环肽类化合物对人肺癌细胞NCI-H460抑制活性显著。总而言之，本发明为研究和开发新的抗肿瘤药物提供了新的先导化合物，为海绵中微量环肽类活性成分的快速识别和定向追踪提供了新策略，也为开发利用我国海洋药用资源提供了科学依据。

附图说明

图1是环肽类化合物1-4的发现流程示意图。

图2是环肽类化合物1的结构阐明示意图。

图3是环肽类化合物2的结构阐明示意图。

图4是环肽类化合物3的结构阐明示意图。

图5是环肽类化合物4的结构阐明示意图。

图6是本发明的环肽类化合物1-4对六种人肿瘤细胞株的体外增殖抑制作用示意图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

实施例1

从海绵中发现并提取海绵环肽类化合物1-4

对海绵样本库采用母离子扫描获得富含环肽的肾指海绵样本Reniochalina sp.。将海绵(干重54.8g)剪碎成块后，用有机溶剂超声提取多次，合并提取液经减压浓缩得粗提物。粗提物经分步萃取、凝胶柱层析、ODS中压柱色谱分离得到若干精细馏分。对富含环肽类化合物的二氯甲烷部分进行母离子扫描分析，得到一系列含有Pro-Leu/Ile片段的目标环肽，结合分子量信息和色谱保留行为，通过质谱分析追踪定位目标化合物所在的精细馏分，并采用质谱导向的半制备高液相色谱分离最终获得海绵环肽类化合物。

从海绵中提取海绵环肽类化合物1-4的具体步骤如下：

第一步，样本筛选：针对环肽类化合物丢失固定中性碎片的特点，将LC-QTRAP-MS/MS的PI扫描功能与IDA触发的EPI扫描技术相结合，建立选择性识别粗提物中环肽类特征结构的快速定位方法，从海绵样本库中筛选出富含环肽类化合物的海绵样本。该样本于2021年4月采集自南海永乐群岛附近海域(25-30m深度)，呈橙黄色，质地较硬。经弗林德斯大学海洋生物制品开发中心的杨琪博士鉴定为Reniochalina sp.。

第二步，溶剂提取：将第一步筛选到的海绵样本Reniochalina sp.(干重54.8g)剪碎成块后，分别加入等体积的MeOH和CH₂Cl₂/MeOH(v/v＝1:1)先后超声提取三次，合并提取液经减压浓缩得到粗提物(23.7g)；

第三步，分步萃取：先将第二步制备的粗提物混悬于90％的甲醇水250mL中，用等体积的石油醚萃取3～5次，再将90％的甲醇水稀释成60％的甲醇水，用等体积的二氯甲烷萃取3～5次，合并萃取液经减压浓缩得到二氯甲烷萃取部分(1.2g)；

第四步，分离富集：将第三步制备的二氯甲烷萃取部分进行Sephadex LH-20凝胶柱层析，第一次以CH₂Cl₂/MeOH(v/v＝1:1)为洗脱剂，第二次以n-hexane/CH₂Cl₂/MeOH(v/v/v＝4:5:1)为洗脱剂，并通过质谱定位追踪的方式，将大分子量的化合物进行富集，得到600mg；采用ODS中压柱色谱分离，用10％-100％的MeOH/H₂O梯度洗脱，采用质谱追踪定位分析，获得一系列含有大分子量环肽类化合物的精细馏分；

第五步，筛选目标化合物：以m/z 211(C₁₁H₁₉N₂O₂)作为Pro-Leu/Ile片段的特征碎片离子，采用母离子扫描质谱法分析第四步制备获得的含有大分子量环肽类化合物的精细馏分，筛选出含Pro-Leu/Ile片段的目标化合物，结合分子量信息和色谱保留行为，通过质谱分析追踪定位目标化合物所在的精细馏分；

第六步，质谱导向分离：采用质谱导向的半制备高液相色谱法对第五步制备的精细馏分进行分离，从而得到目标化合物1-4。各个化合物的分离条件如下:

