CN115006442B - 一种牛大力废弃物中天然活性成分的高效制备方法及牛大力废弃物天然活性成分提取液 - Google Patents
一种牛大力废弃物中天然活性成分的高效制备方法及牛大力废弃物天然活性成分提取液 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种牛大力废弃物中天然活性成分的高效制备方法及牛大力废弃物天然活性成分提取液。该高效制备方法包括如下步骤：将牛大力废弃物粉末、乙醇溶液和纤维素酶混合，在温度为30～60℃下提取40～80min，然后超声5～15min，过滤取滤液，即得所述牛大力废弃物中天然活性成分。本发明提供的高效制备方法可实现牛大力废弃物中多种天然活性成分的高效提取，为牛大力废弃物资源化利用提供了有力的技术支撑。
Description
技术领域
本发明涉及牛大力综合利用技术领域，特别涉及一种牛大力废弃物中天然活性成分的高效制备方法及牛大力废弃物天然活性成分提取液。
背景技术
南药是广东乡村振兴的重点发展产业之一，牛大力是重要南药之一。牛大力，俗称山莲藕(广东、广西)、血藤、九龙串珠、甜牛大力、牛古大力(广西)、大力薯(广东)等，主要分布于福建、湖南、广东、广西、海南、贵州等地。牛大力性味甘、平，具有补虚润肺、强筋活络的功用，临床证明其对腰肌劳损、风湿性关节炎、肺结核、慢性支气管炎等慢性疾病有一定疗效，是我国华南地区重要的南药。20世纪70年代始作为壮腰健肾丸、强力健身胶囊等的原料药材用于中成药生产，在两广地区广泛应用，为岭南地区著名的药食两用植物，其作为药材已有悠久的应用历史。但是，牛大力以干燥块根入药，一般做成传统的保健食材，也可以用来做药酒、养生粥等，而其茎干和枝叶在传统方法上是不可利用的，成为牛大力生产的废弃物。
近年来，随着南药产业的快速发展，牛大力种植面积不断扩大，华南地区已达100万亩，而且种植面积还在快速增长。牛大力作为多年生豆科植物，其藤叶生物量巨大，每亩每年修剪出的藤叶超过5吨，总共核算为500万吨，以往这些藤叶主要作为废弃物被丢弃或焚烧，造成巨大的生物资源浪费和环境污染。
近年来，随着我国乡村振兴工作的推进和大健康产业的发展，农业废弃物资源化利用越来越受到重视，研究发现牛大力藤叶蕴含的巨大经济价值，其含有丰富的黄酮、多酚、多糖、维生素、亚油酸等天然活性成分，展现良好的抗氧化、抗炎和抑菌等活性功效和较高的营养功效。可将其应用于饲料加工、日化品生产等众多领域。
现有的提取工艺(例如发明名称为一种牛大力中黄酮类成分的提取方法的专利、一种牛大力多糖及制备方法以及其在抗菌方面中的应用的专利)主要是利用醇提和热水回流的方式从牛大力(干燥块根)中提取多糖、黄酮等天然活性组分，如将该方法用于提取牛大力废弃物，存在提取率低的问题。
因此，开发一种针对牛大力废弃物的提取工艺，以实现对天然活性成分的高效提取具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的针对牛大力中的天然活性组分的提取工艺用于牛大力废弃物的提取时提取率低的问题，提供一种牛大力废弃物中天然活性成分的高效制备方法。本发明提供的高效制备方法可实现牛大力废弃物中多种天然活性成分的高效提取，为牛大力废弃物资源化利用提供了有力的技术支撑。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种牛大力废弃物中天然活性成分的高效制备方法，包括如下步骤：将牛大力废弃物粉末、乙醇溶液和纤维素酶混合，在温度为30～60℃下提取40～80min，然后超声5～15min，过滤取滤液，即得所述牛大力废弃物中天然活性成分；所述牛大力废弃物粉末和乙醇溶液的料液比为1:20～1:70g/mL。
牛大力废弃物中含有多糖、多酚、黄酮等多种天然活性成分。由于这些天然活性成分的性质各异，很难同时实现多种天然活性成分的高效提取。
本发明的发明人尝试利用乙醇作为提取溶剂，对牛大力废弃物中的天然活性成分进行提取，发现在该醇提工艺条件下，各类天然活性成分的提取率差异很大，无法实现各类天然活性成分的高效提取；本发明的发明人也尝试利用酶的酶解作用对牛大力废弃物中的天然活性成分进行提取，发现常规的果胶酶、木瓜蛋白酶等对各类天然活性成分的提取率差异很大，即使使用多种酶组合(例如木瓜蛋白酶+纤维素酶)，该生物酶解工艺提取效果也不佳。利用超声波辅助醇提工艺或利用超声波辅助生物酶解工艺，相对于之前单独醇提工艺或生物酶解工艺，提取率虽然得到了一定的提高，但仍有较大的提升空间。
经反复研究发现，将特定的醇提工艺、超声工艺及生物酶解工艺有机结合，可同时实现牛大力废弃物中的天然活性成分的高效提取，提取率不仅显著优于现有的一些提取工艺，也显著优于醇提工艺、超声工艺及生物酶解工艺两两组合的工艺，为牛大力废弃物资源化利用提供了有力的技术支撑。
优选地，所述牛大力废弃物为牛大力藤叶。
优选地，所述牛大力废弃物粉末通过如下过程制备得到：将牛大力废弃物剪切晒干后研磨成粉，过筛即得所述牛大力废弃物粉末。
优选地，所述乙醇溶液的体积分数为50～90％。
优选地，所述所述牛大力废弃物粉末和纤维素酶的质量比为10:1～50:1。
优选地，所述超声的功率为150～450W。
优选地，所述牛大力废弃物粉末和乙醇溶液的料液比为1:30g/mL，提取时间为60min。
在该条件下，具有更高的多糖提取率。
优选地，所述提取温度60℃，提取时间为60min。
在该条件下，具有更高的多酚提取率。
优选地，所述牛大力废弃物粉末和乙醇溶液的料液比为1:40，提取时间为60min。
在该条件下，具有更高的黄酮提取率。
优选地，所述天然活性成分为多糖、多酚或黄酮中的一种或几种。
本发明还请求保护一种牛大力废弃物天然活性成分提取液，通过上述制备方法制备得到。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的高效制备方法可实现牛大力废弃物中多种天然活性成分的高效提取，为牛大力废弃物资源化利用提供了有力的技术支撑。
