CN113827775B - 一种人工羊膜骨滑膜及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种人工羊膜骨滑膜及其制备方法，该人工羊膜骨滑膜包括：内滑膜层和外滑膜层，外滑膜层包覆于所述内滑膜层外周，内滑膜层和外滑膜层之间填充有羊膜液，内滑膜层为加载缓释药物的高分子生物材料，外滑膜层为羊膜基底膜或液化再固化的羊膜基底膜液表层。本发明的人工羊膜骨滑膜，内滑膜层为加载缓释药物的高分子生物材料，外滑膜层为羊膜基底膜或液化再固化的羊膜基底膜液表层；内滑膜层的载缓释药物作用于精准作用于膝关节；外滑膜层可实现快速内皮化并且阻隔钙盐沉积，提升抗钙化性能并保留其无免疫原性，阻止血液成分和组织液成分渗入、钙盐的沉积及血栓的形成，延长使用时间。

Description

一种人工羊膜骨滑膜及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医学材料技术领域，尤其涉及一种人工羊膜骨滑膜及其制备方法。
背景技术
滑膜是关节囊的内层，淡红色，平滑闪光，薄而柔润，由疏松结缔组织组成。关节腔内的所有结构，除关节软骨、半月软骨板以外均为滑膜所包裹。滑膜分泌滑液，在关节活动中起重要作用。正常滑膜分为两层，即薄的细胞层(内腔层)和血管层(内膜下层)，贴附于非关节面部分，覆盖于关节囊内的骨面上。膝关节作为保持平衡的部位，使人能够用两只脚支承原本应用四只脚支承的人的体重而站立不摔倒，故膝关节随着上年纪最容易发生退行性变化。此外，经常发生的膝关节疾病，严重的时候导致运动障碍。
常规的治疗药物和治疗方法表现为治疗效果不明显，治疗周期长，亦或者只能减轻患者的痛楚和症状。手术置换骨滑膜是严重膝关节骨滑膜损伤采用的治疗方式。人工骨滑膜耐用，但需终身服用抗凝药物。生物骨滑膜具备与骨滑膜力学性能且生物相容性优于机械瓣膜，且患者仅需要短期或不服用抗凝药物。但是生物骨滑膜易钙化，耐久性差，存在一定的免疫原性。同时，目前的生物骨滑膜力学强度不足难以对身体进行支撑。
基于目前的骨滑膜存在的技术缺陷，有必要对此进行改进。
发明内容
有鉴于此，本发明提出了一种人工羊膜骨滑膜及其制备方法和应用，以解决或部分解决现有技术中存在的技术问题。
第一方面，本发明提供了一种人工羊膜骨滑膜，包括：内滑膜层和外滑膜层，所述外滑膜层包覆于所述内滑膜层外周，所述内滑膜层和外滑膜层之间填充有羊膜液，所述内滑膜层为加载缓释药物的高分子生物材料，所述外滑膜层为羊膜基底膜或液化再固化的羊膜基底膜液表层。
第二方面，本发明还提供了一种人工羊膜骨滑膜的制备方法，包括以下步骤：
将加载缓释药物的高分子生物材料置于含有碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液浸泡；
将羊膜基底膜或羊膜基底膜液置于含有氨基基团小分子物质的水溶液中浸泡；
将浸泡后的高分子生物材料、浸泡后的羊膜基底膜或羊膜基底膜液置于羊膜液中，交联反应后即得人工羊膜骨滑膜。
优选的是，所述的人工羊膜骨滑膜的制备方法，所述内滑膜层的制备方法为：将高分子生物材料浸泡于含有缓释药物的水溶液中60～80h。
优选的是，所述的人工羊膜骨滑膜的制备方法，所述高分子生物材料包括细胞外基质、脱细胞基质、胶原蛋白、纤维蛋白、明胶、壳聚糖、葡聚糖、硫酸软骨素、透明质酸、壳聚糖聚合水凝胶中的至少一种。
优选的是，所述的人工羊膜骨滑膜的制备方法，所述高分子生物材料为壳聚糖聚合水凝胶，所述壳聚糖聚合水凝胶的制备方法为：将明胶、壳聚糖和聚乙烯醇溶解于水制成混合溶液，再加入交联剂搅拌均匀即制备得到壳聚糖聚合水凝胶。
优选的是，所述的人工羊膜骨滑膜的制备方法，混合溶液中明胶的质量分数为1～48％，混合溶液中壳聚糖的质量分数为1～48％，混合溶液中聚乙烯醇的质量分数为0.5～2％，所述交联剂为戊二醛。
优选的是，所述的人工羊膜骨滑膜的制备方法，所述羊膜基底膜液的制备方法为：将羊膜基底膜粉碎后加入胰蛋白酶或核酸酶进行酶解，然后溶解于羊膜液中，即得羊膜基底膜液。
优选的是，所述的人工羊膜骨滑膜的制备方法，所述羊膜基底膜的制备方法为：将羊膜经过分离纤维母细胞层、海绵层、上皮细胞层和致密层，然后脱水、去细胞化后用含有青霉素、链霉素的生理盐水洗涤。
优选的是，所述的人工羊膜骨滑膜的制备方法，去细胞化具体为：将脱水后的羊膜置于去细胞化试剂中进行处理，其中，所述去细胞化试剂包括去垢剂、表面活性剂、核酸酶、胰蛋白酶中的至少一种。
