CN115011587A - 降解土壤中复合多环芳烃的固载型粗酶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
降解土壤中复合多环芳烃的固载型粗酶及其制备方法，它涉及复合有机污染土壤领域，特别涉及一种固载型粗酶及其制备方法。本发明降解土壤中复合多环芳烃的固载型粗酶由酸改性的板栗内壳和白腐真菌的粗酶液制成；白腐真菌的粗酶液中包括铜离子溶液。制备方法：一、板栗内壳制成粉末材料；二、制改性生物炭；三、固载。本发明降解土壤中复合多环芳烃的固载型粗酶利用酸改性的板栗内壳作为固态负载体，改性的板栗内壳具有清晰的孔洞结构有利于白腐真菌粗酶液的负载、固定和保护，大大提升了白腐真菌粗酶在实际土壤修复环境中对多环芳烃的降解效果。
Description
技术领域
本发明涉及复合有机污染土壤领域，特别涉及一种固载型粗酶及其制备方法。
背景技术
2014年发布的《全国土壤污染状况调查公报》显示我国土壤环境状况总体不容乐观，城市土壤作为城市建设的自然基础，对于人类社会的生存发展至关重要。然而，随着石油、煤炭等化工企业搬离城市，以多环芳烃为主要污染物的遗留地土壤污染愈演愈烈，引起了一系列城市生态环境问题。
与利用细菌和真菌等微生物对多环芳烃的降解相比，酶降解多环芳烃的速度更快，即使在复杂的土壤环境条件下也能对多环芳烃有很好的降解效果。因而，利用酶对多环芳烃污染场地土壤的修复被认为是整个生物修复中最具潜力的修复方法。当前研究大多集中于对白腐真菌粗酶液中漆酶进行分离纯化，经分级沉淀、层析纯化后的纯漆酶应用于多环芳烃降解，但纯化后的酶制剂成本普遍偏高，而且不论是酶制剂，还是粗酶液在实际应用过程中对土壤环境中多环芳烃的降解效果都不理想。
发明内容
为了能够用于实际土壤修复并达到理想的多环芳烃的降解效果，本发明提供一种降解土壤中复合多环芳烃的固载型粗酶。
本发明降解土壤中复合多环芳烃的固载型粗酶由酸改性的板栗内壳和白腐真菌的粗酶液制成；白腐真菌的粗酶液中包括铜离子溶液。
进一步的，所述白腐真菌的粗酶液中铜离子的浓度是1mM～2mM。
进一步的，所述白腐真菌的粗酶液还包括乙腈、Tween 80和介体；其中，介体为HBT和紫脲酸，粗酶液中HBT的浓度是0.1mM～0.5mM，粗酶液中紫脲酸的浓度是0.5mM～1mM；粗酶液中乙腈的浓度是10％；粗酶液中Tween 80的浓度是1％。
本实施方式中乙腈作为助溶剂加入白腐真菌的粗酶液，Tween 80作为分散剂加入白腐真菌的粗酶液。
进一步的，所述白腐真菌的粗酶液中漆酶活性为10U/mL。
进一步的，所述白腐真菌的粗酶液的pH值为自然pH。
进一步的，所述白腐真菌的粗酶液由Coriolus versicolo菌株放入液体培养基然后置于25℃～31℃、120r/min-160r/min条件下培养12～18天，然后9000r/min～11000r/min离心10min，分离得到上清液，然后稀释制成；其中，1L液体培养基由15.00g～30.00g麸皮、0.40g～0.50g NH4Cl、0.20g KH2PO4、0.05g MgSO4·7H2O、0.01g CaCl2、1.00g吐温80、无机溶液1.00mL和余量的蒸馏水制成。
本实施方式中液体培养基自然pH。
本实施方式中1L无机溶液由3.00g MgSO4·7H2O、0.50g MnSO4·H2O、1.00g NaCl、0.10g FeSO4·7H2O、0.10g CoCl2、0.10g ZnSO4·7H2O、0.10g CuSO4·5H2O、0.01g KAl(SO4)2·12H2O、0.01g H3BO3、0.01g Na2MoO4·2H2O和余量的蒸馏水制成。
本发明降解土壤中复合多环芳烃的固载型粗酶按以下步骤制备：
一、板栗内壳洗涤后烘干，取出磨碎，制成粉末材料；
二、粉末材料放至于坩埚内，600℃热解3h，待冷却后取出加入柠檬酸溶液，再置于25～30℃、130～180r/min的摇床中震荡改性12～48h，制成改性生物炭；
