CN115003799A - 适用于培养人造血干细胞等血球系细胞的无血清培养基以及培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种适用于培养人体细胞的无血清培养基的组成以及培养方法。根据本发明可提供一种培养人体细胞的方法,该方法包括使人体细胞与由聚乙烯基己内酰胺嵌段以及聚乙酸乙烯酯嵌段的共聚物修饰的聚亚烷基二醇接触。
Description
【技术领域】
本发明公开了一种适用于培养人造血干细胞等血球系细胞的无血清培养基(特别是无白蛋白)的组成以及培养方法。根据本发明提供一种培养人造血干细胞等血球系细胞的方法。该方法可包括使人造血干细胞等血球系细胞与由聚乙烯基己内酰胺嵌段以及聚乙酸乙烯酯嵌段的连结体部分修饰的聚乙二醇接触。
【背景技术】
在造血干细胞的培养中,关于使用化学成分确定的培养基增殖的研究正在进行中,已经阐明可以在化学成分确定的培养基中培养小鼠造血干细胞(非专利文献1)。
【现有技术文献】
【非专利文献】
【非专利文献1】Wilkinson et al.,Nature,571:117-121,2019
【发明内容】
本发明提供适用于培养人造血干细胞等血球系细胞的培养基(例如,无血清培养基,例如,无白蛋白的无血清培养基或无细胞因子的无血清培养基,例如,无白蛋白且无细胞因子的无血清培养基)的组成以及培养方法。
本发明人等发现并报告了小鼠的造血干细胞(由于其分离方法,有时被称为KSL细胞。)在不含有白蛋白的无血清培养基中通过加入聚乙烯醇(PVA)可在很长一段时间内大量增殖,(Wilkinson et al.,Nature,571:117-121,2019)。然而,关于人的造血干细胞,尚未建立在不含有白蛋白的无血清培养基中使其增殖的方法。这次,本发明人等发现人造血干细胞即使在不含有白蛋白的无血清培养基中,在由聚乙烯基己内酰胺嵌段以及聚乙酸乙烯酯嵌段的共聚物修饰的聚乙二醇存在下,在维持干细胞性的同时表现出显著的增殖。另外,发现此时在无细胞因子的条件下也可维持造血干细胞的增殖。进一步,在相同条件下,除了造血干细胞外,还可以增殖包括成红细胞以及巨核细胞以及T细胞、B细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等白细胞在内的各种血球系细胞。
根据本发明可提供以下发明。
[1]一种培养人造血干细胞或人血球系细胞的方法,
其包括在培养基中培养人造血干细胞或人血球系细胞,
培养基为含有聚乙烯醇的无白蛋白的培养基(特别是无血清白蛋白培养基),且含有,
(1)磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)激活剂和选自血小板生成素(TPO)以及TPO受体激动剂的一种以上；
(2)选自干细胞因子(SCF)以及PI3K激活剂的一种以上和TPO受体激动剂；或
(3)PI3K激活剂和TPO受体激动剂,
根据上述培养维持或增加人造血干细胞或人血球系细胞的数量。
[2]根据上述[1]所述的方法,其包括获得增加的人造血干细胞或人血球系细胞。
[3]根据上述[1]或[2]所述的方法,其中,培养基含有PI3K激活剂,不含有干细胞因子(SCF)。
[4]根据上述[1]～[3]中任一项所述的方法,其中,培养基含有PI3K激活剂以及TPO激动剂。
[5]根据上述[4]所述的方法,其中,培养基不含有SCF和TPO。
[5A]根据上述[4]或[5]所述的方法,其中,培养基为无细胞因子的培养基。
[6]根据上述[1]～[5]中任一项所述的方法,其中,培养基还含有4-N-[2-苄基-7-(2-甲基四唑-5-基)-9H-嘧啶[4,5-b]吲哚-4-基]环己烷-1,4-二胺(UM171)。
[7]根据上述[6]所述的方法,其中,培养期间为7日以上。
[8]一种不含有白蛋白的组合物,其含有人造血干细胞或人血球系细胞和聚乙烯醇,以及,
