CN115015343A

CN115015343A - 一种全固态微型溶氧电极制作方法

Info

Publication number: CN115015343A
Application number: CN202210636056.0A
Authority: CN
Inventors: 夏建业; 范勐; 庄英萍
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2022-06-07
Filing date: 2022-06-07
Publication date: 2022-09-06
Anticipated expiration: 2042-06-07
Also published as: CN115015343B

Abstract

本发明为全固态微型溶氧电极制备方法，电极包括参考电极、工作电极以及对电极，通过四个步骤制备溶氧电极：镍铜沉积PCB板后，沉积金属到参考电极、工作电极与对电极；电极清洗烘干；获取参比电极；Nafion滴加至工作电极、参比电极及对电极表面，后烘干。本发明与传统的溶氧电极相比，具有体积小，易制造、改造的特点，使其可经过简单改造即可适用与不同的测试环境，并极大缩减制造成本；同时在制造工艺上替换传统电极中使用液态电解质而使用Nafion作为固态电解质提高电极的灵敏度减少响应时间。

Description

一种全固态微型溶氧电极制作方法

技术领域

本发明涉及电极制造技术领域，具体是全固态微型溶氧电极的制造领域。

背景技术

溶解氧在批量培养和各种生物反应器系统的细胞增殖中起着关键作用，与传统的插入式电极不同，微电极的监测部位更加灵活。由于生物反应器对无菌性的要求很高，在使用前往往需要进行高压灭菌。在选择材料和传感器的结构时，应充分考虑其承受灭菌过程的能力，这也是内填充液的电极的缺点之一。此外，水溶液中溶解氧的长期传感总是受到传感器表面生物膜形成的影响，这强烈影响了氧气向传感器薄膜的扩散。传统溶氧电极其体积相对较大，无法应用到更小的反应器中，如毫升级的反应器以及无法满足测量更小的取样量样品中的溶氧的要求。

发明内容

本实发明的目的在于提供一种全固态的微型溶氧电极的制作方法，通过该方法制作出的电极能够满足各种场景下的溶氧变化的测量。

本发明涉及一种全固态微型溶氧电极制备方法，其特征在于，电极包括参考电极、工作电极以及对电极，制备方法具体包括如下步骤：

镍铜沉积PCB板后，沉积金属到参考电极、工作电极与对电极；

电极清洗烘干；

获取参比电极；

Nafion 滴加至工作电极、参比电极及对电极表面，后烘干。

进一步地，参考电极由银沉积形成，所述工作电极由薄膜金沉积形成，所述对电极也是由薄膜金沉积形成。其中，本发明的全固态微型溶氧电极可制备成长度为40-50mm，宽度6-12mm，例如长度为45mm，宽度9mm。

进一步地，所述镍铜沉积PCB板后，沉积金属到参考电极、工作电极与对电极具体为：

首先，将铜沉积到PCB板上，沉积铜的厚度为200nm；

其次，在铜涂层基础上沉积镍涂层，镍涂层的厚度保持在20nm；

最后，在涂层上沉积参考电极、工作电极以及对电极。

进一步地，所述电极清洗烘干为采用超声波清洗和/或离子水清洗，在清洗之后采用烘箱烘干。

进一步地，所述电极清洗烘干具体为将电极置于75%的乙醇中进行30分钟的超声波清洗，超声波清洗后使用离子水清洗三次并在60℃烘箱中干燥。

进一步地，所述获取参比电极为银参比电极氯化即从原始的银电极中获得Ag/AgCl参比电极。

进一步地，所述获取参比电极具体为将电源的正极连接到银电极上，连通电源，电源的负极连接到银丝上，将正负电极放入到KCl溶液中，处理后将Ag/AgCl参比电极使用去离子水清洗并烘干。

进一步地，所述Nafion 滴加至工作电极、参比电极及对电极表面，后烘干具体为将10uL Nafion滴加至工作电极，参比电极及对电极表面，后将电极放在0.95真空度和60℃的真空干燥箱中2小时蒸发溶剂。

进一步地，将蒸发烘干后的电极温度进一步提升到80℃，继续处理2小时。

同时本发明还保护一种全固态微型溶氧电极，使用上述的方法制备，工作电极呈圆形，所述工作电极以及所述对电极呈弧形环绕设置在所述工作电极的周围；所述对电极的弧度要大于所述参考电极的弧度。

本发明提供一种体积较小的全固态溶氧电极的制作方法，该微型固态电极具有体积小，易制造、改造的特点，使其可经过简单改造即可适用与不同的测试环境，并极大缩减制造成本；同时在制造工艺上替换传统电极中使用液态电解质而使用Nafion作为固态电解质提高电极的灵敏度减少响应时间；针对该电极具体的热模测试环境，使用传统电极和微型溶解氧电极同时监测酵母发酵过程中溶解氧的变化来看，两者具有高度一致性，具有替换传统电极的潜力。