三、将改性生物炭加入权利要求1～6所述白腐真菌的粗酶液中，然后置于25～30℃、130～180r/min摇床中震荡3h-48h，之后5000～10000r/min离心5～10min收集生物炭，即得到固载降解土壤中复合多环芳烃的固载型粗酶。
本发明降解土壤中复合多环芳烃的固载型粗酶利用白腐真菌胞外粗酶作为生物修复材料，其中白腐真菌胞外粗酶中包含漆酶在内的多种氧化还原酶，对底物的作用范围更宽泛，并存在多种天然介体成分。本发明降解土壤中复合多环芳烃的固载型粗酶利用酸改性的板栗内壳作为固态负载体，改性的板栗内壳具有清晰的孔洞结构有利于白腐真菌粗酶液的负载、固定和保护，大大提升了白腐真菌粗酶在实际土壤修复环境中对多环芳烃的降解效果。
附图说明
图1是具体实施方式六中菌株放入液体培养基然后置于25℃～31℃、120r/min-160r/min条件下培养35d过程中粗酶液中漆酶活性变化曲线图；
图2是实施例1中板栗内壳改性生物炭的微观结构图，图2A为×350图，图2B为×500图，图2C为×1100图；
图3是实施例1中板栗外壳改性生物炭的微观结构图，图3A为×350图，图3B为×500图，图3C为×1100图；
图4是具体实施方式九改性生物炭的微观结构图，图4A为×500图，图4B为×800图；
图5是实施例1中酸性改性板栗外壳生物炭的微观结构图，图5A为×500图，图5B为×800图；
图6是实施例1中碱性改性板栗内壳生物炭的微观结构图，图6A为×500图，图6B为×800图；
图7是实施例1中碱性改性板栗外壳生物炭的微观结构图，图7A为×500图，图7B为×800图；
图8是实施例1中稻壳生物炭的微观结构图，图8A为×500图，图8B为×800图；
图9是实施例1中玉米秸秆生物炭的微观结构图，图9A为×500图，图9B为×800图；
图10是实施例1多环芳烃污染土壤降解修复实验结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
具体实施方式一：本实施方式降解土壤中复合多环芳烃的固载型粗酶由酸改性的板栗内壳和白腐真菌的粗酶液制成；白腐真菌的粗酶液中包括铜离子溶液。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于：所述白腐真菌的粗酶液中铜离子的浓度是1mM～2mM。其他与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二的不同点在于：所述白腐真菌的粗酶液还包括乙腈、Tween 80和介体；其中，介体为HBT和紫脲酸，粗酶液中HBT的浓度是0.1mM～0.5mM，粗酶液中紫脲酸的浓度是0.5mM～1mM；粗酶液中乙腈的浓度是10％；粗酶液中Tween 80的浓度是1％。其他与具体实施方式一或二相同。
本实施方式中乙腈作为助溶剂加入粗酶液，Tween 80作为分散剂加入粗酶液。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一的不同点在于：所述白腐真菌的粗酶液中漆酶活性为10U/mL。其他与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一的不同点在于：所述白腐真菌的粗酶液的pH值为自然pH。其他与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一的不同点在于：所述白腐真菌的粗酶液由Coriolus versicolo菌株放入液体培养基然后置于25℃～31℃、120r/min-160r/min条件下培养12～18天，然后9000r/min～11000r/min离心10min，分离得到上清液，然后稀释制成；其中，1L液体培养基由15.00g～30.00g麸皮、0.40g～0.50g NH4Cl、0.20g KH2PO4、0.05g MgSO4·7H2O、0.01g CaCl2、1.00g吐温80、无机溶液1.00mL和余量的蒸馏水制成。其他与具体实施方式一至五之一相同。
本实施方式中液体培养基自然pH。
