CN115010806A - 抑制剂联合骨髓间充质干细胞在治疗癌症中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抑制剂联合骨髓间充质干细胞在治疗癌症中的应用。本发明特异性的开发了针对HSP70单克隆抗体，该抗体能够有效的抑制HSP70的活性同时抑制宫颈癌细胞的增殖。同时将该抗体与负载有化学药的骨髓间充质干细胞一起联用后，能够更好的靶向治疗肿瘤提高药物的敏感性和治疗效果，具有极好的应用前景。

Description

抑制剂联合骨髓间充质干细胞在治疗癌症中的应用
技术领域
本申请涉及生物领域，更具体的涉及癌症治疗领域，涉及了抑制剂联合骨髓间充质干细胞在治疗癌症中的应用。
背景技术
宫颈癌是世界范围内女性仅次于乳腺癌的第二大常见恶性肿瘤，近年来宫颈痛发病率的升高，并出现患者年轻化趋势，其手术及放射治疗虽已日趋成熟，但对于某些病例尤其是局部晚期宫颈癌患者并未取得令人满意的疗效，应用广泛的基于顺铂的联合化疗有效率波动于20％～30％，总生存期小于10个月，正是由于细胞毒性药物较大的治疗成功率及患者的不良预后，因而越来越多的研究集中于宫颈癌的靶向件治疗，分子靶向治疗已经成为未来的发展趋势。
目前主要的分子靶向治疗包括血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂、表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(MammaIian Target of Rapamycin，mTOR)抑制剂等靶向药物。
血管内皮生长因子(VEGF)参与了有丝分裂、血管生成、内皮细胞存活和造血等过程。其不仅与血管生成有关，还参与了肿瘤的快速生成，抑制细胞凋亡。观察到在宫颈高度不典型增生和浸润性宫颈癌中VEGF和缺氧诱导因子1α(HIF-1α)的表达明显增加。因此靶向抑制VEGF信号通路，将对抑制肿瘤生长具有重要作用。抑制VEGF信号的方法有利用抗体中和受体，或通过酪氨酸激酶抑制剂阻断VEGF受体的激活和信号传导。贝伐单抗(bevacizumab)是一种人源化中和VEGF的单克隆抗体。2014年8月14日，美国食品药品监督管理局(FDA)以提高总体生存率(OS)为基础，批准了针对晚期宫颈癌患者的抗血管生成药物贝伐单抗，自此，贝伐单抗成为被批准治疗晚期宫颈癌的第一种生物制剂。TewariKS等发现联合化疗加上贝伐单抗可使复发、持续或转移性宫颈癌患者的中位总生存期提高3.7个月，并且含贝伐单抗的化疗方案可使死亡风险明显降低，缓解率增加。即使靶病灶位于之前接受放疗的骨盆，联合贝伐单抗和化疗方案依然有效。表皮生长因子受体(EGFR)是一种170-kDa跨膜糖蛋白,属于ErbB/HER的受体家族,其中包括HER2(ErbB2),HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4)。EGFR家族通过细胞周期控制细胞凋亡、血管生成以及侵袭和转移潜能的调节参与实体瘤发病机制。表皮生长因子受体是第一个与人类癌症直接相关的酪氨酸激酶跨膜受体。EGFR抑制剂主要分干扰配体结合的单克隆抗体和选择性阻断受体活化的小分子激酶抑制剂。抗EGFR单克隆抗体是肿瘤治疗的重要分子靶向药物。EGFR酪氨酸激酶抑制剂也已获得FDA批准，在肺癌、胃癌和乳腺癌患者中进行测试。在宫颈癌治疗领域，研究发现，EGFR在98％患有晚期或复发性宫颈癌的女性中表达。EGFR-1在原发性和复发性宫颈肿瘤中高表达。因此，EGFR阻断剂有望成为宫颈癌的新型靶向治疗制剂。厄洛替尼(erlotinib)是一种小分子抑制剂，可与ATP可逆地竞争结合EGFR的酪氨酸激酶结构域。厄洛替尼口服给予患者，副作用通常耐受良好。厄洛替尼已被FDA批准用于治疗复发性非小细胞肺癌和用吉西他滨治疗晚期胰腺癌的一线治疗。mTOR是PI3K/AKT/mTOR信号通路里最重要的下游蛋白之一，mTOR信号通路的主要活化效应物是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。