附图说明

图1为本发明固态溶氧电极结构示意图；

图2为本发明固态溶解氧电极的制作流程图。

图3为金属沉积流程图；

图4为电极清洗烘干流程图；

图5为获得参比电极流程图；

图6为Nafion滴加烘干流程图。

图7为反应器测试结果。

图8为酵母发酵结果。

图中：1、参考电极，2、工作电极，3、对电极。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围，下面结合实施例对本发明作进一步的描述。以下围绕溶氧电极以两个实施例来介绍，实施例1主要介绍溶氧电极主体结构，实施例2主要介绍溶氧电极的具体制作过程。

实施例1：

如图1所示，本发明的固态电极的结构主要包括三部分,一个参考电极1,一个工作电极2，一个对电极3，其中长度为45mm，宽度仅9mm。参考电极1由银沉积形成，工作电极2由薄膜金沉积形成，对电极3也是由薄膜金沉积形成。工作电极2、参考电极1以及对电极3均设置在PCB板的上端；工作电极2呈圆形，工作电极2以及对电极3呈弧形环绕设置在工作电极2的周围；对电极3的弧度要大于参考电极1的弧度，优选的对电极3的弧度是参考电极1弧度的5倍。本发明通过形成固态电极的特定方法来形成上述电极，从而生产用于微生物发酵的新型全固态微型溶氧电极。

随着各式各样的微型生物反应器被发明出来，对其中溶氧变化测量的需求逐渐增多，但传统电极体积较大，为了克服其无法适用跟多测量场景等缺点，打破主流传统电极占据发酵行业的领导地位及垄断，本发明提供一种全固态的微型溶氧电极，通过特定工艺方法制造这种电极，以满足工业化对电极的需求。

实施例2：

如图2所示，为了制造具有参考电极（具体为银参考电极）、工作电极（具体为薄膜金工作电极）、对电极（具体为金对电极）的三探针的全固态微型溶氧电极的制造方法，主要包括四个步骤，分别为镍铜沉积PCB板后，沉积金属到参考电极、工作电极与对电极；电极清洗烘干；获取参比电极；Nafion滴加至工作电极、参考电极及对电极表面，后烘干。每个步骤工艺参数以及具体数据的选择都是在多个实验基础上选择确定的，该微型溶氧电极具有体积小、易制造改造的特点，从而使其可经过简单改造即可适应不同的测试环境，并极大缩减制造成本。通过实验比对来调整制造电极的参数，从而达到制造高性能电极的目的。

镍铜沉积PCB板后，沉积金属到参考电极、工作电极与对电极。首先将铜沉积到PCB板上，沉积铜的厚度为200nm，提升PCB板与其他涂层的结合性，另外也有益于表层涂层的堆积。其次，在铜涂层基础上沉积镍涂层，镍涂层的厚度保持在20nm，在制品表层快速转化成一层特薄的钝化处理膜。在制作好涂层基础上，在涂层上沉积参考电极、工作电极以及对电极，具体过程如附图3所示。参考电极采用的沉积金属为银、工作电极以及对电极采用的沉积金属为金材料，对参考电极、工作电极以及对电极的沉积可以同时进行，也可以按照顺序先后进行。沉积过程中需要严格按照电极结构进行沉积，三电极探针的形状如附图1中所示。

参考电极、工作电极与对电极清洗烘干，具体流程参见附图4。电极的清洗采用超声波清洗和/或离子水清洗，在清洗之后为了保证电极干燥采用烘箱烘干。为了提高清洗的效果，本发明优选先后使用两种清洗方式，在多次实验基础上，综合清洗效果以及相关成本确定了最有的清洗方案为将电极置于75%的乙醇中进行30分钟的超声波清洗，超声波清洗后使用离子水清洗三次并在60℃烘箱中干燥。通过上述配置可以有效降低在大部分工况下沉积到电极上的污渍，同时也在保证清洁的情况下尽量的节约成本。

获取参比电极，具体流程见附图5，银参比电极氯化即从原始的银电极中获得Ag/AgCl参比电极。将电源的正极连接到银电极上，连通电源，电源的负极连接到银丝上，将正负电极放入到KCl溶液中，处理后将Ag/AgCl参比电极使用去离子水清洗并烘干。在综合考虑工业化实现方式，以及具体使用效果等多方面因素下，本发明使用电源为300mV的恒定电压电流源，使用的银丝直径为5mm，使用0.1molKCL溶液，清洗后放置在60℃烘箱中烘干。