本实施方式中1L无机溶液由3.00g MgSO4·7H2O、0.50g MnSO4·H2O、1.00g NaCl、0.10g FeSO4·7H2O、0.10g CoCl2、0.10g ZnSO4·7H2O、0.10g CuSO4·5H2O、0.01g KAl(SO4)2·12H2O、0.01g H3BO3、0.01g Na2MoO4·2H2O和余量的蒸馏水制成。
Coriolus versicolor(云芝，别名为彩色云芝、变色云芝、彩绒革盖菌、杂色云芝菌、瓦菌、千层菌、彩绒栓菌)，本实施方式选用的Coriolus versicolor 5.161来源于东北林业大学环境微生物实验室，于2010年杜丽娜(东北林业大学)的硕士学位论文“高效降解多环芳烃白腐真菌菌种的筛选及降解特性”中公开使用。图1是本实施方式Coriolusversicolor放入本实施方式所述液体培养基然后置于28℃、135r/min条件下培养35d过程中粗酶液中漆酶活性变化曲线图；之后稀释，将粗酶液中漆酶活性稀释为10U/mL用于降解土壤中复合多环芳烃的固载型粗酶的制备。
具体实施方式七：本实施方式固载降解土壤中复合多环芳烃的固载型粗酶按以下步骤制备：
一、板栗内壳洗涤后烘干，取出磨碎，制成粉末材料；
二、粉末材料放至于坩埚内，600℃热解3h，待冷却后取出加入柠檬酸溶液，再置于25～30℃、130～180r/min的摇床中震荡改性12～48h，制成改性生物炭；
三、将改性生物炭加入具体实施方式一至六之一所述白腐真菌的粗酶液中，然后置于25～30℃、130～180r/min摇床中震荡3h-48h，之后5000～10000r/min离心5～10min收集生物炭，即得到固载降解土壤中复合多环芳烃的固载型粗酶。
具体实施方式八：本实施方式固载降解土壤中复合多环芳烃的固载型粗酶按以下步骤制备：
一、板栗内壳内外洗涤后烘干，取出磨碎，制成粉末材料；
二、粉末材料放至于坩埚内，600℃热解3h，待冷却后取出加入2mM柠檬酸溶液，再置于25℃、150r/min的摇床中震荡改性24h，制成改性生物炭；
三、将1g改性生物炭加入5ml的白腐真菌的粗酶液中，然后置于25～30℃、130～180r/min摇床中震荡24h，之后80000r/min离心8min收集生物炭，即得到固载降解土壤中复合多环芳烃的固载型粗酶。
其中所述白腐真菌为Coriolus versicolor 5.161，其粗酶液由Coriolusversicolor 5.161放入液体培养基然后置于28℃、120r/min条件下培养15天，然后10000r/min离心10min，分离得到上清液制成；其中，1L液体培养基由25.00g麸皮、0.40g NH4Cl、0.20g KH2PO4、0.05g MgSO4·7H2O、0.01g CaCl2、1.00g吐温80、无机溶液1.00mL和余量的蒸馏水制成。液体培养基自然pH。1L无机溶液由3.00g MgSO4·7H2O、0.50g MnSO4·H2O、1.00gNaCl、0.10g FeSO4·7H2O、0.10g CoCl2、0.10g ZnSO4·7H2O、0.10g CuSO4·5H2O、0.01gKAl(SO4)2·12H2O、0.01g H3BO3、0.01g Na2MoO4·2H2O和余量的蒸馏水制成。且酶液还包括铜离子溶液、乙腈、Tween 80和介体；该粗酶液中铜离子的浓度是1.2mM，介体为HBT和紫脲酸，粗酶液中HBT的浓度是0.3mM，粗酶液中紫脲酸的浓度是0.7mM；粗酶液中乙腈的浓度是10％；粗酶液中Tween 80的浓度是1％。粗酶液的pH为自然pH。粗酶液中漆酶活性为10U/mL。
本实施方式选用的Coriolus versicolor 5.161来源于东北林业大学环境微生物实验室，于2010年杜丽娜(东北林业大学)的硕士学位论文“高效降解多环芳烃白腐真菌菌种的筛选及降解特性”中公开使用。
具体实施方式九：本实施方式固载降解土壤中复合多环芳烃的固载型粗酶按以下步骤制备：
一、板栗内壳内外洗涤后烘干，取出磨碎，制成粉末材料；