mTOR是调节许多细胞事件的关键激酶，如细胞增殖、生长、存活、分化、粘附、运动、血管生成和转移。作为催化亚基，mTOR参与两种不同的复合物，雷帕霉素敏感的mTORC1和雷帕霉素不敏感的mTORC2，它们具有不同的生理功能并且受到不同的调节。来自细胞内和细胞外线索的输入，如氨基酸、应激、氧、能量和生长因子，可激活mTORC1。mTORC1可以调节调节mRNA翻译起始和进展，从而控制蛋白质合成的速率。mTORC1还控制脂肪生成和能量代谢，抑制自噬和溶酶体生物合成，从而促进细胞生长和增殖。体外实验显示，mTOR抑制剂依维莫司和紫杉醇联合用药可以显著抑制人宫颈癌细胞的增殖和克隆，组合治疗比依维莫司或紫杉醇单独治疗疗效更佳。依维莫司和紫杉醇对宫颈癌细胞的诱导凋亡具有协同作用。
此外，随着干细胞理论和技术的发展，为宫颈癌的临床治疗提供了新的思路。研究表明间充质干细胞具有迁移的特性并根据周围环境来调节免疫反应的能力，可以趋化迁移到创伤炎症部位包括肿瘤组织，因此间充质干细胞成为实施肿瘤靶向治疗的理想载体。而且人间充质干细胞可以分泌定的生物活性因子，对肿瘤的细胞信号通路产生一定的影响，从而抑制肿瘤细胞增殖。另一方向，MSC和抗肿瘤药物直接孵育后可有效摄取药物，实现药物的负载。与肿瘤细胞比较，MSC对抗肿瘤药物的敏感度较低，可在相对较大的浓度范围内表现出对化疗药物较好的耐受性。
但是目前，针对靶向药物的种类还不够多，而且研究间充质干细胞与靶向药物联合使用的研究同样也不够多，提供可选的替代方案也不够成熟，有待于进一步的研究。
发明内容
本发明克服现有技术的缺陷，提供了一种改进的治疗宫颈癌的药物组合物。
一方面，通过研究发现，抑制HSP70表达能够抑制宫颈癌细胞的增殖，同时，抑制HSP70的表达的同时给予第二治疗剂的治疗能够协同增加治疗效果。
另外一方面，本发明还提供了特异性针对HSP70的单克隆抗体HSP70-3D9，所述抗体的可变区具体序列如下：
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其氨基酸序列为EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSQMDKRWVRQAPGKGLEWVGDIVARSYCFQRKNTIWRFTI SKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARETQHFDDGAANGWWGQGTLVTVSS；
所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，其氨基酸序列为AYQMTQSPSSVSASVGDRVTITCFDNWNGQKCPSWYQQKPGKAPKLLIYVITWRQPGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCAQDYNVTEHRVPMFGGGTKVEIK。
具体的，本发明抗体的6个CDR序列分别如下所示：
CDR-H1(在本说明书中CDR-H1表示重链CDR1)的氨基酸序列如QMDKR所示；
CDR-H2(在本说明书中CDR-H2表示重链CDR2)的氨基酸序列如DIVARSYCFQRKNTIW所示；
CDR-H3(在本说明书中CDR-H3表示重链CDR3)的氨基酸序列如ETQHFDDGAANGW所示；
CDR-L1(在本说明书中CDR-L1表示轻链CDR1)的氨基酸序列如FDNWNGQKCPS所示；
CDR-L2(在本说明书中CDR-L2表示轻链CDR2)的氨基酸序列如VITWRQP所示；
CDR-L3(在本说明书中CDR-L3表示轻链CDR3)的氨基酸序列如AQDYNVTEHRVPM所示。