(1)PI3K激活剂和选自TPO以及TPO受体激动剂的一种以上；
(2)选自SCF以及PI3K激活剂的一种以上和TPO受体激动剂；或
(3)PI3K激活剂和TPO受体激动剂。
[9]根据上述[8]所述的组合物,其含有PI3K激活剂以及TPO受体激动剂。
[10]根据上述[8]或[9]所述的组合物,其还含有4-N-[2-苄基-7-(2-甲基四唑-5-基)-9H-嘧啶[4,5-b]吲哚-4-基]环己烷-1,4-二胺(UM171)。
[11]通过上述[1]～[7]中任一项所述的方法获得的人造血干细胞或人血球系细胞。
[12]一种用于人造血干细胞或人血球系细胞的培养基,其含有聚乙烯醇,不含白蛋白,且含有,
(1)PI3K激活剂和选自TPO以及TPO受体激动剂的一种以上；
(2)选自SCF以及PI3K激活剂的一种以上和TPO受体激动剂；或
(3)PI3K激活剂和TPO受体激动剂。
〔1〕一种培养或制造人造血干细胞或人血球系细胞的方法,
其包括在培养基中培养人造血干细胞或人血球系细胞,
培养基含有聚乙烯醇,且含有,
(1)磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)激活剂和选自血小板生成素(TPO)以及TPO受体激动剂的一种以上；
(2)选自干细胞因子(SCF)以及PI3K激活剂的一种以上和TPO受体激动剂；或
(3)PI3K激活剂和TPO受体激动剂,
通过上述培养可维持或增加人造血干细胞或人血球系细胞的数量。
〔2〕根据上述〔1〕所述的方法,其中,上述培养基为无血清培养基。
〔3〕根据上述〔1〕所述的方法,其中,上述培养基为化学成分确定的培养基。
〔4〕根据上述〔1〕～〔3〕中任一项所述的方法,其中,上述培养基实质上不含白蛋白。
〔5〕根据上述〔1〕～〔4〕中任一项所述的方法,其包括获得增加的人造血干细胞或人血球系细胞。
〔6〕根据上述〔1〕～〔5〕中任一项所述的方法,其中,培养基含有PI3K激活剂,不含干细胞因子(SCF)。
〔7〕根据上述〔1〕～〔6〕中任一项所述的方法,其中,培养基含有PI3K激活剂以及TPO激动剂。
〔8〕根据上述〔7〕所述的方法,其中,培养基不含SCF和TPO。
〔8A〕根据上述〔7〕或〔8〕所述的方法,其中,培养基为无细胞因子的培养基。
〔9〕根据上述〔1〕～〔8〕中任一项所述的方法,其中,
培养基还含有4-N-[2-苄基-7-(2-甲基四唑-5-基)-9H-嘧啶[4,5-b]吲哚-4-基]环己基-1,4-二胺(UM171)。
〔10〕根据上述〔9〕所述的方法,其中,培养期间为7日以上。
〔11〕一种组合物,其含有人造血干细胞或人血球系细胞和作为白蛋白的替代品的聚乙烯醇,以及
(1)PI3K激活剂和选自TPO以及TPO受体激动剂的一种以上；
(2)选自SCF以及PI3K激活剂的一种以上和TPO受体激动剂；或
(3)PI3K激活剂和TPO受体激动剂。
〔12〕根据上述〔11〕所述的组合物,其含有PI3K激活剂以及TPO受体激动剂。
〔13〕根据上述〔11〕或〔12〕所述的组合物,其还含有4-N-[2-苄基-7-(2-甲基四唑-5-基)-9H-嘧啶[4,5-b]吲哚-4-基]环己基-1,4-二胺(UM171)。
〔14〕通过上述〔1〕～〔10〕中任一项所述的方法获得的人造血干细胞或人血球系细胞。
〔15〕一种用于人造血干细胞或人血球系细胞的培养基,其含有作为白蛋白的替代品的聚乙烯醇,且含有
(1)PI3K激活剂和选自TPO以及TPO受体激动剂的一种以上；
(2)选自SCF以及PI3K激活剂的一种以上和TPO受体激动剂；或
(3)PI3K激活剂和TPO受体激动剂。
〔16〕根据上述〔15〕所述的培养基,其为无血清培养基。
〔17〕根据上述〔15〕所述的培养基,其为化学成分确定的培养基。
〔18〕根据上述〔15〕～〔17〕中任一项所述的培养基,其不含白蛋白。