二、粉末材料放至于坩埚内，600℃热解3h，待冷却后取出加入2mM柠檬酸溶液，再置于28℃、160r/min的摇床中震荡改性40h，制成改性生物炭；
三、将1g改性生物炭加入5ml的白腐真菌的粗酶液中，然后置于30℃、180r/min摇床中震荡5h，之后60000r/min离心6min收集生物炭，即得到固载降解土壤中复合多环芳烃的固载型粗酶。
其中所述白腐真菌为Coriolus versicolor，其粗酶液由Coriolus versicolor放入液体培养基然后置于30℃、150r/min条件下培养18天，然后10000r/min离心10min，分离得到上清液制成；其中，1L液体培养基由20.00g麸皮、0.50g NH4Cl、0.20g KH2PO4、0.05gMgSO4·7H2O、0.01g CaCl2、1.00g吐温80、无机溶液1.00mL和余量的蒸馏水制成。液体培养基自然pH。1L无机溶液由3.00g MgSO4·7H2O、0.50g MnSO4·H2O、1.00g NaCl、0.10gFeSO4·7H2O、0.10g CoCl2、0.10g ZnSO4·7H2O、0.10g CuSO4·5H2O、0.01g KAl(SO4)2·12H2O、0.01g H3BO3、0.01g Na2MoO4·2H2O和余量的蒸馏水制成。且酶液还包括铜离子溶液、乙腈、Tween 80和介体；该粗酶液中铜离子的浓度是1.5mM，介体为HBT和紫脲酸，粗酶液中HBT的浓度是0.4mM，粗酶液中紫脲酸的浓度是0.6mM；粗酶液中乙腈的浓度是10％；粗酶液中Tween 80的浓度是1％。粗酶液的pH为自然pH。粗酶液中漆酶活性为10U/mL。
本实施方式选用的Coriolus versicolor来源于东北林业大学环境微生物实验室，于2013年第10期的《现代农业科技》“底物菲对彩绒革盖菌产漆酶的影响”中公开使用。
实施例1
A.称取50g混有多环芳烃的试验用土放入花盆中(试验用土中多环芳烃的总浓度是3.96mg/L)；
B.将1g未改性板栗内壳、未改性板栗外壳、酸性改性板栗外壳生物炭、碱性改性板栗内壳生物炭、碱性改性板栗外壳生物炭、稻壳生物炭和玉米秸秆生物炭分别加入5mlCoriolus versicolor菌株粗酶液中，制成对应的各自的固载粗酶液；
C.将本发明具体实施方式八制备的降解土壤中复合多环芳烃的固载型粗酶、步骤B中Coriolus versicolor粗酶液以及步骤B制备的碱性改性板栗内壳生物炭固载粗酶、稻壳生物炭固载粗酶和玉米秸秆生物炭固载粗酶1g分别加入混有多环芳烃试验用土的花盆中；
D.花盆中加入适量蒸馏水，使土壤含水率为60％；每隔一天补充水分，使土壤含水率保持在60％；
E.10天后提取土壤样品中的多环芳烃进行测定，计算多环芳烃修复效果。
本实施例中步骤B中白腐真菌Coriolus versicolor菌株粗酶液由Coriolusversicolor 5.161菌株放入液体培养基然后置于28℃、120r/min条件下培养15天，然后10000r/min离心10min，分离得到上清液制成；其中，1L液体培养基由25.00g麸皮、0.40gNH4Cl、0.20g KH2PO4、0.05g MgSO4·7H2O、0.01g CaCl2、1.00g吐温80、无机溶液1.00mL和余量的蒸馏水制成。液体培养基自然pH。1L无机溶液由3.00g MgSO4·7H2O、0.50g MnSO4·H2O、1.00g NaCl、0.10g FeSO4·7H2O、0.10g CoCl2、0.10g ZnSO4·7H2O、0.10g CuSO4·5H2O、0.01g KAl(SO4)2·12H2O、0.01g H3BO3、0.01g Na2MoO4·2H2O和余量的蒸馏水制成。且酶液还包括铜离子溶液、乙腈、Tween 80和介体；该粗酶液中铜离子的浓度是1.2mM，介体为HBT和紫脲酸，粗酶液中HBT的浓度是0.3mM，粗酶液中紫脲酸的浓度是0.7mM；粗酶液中乙腈的浓度是10％；粗酶液中Tween 80的浓度是1％。粗酶液的pH为自然pH。粗酶液中漆酶活性为10U/mL。