附图说明
图1为葡萄糖质量浓度-吸光度标准曲线。
图2为没食子酸质量浓度-吸光度标准曲线。
图3为芦丁质量浓度-吸光度标准曲线。
图4为多糖提取单因素试验结果。
图5为多酚提取单因素试验结果。
图6为黄酮提取单因素试验结果。
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件；所使用的原料、试剂等，如无特殊说明，均为可从常规市场等商业途径得到的原料和试剂。本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
本发明各实施例及对比例中所使用的试剂与仪器信息如下：
1.试剂
2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothia-zoline-6-sulfonic acid),ABTS)98％上海麦克林生化科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-Diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazyl,DPPH)纯度≥98％西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；没食子酸、碳酸钠、无水乙醇分析纯天津市大茂化学试剂厂；福林酚南京都莱生物技术有限公司；蒽酮上海展云化工有限公司；纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶河南万邦实业有限公司；葡萄糖比克曼生物科技有限公司；L-抗坏血酸上海麦克林生化科技有限公司；其余试剂均为国产分析纯试剂。
2.仪器
UV-2450型紫外分光光度计美国安捷伦科技有限公司；BSA 124S型电子分析天平赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；THZ-82型水浴恒温振荡器中国荣华仪器制造有限公司；L400台式低速自动平衡离心机长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司；SCIENTZ-10N真空冷冻干燥机宁波新芝生物科技股份有限公司。
本发明各实施例及对比例中所使用的如下物质、试剂或标准曲线通过如下过程得到：
1.牛大力废弃物藤叶粉末的制备
牛大力藤叶采摘自广东省云浮市小阳农业南药牛大力标准化种植基地，2021年8月采摘于该基地2017年10月所种植的批次。经剪切晒干后磨碎成粉，过50目筛后干燥保存备用。
2.标准曲线的绘制
(1)葡萄糖标准曲线的绘制
采用硫酸蒽酮法，精确称取0.20g蒽酮溶于100mL体积分数为80％的硫酸中，当日配制使用。精确称量10.0mg葡萄糖，用超纯水溶解并定容至100mL配制葡萄糖标准溶液(0.1mg/mL)。用1.0mL的移液管分别移取0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL的葡萄糖标准溶液于10mL试管中，再用2.0mL的移液管分别移取2.0mL、1.8mL、1.6mL、1.4mL、1.2mL、1.0mL的超纯水进试管，使其总体积均为2.0mL。接着将其置于冰水浴中5分钟，再用10.0mL的移液管分别吸取8.0m L配制好的蒽酮试剂进试管，接着将其沸水浴中准确煮沸10min，取出，用自来水冷却，室温放置10min。用10mm比色皿，在620nm条件下用分光光度计进行吸光度的测定。以葡萄糖质量浓度(ug/mL)为横坐标，吸光度为纵坐标，用origin 2021软件描绘葡萄糖质量浓度-吸光度标准曲线图，得回归方程，如图1。
根据葡萄糖质量浓度Y(μg/mL)与紫外分光吸光度X(Abs)之间的对应关系，建立线性方程，绘制相对应的标准曲线，Y＝0.0089X+0.0535，R2＝0.9991，在0μg/mL-50μg/mL上，吸光度与浓度线性表现良好，结果线性显示良好。
(2)没食子酸标准曲线的绘制
采用福林酚法，精确称量0.100±0.001g没食子酸，5mL 70％甲醇溶解，用超纯水定容至100mL配制没食子酸标准溶液(1mg/mL)。分别移取2.0mL、2.5mL、3.0mL、3.5mL、4.0mL、4.5mL的没食子酸标准溶液于100mL容量瓶中，分别用超纯水定容至刻度，摇匀，得到的质量浓度分别为20ug/mL～45ug/mL，间隔5ug/mL。分别移取不同质量浓度的没食子酸工作液1mL于10mL容量瓶中，加入5mL 10％的福林酚试剂，摇匀，反应3～8min，加入4mL 7.5％的碳酸钠溶液，加水定容至刻度，摇匀，室温下静置60min。用10mm比色皿，在765nm条件下用分光光度计进行吸光度的测定。以没食子酸质量浓度(ug/mL)为横坐标，吸光度为纵坐标，用origin 2021软件描绘没食子酸质量浓度-吸光度标准曲线图，得回归方程，如图2。
根据没食子酸浓度Y(μg/mL)与紫外分光吸光度X(Abs)之间的对应关系，建立线性方程，绘制相对应的标准曲线，标准曲线Y＝0.0114X+0.0149，R2＝0.9996。在0μg/mL-50μg/mL上，吸光度与浓度线性表现良好，结果线性显示良好。
(3)芦丁标准曲线的绘制
采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法，精密称取芦丁标准品10.0mg，用60％乙醇溶解并定容于50mL容量瓶中，摇匀，制得浓度为0.2mg/mL的芦丁标准液。分别精密量取芦丁标准液0.0mL(空白样)、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL、7.0mL、8.0mL、9.0mL、10.0mL置于25mL容量瓶中，分别加入2.0mL 30％乙醇和1.0mL 5％NaNO2溶液，摇匀，放置6min，再加入10％Al(NO3)3溶液1.0mL，摇匀，放置6min，然后再加10.0mL 4％NaOH溶液，用30％乙醇定容至刻度，摇匀，静置15min。在300-600nm波长处测定吸光度，确定最大吸收波长为510nm。接着以试剂空白为参比，在510nm处测吸光度，测得结果作芦丁质量浓度-吸光度标准曲线，得回归方程，如图3。