化合物1，50-60％乙腈-水，流速6.0mL/min，在正离子模式下检测分子离子m/z941.59；化合物2和化合物3，20-23％乙腈-水，流速6.0mL/min，在正离子模式下检测分子离子m/z724.37和770.41；化合物4，28-35％乙腈-水，流速6.0mL/min，在正离子模式下检测分子离子m/z 794.48。

图1是环肽类化合物1-4的发现流程示意图。从图中可以看出，本发明所建立的母离子扫描质谱方法准确有效，可从海绵粗提物中成功准确识别含有Pro-Leu/Ile片段的目标环肽，结合质谱导向的分离手段可高效定向追踪目标环肽。

化合物1-4的结构如下所示：

通过上述步骤制得的海绵环肽类化合物1-4的理化性质和核磁共振数据如下：

化合物1：白色无定型粉末；[α]²⁵ _D-75.5(c 0.22，MeOH)；IR(ATR)ν_max 3297，2953，2869，1620，1514，1435，1384，1239，698cm^-1；¹H and ¹³C NMR数据如表1所示；ESIMS/MS数据如图2中C所示；HRESIMS m/z 941.5872[M+H]⁺(calcd for C₅₂H₇₆N₈O₈，941.5864)。

化合物2：淡黄色无定形粉末；[α]²⁵ _D-62.4(c 0.25，MeOH)；IR(ATR)ν_max 3275，2953，1625，1515，1446，1385，1237，512cm^-1；¹H and ¹³C NMR数据如表2所示；ESIMS/MS数据如图3中C所示；HRESIMS m/z 724.3676[M+H]⁺(calcd for C₃₆H₄₉N₇O₉，724.3670)。

化合物3：淡黄色无定形粉末；[α]²⁵ _D-70.0(c 0.22，MeOH)；UV(MeOH)λ_max 279nm；IR(ATR)ν_max 3396，2956，2873，1625，1520，1448，1244，1201，1161，1026，702，538cm^-1；¹H and¹³C NMR数据如表3所示；ESIMS/MS数据如图4中C所示；HRESIMS m/z770.4084[M+H]⁺(calcdfor C₃₈H₅₅N₇O₁₀，770.4089)。

化合物4：淡黄色无定形粉末；[α]²⁵ _D-83.0(c 0.30，MeOH)；UV(MeOH)λ_max 279nm；IR(ATR)ν_max 3239，2956，2873，1636，1515，1446，1345，1241，1026cm^-1；¹H and ¹³C NMR数据如表4所示；ESIMS/MS数据如图5中C所示；HRESIMS m/z 794.4824[M+H]⁺(calcd forC₄₂H₆₃N₇O₈，794.4816)。

海绵环肽类化合物1-4的核磁共振谱数据分别见表1、表2、表3和表4。

表1：环肽类化合物1的核磁共振谱数据(DMSO-d₆)

通过详细分析2D NMR(COSY、TOCSY和HMBC)谱，可以确定组成化合物1的8个氨基酸残基包括脯氨酸(2个)、苯丙氨酸(2个)、异亮氨酸(2个)和亮氨酸(2个)。通过仔细分析HMBC、ROESY相关信号和ESI-MS/MS质谱数据共同确定氨基酸残基的连接顺序。其中，根据HMBC相关信号如Leu¹-NH/Pro²-CO、Ile¹-NH/Pro¹-CO、Phe¹-NH/Phe²-CO、Leu²-NH/Phe¹-CO、Ile²-NH/Leu²-CO和Phe²-NH/Leu ¹-CO，可以确定两个结构片段：Ile¹-Pro¹和Ile²-Leu²-Phe¹-Phe²-Leu¹-Pro²。根据ROESY相关信号如Ile¹-Hα/Pro²-Hδ和Ile²-Hα/Pro¹-Hδ，进而确定化合物1的结构为cyclo-(Pro¹-Ile¹-Pro²-Leu¹-Phe²-Phe¹-Leu²-Ile²)。这一结果经ESI-MS/MS质谱数据验证。两个脯氨酸的Δδ_Cβ-Cγ均具有较小的Δδ_Cβ-Cγ值，其中Pro¹为4.8，Pro²为3.9，说明它们都是反式构象。利用高级Marfey法对比标准品衍生物和本发明化合物1氨基酸衍生物的分子量信息和保留时间(t_R)来确定氨基酸残基的手性，结果显示化合物1的所有氨基酸残基都是_L-构型。本发明环肽类化合物1的结构阐明示意图如图2所示，图2是环肽类化合物1的结构阐明示意图。其中，A为关键的2D NMR相关信号，B为MS/MS碎裂模式，C为HRESI-MS/MS谱图，D为基于LC-MS的高级Marfey法。