本实施方式选用的Coriolus versicolor 5.161来源于东北林业大学环境微生物实验室，于2010年杜丽娜(东北林业大学)的硕士学位论文“高效降解多环芳烃白腐真菌菌种的筛选及降解特性”中公开使用。
其中，未改性板栗内壳由板栗内壳内外洗涤后烘干，取出磨碎制成。
未改性板栗外壳由板栗外壳内外洗涤后烘干，取出磨碎制成。
酸性改性板栗外壳生物炭由板栗外壳内外洗涤后烘干，取出磨碎，制成粉末材料；再将粉末材料放至于坩埚内，600℃热解3h，待冷却后取出加入2mM柠檬酸溶液，再置于25℃、150r/min的摇床中震荡改性24h制成，制成改性生物炭。
碱性改性板栗内壳生物炭由板栗内壳内外洗涤后烘干，取出磨碎，制成粉末材料；再将粉末材料放至于坩埚内，600℃热解3h，待冷却后取出加入饱和氢氧化钾溶液，再置于25℃、150r/min的摇床中震荡改性24h制成，制成改性生物炭。
碱性改性板栗外壳生物炭由板栗外壳内外洗涤后烘干，取出磨碎，制成粉末材料；再将粉末材料放至于坩埚内，600℃热解3h，待冷却后取出加入饱和氢氧化钾溶液，再置于25℃、150r/min的摇床中震荡改性24h制成，制成改性生物炭。
稻壳生物炭由稻壳洗涤后烘干，取出磨碎制成。
玉米秸秆生物炭由玉米秸秆洗涤后烘干，取出磨碎制成。
通过扫描电镜观察到本实施例中板栗内壳生物炭的微观结构如图2所示，板栗外壳生物炭的微观结构如图3所示，具体实施方式八改性生物炭(酸性改性板栗内壳生物炭)的微观结构如图4所示，酸性改性板栗外壳生物炭的微观结构如图5所示，碱性改性板栗内壳生物炭的微观结构如图6所示，碱性改性板栗外壳生物炭的微观结构如图7所示，稻壳生物炭的微观结构如图8所示，玉米秸秆生物炭的微观结构如图9所示。
对比图2～图9，板栗内壳生物炭：未改性的内壳孔道丰富，比表面积较大，但是有些孔道上被细小的粉末堵塞。酸、碱改性后的内壳生物炭：通道更加清晰，碱改性的内壳样品表面的刻蚀比较明显，孔洞较为清晰；酸改性内壳孔道更为清晰，且孔道内部残存碎屑较少，样品表面刻蚀的效果不明显；相对于板栗内壳生物炭和碱性改性板栗内壳生物炭两种样品来说，酸性改性板栗内壳生物炭比表面积更大，更利于酶固定。未改性板栗外壳孔道较少且孔道堵塞严重，经过酸、碱改性后，孔道清晰，内部残存的粉末变少，说明酸碱改性对于提高板栗外壳的承载能力有所提升。但是对比内壳来说，外壳的孔道较少且堵塞严重，扫描电镜观察发现，外壳样品中可利用的样品非常少，视野中基本都为不能作为固定载体的“针状无孔洞”样本。与市售稻壳生物炭和玉米秸秆生物炭相比，酸性改性板栗内壳生物炭具有清晰的孔洞结构。
白腐真菌(Coriolus versicolor)粗酶液及八种生物炭的Zeta电位均进行五次测定取其平均值，结果如表1所示。
表1
生物炭的Zeta电位均为负值，即表面均带负电荷。其中，酸改性板栗内壳电位值最高(-13±1.56mV)，明显高于两种市售生物炭(稻壳生物炭和玉米秸秆生物炭)，并且与改性前内壳Zeta电位值相比，增高了13.34mV。而白腐真菌菌株粗酶液的Zeta电位也为负值，表面也是带负电，所以表面所带正电荷越多的生物炭，与白腐真菌菌株粗酶液间的静电排斥力会越小。Zeta电位越高，越有利于微生物的吸附。受污染土壤中一部分原有的土著微生物对多环芳烃实质有一定的降解能力，但由于多环芳烃的疏水性以及微生物生存环境的限制，这部分土著微生物对多环芳烃的降解潜力难以发挥，而添加合适的生物炭后可促进部分土著微生物对多环芳烃的降解潜力。因而，具有较高Zeta电位的酸性改性板栗内壳生物炭一方面与白腐真菌菌株粗酶液的结合能力最强，另一方面对部分有降解潜力的土著微生物对多环芳烃的降解有一定的促进作用。同时，结合八种生物炭扫描电镜图(图2～图9)可见，酸性改性板栗内壳生物炭孔洞结构也更为明显。
