CN115011502A - 一种用于造纸制剂废水处理的解淀粉芽孢杆菌及制备方法 - Google Patents

一种用于造纸制剂废水处理的解淀粉芽孢杆菌及制备方法 Download PDF

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CN115011502A CN202210222898.1A CN202210222898A CN115011502A CN 115011502 A CN115011502 A CN 115011502A CN 202210222898 A CN202210222898 A CN 202210222898A CN 115011502 A CN115011502 A CN 115011502A
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Abstract

本发明涉及生物剂技术领域，且公开了一种用于造纸制剂废水处理的解淀粉芽孢杆菌及制备方法，其特征在于，解淀粉芽孢杆菌为(Bacillus amyloliquefaciens)
Figure DDA0003538157080000011
‑bio‑3167，保藏号GDMCC NO：62074。本发明用于生化处理法以微生物菌体为降解主体，投加到废水中，吸收、转化废水中的有机物质，生化处理法可首先将大分子有机物分解成小分子物质，后在菌体内实现小分子有机物的彻底氧化，通过筛选获得高效的纤维素降解菌种与产酶所需的营养，通过菌种与营养的结合使用，实现造纸废水中有机污染物的有效去除。

Description

一种用于造纸制剂废水处理的解淀粉芽孢杆菌及制备方法
技术领域
本发明涉及生物剂领域，尤其涉及一种用于造纸制剂废水处理的解淀粉芽孢杆菌及制备方法。
背景技术
造纸废水是指制浆造纸工艺过程中产生的废水。包括制浆蒸煮废液、洗涤废水、漂白废水与纸机白水等。造纸废水成分复杂，可生化性差，属于较难处理的工业废水。其污染性成分主要包括悬浮物、易生物降解有机物、难生物降解有机物、毒性物质、酸碱毒物、带色物质等。其中悬浮物主要是纤维、纤维碎片、杂细胞等；易生物降解有机物主要包括低分子量的半纤维素、甲醇、乙酸、甲酸、糖类等；难生物降解有机物主要为木质素和大分子碳水化合物；毒性物质主要为黑液中含有的松香酸和不饱和脂肪酸等；酸碱毒物一般是指碱法制浆和酸法制浆所产生的废水，带色物质则主要是制浆废水中所残余的木质素。
我国造纸业多采用草秆、木浆等作为造纸原料。制浆造纸生产一般有制浆、洗浆、漂白、造纸的工序组成。造纸工业制浆有碱法制浆、化学机械法制浆和机械法制浆。其废水根据制浆方法不同、原料不同、制浆得率不同、造纸品种不同及有无化学品回收，其污染物的发生与排放就有很大区别，但基本上都含有大量的悬浮物及BOD、COD和部分有毒物质，目前，常规处理工艺难以充分降解木质素和纤维素，导致处理后水体中色度仍然较高，悬浮物含量仍然较大，对环境仍具有一定的污染性。
为解决上述问题，本申请中提出一种用于造纸制剂废水处理的解淀粉芽孢杆菌及制备方法。
发明内容
(一)发明目的
为解决背景技术中存在的技术问题，本发明提出一种用于造纸制剂废水处理的解淀粉芽孢杆菌及制备方法，本发明用于生化处理法以微生物菌体为降解主体，投加到废水中，吸收、转化废水中的有机物质，生化处理法可首先将大分子有机物分解成小分子物质，后在菌体内实现小分子有机物的彻底氧化，通过筛选获得高效的纤维素降解菌种与产酶所需的营养，通过菌种与营养的结合使用，实现造纸废水中有机污染物的有效去除。
(二)技术方案
为解决上述问题，本发明提供了一种用于造纸制剂废水处理的解淀粉芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌为(Bacillus amyloliquefaciens)
Figure BDA0003538157060000021
-bio-3167，保藏号GDMCC NO：62074。
优选的，所述发酵剂中解淀粉芽孢杆菌的浓度为1×109CFU/mL以上。
一种用于造纸制剂废水处理的解淀粉芽孢杆菌的制备方法，包括以下步骤：
S1、纤维素降解菌的筛选
1.1样本采集：分别采集三个造纸厂好氧曝气池活性污泥、不同生态型的山林中土壤、腐木表皮和腐烂木根；
1.2菌种筛选
S2、筛选获得的纤维素降解菌在造纸废水中的小试
将三个造纸厂的活性污泥以同等比例混合作为试验用污泥，三个造纸厂的好氧进水以等比例混合作为好氧进水，每日更换；
S3、纤维素降解菌的驯化与优化
3.1纤维素降解菌的驯化
3.1.1驯化用水：
以三个造纸厂的废水等比例混合作为驯化用水、过滤除菌；
3.1.2纤维素降解菌的准备：以细菌增殖培养基对纤维素降解菌进行扩大培养；
3.1.3菌种驯化：以0.1％的体积比将清洗后的纤维素降解菌接种到驯化用水中，120rpm、30℃振荡培养、每日检测COD，以COD低于100作为驯化标准；