〔19〕根据上述〔1〕～〔8〕中任一项所述的方法,其中,人体细胞为人造血干细胞。
〔20〕根据上述〔11〕～〔13〕中任一项所述的组合物,其中,人体细胞为人造血干细胞。
〔21〕根据上述〔1〕～〔8〕中任一项所述的方法,其中,人体细胞为人血球系细胞。
〔22〕根据上述〔11〕～〔13〕中任一项所述的组合物,其中,人体细胞为人血球系细胞。
〔23〕一种培养基,其含有通过上述〔1〕～〔8〕、〔19〕以及〔21〕中任一项中任一项所述的方法获得的人体细胞。
〔24〕根据上述〔23〕所述的培养基,其为无血清培养基、无白蛋白且无细胞因子。
根据本发明还可提供以下发明。
[1B]一种培养人体细胞的方法,其包括在培养基中培养人体细胞,
培养基含有由聚乙烯基己内酰胺嵌段以及聚乙酸乙烯酯嵌段的共聚物修饰的聚亚烷基二醇。
[2B]根据上述[1B]所述的方法,还包括获得增加的人体细胞。
[3B]根据上述[1B]或[2B]所述的方法,其中,人体细胞为人造血干细胞或人血球系细胞。
[4B]一种用于培养人体细胞的培养基组合物,其含有由聚乙烯基己内酰胺嵌段以及聚乙酸乙烯酯嵌段的共聚物修饰的聚亚烷基二醇。
[5B]一种组合物,其含有人体细胞和由聚乙烯基己内酰胺嵌段以及聚乙酸乙烯酯嵌段的共聚物修饰的聚亚烷基二醇。
[6B]根据上述[4B]或[5B]所述的组合物,其中,人体细胞为人造血干细胞或人血球系细胞。
[7B]通过上述[1B]～[3B]中任一项所述的方法获得的人体细胞。
[8B]根据上述[3B]所述的方法,其中,人体细胞为人造血干细胞。
[9B]根据上述[6B]所述的组合物,其中,人体细胞为人造血干细胞。
[10B]根据上述[3B]所述的方法,其中,人体细胞为人血球系细胞。
[11B]根据述[6B]所述的组合物,其中,人体细胞为人血球系细胞。
[12B]一种培养基,其含有通过上述[1B]～[3B]中任一项所述的方法获得的人体细胞。
[13B]根据上述[12B]所述的培养基,其中,无血清培养基为无白蛋白且无细胞因子。
[14B]根据上述[1B]～[3B]、[8B]、以及[10B]中任一项所述的方法、或者、上述[4B]～[6B]、
[9B]、以及[11B]中任一项所述的组合物、或、上述[12]或[13]所述的培养基,其中,由聚乙烯基己内酰胺嵌段以及聚乙酸乙烯酯嵌段的共聚物修饰的聚亚烷基二醇为,由聚乙烯基己内酰胺嵌段以及聚乙酸乙烯酯嵌段的共聚物修饰的聚乙二醇。
[1C]一种培养人体细胞的方法,其包括在培养基中培养人体细胞,
培养基为无血清白蛋白培养基,含有添加剂,添加剂选自聚乙烯醇以及修饰聚亚烷基二醇,且含有,
(1)磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)激活剂和选自血小板生成素(TPO)以及TPO受体激动剂的一种以上；
(2)选自干细胞因子(SCF)以及PI3K激活剂的一种以上和TPO受体激动剂；或
(3)PI3K激活剂和TPO受体激动剂,
根据上述培养维持或增加人造血干细胞或人血球系细胞的数量。
[2C]根据上述[1C]所述的方法,其中,人体细胞为选自人造血干细胞以及人血球系细胞的细胞。
[3C]根据上述[1C]所述的方法,其中,人体细胞为造血干细胞以外的血球系细胞。
[4C]根据上述[3C]所述的方法,其中,添加剂为聚乙烯醇。
[5C]根据上述[1C]或[2C]所述的方法,其中,添加剂为修饰聚亚烷基二醇。
[6C]根据上述[5C]所述的方法,其中,修饰聚亚烷基二醇为由聚乙烯基己内酰胺嵌段以及聚乙酸乙烯酯嵌段的共聚物修饰的聚亚烷基二醇。
[7C]根据上述[6C]所述的方法,其中,修饰聚亚烷基二醇为由聚乙烯基己内酰胺嵌段以及聚乙酸乙烯酯嵌段的共聚物修饰的聚乙二醇。
【附图说明】