进一步的，本发明的抗体包括对抗体序列的单独取代，缺失或添加，其导致氨基酸被化学上相似的氨基酸取代。提供功能相似氨基酸的保守取代表是本领域众所周知的。这种保守修饰的变体是本发明公开的多态性变体，种间同源物和等位基因之外的变体，但不排除这些变体。以下8组含有彼此保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(a)，甘氨酸(g)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，蛋氨酸(M)，缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)，蛋氨酸(M)。在一些实施方案中，术语“保守序列修饰”用于指不会显著影响或改变包含氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。
进一步的，本发明的抗体其包含具有至少95％的重链，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或与SEQ ID NO:1具有至少100％序列同一性，和与SEQ ID NO:2具有至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或至少100％序列同一性的轻链。
进一步的，本发明的抗体其包含具有至少90％的重链，至少89％，至少88％，至少87％，至少86％，或与SEQ ID NO:1具有至少85％序列同一性，和与SEQ ID NO:2具有至少90％，至少89％，至少88％，至少87％，至少86％或至少85％序列同一性的轻链。
进一步的，本发明提供了HSP70特异性的单克隆抗体在制备治疗宫颈癌的药物中的用途。
本发明的另一个目的是包含治疗有效量的本发明抗体的组合物，优选药物组合物。
所述组合物可根据本领域技术人员常用的技术制备。它们可以通过例如将具有所需纯度的本发明化合物与任选的生理上可接受的药学上可接受的载体，赋形剂或冻干制剂或水溶液形式的稳定剂混合来制备。这些药物组合物用于治疗有需要的患者。为了治疗有需要的患者，可以给予治疗有效剂量的该化合物。这里所说的“治疗有效剂量”是指产生其施用效果的剂量。确切的剂量取决于治疗的目的，本领域技术人员使用已知的技术就可以确定。剂量可以是0.001-100mg/kg体重或更大，例如0.1，0，10或50mg/kg体重，优选0.1-10mg/kg体重。
本发明组合物的给药可以以多种方式进行，包括但不限于口服，皮下，静脉内，胃肠外，鼻内，皮质内，眼内，直肠，阴道，透皮，局部(例如凝胶，药膏，洗剂，乳膏等)，腹膜内，肌肉内，肺内。
进一步的，本发明提供了HSP70特异性的单克隆抗体和载药的骨髓间充质干细胞在制备治疗宫颈癌的药物组合物中的用途；其中，载药的骨髓间充质干细胞是将顺铂与骨髓间充质干细胞一起孵育后制备获得。
进一步的，本发明的药物组合物还含有适用于药物制剂的载体，赋形剂和稀释剂的例子包括但不限于乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨醇，甘露醇，木糖醇，赤藓糖醇，麦芽糖醇，淀粉，阿拉伯胶，藻酸盐，明胶，磷酸钙，硅酸钙，纤维素，甲基纤维素，微晶纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，水，甲基羟基苯甲酸酯，丙基羟基苯甲酸酯，滑石，硬脂酸镁和矿物油。此外，药物制剂还可包括填料，抗凝剂，润滑剂，湿润剂，矫味剂和防腐剂。
一个实施方案中，组合物的剂量可以每天，半周，每周，两周或每月给药。治疗周期可以是一周，两周，一个月，两个月，四个月，六个月，八个月，一年或更长。初始剂量可以大于持续剂量。在一个实施例中，剂量范围为每周至少0.01mg/kg，至少0.25mg/kg，至少0.3mg/kg，至少0.5mg/kg，至少0.75mg/kg，至少1mg/kg，至少2mg/kg，至少3mg/kg，至少4mg/kg，至少5mg/kg，至少6mg/kg，至少7mg/kg，至少8mg/kg，至少9mg/kg，至少10mg/kg，至少15mg/kg，至少20mg/kg，至少25mg/kg，或者至少30mg/kg在一个实施方案中，每周剂量可以是至多5mg/kg，至多2mg/kg，至多2.5mg/kg，至多3mg/kg，至多4mg/kg，至多5mg/kg，至多6mg/kg，至多7mg/kg，至多8mg/kg，至多9mg/kg，至多10mg/kg，至多15mg/kg，至多20mg/kg，至多25mg/kg或至多30mg/kg。在一个具体方面，每周剂量可以在5mg/kg到20mg/kg的范围内。在另一个方面，每周剂量可以在10-15mg/kg的范围内。