优选的是，所述的人工羊膜骨滑膜的制备方法，将浸泡后的高分子生物材料、浸泡后的羊膜基底膜或羊膜基底膜液置于羊膜液中，交联反应20～24h，然后置于200～300r/min的水中清洗2～4h即得人工羊膜骨滑膜；
含有碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液中碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔浓度之和为0.1～0.9M，且碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:(1～2)；
所述氨基基团小分子物质包括天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸中的至少一种；
所述含有氨基基团小分子物质的水溶液的质量浓度为1～5％。
本发明的一种人工羊膜骨滑膜及其制备方法和应用相对于现有技术具有以下有益效果：
(1)本发明的人工羊膜骨滑膜，外滑膜层包覆于内滑膜层外周，内滑膜层和外滑膜层之间形成液体腔，液体腔中填充有羊膜液，内滑膜层为加载缓释药物的高分子生物材料，外滑膜层为羊膜基底膜或液化再固化的羊膜基底膜液表层；内滑膜层的载缓释药物作用于精准作用于膝关节；外滑膜层可实现快速内皮化并且阻隔钙盐沉积，提升抗钙化性能并保留其无免疫原性，阻止血液成分和组织液成分渗入、钙盐的沉积及血栓的形成，延长使用时间；
(2)本发明的人工羊膜骨滑膜的制备方法，加载缓释药物的高分子生物材料置于含有碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液浸泡后，内滑膜层上的羧基和羊膜基底膜或羊膜基底膜液表层上多个氨基基团小分子物质的氨基基团发生化学交联反应制备成人工骨滑膜，其中，碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺作为交联剂，通过化学缩合作用提供更多的交联位点来提高人工骨滑膜的力学强度，提高对身体的支撑性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的人工羊膜骨滑膜的结构示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
本申请实施例提供了一种人工羊膜骨滑膜，如图1所示，包括内滑膜层2和外滑膜层1，外滑膜层1包覆于内滑膜层2外周，内滑膜层2和外滑膜层1之间填充有羊膜液3，内滑膜层2为加载缓释药物的高分子生物材料，外滑膜层1为羊膜基底膜或液化再固化的羊膜基底膜液表层。
需要说明的是，本申请实施例的人工羊膜骨滑膜，外滑膜层1包覆于内滑膜层2外周，内滑膜层2和外滑膜层1之间形成液体腔，液体腔中填充有羊膜液3，内滑膜层2为加载缓释药物的高分子生物材料，外滑膜层1为羊膜基底膜或液化再固化的羊膜基底膜液表层。内滑膜层2的载缓释药物作用于精准作用于膝关节；外滑膜层1可实现快速内皮化并且阻隔钙盐沉积，提升抗钙化性能并保留其无免疫原性，阻止血液成分和组织液成分渗入、钙盐的沉积及血栓的形成，延长使用时间。
具体的，液化再固化的羊膜基底膜液表层的制备方法为：将羊膜基底膜液置于含有氨基基团小分子物质的水溶液中浸泡得到。
第二方面，本发明还提供了一种人工羊膜骨滑膜的制备方法，包括以下步骤：
S1、将加载缓释药物的高分子生物材料置于含有碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液浸泡；
S2、将羊膜基底膜或羊膜基底膜液置于含有氨基基团小分子物质的水溶液中浸泡；
S3、将浸泡后的高分子生物材料、浸泡后的羊膜基底膜或羊膜基底膜液置于羊膜液中，交联反应后即得人工羊膜骨滑膜。
本申请实施例的人工羊膜骨滑膜的制备方法，加载缓释药物的高分子生物材料即为内膜层；羊膜基底膜液置于含有氨基基团小分子物质的水溶液中浸泡后羊膜基底膜液表层，内滑膜层置于含有碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液浸泡后，内滑膜层上的羧基和羊膜基底膜或羊膜基底膜液表层上多个氨基基团小分子物质的氨基基团发生化学交联反应制备成人工骨滑膜，其中，碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺作为交联剂，通过化学缩合作用提供更多的交联位点来提高人工骨滑膜的力学强度，提高对身体的支撑性。