3.1.4重复驯化：当COD低于100时，将接种纤维素降解菌的驯化用水涂布羧甲基纤维素钠(CMC-Na)琼脂平板、选择生长最快速的菌种应用细菌增值培养基扩培、重复3.1.2-3.1.3的驯化操作；
3.2纤维素降解菌的无机盐优化
取新制备的纤维素降解菌、取1mL菌液置于含1％羧甲基纤维素钠水溶液中，分别添加不同种类的0.5％无机盐、检查纤维素酶活性，获得无机盐对酶活性影响的定性实验。
取新制备的纤维素降解菌、取1mL菌液置于含1％羧甲基纤维素钠水溶液中，选择酶活性最高的几种无机盐、以0.1％、0.2％、0.5％、1％、2％等浓度、 30℃温浴30分钟进行重复，检测酶活性，获得无机盐对酶活性影响的定量实验。
优选的，还包括：
S4、驯化后菌种组合与营养在废水处理中的试验
活性污泥：将三个造纸厂的活性污泥以同等比例混合作为试验用污泥；
好氧进水：将三个造纸厂的好氧进水以等比例混合作为好氧进水；每日更换25％；
纤维素降解菌的投加比例：以1000ppm的比例添加纤维素降解细菌；
氮源与无机盐的添加：根据优化结果添加：
4.1菌种与无机盐组合对造纸废水COD去除的100mL实验
4.2菌种与无机盐组合对造纸废水COD去除的4L模拟器实验
4.3菌种与无机盐组合对造纸废水COD去除的100L实验
S5、菌种鉴定与保藏：
选择COD去除效果最好的细菌、于2021年11月19日委托广东省微生物菌种保藏中心进行鉴定并进行专利保藏。
优选的，在S2中，每日更换25％，以1000ppm的比例添加纤维素降解细菌。
优选的，在3.1.2中，以细菌增殖培养基对纤维素降解菌进行扩大培养， 30℃、120rpm培养24h、菌种数量大于109个/mL，使用无菌水清洗纤维素降解菌。
优选的，在S1中，降解纤维素菌株初筛选所用培养基如下，细菌增殖培养基的配方：牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、琼脂15g、水1000mL， pH7.0-7.2。
优选的，在S1中，羧甲基纤维素钠(CMC-Na)琼脂板作为分离筛选培养基的配方：羧甲基纤维素钠10g、KH2PO4 2g、(NH4)2SO41.4g、MgSO4.7H2O 0.3g、 CaCl2 0.3g、FeSO4.7H2O 5mg、MnSO4 1.6mg、ZnCl2 1.7mg、CoCl2 1.7mg、琼脂15g、溶于1000mL蒸馏水。
优选的，在S1中，滤纸条培养基的配方：KH2PO4 2g、(NH4)2SO41.4g、MgSO4.7H2O0.3g、CaCl2 0.3g、Fe SO4.7H2O 5mg、MnSO4 1.6mg、ZnCl2 1.7mg、 CoCl2 1.7mg、琼脂15g、溶于1000mL蒸馏水。
本发明的上述技术方案具有如下有益的技术效果：
用于生化处理法以微生物菌体为降解主体，投加到废水中，吸收、转化废水中的有机物质，生化处理法可首先将大分子有机物分解成小分子物质，后在菌体内实现小分子有机物的彻底氧化，通过筛选获得高效的纤维素降解菌种与产酶所需的营养，通过菌种与营养的结合使用，实现造纸废水中有机污染物的有效去除。
附图说明
图1为本发明中纤维素降解菌在造纸废水中应用图。
图2为本发明中纤维素降解菌的第1次菌种驯化图。
图3为本发明中纤维素降解菌的第5次菌种驯化图。
图4为本发明中纤维素降解菌的第23次菌种驯化图。
图5为本发明中机盐对菌种产纤维素酶的影响图。
图6为本发明中硫酸镁浓度对菌种产纤维素酶的影响图。
图7为本发明中柠檬酸钠浓度对菌种产纤维素酶的影响图。
图8为本发明中磷酸二氢钾浓度对菌种产纤维素酶的影响图。
图9为本发明中磷酸二氢钾浓度对菌种产纤维素酶的影响另一图。
图10为本发明中2020年7月100mL实验室小试图。
图11为本发明中2020年8月4L模拟器实验图。
图12为本发明中2020年9月100L实验图。
图13为本发明流程图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式并参照附图1-13，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。
解淀粉芽孢杆菌的保藏中心的具体地址：广东省微生物菌种保藏中心 地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院实验大楼5楼。
实施例
一、纤维素降解菌的筛选
结合附图1
2019年2月开始对采集到的71份样品进行为期3个月的分离筛选共获得 69个菌株能够在羧甲基纤维素钠琼脂平板生长，而能够在滤纸培养基生长的菌株只有16株。命名为：
Figure BDA0003538157060000061
-bio-3161、
Figure BDA0003538157060000062
-bio-3162...