本文公开的组合物的总有效剂量可以以单剂量给予患者，或者可以根据分级治疗方案以多剂量长期给予患者。在本文公开的药物组合物中，活性成分的含量可以根据疾病的严重程度而不同。优选地，本文公开的抗体和干细胞的总日剂量可以是每1kg患者体重约0.0001pg-500mg。然而，除药物组合物的给药途径和治疗频率外，还考虑包括患者年龄，体重，健康状况，性别，疾病严重程度，饮食和分泌速率在内的各种因素来确定肽的有效剂量。据此，本领域技术人员可以容易地确定适合于本文公开的药物组合物的特定用途的有效剂量。本文公开的药物组合物不特别限于制剂，给药途径和方式，只要它显示出合适的效果即可。
有益效果
本发明特异性的开发了针对HSP70单克隆抗体，该抗体能够有效的抑制HSP70的活性同时抑制宫颈癌细胞的增殖。同时将该抗体与负载有化学药的骨髓间充质干细胞一起联用后，能够更好的靶向治疗肿瘤提高药物的敏感性和治疗效果，具有极好的应用前景。
附图说明
图1单抗单独及联合药物对宫颈癌细胞存活率影响结果图
图2单抗单独及联合药物对宫颈癌细胞HSP70蛋白表达量的影响结果图
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
实施例1人HSP70单克隆抗体的制备
取5只BALB/c小鼠，以重组人HSP70蛋白(ab78427,abcam)为免疫原与福氏佐剂等量混合，免疫BALB/c小鼠，100μg/只，间隔2周/次。用ELISA法检测抗体血清效价达104时，选择效价最高的小鼠经脾加强免疫后3d，在无菌情况下取脾，采用传统的杂交瘤技术与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞融合，经次黄嘌呤、氨基蝶呤与胸苷(hypoxathine，aminopterinandthymidine，HAT)选择性培养融合后第13天，进行第1次ELISA双筛选，选出对人Hsp70呈强阳性且不与鼠HSP70反应的22孔进行亚克隆筛选，此后重复进行ELISA筛选及亚克隆3次，直至每个单克隆孔均呈强阳性。共获得3株阳性反应最强的杂交瘤细胞株。其中，1株能稳定分泌抗HSP70单抗的杂交瘤细胞株，命名为HSP70-3D9。
将高压(121℃，20min)灭菌的石蜡油注射到同型的Balb/c小鼠腹腔，0.5ml/只，1周后每只小鼠腹腔注射2×106个HSP70-3D9杂交瘤细胞，注射细胞10d后，当小鼠腹部膨胀且行动迟缓时抽取腹水，37℃温箱孵育1h后，3000r/min离心10min，弃去脂肪，收集中间澄清腹水，分装冻存备用。将腹水采用间接ELISA法测定mAb的效价为10-6，将所述腹水采用柱纯化后备用。具体的纯化步骤为用BufferA(0.05mol/L Boric acid，4.0mol/LNaCl，pH9.0)平衡柱子；加少量的腹水，用BufferA冲洗柱子；再用BufferB(0.05mol/L Sodiumphosphate,0.05mol/L Sodium citrate,0.3mol/L NaCl,pH3.0)洗脱；收集蛋白加入5％体积的1.0mol/L Tris-HCl(pH8.0)调节pH值，浓缩蛋白，得到了纯化后的抗体，调整浓度为1mg/mL备用。用Sigama小鼠单抗亚型检测试剂盒检测纯化抗体为IgG1亚类。
特异性鉴定：分别用100μg/mL的人重组HSP70蛋白、小鼠HSP70蛋白、GST蛋白及大肠杆菌裂解物为固相，ELISA检测单抗与其特异性反应。结果如表1所示。
表1HSP70-3D9单抗的特异性鉴定结果
各固相成分 OD490nm
人重组HSP70蛋白 2.464±0.031
小鼠HSP70蛋白 0.032±0.008
GST蛋白 0.016±0.002
大肠杆菌裂解物 0.021±0.004
从表1结果可以看出单抗只与重组人HSP70蛋白有较强的特异性反应，而与其它蛋白及宿主菌裂解物无交叉反应，表现了较好的特异性。