表2：环肽类化合物2的核磁共振谱数据(DMSO-d₆)

通过详细分析2D NMR(COSY和HMBC)谱，可以确定组成化合物2的7个氨基酸残基包括亮氨酸(1个)、天冬氨酸(1个)、脯氨酸(3个)、甘氨酸(1个)和苯丙氨酸(1个)。通过仔细分析HMBC、ROESY相关信号和ESI-MS/MS质谱数据共同确定氨基酸残基的连接顺序。其中，根据HMBC相关信号如Gly-NH/Pro²-CO、Asp-NH/Gly-CO、Leu-NH/Pro¹-CO和Phe-NH/Leu-CO，可以确定两个结构片段：Asp-Gly-Pro²和Phe-Leu-Pro¹。根据ROESY相关信号如Asp-Hα/Pro³-Hδ、Pro¹-Hδ/Pro³-Hα和Phe-Hα/Pro²-Hα，进而确定化合物2的结构为cyclo-(Pro¹-Leu-Phe-Pro²-Gly-Asp-Pro³)。这一结果经ESI-MS/MS质谱数据验证。通过脯氨酸的Δδ_Cβ-Cγ值确定其顺反式构象，其中，Pro¹为5.0、Pro³为3.3，说明它们为反式构象，而Pro²为10.0，说明它为顺式构象。利用高级Marfey法对比标准品衍生物和本发明化合物2氨基酸衍生物的分子量信息和保留时间(t_R)来确定氨基酸残基的手性，结果显示化合物2的所有氨基酸残基都是_L-构型。本发明环肽类化合物2的结构阐明示意图如图3所示，图3是环肽类化合物2的结构阐明示意图。其中，A为关键的2D NMR相关信号，B为MS/MS碎裂模式，C为HRESI-MS/MS谱图，D为基于LC-MS的高级Marfey法。

表3：环肽类化合物3的核磁共振谱数据(DMSO-d₆)

通过详细分析2D NMR(COSY、TOCSY和HMBC)谱，可以确定组成化合物3的7个氨基酸残基包括亮氨酸(2个)、脯氨酸(2个)、酪氨酸(1个)、丙氨酸(1个)和天冬氨酸(1个)。通过仔细分析HMBC、ROESY相关信号和ESI-MS/MS质谱数据共同确定氨基酸残基的连接顺序。其中，根据HMBC相关信号如Tyr-NH/Pro²-CO、Asp-NH/Tyr-CO、Leu²-NH/Ala-CO和Ala-NH/Leu¹-CO，可以确定两个结构片段：Leu²-Ala-Leu¹和Asp-Tyr-Pro²。根据ROESY相关信号如Asp-Hα/Pro¹-Hδ、Leu¹-Hα/Pro¹-Hα和Leu²-Hβ/Pro²-Hα，进而确定化合物3的结构为cyclo-(Pro¹-Leu¹-Ala-Leu²-Pro²-Tyr–Asp)。这一结果经ESI-MS/MS质谱数据验证。两个脯氨酸具有不同的Δδ_Cβ-Cγ值，其中，Pro¹为4.6，对应反式构象，Pro²为10.3，对应顺式构象。利用高级Marfey法对比标准品衍生物和本发明化合物3氨基酸衍生物的分子量信息和保留时间(t_R)来确定氨基酸残基的手性，结果显示化合物3的所有氨基酸残基都是_L-构型。本发明环肽类化合物3的结构阐明示意图如图4所示，图4是环肽类化合物3的结构阐明示意图。其中，A为关键的2D NMR相关信号，B为MS/MS碎裂模式，C为HRESI-MS/MS谱图，D为基于LC-MS的高级Marfey法。