Figure BDA0003538157060000063
-bio-3176
羧甲基纤维素钠酶活力测定，
一个酶活力单位(U)定义为每分钟水解1％羧甲基纤维素钠溶液(用羟甲基纤维素钠以pH＝4.8的醋酸缓冲液配成1％的溶液)产生1mg葡萄糖计所需的酶量。
纤维素降解菌应用细菌增值培养基进行扩大培养，30℃、120rpm培养24h、菌种数量大于109个/mL。取1mL菌液加入1％羧甲基纤维素钠溶液中30℃30 分钟检测羧甲基纤维素钠酶活性。
Figure BDA0003538157060000064
-bio-3167最高为67.11U，而
Figure BDA0003538157060000065
-bio-3173最低为0.75U，两者相差数十倍。见下表。
Figure BDA0003538157060000066
Figure BDA0003538157060000071
表1纤维素降解菌以CMC作为碳源液态发酵产酶比较
二、纤维素降解菌在造纸废水中的尝试
选取冠军、法门寺与亚太森博等三个造纸厂的活性污泥以同等比例混合作为试验用污泥。以冠军、法门寺、亚太森博的三个造纸厂的废水等比例混合作为实验用水。选择纤维素酶活性最高的6株纤维素降解菌
Figure BDA0003538157060000072
-bio-3167、
Figure BDA0003538157060000073
-bio-3163、
Figure BDA0003538157060000074
-bio-3174、
Figure BDA0003538157060000075
-bio-3162、
Figure BDA0003538157060000076
-bio-3169、
Figure BDA0003538157060000077
-bio-3174作为试验菌种。
试验菌种：将菌种接入液态细菌增殖培养基30℃、120rpm培养24h至菌种数量大于109个/mL。
试验方法：每日更换总体积25％的试验用水，CK(对照组)仅补氮磷，实验组在对照组的基础上分别接入加入试验用水0.1％比例的对应试验菌种。
从图1可知，初步筛选得到的纤维素降解菌对造纸废水COD的去除基本没有作用。
三、3.1、纤维素降解菌驯化：
6株纤维素降解菌
Figure BDA0003538157060000078
-bio-3167、
Figure BDA0003538157060000079
-bio-3163、
Figure BDA00035381570600000710
-bio-3174、
Figure BDA00035381570600000711
-bio-3162、
Figure BDA00035381570600000712
-bio-3169、
Figure BDA00035381570600000713
-bio-3174作为驯化菌种。
(见附图2，纤维素降解菌的第1次菌种驯化；附图3为纤维素降解菌的第5次菌种驯化，附图4为纤维素降解菌的第23次菌种驯化)
2019年7月开始纤维素降解菌的驯化。
从图2、图3、图4可以看出经过23次菌种驯化，菌种
Figure BDA00035381570600000714
-bio-3163、
Figure BDA00035381570600000715
-bio-3167的COD去除的效果最好。
3.2、纤维素降解菌产酶的无机盐优化(见附图5，无机盐对菌种产纤维素酶的影响)
对
Figure BDA0003538157060000081
-bio-3163、
Figure BDA0003538157060000082
-bio-3167进行产酶的无机盐优化。
从图5可知硫酸镁对纤维素酶活性的影响最大、其次是柠檬酸钠、磷酸二氢钾、氯化钠。
3.3、各无机盐浓度对纤维素酶活性的影响：
将菌种接入液态细菌增殖培养基30℃、120rpm培养24h至菌种数量大于 109个/mL。取1mL菌液置于含1％羧甲基纤维素钠水溶液中，各实验组对应加入总体积0.1％、0.2％、0.5％、1％、2％的无机盐、30℃温浴30分钟。三次重复，检测酶活性。
3.4、硫酸镁浓度的影响(参考图6硫酸镁浓度对菌种产纤维素酶的影响)
见附图6，可知硫酸镁对纤维素酶活性的影响最大、其次是柠檬酸钠、磷酸二氢钾、氯化钠。
参照附图7(柠檬酸钠浓度对菌种产纤维素酶的影响)。
参照附图8(磷酸二氢钾浓度对菌种产纤维素酶的影响)。
参照附图9(磷酸二氢钾浓度对菌种产纤维素酶的影响)。
从图6-9可知0.2％硫酸镁、0.2％柠檬酸钠、0.2％的磷酸二氢钾、0.2-0.5％的氯化钠纤维素酶活性最高。