采用间接ELISA方法测定亲和力：将重组HSP70分别以5μg/ml开始梯度稀释后进行包被，加入倍比稀释的单克隆抗体，加入HRP标记羊抗鼠IgG，TMB显色测D(λ)值。以抗体浓度的对数为横座标，以D(λ)值为纵座标，单克隆抗体可得出多条反应曲线，以每条曲线上部平坦段的D(λ)值作为100％，在曲线上查,50％D(λ)值时相对应的抗体浓度，按本领域常用的公式Kaff＝(n-1)/2([Ab’]t-[Ab]t)计算亲和常数,HSP70-3D9单克隆抗体的亲和常数为5.39×10-10M，具有较好的亲和力。
通过轻重链可变区测序，鉴定得到该抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO：1所示，重链可变区序列如SEQ ID NO：2所示。
实施例2HSP70-3D9单克隆抗体和/或顺铂体外抗宫颈癌细胞实验
人宫颈癌细胞HT-3(中乔新舟，货号：ZQ0070)细胞复苏后，于DMEM培养液(含10％胎牛血清，3.7g/L碳酸氢钠，1×105U/L青霉素，100mg/L链霉素)，置37℃、饱和湿度、5％CO2培养箱中培养，0.25％胰酶消化后传代培养。
取对数生长期细胞，0.25％胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，并调整细胞密度为1×106/L，接种于96孔板中，每孔100μL，于5％CO2、饱和湿度、37℃培养箱中培养24h。分组为：(1)不同浓度(6.25、12.5、25、50、100μg/mL)HSP70-3D9单克隆抗体；(2)不同浓度(6.25、12.5、25、50、100μg/mL)HSP70-3D9单克隆抗体联合100μg/mL顺铂；(3)以PFT-μ为阳性对照(100μg/mL)；(4)顺铂单独给药组(100μg/mL)；(5)不加任何药物为阴性对照，每组设3个复孔，继续培养72h后每孔加入MTT(5g/L)15μL，继续培养4h，弃去培养液，每孔加入DMSO 150μL，培养箱内孵育30min，微量振荡器振荡10min使结晶物充分溶解，酶标仪在490nm波长下检测每孔的吸光度(A)值，计算细胞存活率：细胞存活率/％＝实验组A值/对照组A值×100％。以上实验重复3次。结果如图1所示。
从图1的结果可以看出，无论是单抗单独使用还是将HSP70-3D9单抗与顺铂联合使用，均可以相对于阴性对照有显著的降低细胞存活率的效果(P<0.05)。本领域都知道，Pifithrin-m(PFT-μ)是一种有高效的HSP70抑制剂，在细胞和动物水平上均有着很好的抑制作用。用100μg/mL浓度的PFT-μ作为阳性对照，与本发明的HSP70-3D9抗体相比较，本发明的抗体HSP70-3D9对于细胞的抑制效果具有更好的优势。而将本发明的HSP70-3D9抗体与顺铂进行合用，与单用顺铂比较，结果表明二者合用能增加顺铂对宫颈癌细胞的抑制作用。主要是因为当HSP70表达被抑制后，顺铂可通过诱导细胞发生明显的凋亡，进而抑制癌细胞增殖，即抑制HSP70表达能增加癌细胞对顺铂的敏感性。在100μg/mL单抗HSP70-3D9+100μg/mL顺铂联合作用下，癌细胞的存活率只有(9.01±2.04)％，具有较好的抑制效果。
Western印迹检测蛋白：各组细胞，用预冷的PBS洗涤，加入蛋白裂解液，提取总蛋白，用Bradford法测定蛋白质浓度。分别取50μg蛋白，变性后经5％SDS-PAGE浓缩胶和10％SDS-PAGE分离胶电泳，电泳完后取出凝胶转膜，将凝胶置于转移缓冲液中平衡20min，再15V30min半干转印蛋白到PVDF膜上，脱脂奶粉室温震荡封闭90min，孵一抗，4℃过夜。加辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗，37℃室温孵育1h。取等量ECL显色试剂A、B液混匀后孵育PVDF膜，显色拍照。以β-actin为内参。结果如图2所示。