图1表示在无白蛋白的无血清培养基中,在含有聚乙烯醇(PVA)的培养基中,在小鼠以及人的10ng/mL的组织因子(SCF)以及100ng/mL的血小板生成素(TPO)存在下,分别培养小鼠造血干细胞(小鼠KSL细胞)以及人造血干细胞(CD34+CD38-细胞)的结果。
图2表示在白蛋白不存在下且PVA存在下,在10ng/mL的组织因子(SCF)以及100ng/mL的血小板生成素(TPO)存在下培养小鼠以及人类各自的造血干细胞的造血干细胞中SCF以及TPO下游的信号因子的磷酸化程度。
符号“m”表示小鼠造血干细胞,“h”表示人造血干细胞。
图3表示在白蛋白不存在下且PVA存在下,在10ng/mL的人类组织因子(SCF)以及100ng/mL的人类血小板生成素(TPO)存在下且AKTActivator II(AKTa)或PI3K激活剂(PI3Ka)的存在下培养人造血干细胞的结果。
图4表示在白蛋白不存在下且PVA存在下且100ng/mL的人类血小板生成素(TPO)存在下培养人造血干细胞,第7天的总细胞以及CD34+细胞的增殖率。图4中,比较了含SCF的条件和不含SCF的条件,在培养第7天的细胞总数以及CD34+细胞的数量上,条件之间没有统计学上的显着差异。
图5表示在白蛋白或PVA的存在下,用各种TPO受体激动剂替代TPO培养人造血干细胞时的细胞数量的变化。符号“Buty”表示Butyzamide,“Elt”表示艾曲波帕,“Ava”表示阿伐曲泊帕。
图6表示在白蛋白以及PVA中任一项的存在下,用各种TPO受体激动剂代替TPO培养人造血干细胞时第7天的总细胞以及CD34+细胞的增殖率。
图7表示在白蛋白不存在下且PVA存在下,在含有PI3K激活剂和TPO或Butyzamide(Buty)的培养基中培养人造血干细胞时,第7天的细胞总数、CD34+细胞的数量以及GEmM菌落的数量。在显微镜下采集菌落制作细胞涂片标本,然后进行吉姆萨染色,在在显微镜下确定菌落的种类。G意味着“颗粒细胞”,E意味着“成红细胞”(erythroblast),m意味着“巨噬细胞”,M意味着“巨核细胞”。
图8表示在白蛋白不存在下且PVA存在下,用不含SCF以及TPO但含有PI3K激活剂或者TPO受体激动剂或这些的组合的培养基培养人造血干细胞时,第7天的总细胞以及CD34+细胞的增殖率。
图9表示在白蛋白不存在下且PVA存在下,用不含SCF以及TPO但含有PI3K激活剂以及TPO受体激动剂的培养基培养人造血干细胞时,第7天获得的培养物中各细胞群的增殖率。
图10表示在白蛋白不存在下且PVA存在下,用不含SCF以及TPO但含有PI3K激活剂以及TPO受体激动剂的培养基培养人造血干细胞时,第7天以及第14天的细胞总数的变化以及CD34+细胞的数量的变化。
图11表示在白蛋白不存在下且PVA存在下,用不含SCF以及TPO但含有PI3K激活剂以及TPO受体激动剂的培养基培养人造血干细胞时,第14天获得的细胞浇口的结果。左侧面板为将CD34和CD38作为标记的流式细胞仪结果,右侧面板为将CD41a和CD42b作为标记的流式细胞仪结果。图11的照片为获得的培养物的光学显微镜照片。
图12表示在白蛋白不存在下且PVA存在下,用不含SCF以及TPO但含有PI3K激活剂以及TPO受体激动剂的培养基培养人造血干细胞时,第14天获得的细胞的菌落测定结果。在显微镜下采集菌落制作细胞涂片标本,然后进行吉姆萨染色,在在显微镜下确定菌落的种类。G意味着含“颗粒细胞”的菌落,E意味着含“成红细胞”的菌落,m意味着含“巨噬细胞”的菌落,M意味着含“巨核细胞”的菌落。
图13表示在白蛋白不存在下且PVA存在下,用不含SCF以及TPO但含有PI3K激活剂；TPO受体激动剂；SR-1以及UM171中任一项或全部；的培养基培养人造血干细胞时,第14天的总细胞和CD34+细胞的增殖率。
图14表示用条件1～3分别培养时,第14天的总细胞以及CD34+细胞的增殖率以及CD41+细胞的细胞数量。