四种修复材料对多环芳烃污染土壤均有一定的降解能力，与游离漆酶(即白腐真菌菌株粗酶液)相比，三种固定化粗酶的降解有明显提高。在相同条件下，负载固定化粗酶对土壤中多环芳烃的降解量较大，降解效果较好。另外，酸性改性板栗内壳生物炭负载固定化粗酶在10天的的修复周期内，修复效果可达36.87％，与两种市售生物炭(稻壳生物炭和玉米秸秆生物炭)负载固定化粗酶相比均有显著提升，如图10所示。酸性改性板栗内壳生物炭孔洞结构更为明显，且与白腐真菌(Coriolus versicolor)菌株粗酶液间的静电斥力较小等特性相关。负载固定化粗酶和游离粗酶液对多环芳烃均有一定的降解效果，而固载降解土壤中复合多环芳烃的固载型粗酶对多环芳烃具有更好的活力、更高的稳定性和更好的催化降解效果。游离粗酶液由于土壤复杂的环境因素而迅速失活，而负载固定化粗酶附着在生物炭的孔隙中，在很大程度上避免了复杂土壤环境的影响。即使是在复杂污染土壤中，本发明固载降解土壤中复合多环芳烃的固载型粗酶也对土壤的修复有一定的效果。这表明本发明固载降解土壤中复合多环芳烃的固载型粗酶在未来多环芳烃污染土壤的生物修复中具有广阔的应用前景。
Claims (8)
1.降解土壤中复合多环芳烃的固载型粗酶，其特征在于该固载型粗酶液由酸改性的板栗内壳和白腐真菌的粗酶液制成；白腐真菌的粗酶液中包括铜离子溶液。
2.根据权利要求1所述的降解土壤中复合多环芳烃的固载型粗酶，其特征在于所述白腐真菌的粗酶液中铜离子的浓度是1mM～2mM。
3.根据权利要求1或2所述的降解土壤中复合多环芳烃的固载型粗酶，其特征在于所述白腐真菌的粗酶液还包括乙腈、Tween 80和介体；其中，介体为HBT和紫脲酸，粗酶液中HBT的浓度是0.1mM～0.5mM，粗酶液中紫脲酸的浓度是0.5mM～1mM；粗酶液中乙腈的浓度是10％；粗酶液中Tween 80的浓度是1％。
4.根据权利要求3所述的降解土壤中复合多环芳烃的固载型粗酶，其特征在于所述白腐真菌的粗酶液中漆酶活性为10U/mL。
5.根据权利要求3所述的降解土壤中复合多环芳烃的固载型粗酶，其特征在于所述白腐真菌的粗酶液的pH值为自然pH。
6.根据权利要求1所述的降解土壤中复合多环芳烃的固载型粗酶，其特征在于所述白腐真菌为Coriolus versicolo。
7.根据权利要求3所述的降解土壤中复合多环芳烃的固载型粗酶，其特征在于所述白腐真菌的粗酶液由Coriolus versicolo菌株放入液体培养基然后置于25℃～31℃、120r/min-160r/min条件下培养12～18天，然后9000r/min～11000r/min离心10min，分离得到上清液，然后稀释制成；其中，1L液体培养基由15.00g～30.00g麸皮、0.40g～0.50g NH4Cl、0.20g KH2PO4、0.05g MgSO4·7H2O、0.01g CaCl2、1.00g吐温80、无机溶液1.00mL和余量的蒸馏水制成。
8.降解土壤中复合多环芳烃的固载型粗酶的制备方法，其特征在于降解土壤中复合多环芳烃的固载型粗酶按以下步骤制备：
一、板栗内壳洗涤后烘干，取出磨碎，制成粉末材料；
二、粉末材料放至于坩埚内，600℃热解3h，待冷却后取出加入柠檬酸溶液，再置于25～30℃、130～180r/min的摇床中震荡改性12～48h，制成改性生物炭；
三、将改性生物炭加入权利要求1～6所述白腐真菌的粗酶液中，然后置于25～30℃、130～180r/min摇床中震荡3h-48h，之后5000～10000r/min离心5～10min收集生物炭，即得到固载降解土壤中复合多环芳烃的固载型粗酶。
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Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004063036A1 (de) * | 2003-01-09 | 2004-07-29 | Baxter Healthcare S.A. | Sicherheitsbehälter für biologisch aktive substanzen und verfahren zu deren herstellung |