根据芦丁质量浓度Y(μg/mL)与紫外分光吸光度X(Abs)之间的对应关系，建立线性方程，绘制相对应的标准曲线，标准曲线Y＝0.0271X-0.0228，R2＝0.9999。在0μg/mL-30μg/mL上，吸光度与浓度线性表现良好，结果线性显示良好。
实施例1
本实施例提供一系列的牛大力废弃物中天然活性成分的高效制备方法，以多糖的提取率为评价指标，对提取工艺进行优化，具体过程如下。
准确称取制备好的牛大力废弃物藤叶粉末1g到烧杯中，以一定量的乙醇作为提取溶剂加入其中，再将100mg酶加入烧杯中，用保鲜膜将其封起，置于一定温度的恒温水浴锅中加热酶解及提取一定时间，接着拿去超声波清洗机中超声一定时间，之后将其进行抽滤，得滤液。
测定滤液中的多糖提取率：将滤液转移至离心管内，用无水乙醇醇沉12h，醇沉完毕后将其放置在离心机中5000r/min的参数下离心15min，后用滤布过滤，然后用无水乙醇洗涤三次除杂得到牛大力废弃物藤叶的多糖。将得到的多糖用50mL超纯水溶解，接着再稀释100倍，从中取1.0mL稀释后的样品液放置到冰箱中冷藏10min。采用上述硫酸蒽酮法测定多糖提取率，接着向其中加入4mL蒽酮试剂，将其置于沸水浴中煮沸10min，取出冷却至室温。用紫外分光光度计在620nm处测定样品溶液的吸光度，并将其代入上述葡萄糖质量浓度-吸光度标准曲线计算出多糖提取率。
对料液比(牛大力废弃物藤叶粉末(g):乙醇(mL)，1:10(g/mL)、1:30(g/mL)、1:50(g/mL)、1:70(g/mL)、1:90(g/mL))、提取温度(50℃、55℃、60℃、65℃、70℃)、酶解时间(20min、40min、60min、80min、100min)、超声时间(0min、5min、10min、15min、20min)、酶种类(纤维素酶+果胶酶(50mg:50mg)、果胶酶(100mg)、纤维素酶(100mg)、木瓜蛋白酶(100mg)、纤维素酶+木瓜蛋白酶(50mg:50mg))进行单因素实验。
(1)料液比单因素试验过程
分别准确称取5份制备好的牛大力废弃物藤叶粉末各1g到五个烧杯中，接着分别将10mL、30mL、50mL、70mL、90mL的70％乙醇溶液加入各烧杯中，再将100mg纤维素酶加入各烧杯中(料液比1:10、1:30、1:50、1:70、1:90)，用保鲜膜将其封起，置于60℃的恒温水浴锅中加热酶解60min，接着拿去超声波清洗机中超声10min，之后将其进行抽滤，将滤液转移至离心管内，用无水乙醇醇沉12h，醇沉完毕后将其放置在离心机中5000r/min的参数下离心15min，后用滤布过滤，然后用无水乙醇洗涤三次除杂得到牛大力废弃物藤叶的多糖。将得到的多糖用50mL超纯水溶解，接着再稀释100倍，从中取1.0mL稀释后的样品液放置到冰箱中冷藏10min。采用上述硫酸蒽酮法测定多糖提取率，接着向其中加入4mL蒽酮试剂，将其置于沸水浴中煮沸10min，取出冷却至室温。用紫外分光光度计在620nm处测定样品溶液的吸光度，并将其代入上述葡萄糖质量浓度-吸光度标准曲线分别计算出不同料液比下的多糖提取率。
(2)提取温度单因素试验过程
分别准确称取5份制备好的牛大力废弃物藤叶粉末各1g到五个烧杯中，接着将50mL的70％乙醇溶液加入其中，再将100mg纤维素酶加入烧杯中(料液比1:50)，用保鲜膜将其封起，然后将5个烧杯分别置于50℃、55℃、60℃、65℃、70℃的恒温水浴锅中加热，用纤维素酶解60min，接着拿去超声波清洗机中超声10min，之后将其进行抽滤，将滤液转移至离心管内，用无水乙醇醇沉12h，醇沉完毕后将其放置在离心机中5000r/min的参数下离心15min，后用滤布过滤，然后用无水乙醇洗涤三次除杂得到牛大力废弃物藤叶的多糖。将得到的多糖用50mL超纯水溶解，接着再稀释100倍，从中取1.0mL稀释后的样品液放置到冰箱中冷藏10min。采用上述硫酸蒽酮法测定多糖提取率，接着向其中加入4mL蒽酮试剂，将其置于沸水浴中煮沸10min，取出冷却至室温。用紫外分光光度计在620nm处测定样品溶液的吸光度，并将其代入上述葡萄糖质量浓度-吸光度标准曲线分别计算出多糖提取率。
(3)酶解时间单因素实验过程
分别准确称取5份制备好的牛大力废弃物藤叶粉末各1g到五个烧杯中，接着将50mL的70％乙醇溶液加入其中，再将100mg纤维素酶加入烧杯中(料液比1:50)，用保鲜膜将其封起，然后将其置于60℃的恒温水浴锅中加热，分别用纤维素酶解20min、40min、60min、80min、100min，接着拿去超声波清洗机中超声10min，之后将其进行抽滤，将滤液转移至离心管内，用无水乙醇醇沉12h，醇沉完毕后将其放置在离心机中5000r/min的参数下离心15min，后用滤布过滤，然后用无水乙醇洗涤三次除杂得到牛大力废弃物藤叶的多糖。将得到的多糖用50mL超纯水溶解，接着再稀释100倍，从中取1.0mL稀释后的样品液放置到冰箱中冷藏10min。采用上述硫酸蒽酮法测定多糖提取率，接着向其中加入4mL蒽酮试剂，将其置于沸水浴中煮沸10min，取出冷却至室温。用紫外分光光度计在620nm处测定样品溶液的吸光度，并将其代入上述葡萄糖质量浓度-吸光度标准曲线分别计算出多糖提取率。
(4)超声时间单因素实验过程