四、驯化菌种与无机盐组合在造纸制浆废水COD去除中的试验(参照附图11)
冠军、法门寺与亚太森博等三个造纸厂的活性污泥以同等比例混合作为试验用污泥。
以冠军、法门寺、亚太森博的三个造纸厂的废水等比例混合作为实验用水。每日更换总体积25％的试验用水。
菌种：
Figure BDA0003538157060000083
-bio-3163、
Figure BDA0003538157060000084
-bio-3167菌种分别接入液态细菌增殖培养基30℃、120rpm培养24h至菌种数量大于109个/mL。菌种与无机盐组合：试验用水总体积0.1％对应菌种、0.2％硫酸镁、0.2％柠檬酸钠、0.2％的磷酸二氢钾、0.2％的氯化钠作为无机盐组合。
附图10为2020年7月100mL实验室小试。
附图11为2020年8月4L模拟器实验。
附图12为2020年9月100L实验。
由图9-12可知：菌种
Figure BDA0003538157060000091
-bio-3163、
Figure BDA0003538157060000092
-bio-3167经过驯化后、菌种与无机盐组合的添加对造纸废水COD的去除效果非常显著、对照排放 COD272、实验组降低到120，COD降低了152、COD去除效率从76.7％提高到 93.9％。
五、菌种鉴定与保藏
选择COD去除效果最好
Figure BDA0003538157060000093
-bio-3167、委托广东省微生物菌种保藏中心进行鉴定并进行专利保藏。经鉴定
Figure BDA0003538157060000094
-bio-3167是解淀粉芽孢杆菌 (Bacillusamyloliquefaciens)，保藏号GDMCC NO：62074。
实施例1、菌种培养
菌种
Figure BDA0003538157060000095
-bio-3167接入液态细菌增殖培养基30℃、120rpm培养24h至菌种数量大于109个/mL。按接种量1％分别接液体LB液态培养基30度24h。
实施例2、菌种的添加
菌种以0.1％的比例与待处理废水混合添加到好氧曝气池中。
实施例3、无机盐的组合配方
待处理废水总体积0.2％硫酸镁、0.2％柠檬酸钠、0.2％的磷酸二氢钾、0.2％的氯化钠。
效果例1
造纸废水初步沉淀后上清液，曝气池有效容积为100L，温度20-25度，推流式样、进水量5L/小时，COD为1100～1350mg/L，溶解氧控制在3～4mg/L，按比例添加菌种与营养运行72h(以不加菌活性污泥为对照)
好氧曝气 COD去除
菌种+营养 89.1％
对照 76.7％
效果例2
造纸废水初步沉淀后上清液，曝气池有效容积为100L，温度25-30度，推流式、进水量5L/小时，COD为1100～1350mg/L，溶解氧控制在3～4mg/L，按比例添加菌种与营养运行72h(以不加菌活性污泥为对照)，
好氧曝气 COD去除
菌种+营养 93.9％
对照 81.7％
效果例3
造纸废水初步沉淀后上清液，曝气池有效容积为1000L，温度25-30度，
进水量55L/小时，COD为1100～1350mg/L，溶解氧控制在3～4mg/L，按比例添加菌种与营养运行72h(以不加菌活性污泥为对照)，
好氧曝气 COD去除
菌种+营养 92.5％
对照 80.2％
可见，对造纸废水在添加多种纤维素降解菌种组合与生物营养对于造纸制浆废水的COD去除效果显著。
应当理解的是，本发明的上述具体实施方式仅仅用于示例性说明或解释本发明的原理，而不构成对本发明的限制。因此，在不偏离本发明的精神和范围的情况下所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。此外，本发明所附权利要求旨在涵盖落入所附权利要求范围和边界、或者这种范围和边界的等同形式内的全部变化和修改例。

Claims (9)

1.一种用于造纸制剂废水处理的解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，解淀粉芽孢杆菌为(Bacillus amyloliquefaciens)
Figure FDA0003538157050000011
-bio-3167，保藏号GDMCC NO：62074。
2.一种用于造纸制剂废水处理的解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，所述发酵剂中解淀粉芽孢杆菌的浓度为1×109CFU/mL以上。