Nafion 滴加至工作电极、参比电极及对电极表面，后烘干。相比于传统电极使用液态电解质，本发明使用Nafion作为固态电解质提高电极的灵敏度减少响应时间。具体为将10 uLNafion (Sigma 117)滴加至工作电极，参考电极及对电极表面，后将电极放在0.95真空度和60℃的真空干燥箱中2小时蒸发溶剂。为了增加Nafion薄膜的机械强度，将蒸发烘干后的电极温度进一步提升到80℃，继续处理2小时。为了验证全氟磺酸处理后电极能够有效减少响应时间，设计了反应器测试，如图7。

通过假设电极反应遵循一阶动力学，时间反应可以表示为一个恒定的时间值（

），定义为达到63%的C*的时间。溶解氧动力学可以通过一阶模型，加上一个时间延迟作为参数后，可以很好的进行拟合，结果如图7所示。

O₂电极的末端稍微浸泡在空气饱和的水中，以保持DO信号的最大水平。在电极旁边，用99.999%的N2净化纯水，以保持耗尽的DO条件，创造一个0 %的DO环境。然后，通过将O₂电极快速浸入100 %的DO溶液中来绘制反应曲线。经测量，切换时间小于0.5 s，这比电极的响应时间小得多。此外，在5升反应器系统内还评估了流量依赖性对溶解氧测量的影响。在恒定的溶解氧（8.05 mg/L）条件下，通过以50 mV/s的扫描速率从-300 mV到-500 mV的线性电压扫过，进行CV法测量。

克拉克型传感器的响应时间受到一些要素的影响，如膜的类型、膜的厚度、工作电极的面积以及膜与工作电极表面之间的间隙。与所使用的商业电极相比，本发明溶氧电极是一个全固体的DO电极，固体电解质和电极表面的选择性膜的总厚度小于2微米，减少了氧分子参与的电化学反应和物理三电极系统之间的距离。众所周知，DO电极显示出明显的滞后性，其动态响应通常由一阶响应和纯时间延迟的组合来很好地模拟，当从DO和气流速率的测量中估计呼吸速率和氧传递函数时，有必要使用气流速率的高激励。气流率的高激励意味着DO的快速变化。如果DO传感器的速度不快，估计值就会有偏差。图7中(a)显示了在大约25分钟的测量时间内，在三个周期的空气-氮气脉冲中由微电极测得的电流以及使用回归方程获得的相应的DO值。在溶解氧饱和度与零溶解氧时，电流偏差为1.79%，表明稳定性良好。对图7中(a)中数据的分析表明，从零溶解氧到90 %的饱和溶解氧所需的时间为100s，这并不意味着电极有很长的反应时间，因为反应器中溶解氧的变化速度不仅与电极的动力学有关，还与反应器的操作条件有关，如曝气量的大小、搅拌速度、搅拌叶轮的形状和分配器的类型等。τ_e可以通过将模型的动态响应与系统对已知输入变化的测量动态响应进行拟合而得到。因此，如图7中(b)所示，测量了传统电极和微型电极的电极动力学。微型电极和商业电极的τ_e分别为4.6 s和10.2 s。在各种脉冲实验中，如糖脉冲、氧脉冲和乙醇脉冲，往往伴随着DO的快速变化，较短的τ_e使得获得实时数据成为可能，从而更准确地反映出反应系统的真实溶解氧。同时，微型电极在制造成本方面具有明显的优势。对于在持续供应氧气的搅拌介质中的宏观电极来说，可能需要几分钟的时间才能使浓度梯度达到平衡，并且由此产生的扩散边界层会受到流动的影响。因此，测量的电流也与流量有关。在传统的克拉克氧电极中，这些问题是通过让浓度梯度主要在一个包含安培单元的内部空腔的膜上建立起来而规避的。然而，这种结构限制了传感器的反应时间，使传感器难以小型化。测试了该传感器的流量依赖性，并与由77mm²工作电极的铂金大电极组成的安培传感器在恒定溶氧浓度（8.05 mg/L）下的流量依赖性进行了比较。为了验证本文提出的电极测量得到的电流也具有流量依赖性，在不同的搅拌速率下进行了验证实验，如图7中(c)所示。在不同的速度下，电流的流量依赖性并不明显，误差在±5 %以内。可能的原因是表面积小，测量面垂直于水面，减少了气泡和旋转速度的影响，以及测量位置靠近壁面，液体流动较少。