分别准确称取5份制备好的牛大力废弃物藤叶粉末各1g到五个烧杯中，接着将50mL的70％乙醇溶液加入其中，再将100mg纤维素酶加入烧杯中(料液比1：50)，用保鲜膜将其封起，然后将其置于60℃的恒温水浴锅中加热，用纤维素酶解60min，接着分别拿去超声波清洗机中超声0min、5min、10min、15min、20min，之后将其进行抽滤，将滤液转移至离心管内，用无水乙醇醇沉12h，醇沉完毕后将其放置在离心机中5000r/min的参数下离心15min，后用滤布过滤，然后用无水乙醇洗涤三次除杂得到牛大力废弃物藤叶的多糖。将得到的多糖用50mL超纯水溶解，接着再稀释100倍，从中取1.0mL稀释后的样品液放置到冰箱中冷藏10min。采用上述硫酸蒽酮法测定多糖提取率，接着向其中加入4mL蒽酮试剂，将其置于沸水浴中煮沸10min，取出冷却至室温。用紫外分光光度计在620nm处测定样品溶液的吸光度，并将其代入上述葡萄糖质量浓度-吸光度标准曲线分别计算出多糖提取率。
(5)酶种类单因素实验过程
分别准确称取5份制备好的牛大力废弃物藤叶粉末各1g到五个烧杯中，接着将50mL的70％乙醇溶液加入其中，再将100mg酶加入烧杯中(料液比1：50)，用保鲜膜将其封起，然后将其置于60℃的恒温水浴锅中加热，分别用纤维素酶+果胶酶(50mg:50mg)、果胶酶、纤维素酶、木瓜蛋白酶、纤维素酶+木瓜蛋白酶(50mg:50mg)酶解60min，接着拿去超声波清洗机中超声10min，之后将其进行抽滤，将滤液转移至离心管内，用无水乙醇醇沉12h，醇沉完毕后将其放置在离心机中5000r/min的参数下离心15min，后用滤布过滤，然后用无水乙醇洗涤三次除杂得到牛大力废弃物藤叶的多糖。将得到的多糖用50mL超纯水溶解，接着再稀释100倍，从中取1.0mL稀释后的样品液放置到冰箱中冷藏10min。采用上述硫酸蒽酮法测定多糖提取率，接着向其中加入4mL蒽酮试剂，将其置于沸水浴中煮沸10min，取出冷却至室温。用紫外分光光度计在620nm处测定样品溶液的吸光度，并将其代入上述葡萄糖质量浓度-吸光度标准曲线分别计算出多糖提取率。
图4为单因素实验结果图。从图4(a)～图4(e)可知，影响从大到小的因素分别为酶种类>提取料液比>酶解时间>超声时间>提取温度，酶种类对多糖的提取率具有非常显著的影响，料液比、酶解时间对多糖的提取率有较大的影响，超声时间对多糖的提取率有一定的影响，而提取温度对多糖的提取率影响较小。具体地，随着料液比增加，提取率先增后减，最大值为9.31％，这可能是由于继续增加液料比，纤维素酶的有效作用浓度被稀释，酶解不充分，最终多糖得率下降。温度升高有利于加快分子间的运动，提高纤维素酶的活性，此时提取率最大值为3.64％，之后，由于多糖在较高温度下可能发生氧化或者降解，而且纤维素酶可能因温度过高而失去活性，提取率由此开始下降。酶解时间刚开始增加时，提取率不断增加，之后由于提取时间过长，多糖类物质发生了分解，使得提取率开始下降。酶解时间增加时，多糖提取率也增加，之后随着酶解时间继续升高，使得牛大力藤叶中的杂质溶出增多，导致多糖含量下降，提取率逐渐下降。提取率随超声时间的增加先增后减，在10min时达到最大值为8.45％。酶种类的不同极大影响多糖的提取率，纤维素酶对其提取率最高，为13.62％。
故选取酶解时间、酶种类、料液比三个因素进行L9(34)正交试验设计，以多糖提取率为指标确定最佳提取工艺，超声时间做误差列。正交试验因素与水平见表1，正交试验设计及结果如表2。其余条件为：超声时间为10min，提取温度为60℃。
表1多糖提取正交试验因素与水平
表2多糖的正交试验设计及结果
影响从大到小的因素分别为酶种类>提取料液比>酶解时间>超声时间>提取温度。同时，可知牛大力废弃物藤叶中多糖提取的最佳工艺组合为：1:30(g/mL)的提取料液比，纤维素酶，60min的酶解时间。通过该最佳提取工艺组合所得到的多糖，重复3次实验得到的提取率为16.44％。
针对该最佳提取工艺得到的滤液，同时测定其多酚提取率和黄酮提取率。
(1)多酚提取率测定：
采用上述福林酚法测定多酚提取率。移取滤液1mL于10mL容量瓶中，加入5mL 10％的福林酚试剂，摇匀，反应3～8min，加入4mL 7.5％的碳酸钠溶液，加水定容至刻度，摇匀，室温下静置60min。用10mm比色皿，在765nm条件下用分光光度计进行吸光度的测定。并将其代入上述没食子酸质量浓度-吸光度标准曲线计算出多酚提取率。重复三次实验得到的多酚提取率为13.78％。
(2)黄酮提取率测定：
采用上述亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法测定黄酮提取率，在510nm处测吸光度，测得结果代入芦丁质量浓度-吸光度标准曲线计算出提取率。重复三次实验得到的黄酮提取率为12.54％。
可知，在多糖具有最高的提取率的情况下，多酚和黄酮的提取率也较高，可实现多种天然活性成分的高效提取。
实施例2
本实施例提供一系列的牛大力废弃物中天然活性成分的高效制备方法，以多酚的提取率为评价指标，对提取工艺进行优化，具体过程如下。
准确称取制备好的牛大力废弃物藤叶粉末1g到烧杯中，以一定量的一定浓度乙醇作为提取溶剂加入其中，再将20mg酶加入烧杯中，用保鲜膜将其封起，置于一定温度的恒温水浴锅中加热酶解及提取一定时间，接着拿去超声波清洗机中超声一定时间，之后将其进行抽滤，得滤液。
测定滤液中的多酚提取率：
按照实施例1中相同的方法得到多酚提取率。
对料液比(1:10(g/mL)、1:20(g/mL)、1:30(g/mL)、1:40(g/mL)、1:50(g/mL))、提取温度(30℃、40℃、50℃、60℃、70℃)、酶解时间(20min、40min、60min、80min、100min)、乙醇浓度(50％、60％、70％、80％、90％)、酶种类(纤维素酶+果胶酶、果胶酶、纤维素酶、木瓜蛋白酶、纤维素酶+木瓜蛋白酶)进行单因素实验。
(1)料液比单因素试验过程
