CN115025276A - 一种含有阳离子盐的光交联微针材料及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种含有阳离子盐的光交联微针材料及其制备方法和应用，所述光交联微针材料是由水凝胶预聚体经紫外光固化后形成的微针阵列，水凝胶预聚体是含有甲基丙烯酸酐化明胶、壳聚糖季铵盐和光引发剂的水溶液，微针阵列包括基底以及分布在基底表面上的圆锥形微针。该光交联微针材料具有良好的生物相容性、生物可降解性、广谱抗菌性和止血效果，能显著缩短出血时间，减少出血量，尤其适用于腹腔脏器出血的医疗救护中，在临床上具有较大的应用潜力。

Description

一种含有阳离子盐的光交联微针材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种含有阳离子盐的光交联微针材料，以及其制备方法和在腹腔脏器止血中的应用。
背景技术
在战争、手术或交通事故等环境下，不可控的失血是造成伤者死亡的重要原因之一。出血过多而不加以控制，伤者将承受低体温、低灌注、凝血功能障碍、酸中毒和器官受损等诸多危害，重要脏器(心、肝、脾、肺、肾)破裂出血可直接威胁生命。止血是紧急医疗救治中的关键环节。传统的止血方式存在各自的局限性。例如：压迫止血适用于体表而不适合深部组织脏器止血；丝线结扎法仅适用于大血管止血，对小血管出血、弥漫性出血的控制效果不理想；药物止血仅能作为辅助止血手段，对腹腔实质性脏器的直接止血作用欠佳。生物材料是紧急止血的优选途径，一系列的止血材料已经被研制出来并逐步得到临床推广。然而，极少有止血材料是专门针对腹腔脏器出血而设计的。
理想的止血材料应具备以下优点：止血迅速、无毒性、广谱抗菌性、促进组织愈合、可生物降解、制作简单、便于储存和运输等。市面上常见的止血材料包括：纤维蛋白胶、明胶海绵、氧化纤维素、壳聚糖、藻酸钙和无机矿物类(如沸石、高岭土)。上述材料通过有效地富集血浆和血细胞、激活外源性和内源性凝血途径发挥止血作用。微针材料是一类新兴的材料，其特征为具有针头状阵列结构，可迅速穿透组织屏障。目前，微针材料的应用潜力还有待于深度发掘。
甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)是明胶(Gelatin)和甲基丙酸酐(MA)发生开环聚合反应的产物，由Van Den Bulcke于2000年首次合成。明胶来源于胶原蛋白，具有溶解性好、抗原性低等优点。此外，明胶还保持了精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列，有利于细胞的黏附、增殖和分化。明胶与MA发生共价交联反应，获得的GelMA克服了明胶在室温环境下的不稳定性问题。与此同时，GelMA还可以通过光聚合反应形成生物水凝胶，呈现出类似于细胞外基质的3D网络结构，生物相容性和生物活性得到了大幅度提升。
壳聚糖(CS)具有良好的抗菌性、生物相容性和生物可降解性，常用于复合水凝胶材料的制备和改性。然而，壳聚糖在溶解条件、应用环境等方面要求苛刻，较大程度地限制了其应用。壳聚糖分子链上含有羟基，可通过化学改性的方式改善其不足。近年来，壳聚糖季铵盐(HTCC)的化学合成方法与生物医学应用得到了广泛的研究。与壳聚糖相比，HTCC在水溶性和抗菌性等方面得到了显著提升。但截至目前，HTCC的止血研究处于起步阶段，尚无一种研发产品得到市场推广。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种含有阳离子盐(HTCC)光交联微针材料，其不仅具有良好的生物相容性、生物可降解性，且具有非常好的止血作用。
为了实现上述目的，本发明的技术方案具体为：