图15表示用条件1～3分别培养时,第14天的培养物中细胞的流式细胞仪结果。上半部分表示CD34(横轴)以及CD38(纵轴)的结果,下半部分表示CD41a(横轴)以及CD42b(纵轴)的结果。
图16表示用条件1～3分别培养时,将第7天的人造血干细胞移植于小鼠,12周后小鼠的外周血中人造血干细胞的植入。
图17表示单核细胞分离移植的脐带血之后,用不含白蛋白、SCF以及TPO但含有PVA和PI3K激活剂和TPO受体激动剂的培养基,以UM171存在下或不存在下的条件培养14天获得的培养物的总细胞数量、CD34+细胞的比例(％)、存活细胞的比例(％)以及CD34+细胞数量。
图18表示在白蛋白不存在下小鼠造血干细胞的体外培养实验结果。小鼠造血干细胞的培养基含有最终浓度为0.1％的所示成分。更具体而言,分别向上述培养基添加了最终浓度0.1％的以下成分:BASF公司制造的同浓度的KOLLIPHOR R P188 bio(188bio)、KOLLIPHOR(商标)P 188Geismar(188Geismar)、SOL-PLUS(Sol+)、KOLLIPHOR(商标)P407Geismar(407Geismar)、KOLLIDON(商标)30Origin USA(30USA)、KOLLIDON(商标)17PF(17PF)、KOLLIDON(商标)25(25)、KOLLIDON(商标)90F(90F)、以及KOLLIDON(商标)12PF(12PF)。
图19表示在白蛋白不存在下的无血清培养基中,在PVA或聚合物A存在下的小鼠造血干细胞的体外菌落形成实验结果。
图20表示在白蛋白不存在下的无血清培养基中PVA或聚合物A存在下培养的小鼠造血干细胞的干细胞标记CD201的阳性率(％)。
图21表示将在白蛋白不存在下的无血清培养基中PVA或聚合物A存在下培养的小鼠造血干细胞移植于辐照小鼠的方案(左),以及移植4周后的小鼠的外周血(PB)中的嵌合率(％)。嵌合率为来源于全血细胞中移植造血干细胞的细胞的比例。
图22表示在白蛋白不存在下的无血清培养基中PVA或聚合物A存在下培养的小鼠造血干细胞的CD34阳性细胞率(％)。
图23表示在白蛋白不存在下的无血清培养基中PVA或聚合物A存在下培养的小鼠造血干细胞的数量的变化。
图24是表示在白蛋白不存在下且PVA存在下,分别在小鼠以及人类的造血干细胞10ng/mL的组织因子(SCF)以及100ng/mL的血小板生成素(TPO)存在下培养的造血干细胞中SCF以及TPO下游的信号因子的磷酸化程度的图。符号“m”表示小鼠造血干细胞,“h”表示人造血干细胞。
图25是表示在白蛋白不存在下且PVA存在下,在10ng/mL的人类组织因子(SCF)以及100ng/mL的人类血小板生成素(TPO)存在下且AKTActivator II(AKTa)或PI3K激活剂(PI3Ka)的存在下培养人造血干细胞的结果。
图26是表示在白蛋白不存在下且PVA存在下且100ng/mL的人类血小板生成素(TPO)存在下培养人造血干细胞时,第7天的总细胞以及CD34+细胞的增殖率。图26中比较了含SCF的条件与不含SCF的条件,在培养第7天的细胞总数以及CD34+细胞的数量示出条件之间没有统计学上的显着差异。
图27表示在白蛋白或PVA的存在下,用各种TPO受体激动剂替代TPO培养人造血干细胞是的细胞数量的变化。符号“Buty”表示Butyzamide,“Elt”表示艾曲波帕,“Ava”表示阿伐曲泊帕。
图28表示在白蛋白以及PVA中任一项的存在下,用各种TPO受体激动剂替代TPO培养人造血干细胞时,第7天的总细胞以及CD34+细胞的增殖率。
图29表示在白蛋白不存在下且PVA存在下,用含PI3K激活剂和TPO或Butyzamide(Buty)的培养基培养人造血干细胞时,第7天的细胞总数、CD34+细胞的数量以及GEmM菌落的数量。在显微镜下采集菌落制作细胞涂片标本,然后进行吉姆萨染色,在在显微镜下确定菌落的种类。G意味着“颗粒细胞”,E意味着“成红细胞”,m意味着“巨噬细胞”,M意味着“巨核细胞”。