分别准确称取5份制备好的牛大力废弃物藤叶粉末各1g到五个烧杯中，接着分别将10mL、20mL、30mL、40mL、50mL的70％乙醇溶液加入各烧杯中，再将20mg纤维素酶加入各烧杯中(料液比1：10、1：20、1：30、1：40、1：50)，用保鲜膜将其封起，置于50℃的恒温水浴锅中加热60min，接着拿去超声波清洗机中超声10min，之后将其进行抽滤，记录滤液体积V，即得到牛大力废弃物藤叶多酚提取液，采用上述福林酚法测定多酚提取率。移取牛大力废弃物藤叶多酚提取液1mL于10mL容量瓶中，加入5mL 10％的福林酚试剂，摇匀，反应3～8min，加入4mL 7.5％的碳酸钠溶液，加水定容至刻度，摇匀，室温下静置60min。用10mm比色皿，在765nm条件下用分光光度计进行吸光度的测定。并将其代入上述没食子酸质量浓度-吸光度标准曲线分别计算出多酚提取率。
(2)提取温度单因素试验过程
分别准确称取5份制备好的牛大力废弃物藤叶粉末各1g到五个烧杯中，接着将30mL的70％乙醇溶液加入各烧杯中，再将20mg纤维素酶加入各烧杯中，用保鲜膜将其封起，分别置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃的恒温水浴锅中加热，接着拿去超声波清洗机中超声10min，之后将其进行抽滤，记录滤液体积V，即得到牛大力废弃物藤叶多酚提取液，采用上述福林酚法测定多酚提取率。移取牛大力废弃物藤叶多酚提取液1mL于10mL容量瓶中，加入5mL 10％的福林酚试剂，摇匀，反应3～8min，加入4mL 7.5％的碳酸钠溶液，加水定容至刻度，摇匀，室温下静置60min。用10mm比色皿，在765nm条件下用分光光度计进行吸光度的测定。并将其代入上述没食子酸质量浓度-吸光度标准曲线分别计算出多酚提取率。
(3)酶解时间单因素试验过程
分别准确称取5份制备好的牛大力废弃物藤叶粉末各1g到五个烧杯中，接着将30mL的70％乙醇溶液加入各烧杯中，再将20mg纤维素酶加入各烧杯中，用保鲜膜将其封起，置于50℃的恒温水浴锅中分别加热20min、40min、60min、80min、100min，接着拿去超声波清洗机中超声10min，之后将其进行抽滤，记录滤液体积V，即得到牛大力废弃物藤叶多酚提取液，采用上述福林酚法测定多酚提取率。移取牛大力废弃物藤叶多酚提取液1mL于10mL容量瓶中，加入5mL 10％的福林酚试剂，摇匀，反应3～8min，加入4mL 7.5％的碳酸钠溶液，加水定容至刻度，摇匀，室温下静置60min。用10mm比色皿，在765nm条件下用分光光度计进行吸光度的测定。并将其代入上述没食子酸质量浓度-吸光度标准曲线分别计算出多酚提取率。
(4)乙醇浓度单因素试验过程
分别准确称取5份制备好的牛大力废弃物藤叶粉末各1g到五个烧杯中，接着分别将30mL的50％、60％、70％、80％、90％乙醇溶液加入各烧杯中，再将20mg纤维素酶加入各烧杯中，用保鲜膜将其封起，置于50℃的恒温水浴锅中加热60min，接着拿去超声波清洗机中超声10min，之后将其进行抽滤，记录滤液体积V，即得到牛大力废弃物藤叶多酚提取液，采用上述福林酚法测定多酚提取率。移取牛大力废弃物藤叶多酚提取液1mL于10mL容量瓶中，加入5mL 10％的福林酚试剂，摇匀，反应3～8min，加入4mL 7.5％的碳酸钠溶液，加水定容至刻度，摇匀，室温下静置60min。用10mm比色皿，在765nm条件下用分光光度计进行吸光度的测定。并将其代入上述没食子酸质量浓度-吸光度标准曲线分别计算出多酚提取率。
(5)酶种类单因素试验过程
分别准确称取5份制备好的牛大力废弃物藤叶粉末各1g到五个烧杯中，接着将30mL的70％乙醇溶液加入各烧杯中，再分别将20mg纤维素酶+果胶酶(10mg:10mg)、果胶酶(20mg)、纤维素酶(20mg)、木瓜蛋白酶(20mg)、纤维素酶+木瓜蛋白酶(10mg:10mg)加入各烧杯中，用保鲜膜将其封起，置于50℃的恒温水浴锅中加热60min，接着拿去超声波清洗机中超声10min，之后将其进行抽滤，记录滤液体积V，即得到牛大力废弃物藤叶多酚提取液，采用上述福林酚法测定多酚提取率。移取牛大力废弃物藤叶多酚提取液1mL于10mL容量瓶中，加入5mL 10％的福林酚试剂，摇匀，反应3～8min，加入4mL 7.5％的碳酸钠溶液，加水定容至刻度，摇匀，室温下静置60min。用10mm比色皿，在765nm条件下用分光光度计进行吸光度的测定。并将其代入上述没食子酸质量浓度-吸光度标准曲线分别计算出多酚提取率。
图5为单因素试验结果图。从图5(a)～图5(e)可知，影响从大到小的因素分别为酶种类>酶解时间>提取温度>乙醇浓度>料液比，酶种类对多酚的提取率具有非常显著的影响，提取温度、酶解时间对多酚的提取率有较大的影响，乙醇浓度对多酚的提取率有一定的影响，而料液比对多酚的提取率影响较小。具体地，随着料液比增加，提取率先增后减，最大值为17.21％，这可能是由于继续增加液料比，纤维素酶的有效作用浓度被稀释，酶解不充分，最终多酚得率下降。温度升高有利于加快分子间的运动，提高纤维素酶的活性，此时提取率最大值为16.71％，之后，由于多酚在较高温度下可能发生氧化或者降解，而且纤维素酶可能因温度过高而失去活性，提取率由此开始下降。提取时间刚开始增加时，提取率不断增加，之后由于提取时间过长，多酚发生了分解，使得提取率开始下降。在乙醇浓度较低时，水溶性糖类等物质会溶出，影响多酚的提取，随着乙醇浓度的增加，多酚与乙醇溶剂的极性越来越接近，根据相似相溶原理，多酚的提取量会增大，但乙醇溶液过高时，一些脂溶性成分会浸出，同时乙醇与多酚类物质极性差异变大，还有乙醇溶液在高体积分数条件下会挥发出来，这些都会影响多酚的提取效果，酶种类的不同极大影响多糖的提取率，纤维素酶对其提取率最高，为12.51％。
故选取提取时间、酶种类、提取温度三个因素进行L9(34)正交试验设计，以多酚提取率为指标确定最佳提取工艺，乙醇浓度做误差列。正交试验因素与水平见表3，正交试验设计及结果如表4。其余条件为：料液比1:30(g/mL)、乙醇浓度70％
表3多酚提取的正交试验因素与水平
表4多酚的正交试验设计及结果
影响从大到小的因素分别为酶种类>酶解时间>提取温度>乙醇浓度>料液比。同时，可知牛大力废弃物藤叶中多酚提取的最佳工艺组合为：纤维素酶，60℃的提取温度，60min的提取时间。通过该最佳提取工艺组合所得到的多酚，重复3次实验得到的提取率为15.21％。