表4：环肽类化合物4的核磁共振谱数据(DMSO-d₆)

通过详细分析2D NMR(COSY、TOCSY和HMBC)谱，可以确定组成化合物4的7个氨基酸残基包括亮氨酸(1个)、脯氨酸(3个)、异亮氨酸(2个)和酪氨酸(1个)。通过仔细分析HMBC、ROESY相关信号和ESI-MS/MS质谱数据确定残基之间的连接顺序。其中，根据HMBC相关信号Ile²-NH,Hα/Leu-CO确定一个关键的结构片段Ile²-Leu。HMBC谱中缺失的关键信号由ROESY相关信号补充，根据Ile²-Hα/Pro¹-Hα，Leu-NH/Tyr-Hα,β，Pro³-Hα/Ile¹-Hα，Tyr-NH/Pro³-Hα,γ，Pro³-Hα/Ile¹-Hα和Pro¹-Hα/Pro²-Hα确定化合物4的结构为cycloPro¹-Pro²-Ile¹-Pro³-Tyr-Leu-Ile²)。这一结果经ESI-MS/MS质谱数据验证。三个脯氨酸都具有较大的Δδ_Cβ-Cγ值，Pro¹、Pro²和Pro³分别为9.6、8.4和9.8，说明它们均是顺式构象。利用高级Marfey法对比标准品衍生物和本发明化合物4氨基酸衍生物的分子量信息和保留时间(t_R)来确定氨基酸残基的手性，结果显示化合物4的所有氨基酸残基都是L-构型。本发明环肽类化合物4的结构阐明示意图如图5所示，图5是环肽类化合物4的结构阐明示意图。其中，A为关键的2D NMR相关信号，B为MS/MS碎裂模式，C为HRESI-MS/MS谱图，D为基于LC-MS的高级Marfey法。

实施例2

体外抗肿瘤活性实验

初筛实验方法：采用CCK-8法评估本发明的环肽类化合物1-4的体外细胞毒活性。所用肿瘤细胞株为A2780(人卵巢癌细胞)、HCT-8(人结肠癌细胞)、NCI-H460(人肺癌细胞)、SW480(人结肠癌细胞)、PC-9(人肺癌细胞)和HepG2(人肝癌细胞)。其中，A2780、HCT-8和HepG2细胞使用DMEM培养基，NCI-H460、SW480和PC-9细胞使用RPMI 1640培养基。样品用DMSO溶解后低温保存，DMSO在最终体系中的浓度控制在不影响检测活性的范围之内，倍比稀释为1-100μg/mL的工作浓度。待细胞株培养至对数生长期时，取培养液将其制成单细胞悬液1×10⁶个/mL，并将该悬液加到96孔板中，每孔100μL。于5％CO₂，37℃培养箱中培养24h后，加入受试药物(本发明的环肽类化合物1-4)，每个样品设3个复孔，并以等体积培养基为阴性对照，相应浓度的DMSO为溶媒对照，顺铂cisplatin为阳性对照。于5％CO₂，37℃培养箱中培养48h后，每孔加入10μL CCK-8溶液。继续培养4h后，在450nm处测定各孔吸光值(OD值)，每株细胞测3次以上。根据细胞活力公式计算相应细胞活力(％)。对于抑制率大于50％的化合物，利用GraphPad Prism6.0软件计算其IC₅₀值，并以平均值(mean)±标准偏差(SD)的方式表示最终结果。