在一些实施例中，氨基基团小分子物质包括天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸中的至少一种；
含有氨基基团小分子物质的水溶液的质量浓度为1～5％。
在一些实施例中，加载缓释药物的高分子生物材料内滑膜层的制备方法为：将高分子生物材料浸泡于含有缓释药物的水溶液中60～80h。
具体的，药物包括抗感染药物、抗炎药物、抑菌药物中的至少一种。
在一些实施例中，高分子生物材料包括细胞外基质、脱细胞基质、胶原蛋白、纤维蛋白、明胶、壳聚糖、葡聚糖、硫酸软骨素、透明质酸、壳聚糖聚合水凝胶中的至少一种。
在一些实施例中，高分子生物材料为壳聚糖聚合水凝胶，壳聚糖聚合水凝胶的制备方法为：将明胶、壳聚糖和聚乙烯醇溶解于水制成混合溶液，再加入交联剂搅拌均匀即制备得到壳聚糖聚合水凝胶。
在上述实施例中，壳聚糖聚合水凝胶的分散相介质是水，它是由水溶性分子经过交联后形成的，能够在水中溶胀并且爆出大量水分而不溶解的胶态物质。它能够吸收大量的水分显著溶胶，并且在溶胀之后能够继续保持原有结构而不被溶解。
在一些实施例中，混合溶液中明胶的质量分数为1～48％，混合溶液中壳聚糖的质量分数为1～48％，混合溶液中聚乙烯醇的质量分数为0.5～2％，交联剂为戊二醛。
在一些实施例中，羊膜基底膜液的制备方法为：将羊膜基底膜粉碎后加入胰蛋白酶或核酸酶进行酶解，然后溶解于羊膜液中，即得羊膜基底膜液。
在一些实施例中，羊膜基底膜的制备方法为：将羊膜经过分离纤维母细胞层、海绵层、上皮细胞层和致密层，然后脱水、去细胞化后用含有青霉素、链霉素的生理盐水洗涤。
在一些实施例中，将脱水后的羊膜置于去细胞化试剂中进行处理，其中，去细胞化试剂包括去垢剂、表面活性剂、核酸酶、胰蛋白酶中的至少一种。
在一些实施例中，将浸泡后的高分子生物材料、浸泡后的羊膜基底膜或羊膜基底膜液置于羊膜液中，交联反应20～24h，然后置于200～300r/min的水中清洗2～4h即得人工羊膜骨滑膜；
含有碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液中碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔浓度之和为0.1～0.9M，且碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:(1～2)；
氨基基团小分子物质包括天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸中的至少一种；
含有氨基基团小分子物质的水溶液的质量浓度为1～5％。
具体的，本申请中所用的羊膜和羊膜基底膜还可以采用人工合成羊膜和人工合成羊膜基底膜。
以下进一步以具体实施例说明本申请的人工羊膜骨滑膜的制备方法。
实施例1
本申请实施例提供了一种人工羊膜骨滑膜的制备方法，包括以下步骤：
S1、羊膜的获取：在无菌环境中获取胎膜，用含有青霉素、链霉素和青霉素的生理盐水浸泡30min，洗涤数次冲净血迹，再将羊膜从胎盘的绒毛膜上钝性分离后，将其上表面平铺于消毒的乙酸纤维素膜上，备用；
S2、羊膜基底膜的获取：将羊膜经过分离纤维母细胞层、海绵层、上皮细胞层和致密层，然后脱水、去细胞化后用含有青霉素、链霉素的生理盐水洗涤；
S3、将明胶、壳聚糖和聚乙烯醇溶解于水制成混合溶液，再加入交联剂搅拌均匀制备得到壳聚糖聚合水凝胶；其中，混合溶液中明胶的质量分数为24％，混合溶液中壳聚糖的质量分数为24％，混合溶液中聚乙烯醇的质量分数为1％，交联剂为戊二醛，交联剂的加入量为混合溶液质量的1％；
S4、将制得的壳聚糖聚合水凝胶浸泡在含有缓释药物的水性溶液中浸泡72h制得加载缓释药物的壳聚糖聚合水凝胶；其中，药物为抗炎药物，含有缓释药物的水性溶液的质量浓度为5％；
S5、将加载缓释药物的壳聚糖聚合水凝胶置于含有碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液浸泡24h；水溶液中碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔浓度之和为0.6M，且碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:1；
S6、将羊膜基底膜置于质量浓度为3％的赖氨酸的水溶液中浸泡24h；
S7、将浸泡后的壳聚糖聚合水凝胶、浸泡后的羊膜基底膜置于羊膜液中，交联反应22h，然后置于250r/min的水中清洗2h即得人工羊膜骨滑膜。