3.一种用于造纸制剂废水处理的解淀粉芽孢杆菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、纤维素降解菌的筛选
1.1样本采集：分别采集三个造纸厂好氧曝气池活性污泥、不同生态型的山林中土壤、腐木表皮和腐烂木根；
1.2菌种筛选
S2、筛选获得的纤维素降解菌在造纸废水中的小试
将三个造纸厂的活性污泥以同等比例混合作为试验用污泥，三个造纸厂的好氧进水以等比例混合作为好氧进水，每日更换；
S3、纤维素降解菌的驯化与优化
3.1纤维素降解菌的驯化
3.1.1驯化用水：
以三个造纸厂的废水等比例混合作为驯化用水、过滤除菌；
3.1.2纤维素降解菌的准备：以细菌增殖培养基对纤维素降解菌进行扩大培养；
3.1.3菌种驯化：以0.1％的体积比将清洗后的纤维素降解菌接种到驯化用水中，120rpm、30℃振荡培养、每日检测COD，以COD低于100作为驯化标准；
3.1.4重复驯化：当COD低于100时，将接种纤维素降解菌的驯化用水涂布羧甲基纤维素钠(CMC-Na)琼脂平板、选择生长最快速的菌种应用细菌增值培养基扩培、重复3.1.2-3.1.3的驯化操作；
3.2纤维素降解菌的无机盐优化
取新制备的纤维素降解菌、取1mL菌液置于含1％羧甲基纤维素钠水溶液中，分别添加不同种类的0.5％无机盐、检查纤维素酶活性，获得无机盐对酶活性影响的定性实验。
取新制备的纤维素降解菌、取1mL菌液置于含1％羧甲基纤维素钠水溶液中，选择酶活性最高的几种无机盐、以0.1％、0.2％、0.5％、1％、2％等浓度、30℃温浴30分钟进行重复，检测酶活性，获得无机盐对酶活性影响的定量实验。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，还包括：
S4、驯化后菌种组合与营养在废水处理中的试验
活性污泥：将三个造纸厂的活性污泥以同等比例混合作为试验用污泥；
好氧进水：将三个造纸厂的好氧进水以等比例混合作为好氧进水；每日更换25％；
纤维素降解菌的投加比例：以1000ppm的比例添加纤维素降解细菌；
氮源与无机盐的添加：根据优化结果添加：
4.1菌种与无机盐组合对造纸废水COD去除的100mL实验
4.2菌种与无机盐组合对造纸废水COD去除的4L模拟器实验
4.3菌种与无机盐组合对造纸废水COD去除的100L实验
S5、菌种鉴定与保藏：
选择COD去除效果最好的细菌、委托广东省微生物菌种保藏中心进行鉴定并进行专利保藏。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在S2中，每日更换25％，以1000ppm的比例添加纤维素降解细菌。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在3.1.2中，以细菌增殖培养基对纤维素降解菌进行扩大培养，30℃、120rpm培养24h、菌种数量大于109个/mL，使用无菌水清洗纤维素降解菌。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在S1中，降解纤维素菌株初筛选所用培养基如下，细菌增殖培养基的配方：牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、琼脂15g、水1000mL，pH7.0-7.2。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在S1中，羧甲基纤维素钠(CMC-Na)琼脂板作为分离筛选培养基的配方：羧甲基纤维素钠10g、KH2PO4 2g、(NH4)2SO41.4g、MgSO4.7H2O 0.3g、CaCl2 0.3g、Fe SO4.7H2O 5mg、MnSO4 1.6mg、ZnCl2 1.7mg、CoCl2 1.7mg、琼脂15g、溶于1000mL蒸馏水。
9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在S1中，滤纸条培养基的配方：KH2PO42g、(NH4)2SO41.4g、MgSO4.7H2O 0.3g、CaCl2 0.3g、Fe SO4.7H2O 5mg、MnSO4 1.6mg、ZnCl21.7mg、CoCl2 1.7mg、琼脂15g、溶于1000mL蒸馏水。
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