针对该最佳提取工艺得到的滤液，按照实施例1相同的方法测定其多糖提取率和黄酮提取率。重复三次实验得到的多糖提取率为14.39％。重复三次实验得到的黄酮提取率为11.84％。
可知，在多酚具有最高的提取率的情况下，多糖和黄酮的提取率也较高，可实现多种天然活性成分的高效提取。
实施例3
本实施例提供一系列的牛大力废弃物中天然活性成分的高效制备方法，以黄酮的提取率为评价指标，对提取工艺进行优化，具体过程如下。
准确称取制备好的牛大力废弃物藤叶粉末1g到烧杯中，以一定量的一定浓度乙醇作为提取溶剂加入其中，再将40mg酶加入烧杯中，用保鲜膜将其封起，置于一定温度的恒温水浴锅中加热酶解及提取一定时间，接着拿去超声波清洗机中超声10，之后将其进行抽滤，得滤液。
按照实施例1中相同的方法得到黄酮提取率。
对料液比(1:10(g/mL)、1:20(g/mL)、1:30(g/mL)、1:40(g/mL)、1:50(g/mL))、提取温度(30℃、40℃、50℃、60℃、70℃)、酶解时间(20min、40min、60min、80min、100min)、乙醇浓度(50％、60％、70％、80％、90％)、酶种类(纤维素酶+果胶酶(20mg:20mg)、果胶酶(40mg)、纤维素酶(40mg)、木瓜蛋白酶(40mg)、纤维素酶+木瓜蛋白酶(20mg:20mg))进行单因素试验。
(1)料液比单因素试验过程
分别准确称取5份制备好的牛大力废弃物藤叶粉末各1g到五个烧杯中，接着分别将10mL、20mL、30mL、40mL、50mL的70％乙醇溶液加入各烧杯中，再将40mg纤维素酶加入各烧杯中(料液比1:10、1:20、1:30、1:40、1:50)，用保鲜膜将其封起，置于50℃的恒温水浴锅中加热60min，接着拿去超声波清洗机中超声10min，之后将其进行抽滤，记录滤液体积V，即得到牛大力废弃物藤叶黄酮提取液。移取10.0mL牛大力废弃物藤叶黄酮提取液置于25mL容量瓶中，分别加入3.0mL 30％乙醇和1.0mL 5％NaNO2溶液，摇匀，放置6min，再加入10％Al(NO3)3溶液1.0mL，摇匀，放置6min，然后再加10.0mL 4％NaOH溶液，用30％乙醇定容至刻度，摇匀，静置15min。在510nm处测吸光度，测得结果代入芦丁质量浓度-吸光度标准曲线计算出提取率。
(2)提取温度单因素试验过程
分别准确称取5份制备好的牛大力废弃物藤叶粉末各1g到五个烧杯中，接着将30mL的70％乙醇溶液加入各烧杯中，再将40mg纤维素酶加入各烧杯中(1：30)，用保鲜膜将其封起，分别置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃的恒温水浴锅中加热60min，接着拿去超声波清洗机中超声10min，之后将其进行抽滤，记录滤液体积V，即得到牛大力废弃物藤叶黄酮提取液。移取10.0mL牛大力废弃物藤叶黄酮提取液置于25mL容量瓶中，分别加入3.0mL 30％乙醇和1.0mL 5％NaNO2溶液，摇匀，放置6min，再加入10％Al(NO3)3溶液1.0mL，摇匀，放置6min，然后再加10.0mL 4％NaOH溶液，用30％乙醇定容至刻度，摇匀，静置15min。在510nm处测吸光度，测得结果代入芦丁质量浓度-吸光度标准曲线计算出提取率。
(3)酶解时间单因素试验过程
分别准确称取5份制备好的牛大力废弃物藤叶粉末各1g到五个烧杯中，接着将30mL的70％乙醇溶液加入各烧杯中，再将40mg纤维素酶加入各烧杯中(1：30)，用保鲜膜将其封起，置于50℃的恒温水浴锅中分别加热20min、40min、60min、80min、100min，接着拿去超声波清洗机中超声10min，之后将其进行抽滤，记录滤液体积V，即得到牛大力废弃物藤叶黄酮提取液。移取10.0mL牛大力废弃物藤叶黄酮提取液置于25mL容量瓶中，分别加入3.0mL30％乙醇和1.0mL 5％NaNO2溶液，摇匀，放置6min，再加入10％Al(NO3)3溶液1.0mL，摇匀，放置6min，然后再加10.0mL 4％NaOH溶液，用30％乙醇定容至刻度，摇匀，静置15min。在510nm处测吸光度，测得结果代入芦丁质量浓度-吸光度标准曲线计算出提取率。
(4)乙醇浓度单因素试验过程
分别准确称取5份制备好的牛大力废弃物藤叶粉末各1g到五个烧杯中，接着分别将30mL的50％、60％、70％、80％、90％乙醇溶液加入各烧杯中，再将40mg纤维素酶加入各烧杯中(1：30)，用保鲜膜将其封起，置于50℃的恒温水浴锅中加热60min，接着拿去超声波清洗机中超声10min，之后将其进行抽滤，记录滤液体积V，即得到牛大力废弃物藤叶黄酮提取液。移取10.0mL牛大力废弃物藤叶黄酮提取液置于25mL容量瓶中，分别加入3.0mL 30％乙醇和1.0mL 5％NaNO2溶液，摇匀，放置6min，再加入10％Al(NO3)3溶液1.0mL，摇匀，放置6min，然后再加10.0mL 4％NaOH溶液，用30％乙醇定容至刻度，摇匀，静置15min。在510nm处测吸光度，测得结果代入芦丁质量浓度-吸光度标准曲线计算出提取率。
(5)酶种类单因素试验过程
分别准确称取5份制备好的牛大力废弃物藤叶粉末各1g到五个烧杯中，接着将30mL的70％乙醇溶液加入各烧杯中，再分别将40mg纤维素酶+果胶酶(20mg:20mg)、果胶酶(40mg)、纤维素酶(40mg)、木瓜蛋白酶(40mg)、纤维素酶+木瓜蛋白酶(20mg:20mg)加入各烧杯中，用保鲜膜将其封起，置于50℃的恒温水浴锅中加热60min，接着拿去超声波清洗机中超声10min，之后将其进行抽滤，记录滤液体积V，即得到牛大力废弃物藤叶黄酮提取液。移取10.0mL牛大力废弃物藤叶黄酮提取液置于25mL容量瓶中，分别加入3.0mL 30％乙醇和1.0mL 5％NaNO2溶液，摇匀，放置6min，再加入10％Al(NO3)3溶液1.0mL，摇匀，放置6min，然后再加10.0mL 4％NaOH溶液，用30％乙醇定容至刻度，摇匀，静置15min。在510nm处测吸光度，测得结果代入芦丁质量浓度-吸光度标准曲线计算出提取率。