一种含有阳离子盐的光交联微针材料，是由水凝胶预聚体经紫外光固化后形成的微针阵列，其中水凝胶预聚体是含有甲基丙烯酸酐化明胶、壳聚糖季铵盐和光引发剂的水溶液，微针阵列包括基底以及分布在基底表面上的圆锥形微针。
优选地，圆锥形微针的形态参数为：针尖直径5-50μm，针高为400-1500μm，底座直径150-500-μm，中心间距500-2000-μm，微针的阵列数大于5×5。
优选地，在上述水凝胶预聚体中，壳聚糖季铵盐干重占甲基丙烯酸酐化明胶干重与壳聚糖季铵盐干重总量的5-50％。
优选地，光引发剂为2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(l2959)。
本发明进一步提供了制备上述光交联微针材料的方法，具体包括以下步骤：
步骤1、将甲基丙烯酸酐化溶液与壳聚糖季铵盐溶液混合，加入光引发剂；
步骤2、将步骤1所得混合液分批次浇筑至微针阵列模具中，每次浇筑均需离心脱气泡并浓缩；
步骤3、将模具置于紫外光源下，交联固化，脱模即得。
优选地，在步骤1中，甲基丙烯酸酐化溶液的质量分数为5-30％，壳聚糖季铵盐溶液的质量分数为0.5-5％，光引发剂的添加量为混合液质量的0.02-0.1％。
优选地，在步骤2中，微针阵列模具可采用光刻胶技术制备且材质为聚二甲基硅氧烷，该模具参数具体依据微针形态参数设置。
优选地，在步骤2中，离心脱除气泡的参数为：3000-10000rpm，每次5-15min，可根据气泡脱除情况多次离心。
优选地，在步骤2中，浓缩具体于28～35℃下处理2-3h，并每次浓缩至该批次新加入量减少至50％。
优选地，紫外光源的波长为200-400nm，功率为50-500W；交联固化的时间为3-30min。
GelMA和HTCC均为生物相容性的和生物可降解的高分子材料，但是HTCC为水溶性高分子材料，单一成分难以成型。本发明利用GelMA良好的成型性和可加工性，构建半互穿网络水凝胶结构(如图1所示)，以GelMA交联形成的分子笼为骨架，将HTCC约束于分子笼内。GelMA和HTCC虽然均可以激活外源性凝血途径，然而其作用强度较弱，与其他高分子材料相比无显著优势。本发明将二者构成的水凝胶结构制备成微针阵列贴片，不仅可以传导外力封闭出血位点，更重要的是，微针阵列穿透组织屏障，插入到出血位点内部(见图1所示)，此时分子笼内带正电荷的HTCC可迅速中和红细胞膜的负电荷，使血液处于高凝状态，且HTCC和GelMA协同作用激活外源性凝血途径，加速血凝块形成；即本发明中的微针材料创新型的通过物理和生物途径联用的止血过程，显著提高了材料的止血性能。
本发明的有益效果为：
1)本发明采用GelMA和HTCC制备的微针材料，不仅有效克服了单一组分存在的性能缺陷，且从生物相容性、生物可降解性、广谱抗菌性、止血效果等方面更好地满足了止血材料的临床需求，故在医疗器械市场上具有更大的竞争力；
2)本发明通过调节GelMA和HTCC的质量比可得到一系列生物相容性、广谱抗菌性和止血活性各异的微针材料，且该微针材料制备工艺简单，所得材料稳定性强、重复性好，适合工业化生产；
3)本发明的微针材料不仅可以控制活动性出血，还可以牢固黏附于创面上防止二次出血；而且体内止血实验结果表明，本发明所获得的微针材料可以有效减少肝脏破裂的出血量和出血时间，并且具有很低的血液毒性和细胞毒性，特别适用于腹腔脏器出血的医疗救护，也可以用于伤口敷料、皮肤缝合器和透皮给药。
附图说明
图1为本发明提供的微针材料的制备和应用原理示意图；
图2为本发明制备的微针材料(GHCH-10)在不同放大倍率下的形貌图；
图3为本发明制备的微针材料(GHCH-n,n＝0,5,10,15)的体外生物相容性评价结果图。
图4为本发明制备的微针材料(GHCH-n,n＝0,5,10,15)的体内生物相容性评价结果图；