针对该电极具体的热模测试环境，使用传统电极和微型溶氧电极同时监测酵母发酵过程中DO的变化来看，两者具有高度一致性，具有替换传统电极的潜力。具体见图8。

与纯水和盐溶液相比，发酵液系统具有相当复杂的环境，包含酵母细胞、各种底物和产物，以及不断变化的气相和液相水动力环境，这使得微电极的使用对DO测量的影响更加复杂。因此，有必要在冷模型实验的基础上验证微型DO电极在实际发酵过程中的应用的可行性。在分批培养过程中，由于指数增长的酵母对氧的需求不断增加，溶解氧浓度随时间逐渐下降。批发酵在接种后约23小时结束。从图8中(a)中可以看出，酵母的批量发酵显示出两个不同的阶段。从0小时到6.5小时（Batch I），酵母细胞优先使用反应器中的葡萄糖，作为快速作用的碳源，同时伴随着二氧化碳进化率（CER）的快速上升。伴随着葡萄糖的消耗，酵母产生大量的乙醇和副产品二氧化碳，以迅速产生NAD+，平衡细胞内的氧化还原环境。从6.5小时到23小时（Batch II），在酵母利用了葡萄糖后，开始利用产生的乙醇，与第一批相比，OUR的上升速度加快，同时DO迅速下降，见图8中(b)和(c）。呼吸商（RQ）反映了酵母对糖类的代谢情况。对于酵母来说，如果RQ>1，意味着一些葡萄糖被厌氧途径不完全氧化，意味着一些葡萄糖被厌氧途径不完全氧化，那么可能会产生乙醇（Batch I）。如果RQ<0.7，意味着没有足够的葡萄糖，乙醇可能作为碳源被代谢掉（Batch II）。在整个发酵周期中，DO从100 %下降到55 %，并在发酵结束时恢复到100 %。Nafion和空白微生物都是通过批量培养验证的。在批量培养之前，进行了两点原位校准（0-12.1 mg/L）。从图8中(b)可以看出，Nafion微电极的信号与Clark细胞的信号密切相关。同时，在1分钟的采样率下，由于批次II结束时酵母细胞凋亡导致的DO峰值在曲线中清晰可见，与传统的DO电极相比，代表了微型电极响应时间在捕捉反应系统内快速变化的相同性能。还可以看出，空白微型电极的信号比Nafion电极的信号含有更多的噪音。这可能是由于低电流水平加上环境的电磁干扰造成的。提高信噪比的方法是通过增加电极面积，从而提高测量的电流水平。用Nafion覆盖空白表面可以显著增加CV方法测量的电压，这有助于降低信噪比。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims

1.一种全固态微型溶氧电极制备方法，其特征在于，电极包括参考电极（1）、工作电极（2）以及对电极（3），制备方法具体包括如下步骤：

电极清洗烘干；

获取参比电极；

Nafion滴加至工作电极、参比电极及对电极表面，后烘干。

2.如权利要求1所述的全固态微型溶氧电极制备方法，其特征在于：所述参考电极（1）由银沉积形成，所述工作电极（2）由薄膜金沉积形成，所述对电极（3）由薄膜金沉积形成。

3.如权利要求2所述的全固态微型溶氧电极制备方法，其特征在于：所述镍铜沉积PCB板后，沉积金属到参考电极、工作电极与对电极具体为：

首先，将铜沉积到PCB板上，沉积铜的厚度为150-250nm，优选为200nm；

其次，在铜涂层基础上沉积镍涂层，镍涂层的厚度保持在16-24nm，优选为20nm；

最后，在涂层上沉积参考电极、工作电极以及对电极。

4.如权利要求1所述的全固态微型溶氧电极制备方法，其特征在于：所述电极清洗烘干为采用超声波清洗和/或离子水清洗，在清洗之后采用烘箱烘干。

5.如权利要求4所述的全固态微型溶氧电极制备方法，其特征在于：所述电极清洗烘干具体为将电极置于75%的乙醇中进行30分钟的超声波清洗，超声波清洗后使用离子水清洗三次并在60℃烘箱中干燥。

6.如权利要求2所述的全固态微型溶氧电极制备方法，其特征在于：所述获取参比电极为银参比电极氯化即从原始的银电极中获得Ag/AgCl参比电极。

7.如权利要求6所述的全固态微型溶氧电极制备方法，其特征在于：所述获取参比电极具体为将电源的正极连接到银电极上，连通电源，电源的负极连接到银丝上，将正负电极放入到KCl溶液中，处理后将Ag/AgCl参比电极使用去离子水清洗并烘干。

8.如权利要求1所述的全固态微型溶氧电极制备方法，其特征在于：所述Nafion 滴加至工作电极、参比电极及对电极表面，后烘干具体为将Nafion滴加至工作电极，参比电极及对电极表面，后将其放在0.95真空度和60℃的真空干燥箱中2小时蒸发溶剂。

9.如权利要求8所述的全固态微型溶氧电极制备方法，其特征在于：将蒸发烘干后的电极温度进一步提升到80℃，继续处理2小时。

10.一种全固态微型溶氧电极，使用权利要求1-9任意一项所述的方法制备得到，其特征在于所述工作电极（2）呈圆形，所述工作电极（2）以及所述对电极（3）呈弧形环绕设置在所述工作电极（2）的周围；所述对电极（3）的弧度要大于所述参考电极（1）的弧度。