初筛实验结果：以20μM的浓度对六种人肿瘤细胞株进行初筛，结果显示，本发明的四种新环肽类化合物中，仅化合物1表现出明显的细胞毒活性，其对NCI-H460、SW480、PC-9和HepG2四种肿瘤细胞株的生长抑制率均远远大于50％，如图6所示，图6是本发明的环肽类化合物1-4对六种人肿瘤细胞株的体外增殖抑制作用示意图。

鉴于化合物1在初筛环节表现出较好的肿瘤细胞体外增殖抑制作用，故设浓度梯度范围0.01、0.03、0.10、0.30、1.00、3.00、10.00、20和40.00μM，进一步考察其活性剂量依赖关系。结果如表5所示，其中，化合物1对NCI-H460细胞的半数有效抑制浓度IC₅₀值仅为4.7±0.35μM。因此可用于制备抗肿瘤药物。本发明为研制新的抗肿瘤药物提供了新的先导化合物。

表5化合物1的细胞毒活性

以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。

Claims (6)

1.一种从海绵中提取的环肽类化合物，其特征在于，结构选自以下化合物1-4中的一种：

2.一种权利要求1所述的从海绵中提取的环肽类化合物的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

第一步，样本筛选：针对环肽类化合物丢失固定中性碎片的特点，将LC-QTRAP-MS/MS的PI扫描功能与IDA触发的EPI扫描技术相结合，建立选择性识别粗提物中环肽类特征结构的快速定位方法，从海绵样本库中筛选出富含环肽类化合物的海绵样本Reniochalina sp.；

第二步，溶剂提取：将第一步筛选到的海绵样本Reniochalina sp.剪碎成块后，分别加入等体积的MeOH和体积比为1:1的CH₂Cl₂/MeOH先后超声提取至少三次，合并提取液经减压浓缩得到粗提物；

第三步，分步萃取：先将第二步制备的粗提物混悬于90％的甲醇水中，用等体积的石油醚萃取3～5次，再将90％的甲醇水稀释成60％的甲醇水，用等体积的二氯甲烷萃取3～5次，合并萃取液经减压浓缩得到二氯甲烷萃取部分；

第四步，分离富集：将第三步制备的二氯甲烷萃取部分进行Sephadex LH-20凝胶柱层析，第一次以体积比为1:1的CH₂Cl₂/MeOH为洗脱剂，第二次以体积比为4:5:1的n-hexane/CH₂Cl₂/MeOH为洗脱剂，并通过质谱定位追踪的方式，将大分子量的化合物进行富集；采用ODS中压柱色谱分离，用10％-100％的MeOH/H₂O梯度洗脱，采用质谱追踪定位分析，获得一系列含有大分子量环肽类化合物的精细馏分；

第五步，筛选目标化合物：以m/z 211作为Pro-Leu/Ile片段的特征碎片离子，采用母离子扫描质谱法分析第四步制备的含有大分子量环肽类化合物的精细馏分，筛选出含Pro-Leu/Ile片段的目标化合物，结合分子量信息和色谱保留行为，通过质谱分析追踪定位目标化合物所在的精细馏分；

第六步，质谱导向分离：采用质谱导向的半制备高液相色谱法对第五步制备的精细馏分进行分离，从而得到化合物1-4。

3.根据权利要求2所述的从海绵中提取的环肽类化合物的提取方法，其特征在于，所述第六步中，质谱导向的半制备高液相色谱法的分离条件：化合物1，50-60％乙腈-水，流速6.0mL/min，在正离子模式下检测分子离子m/z 941.59；化合物2和化合物3，20-23％乙腈-水，流速6.0mL/min，在正离子模式下检测分子离子m/z 724.37和770.41；化合物4，28-35％乙腈-水，流速6.0mL/min，在正离子模式下检测分子离子m/z 794.48。

4.一种权利要求1所述的从海绵中提取的环肽类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的从海绵中提取的环肽类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤为肺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌。

6.根据权利要求5所述的从海绵中提取的环肽类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤细胞为人卵巢癌细胞A2780、人结肠癌细胞HCT-8、人肺癌细胞NCI-H460、人结肠癌细胞SW480、人肺癌细胞PC-9、人肝癌细胞HepG2。

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