Western blot实验结果显示HSP70单抗处理组的蛋白表达与阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。Western blot实验结果表明HSP70-3D9单抗处理癌细胞HSP70蛋白表达明显减弱，并且具有一定的浓度依赖性，而单抗和顺铂联用后，对于HSP70的抑制影响并不大，这也说明，顺铂和HSP70单抗联用的增益效果并不是通过进一步抑制HSP70蛋白的表达实现的。
实施例3骨髓间充质干细胞的制备及载药实验
将人骨髓间充质干细胞HBMSC(CQ80235，传秋生物)接种到培养基：DMEM90％+FBS10％+重组人碱性成纤维细胞生长因子5ng/mL+rhIGF-1
15ng/mL+L-Alanyl-L-Glutamine2.4mM中进行培养，待细胞长满瓶底面积80％，将0.25％胰酶-0.53mMEDTA消化液置于室温预热，倒掉培养瓶中的培养基，往培养瓶中加入3-5mlPBS，轻晃洗涤后弃去。往瓶中加1-2ml预热好的胰酶，置于室温孵育消化，消化好后加入3ml胰蛋白酶中和溶液终止消化。用移液枪轻轻吹打瓶壁上的细胞，使之完全脱落，然后收集细胞悬液，1000rpm离心3min，弃上清，加入培养基重悬细胞，进行传代，传代比例为1:3。收集培养的细胞备用。
将培养的人骨髓间充质干细胞HBMSC按照细胞浓度为1×105个/mL与浓度为5mg/ml顺铂在培养基中孵育24h后，通过低温离心400g，10分钟，收集负载了顺铂的人骨髓间充质干细胞。
用无顺铂的培养基洗涤人骨髓间充质干细胞，直至表面无结合的顺铂。取一定量的负载人骨髓间充质干细胞进行细胞裂解，通过质谱，测定平均每个单细胞的平均顺铂吸附量在约0.18ng左右。
实施例4载药干细胞和/或单克隆抗体对人宫颈癌裸鼠肿瘤模型的抑制作用
取增殖旺盛的对数生长期的人宫颈癌细胞HT-3，制成细胞悬液，用PBS悬浮细胞。将细胞悬液接种于裸鼠腋下皮下，接种量为每只裸鼠1×108细胞(100μL)，整个接种过程中将细胞置于冰上。实验选用雌性裸鼠，4-5周龄。待移植瘤体积达到约200mm3时，将荷瘤裸鼠随机分组，每组5只，具体分组如下：
A、空白给药对照组(PBS)；
B、顺铂组(2.5mg/kg)；
C、阳性对照PFT-μ组(5mg/kg)；
D、HSP70-3D9单抗组(1mg/kg)；
E、载药干细胞组(1×106个/kg)；
F、HSP70-3D9单抗联合载药干细胞组(单抗1mg/kg+载药干细胞1×106个/kg)；
G、HSP70-3D9单抗联合顺铂组(单抗1mg/kg+2.5mg/kg)；
开始腹腔注射给药，每隔5d给药1次，共给药3次。并用游标卡尺测量给药前后的瘤体积，分别记为a(最长径)，b(最短径)，瘤体积公式为V＝ab2/2。第一次给药后的第20d将小鼠脱臼处死拍照，剥离肿瘤，测量肿瘤体积，计算抑瘤率。结果如表2所示。
表2肿瘤体积(mm3，mean±SD)
Figure BDA0003719268600000101
Figure BDA0003719268600000111
从表2的结果可以看出，结果表明用药组的肿瘤体积生长速度明显慢于对照组(*P<0.01)。空白给药对照组平均瘤体积为为(856.8±29.5)mm3，单抗组平均瘤体积为(537.8±19.4)mm3，阳性对照组平均瘤体积为(583.4±21.2)mm3，载药干细胞组平均瘤体积为(396.4±15.3)mm3，单抗联合载药干细胞组平均瘤体积为(288.5±10.2)mm3，单抗联合顺铂组平均瘤体积为(349.5±13.6)mm3。从这个结果也可以看出，载药干细胞具有一定的肿瘤靶向性，能够更好的针对肿瘤部位进行药物释放，进而起到更好的抑制肿瘤生长的效果。载药干细胞组与单抗联合使用后，通过单抗抑制HSP70的活性后，能够显著的提高顺铂的药物敏感性，治疗效果得到显著的提高。
将各组小鼠的肝肾组织通过HE染色结果表明，而相对于PBS组，单抗组以及单抗联合用药组的肝肾组织并未出现明显的坏死，表明本发明的药物无明显的毒副作用。
应当理解的是，本发明在其应用上并不一定局限于在以下说明中所描述和/或在附图中所说明的组件的构造和布置的细节。本发明能够具有除所述和以不同方式实践或进行的那些实施方案之外的实施方案。而且，应理解本文所采用的短语和术语以及摘要出于描述目的并且不应视为限制性的。