图6为单因素试验结果图。从图6(a)～图6(e)可知，影响从大到小的因素分别为酶种类>酶解时间>料液比>乙醇浓度>提取温度，酶种类对多酚的提取率具有非常显著的影响，酶解时间、料液比对黄酮的提取率有较大的影响，乙醇浓度对多酚的提取率有一定的影响，而提取温度对多酚的提取率影响较小。具体地，随着料液比增加，提取率先增后减，最大值为10.42％，这可能是由于继续增加液料比，纤维素酶的有效作用浓度被稀释，酶解不充分，最终黄酮得率下降。提取温度升高有利于加快分子间的运动，提高纤维素酶的活性，此时提取率最大值为11.12％，之后，由于黄酮在较高温度下可能发生氧化或者降解，而且纤维素酶可能因温度过高而失去活性，提取率由此开始下降。提取时间刚开始增加时，提取率不断增加，之后由于提取时间过长，黄酮发生了分解，使得提取率开始下降。在乙醇浓度较低时，更多杂质会溶出，影响黄酮的提取，随着乙醇浓度的增加，黄酮与乙醇溶剂的极性越来越接近，根据相似相溶原理，黄酮的提取量会增大，但乙醇溶液过高时，一些脂溶性成分会浸出，同时乙醇与黄酮类物质极性差异变大，还有乙醇溶液在高体积分数条件下会挥发出来，这些都会影响黄酮的提取效果。酶种类的不同极大影响黄酮的提取率，纤维素酶对其提取率最高，为12.36％。
故选取酶解时间、纤维素酶含量、提取温度三个因素进行L9(34)正交试验设计，以黄酮提取率为指标确定最佳提取工艺，乙醇浓度做误差列。正交试验因素与水平见表5，正交试验设计及结果如表6。其余条件为：乙醇浓度为70％、提取温度为50℃、超声时间为10min。
表5黄酮提取的正交试验因素与水平
表6黄酮的正交试验设计及结果
影响从大到小的因素分别为酶种类>酶解时间>料液比>乙醇浓度>提取温度。同时，可知牛大力废弃物藤叶中黄酮提取的最佳工艺组合为：纤维素酶，1:30(g/mL)的提取料液比，60min的酶解时间。通过该最佳提取工艺组合所得到的多酚，重复3次实验得到的提取率为14.21％。
针对该最佳提取工艺得到的滤液，按照实施例1相同的方法测定其多糖提取率和多酚提取率。重复三次实验得到的多糖提取率为12.97％。重复三次实验得到的多酚提取率为11.77％。
可知，在多酚具有最高的提取率的情况下，多糖和黄酮的提取率也较高，可实现多种天然活性成分的高效提取。
实施例4
本实施例提供一系列的牛大力废弃物中天然活性成分的高效制备方法，以优化提取工艺，具体过程如下：
分别准确称取2份制备好的牛大力废弃物藤叶粉末各1g到两个烧杯中，接着分别将50mL的70％乙醇溶液和去离子水加入各烧杯中，再将100mg纤维素酶加入各烧杯中，用保鲜膜将其封起，置于60℃的恒温水浴锅中加热酶解60min，接着拿去超声波清洗机中超声10min，之后将其进行抽滤，将滤液转移至离心管内，用无水乙醇醇沉12h，醇沉完毕后将其放置在离心机中5000r/min的参数下离心15min，后用滤布过滤，然后用无水乙醇洗涤三次除杂得到牛大力废弃物藤叶的多糖。将得到的多糖用50mL超纯水溶解，接着再稀释100倍，从中取1.0mL稀释后的样品液放置到冰箱中冷藏10min。采用上述硫酸蒽酮法测定多糖提取率，接着向其中加入4mL蒽酮试剂，将其置于沸水浴中煮沸10min，取出冷却至室温。用紫外分光光度计在620nm处测定样品溶液的吸光度，并将其代入上述葡萄糖质量浓度-吸光度标准曲线分别计算出不同料液比下的多糖提取率。
实验结果显示，加入了50mL的70％乙醇溶液的这组，最优提取条件下其多糖提取率为16.44％，而以去离子水作为提取溶剂的一组，多糖提取率为4.25％，说明乙醇对此实验的提取率提高是极为重要的，而换成去离子水则降低了74.15％。
相应的，对这两组制备得到的滤液按照实施例1的方法测定多酚和黄酮提取率，与乙醇溶液作为提取溶剂相比，以水作为提取溶剂时，多酚提取率从13.78％降低到了3.68％，黄酮提取率从12.54％降低到了6.24％。
实施例5
本实施例提供一系列的牛大力废弃物中天然活性成分的高效制备方法，以优化提取工艺，具体过程如下：
分别准确称取2份制备好的牛大力废弃物藤叶粉末各1g到两个烧杯中，接着将30mL的70％乙醇溶液加入各烧杯中，其中一个烧杯中加入20mg纤维素酶，另一个则不加，用保鲜膜将其封起，将其置于50℃的恒温水浴锅中加热，接着拿去超声波清洗机中超声10min，之后将其进行抽滤，记录滤液体积V，即得到牛大力废弃物藤叶多酚提取液，采用上述福林酚法测定多酚提取率。移取牛大力废弃物藤叶多酚提取液1mL于10mL容量瓶中，加入5mL 10％的福林酚试剂，摇匀，反应3～8min，加入4mL 7.5％的碳酸钠溶液，加水定容至刻度，摇匀，室温下静置60min。用10mm比色皿，在765nm条件下用分光光度计进行吸光度的测定。并将其代入上述没食子酸质量浓度-吸光度标准曲线分别计算出多酚提取率。
实验结果显示，加入了20mg纤维素酶的这组，最优提取条件下其多酚提取率为15.21％，而不加酶的一组，多酚提取率为3.94％，说明酶的添加对此实验的提取率提高是极为重要的，而不加则降低了74.06％。
相应的，对这两组制备得到的滤液按照实施例1的方法测定多糖和黄酮提取率，相比于添加纤维素酶的情况，不添加纤维素酶的那组多糖提取率从14.39％降低到了3.43％，黄酮提取率从11.84％降低到了4.27％。
实施例6
本实施例提供一系列的牛大力废弃物中天然活性成分的高效制备方法，以优化提取工艺，具体过程如下：
分别准确称取2份制备好的牛大力废弃物藤叶粉末各1g到两个烧杯中，接着将30mL的70％乙醇溶液加入各烧杯中，再将40mg纤维素酶加入各烧杯中(1：30)，用保鲜膜将其封起，置于50℃的恒温水浴锅中加热60min，其中一组拿去超声波清洗机中超声10min，另一组则不进行超声处理，之后将其进行抽滤，记录滤液体积V，即得到牛大力废弃物藤叶黄酮提取液。移取10.0mL牛大力废弃物藤叶黄酮提取液置于25mL容量瓶中，分别加入3.0mL30％乙醇和1.0mL 5％NaNO2溶液，摇匀，放置6min，再加入10％Al(NO3)3溶液1.0mL，摇匀，放置6min，然后再加10.0mL 4％NaOH溶液，用30％乙醇定容至刻度，摇匀，静置15min。在510nm处测吸光度，测得结果代入芦丁质量浓度-吸光度标准曲线分别计算出提取率。