图5为本发明制备的微针材料(GHCH-n,n＝0,5,10,15)的广谱抗菌性评价结果图；
图6为本发明制备的微针材料(GHCH-10)的体内止血实验结果图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合具体实施例进一步阐明本发明的内容。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
实施例1
本实施例提供了一种微针材料，其制备过程具体如下：
(1)水凝胶预聚体的制备：将GelMA加入到去离子水中，50℃加热搅拌得到质量分数为20％的GelMA溶液；同样方法得到质量分数为2％的HTCC溶液。将GelMA溶液和HTCC溶液混合，并使混合溶液中HTCC干重占总溶质干重(即GelMA干重和HTCC干重之和)的5％。然后向混合溶液中加入光引发剂l2959，其添加量为混合溶液总质量的0.05％，再次混合均匀。
(2)紫外光源下交联固化：根据微针的形态参数，采用光刻胶技术制备PDMS微针阵列模具(针高800μm，底座直径240μm，针尖直径10μm，中心间距700μm，微针的阵列数13×13)。将水凝胶预聚体滴加到微针阵列模具中，在5000rpm条件下离心10min除去气泡。将模具置于30℃恒温箱中浓缩3h(应避免浓缩过久致使模具见底，浓缩过程基本不会导致GelMA和HTCC损失)。取出模具，再次滴加溶液，并再次离心脱气泡后，在30℃恒温箱中浓缩2h。然后转移至波长365nm、功率500W的紫外源下照射5min，溶液发生化学交联反应而固化。将微针模具置于室温下干燥过夜，脱模后得到成型的微针材料(记为GHCH-5)。
实施例2
本实施例中的微针材料与实施例1的不同之处在于，步骤(1)的混合溶液中，HTCC干重占总溶质干重的10％。其他同实施例1一致，所得微针材料记为GHCH-10。
实施例3
本实施例中的微针材料与实施例1的不同之处在于，步骤(1)的混合溶液中，HTCC干重占总溶质干重的15％。其他同实施例1一致，所得微针材料记为GHCH-15。
对比例1
本实施例中的微针材料与实施例1的不同之处在于，步骤(1)的水凝胶预聚体中不含有HTCC。其他同实施例1一致，所得微针材料记为GHCH-0。
以实施例2制备的GHCH-10为样本，采用数码相机(iPhone 12,美国)拍摄微针材料的实物照片；采用金相显微镜(Axio Oberver A1m，蔡司，德国)观察微针材料的局部形貌；将样本喷金，采用扫描电子显微镜(Verios XHR，FEI，美国)仔细观察微针材料的形貌结构。检测结果具体如图1所示，一系列微针均匀分布于基座上，形成微针阵列。微针呈现圆锥状，底面粗，尖端细，有利于穿透皮肤和组织屏障。
对实施例和对比例制备的微针材料进一步做如下评价(以下测试均获得武汉大学动物福利与伦理委员会的批准)：
1.微针材料的溶血率和细胞毒性测试。
SD大鼠，体重180-200g，购于湖北省安评中心。采用异氟烷吸入麻醉动物，将动物固定于实验台面上，行心脏直视下采血术，抗凝剂选用3.8wt％枸缘酸钠溶液。取10mL新鲜抗凝全血，在1000rpm条件下离心10min，弃去血浆和白膜层。采用生理盐水洗涤沉淀4-5次，获得单纯的红细胞。调节红细胞悬液的体积分数至20％，置于4℃冰箱冷藏备用。
以微针材料(GHCH-n,n＝0,5,10,15)为实验组，置于15mL离心管中。加入10mL生理盐水和0.5mL红细胞悬液，轻摇混匀，置于37℃水浴中保温60min。无菌生理盐水作为阴性对照组，蒸馏水作为阳性对照组，每组设定3个重复样品。将样品在3000rpm条件下离心10min，取200μL上清液加入到96孔培养板中，采用多功能酶标仪(Multiskan SkyHigh，赛默飞世尔，中国)检测540nm处吸光度(OD)值。溶血率通过如下公式计算得到：