| KR20040083994A (ko) * | 2003-03-26 | 2004-10-06 | 황인준 | 한방비누조성물 및 그 제조방법 |
| CN101845420A (zh) * | 2010-03-31 | 2010-09-29 | 中国科学院南京土壤研究所 | 一种用于降解多环芳烃粗酶制剂的提取方法 |
| CN105130657A (zh) * | 2015-09-09 | 2015-12-09 | 凤台县千秋食用菌有限公司 | 一种杜仲叶抑杂菌防结板的平菇高效培养基及其制备方法 |
| CN109749750A (zh) * | 2018-12-27 | 2019-05-14 | 天津天丰泽田生物科技有限公司 | 一种土壤重金属污染修复剂及其制备方法 |
| KR101980142B1 (ko) * | 2017-11-29 | 2019-05-20 | 대구가톨릭대학교산학협력단 | 효소 및 가압가열 처리를 이용한 피부 미백 및 주름 개선 효과가 증가된 율피 추출물의 제조 방법 |
-
2022
- 2022-07-03 CN CN202210776864.7A patent/CN115011587B/zh active Active
-
2023
- 2023-06-30 US US18/216,837 patent/US20240002829A1/en active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004063036A1 (de) * | 2003-01-09 | 2004-07-29 | Baxter Healthcare S.A. | Sicherheitsbehälter für biologisch aktive substanzen und verfahren zu deren herstellung |
| KR20040083994A (ko) * | 2003-03-26 | 2004-10-06 | 황인준 | 한방비누조성물 및 그 제조방법 |
| CN101845420A (zh) * | 2010-03-31 | 2010-09-29 | 中国科学院南京土壤研究所 | 一种用于降解多环芳烃粗酶制剂的提取方法 |
| CN105130657A (zh) * | 2015-09-09 | 2015-12-09 | 凤台县千秋食用菌有限公司 | 一种杜仲叶抑杂菌防结板的平菇高效培养基及其制备方法 |
| KR101980142B1 (ko) * | 2017-11-29 | 2019-05-20 | 대구가톨릭대학교산학협력단 | 효소 및 가압가열 처리를 이용한 피부 미백 및 주름 개선 효과가 증가된 율피 추출물의 제조 방법 |
| CN109749750A (zh) * | 2018-12-27 | 2019-05-14 | 天津天丰泽田生物科技有限公司 | 一种土壤重金属污染修复剂及其制备方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ALMEIDA, LC等: "Electrochemical deposition of bio-inspired laccase-polydopamine films for phenolic sensors" * |
| HUAN ZHAO等: "Immobilized enzyme with sustainable chestnut biochar to remediate polycyclic aromatic hydrocarbons contaminated soils" * |
| 赵欢: "Trametes versicolor粗酶对多环芳烃污染土壤的修复研究" * |
Also Published As
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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