序列表
<110> 南京皓羽生物科技有限公司
<120> 抑制剂联合骨髓间充质干细胞在治疗癌症中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Gln Met
20 25 30
Asp Lys Arg Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Asp Ile Val Ala Arg Ser Tyr Cys Phe Gln Arg Lys Asn Thr Ile
50 55 60
Trp Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Glu Thr Gln His Phe Asp Asp Gly Ala Ala Asn Gly Trp Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ala Tyr Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Phe Asp Asn Trp Asn Gly Gln Lys Cys
20 25 30
Pro Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Val Ile Thr Trp Arg Gln Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gln Asp Tyr Asn Val Thr Glu
85 90 95
His Arg Val Pro Met Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110

Claims (5)

1.特异性针对HSP70的单克隆抗体HSP70-3D9，所述抗体的可变区具体序列如下：
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，
所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.HSP70特异性的单克隆抗体在制备治疗宫颈癌的药物组合物中的用途，其中，HSP70的单克隆抗体为HSP70-3D9，所述抗体的可变区具体序列如下：
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.HSP70特异性的单克隆抗体和负载有顺铂的骨髓间充质干细胞在制备治疗宫颈癌的药物组合物中的用途，其中，HSP70的单克隆抗体为HSP70-3D9，所述抗体的可变区具体序列如下：
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；
所述负载有顺铂的骨髓间充质干细胞是通过将培养的人骨髓间充质干细胞按照细胞浓度为1×105个/mL与浓度为5mg/ml顺铂在培养基中孵育24h后，通过离心400g，10分钟，收集获得的负载了顺铂的人骨髓间充质干细胞。
4.如权利要求2或3任一项所述的用途，其特征在于所述药物组合物中还含有药学上可接受的载体。
5.如权利要求2或3任一项所述的用途，其特征在于所述药物组合物为注射剂型。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US20150025052A1 (en) * 2013-07-16 2015-01-22 Georgia Regents Research Institute, Inc. Compositions and Methods for Inhibiting HSP90/HSP70 Machinery
CN108484776A (zh) * 2018-03-19 2018-09-04 首都医科大学附属北京朝阳医院 一种融合蛋白、制备方法及其应用

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