性能测试
体外细胞实验测试实施例1中制备得到的人工羊膜骨滑膜的细胞毒性。
细胞毒性测试具体为：取对数生长期的小鼠成纤维细胞接种于96孔培养板中，每孔接种1.5/mL×104/mL的细胞悬液200μL，培养24小时。细胞毒性测试采用MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒进行测试：实验分为实验组和阳性对照组，实验组为是实施例1制备的人工羊膜骨滑膜，阳性对照组是市场购买的人工骨滑膜，将实验组和对照组按照试剂盒的步骤操作，最后用酶标仪测定570nm处的吸收度。计算细胞相对增殖百分率(RGR)，评定细胞毒性级别，结果如表1所示。
表1-细胞毒性实验结果
Figure BDA0003319657170000081
从上表1中可以看出，实验组的细胞毒性为0-1级，明显低于阳性对照组，安全性能明显提高。
体外细胞实验测试实施例1中制备得到的人工羊膜骨滑膜的力学强度
实验分为实验组和阳性对照组，实验组为按照实施例1中的方法重复三次，制备得到三个人工羊膜骨滑膜，将三个人工羊膜骨滑膜样品制成50mm×8mm的哑铃状，三个样品分别记为实验组一、实验组二、实验组三；对照组为市场上购买的人工骨滑膜，将实验组和阳性对照组用材料力学检测仪固定样品两端，以5mm/min的速度进行拉伸，测算力学强度，结果如下表2所示。
表2-力学强度结果
Figure BDA0003319657170000082
从表2中可以看出，本发明制备得到的人工羊膜骨滑膜的平均力学强度为24.7±3N/mm2，与市场上购买的人工骨滑膜力学强度相当，满足使用要求。
上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种人工羊膜骨滑膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将加载缓释药物的高分子生物材料置于含有碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液浸泡；
将羊膜基底膜或羊膜基底膜液置于含有氨基基团小分子物质的水溶液中浸泡；
将浸泡后的高分子生物材料、浸泡后的羊膜基底膜或羊膜基底膜液置于羊膜液中，交联反应后即得人工羊膜骨滑膜；
所述加载缓释药物的高分子生物材料的制备方法为：将高分子生物材料浸泡于含有缓释药物的水溶液中60～80h；
所述高分子生物材料为壳聚糖聚合水凝胶，所述壳聚糖聚合水凝胶的制备方法为：将明胶、壳聚糖和聚乙烯醇溶解于水制成混合溶液，再加入交联剂搅拌均匀即制备得到壳聚糖聚合水凝胶；
混合溶液中明胶的质量分数为1～48％，混合溶液中壳聚糖的质量分数为1～48％，混合溶液中聚乙烯醇的质量分数为0.5～2％，所述交联剂为戊二醛；
将浸泡后的高分子生物材料、浸泡后的羊膜基底膜或羊膜基底膜液置于羊膜液中，交联反应20～24h，然后置于200～300r/min的水中清洗2～4h即得人工羊膜骨滑膜；
含有碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液中碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔浓度之和为0.1～0.9M，且碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:(1～2)；
所述氨基基团小分子物质包括天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸中的至少一种；
所述含有氨基基团小分子物质的水溶液的质量浓度为1～5％。
2.如权利要求1所述的人工羊膜骨滑膜的制备方法，其特征在于，所述羊膜基底膜液的制备方法为：将羊膜基底膜粉碎后加入胰蛋白酶或核酸酶进行酶解，然后溶解于羊膜液中，即得羊膜基底膜液。
3.如权利要求1所述的人工羊膜骨滑膜的制备方法，其特征在于，所述羊膜基底膜的制备方法为：将羊膜经过分离纤维母细胞层、海绵层、上皮细胞层和致密层，然后脱水、去细胞化后用含有青霉素、链霉素的生理盐水洗涤。
4.如权利要求3所述的人工羊膜骨滑膜的制备方法，其特征在于，去细胞化具体为：将脱水后的羊膜置于去细胞化试剂中进行处理，其中，所述去细胞化试剂包括去垢剂、表面活性剂、核酸酶、胰蛋白酶中的至少一种。
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