Figure BDA0003706135500000071
噻唑蓝实验的步骤如下：按照国标ISO10993-12:2007制备微针材料的浸提液。常规培养骨髓间充质干细胞(BMSC)。将BMSC接种于96孔组织培养板内，密度为3000个/孔。向每孔中加入200μL浸提液，继续培养72h。正常培养基作为空白对照组。每隔24h取出一块96孔板，加入20μL噻唑蓝试剂，4h后弃去培养基，加入150μL二甲基亚砜。避光震荡10min后，采用多功能酶标仪(Multiskan SkyHigh，赛默飞世尔，中国)检测490nm处吸光度(OD)值，经统计得出BMSC的增殖趋势。
图2为微针材料(GHCH-n,n＝0,5,10,15)的溶血率(左图)和细胞毒性试验(右图)结果。如图所见，GHCH-n(n＝0,5,10,15)的溶血率均显著低于5％，其中GHCH-10的溶血率与GHCH-0接近。随着n由0增加至15，BMSC的增殖速率呈现出放缓的趋势，这种现象可能是由于HTCC存在轻微的细胞毒性。因此，微针材料中HTCC的含量不宜过大。生物医用材料并不要求完全无毒性，其相对细胞增殖率应不低于80％，而GHCH-n(n＝0,5,10,15)较好的达到了上述标准。
2.微针材料的体内生物相容性评价。
采用异氟烷吸入麻醉SD大鼠。无菌条件下将微针材料(GHCH-n,n＝0,5,10,15)移植入大鼠腹腔，并通过缝合线固定于大鼠的腹壁上，术后常规饲养。2周后处死动物，采用眼科剪将微针材料及包膜组织一同取下，然后在4wt％多聚甲醛溶液中固定48h。HE染色实验参照通用的试剂盒说明书进行，染色结果采用全自动数字玻片扫描与分析系统(AperioVERSA 8，莱卡，德国)进行观察并同步记录。通过炎性细胞浸润的程度评价微针材料的体内生物相容性。
图3为微针材料(GHCH-n,n＝0,5,10,15)体内生物相容性评价的结果。如图可见，高倍镜下GHCH-0组炎性浸润程度最轻，GHCH-10和GHCH-5组次之，GHCH-15组最重。GHCH-15组可见大量的炎性细胞和脓腔形成，因此被淘汰。而GHCH-0，GHCH-5和GHCH-10仍然具备体内应用的价值和潜力。
3.微针材料的抗菌性能测试。
以大肠杆菌(E.coli)作为革兰阴性菌代表、金黄色葡萄球菌(S.aureus)作为革兰阳性菌代表，分别进行抗菌性能测试。挑取细菌单克隆，转移至LB液体培养基中，震荡培养过夜。将菌液在3000rpm条件下离心10min,弃去培养基。重悬细菌，调整菌液密度至1×106CFU/mL。以微针材料(GHCH-n,n＝0,5,10,15)为实验组，置于15mL离心管中，加入10mL菌液，然后转移至恒温摇床内震荡培养。正常LB溶液作为阴性对照组，含抗生素LB溶液作为阳性对照组。每隔一段时间，取出10μL菌液，采用微量分光光度计(NanoDropTM One，赛默飞世尔，中国)检测600nm处吸光度(OD)值，经统计得出细菌的增殖曲线。
图4为微针材料(GHCH-n,n＝0,5,10,15)广谱抗菌性评价的结果。由图可见，微针材料可以有效地抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的增殖能力，随着季铵化甲壳素含量增加，微针材料的广谱抗菌性逐渐增强。其原因在于，HTCC具有两亲性长链分子结构，其疏水端可插入细菌细胞膜上致使细菌裂解死亡。HTCC的抗菌机制不涉及细胞内酶促反应，不会导致细菌耐药性的发生。
4.微针材料的腹腔脏器止血效果评价。
新西兰兔，体重2.5-3.0kg，购于湖北省安评中心。采用异氟烷麻醉动物，将其固定于实验台面上。消毒皮肤，沿腹白线打开腹腔，清除腹腔少量积液，充分暴露腹腔脏器。