实验结果显示，进行了超声处理的这组，最优提取条件下其黄酮提取率为14.21％，而未经超声处理的一组，黄酮提取率为5.67％，说明超声对此实验的提取率提高是极为重要的，而不超声则降低了60.09％。
相应的，对这两组制备得到的滤液按照实施例1的方法测定多糖和多酚提取率，与进行超声处理的情况作为相比，不超声的情况下，多糖提取率从12.97％降低到了4.13％，多酚提取率从11.77％降低到了3.72％。
从实施例1～3的单因素试验可知，对于多糖、多酚及黄酮的提取，料液比、提取时间、酶种类都具有相似的影响规律。其中，料液比为1:20～1:70，提取时间为40～80min、以及选用纤维素酶时，均具有较高的提取率。
其中多糖的最优制备工艺为：酶为纤维素酶，料液比为1:30，酶解时间为60min，最佳提取率为16.44％，相较于莫宏辉等人(莫宏辉,邓国卫,李珊.牛大力叶中总多糖、总黄酮、总皂苷含量及其抗氧化活性的研究[J].湖北农业科学,2021,60(19):88-91+94.DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2021.19.017.)所使用的传统的热水回流提取法的提取率提高了412.03％；比苏芬丽等人(苏芬丽,杨泽锐,黄松,冯时茵,丘振文.牛大力多糖提取工艺的优化[J].海峡药学,2019,31(11):38-41.)所用的水提醇沉法提取率提高了59.86％；相较于蒋德旗(蒋德旗,柒善怀,张兰熙,车燕凤.牛大力多糖酶法提取工艺优化及其抗氧化活性[J].中药材,2018,41(11):2641-2645.DOI:10.13863/j.issn1001-4454.2018.11.033)等人所使用的纤维素酶提取法则提高了155.06％。
而在多糖具有非常高的提取率的同时，多酚的提取率和黄酮的提取率都较好。
多酚的最优制备工艺为：酶为纤维素酶，提取温度60℃，提取时间为60min，最佳提取率为15.21％，相较于现有研究而言，补缺了过往较少对牛大力废弃物藤叶进行多酚提取的空白，且所得的提取率较高。而在多酚具有非常高的提取率的同时，多糖的提取率和黄酮的提取率均较高。
黄酮的最优制备工艺为：酶为纤维素酶，料液比为1：40，提取时间为60min，最佳提取率为14.21％，相较于勾玲等人(勾玲,唐珍,苏春蓝,姚水莲,卢海啸.牛大力黄酮类成分提取条件的优化[J].检验检疫学刊,2020,30(02):78-80.)所采用的加热回流提取法而言提高了62.42％，而采用王呈文等人在文献中所用的超声波辅助则提高了159.66％。
而在黄酮具有非常高的提取率的同时，多糖的提取率和多酚的提取率均较高。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种牛大力废弃物中天然活性成分的高效制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将牛大力废弃物粉末、乙醇溶液和纤维素酶混合，在温度为30～60℃下提取40～80min，然后超声5～15min，过滤取滤液，即得所述牛大力废弃物中天然活性成分；所述牛大力废弃物粉末和乙醇溶液的料液比为1:20～1:70g/mL；
所述乙醇溶液的体积分数为50～90％；
所述超声的功率为150～450W；
所述牛大力废弃物为牛大力藤叶；所述牛大力废弃物粉末通过如下过程制备得到：将牛大力废弃物剪切晒干后研磨成粉，过筛即得所述牛大力废弃物粉末；
所述然活性成分为多糖、多酚或黄酮中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述高效制备方法，其特征在于，所述牛大力废弃物粉末和纤维素酶的质量比为10:1～50:1。
3.根据权利要求1所述高效制备方法，其特征在于，所述牛大力废弃物粉末和乙醇溶液的料液比为1:30g/mL，提取时间为60min。
4.根据权利要求1所述高效制备方法，其特征在于，所述提取温度60℃，提取时间为60min。
5.根据权利要求1所述高效制备方法，其特征在于，所述牛大力废弃物粉末和乙醇溶液的料液比为1:40，提取时间为60min。
6.一种牛大力废弃物天然活性成分提取液，其特征在于，通过权利要求1～5任一所述制备方法制备得到。
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| 曾庆钱 ; 崔露 ; 钟小花 ; 聂阳 ; 刘翠红 ; 吴铎锋 ; .10个产地牛大力的总黄酮、多糖和微量元素含量分析.海峡药学.2020,第32卷(第6期),24-27. * |
| 李荣宇 ; 林少玲 ; 骆月姬 ; 苏靖雯 ; .不同产地牛大力水提物中总黄酮、总皂苷及总多糖的含量测定.中国药师.2020,第23卷(第6期),1208-1210. * |
| 莫宏辉 等.牛大力叶中总多糖、总黄酮、总皂苷含量及其抗氧化活性的研究.湖北农业科学.2021,第60卷(第19期),第89页左栏第1段、第91页"小结". * |
| 蒋德旗 ; 柒善怀 ; 张兰熙 ; 车燕凤 ; .牛大力多糖酶法提取工艺优化及其抗氧化活性.中药材.2018,第41卷(第11期),2641-2645. * |
| 邢颖 ; 雷宏杰 ; 岳珍珍 ; 高瑞雄 ; 王景华 ; 徐怀德 ; .超声波纤维素酶法提取紫苏叶活性物质及其抗氧化活性.食品科学.2016,第37卷(第10期),111-115. * |
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