构建腹腔脏器大出血模型，包括肝脏模型、肾脏模型和脾脏模型。针对肝脏和肾脏模型，我们采用50mL注射器的粗针头进行穿刺，深度控制在0.4-0.5cm左右。脾脏的体积较小，我们采用眼科剪在其表面做一长约1cm，深度约0.2cm的纵行切口。术后迅速采取止血措施。
基于前期生物相容性和广谱抗菌性评价的结果，我们优选出GHCH-10微针贴片作为最佳的研究对象，开展体内止血效果研究。以医用纱布作为阴性对照组，商品化明胶止血海绵作为阳性对照组，另设置空白对照组。比较各组的出血时间和出血量。
图5为实施例1所获得的微针贴片(GHCH-10)体内止血实验的结果。如图所见，GHCH-10微针贴片成功地应用于家兔腹腔脏器大出血的医疗救护中。
以肝脏模型为例，空白组、阴性对照组、阳性对照组和GHCH-10组的出血时间如下表所示：
Figure BDA0003706135500000091
表中，与空白组相比，$P<0.05；与阴性对照组相比，#P<0.05。
GHCH-10微针材料的止血效果显著优于医用纱布(P<0.05)，与商品化明胶止血海绵相当(P>0.05)。
本发明所列举的各原料，以及本发明各原料的上下限、区间取值，以及工艺参数的上下限、区间取值都能实现本发明，在此不一一列举实施例。
以上所述是本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种含有阳离子盐的光交联微针材料，其特征在于：所述光交联微针材料是由水凝胶预聚体经紫外光固化后形成的微针阵列，所述水凝胶预聚体是含有甲基丙烯酸酐化明胶、壳聚糖季铵盐和光引发剂的水溶液，所述微针阵列包括基底以及分布在基底表面上的圆锥形微针。
2.根据权利要求1所述的光交联微针材料，其特征在于：所述微针的形态参数为：针尖直径5-50μm，针高为400-1500μm，底座直径150-500μm，中心间距500-2000μm。
3.根据权利要求1所述的光交联微针材料，其特征在于：在所述水凝胶预聚体中，壳聚糖季铵盐干重占甲基丙烯酸酐化明胶干重与壳聚糖季铵盐干重总量的5-50％。
4.根据权利要求1所述的光交联微针材料，其特征在于：所述光引发剂为2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮。
5.如权利要求1～4任一权利要求所述光交联微针材料的制备方法，其特征在于：通过以下过程得到：
步骤1、将甲基丙烯酸酐化溶液与壳聚糖季铵盐溶液混合，加入光引发剂；
步骤2、将步骤1所得混合液分批次浇筑至微针阵列模具中，每次浇筑后均需离心脱气泡并浓缩；
步骤3、将模具置于紫外光源下，交联固化，脱模即得。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：在所述步骤1中，甲基丙烯酸酐化溶液的质量分数为5-30％，壳聚糖季铵盐溶液的质量分数为0.5-5％，光引发剂的添加量为混合液质量的0.02-0.1％。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤2所述微针阵列模具采用光刻胶技术制备且材质为聚二甲基硅氧烷。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤2所述离心的参数为：3000-10000rpm，每次5-15min；步骤2所述浓缩是于28～35℃下处理2-3h，且每次浓缩至新加入量减少至50％。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述紫外光源的波长为200-400nm，功率为50-500W；所述交联的时间为3-30min。
10.如权利要求1所述的光交联微针材料在制备腹腔脏器止血药物或医疗器具中的应用。
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