图30表示在白蛋白不存在下且PVA存在下,用不含SCF以及TPO但含PI3K激活剂或者TPO受体激动剂或这些的组合的培养基培养人造血干细胞时,第7天的总细胞以及CD34+细胞的增殖率。
图31表示在白蛋白不存在下且PVA存在下,用不含SCF以及TPO但含PI3K激活剂以及TPO受体激动剂的培养基培养人造血干细胞,在第7天获得的培养物中各细胞群的增殖率。
图32表示在白蛋白不存在下且PVA存在下,用不含SCF以及TPO但含PI3K激活剂以及TPO受体激动剂的培养基培养人造血干细胞,在第7天以及第14天的细胞总数的变化以及CD34+细胞的数量的变化。
图33表示在白蛋白不存在下且PVA存在下,用不含SCF以及TPO但含PI3K激活剂以及TPO受体激动剂的培养基培养人造血干细胞,在第14天获得的细胞浇口的结果。左侧面板表示以CD34和CD38为标记的流式细胞仪结果,右侧面板表示以CD41a和CD42b为标记的流式细胞仪结果。图16的照片为获得的培养物的光学显微镜照片。
图34表示在白蛋白不存在下且PVA存在下,用不含SCF以及TPO但含PI3K激活剂以及TPO受体激动剂的培养基培养人造血干细胞,在第14天获得的细胞的菌落测定结果。在显微镜下采集菌落制作细胞涂片标本,然后进行吉姆萨染色,在显微镜下确定菌落的种类。G意味着含“颗粒细胞”的菌落,E意味着含“成红细胞”的菌落,m意味着含“巨噬细胞”的菌落,M意味着含“巨核细胞”的菌落。
图35表示在白蛋白不存在下且PVA存在下,用不含SCF以及TPO但含PI3K激活剂；TPO受体激动剂；SR-1以及UM171中任一项或全部的培养基培养人造血干细胞时,第14天的总细胞和CD34+细胞的增殖率。
图36表示用条件1～3分别培养时,第14天的总细胞以及CD34+细胞的增殖率以及CD41+细胞的细胞数量。
图37表示用条件1～3分别培养时,第14天的培养物中细胞的流式细胞仪结果。上半部分表示CD34(横轴)以及CD38(纵轴)的结果,下半部分表示CD41a(横轴)以及CD42b(纵轴)的结果。
图38是表示用条件1～3分别培养,将第7天的人造血干细胞移植于小鼠,12周后的小鼠的外周血中人造血干细胞的植入的图。
图39表示单核细胞分离移植的脐带血后,用不含白蛋白、SCF以及TPO任何一种但含PVA和PI3K激活剂和TPO受体激动剂的培养基,在UM171存在下或不存在下的条件培养14天获得的培养物的总细胞数量、CD34+细胞的比例(％)、存活细胞的比例(％)以及CD34+细胞数量。
图40表示在PVA或SOL-PLUS(商标)存在下无白蛋白且无细胞因子培养基中人类T细胞的增殖。
图41表示在PVA或SOL-PLUS(商标)存在下无白蛋白培养基中人造血干细胞的分化实验结果。广泛系列血球系细胞可以从造血干细胞增殖分化(特别是增殖)。
图42表示慢性骨髓性白血病(CML)细胞可以在PVA或SOL-PLUS(商标)存在下无白蛋白且无细胞因子的培养基中增殖。图中“IM+”意味着伊马替尼存在下,“IM-”意味着伊马替尼不存在下。
【具体实施方式】
本说明书中,“造血干细胞”为可分化为血球系细胞的干细胞。造血干细胞可从骨髓、脐带、胎盘以及外周血采集。人造血干细胞为CD34阳性的细胞。已知,人类的造血干细胞在CD34阳性CD38阴性的细胞组分中含量丰富。因此,人造血干细胞可以为CD34阳性CD38阴性。造血干细胞可以是通过在体外分化ES细胞和iPS细胞等多能性干细胞获得的细胞。
本说明书中“血球系细胞”为造血干细胞以及造血干细胞分化生成的细胞。血球系细胞根据分化阶段大致分为造血干细胞、造血祖细胞以及血液细胞。造血干细胞经由造血祖细胞分化为血液细胞。更具体而言,造血干细胞经由淋巴母细胞分化为淋巴细胞(例如、T细胞、B细胞、NK细胞)。造血干细胞还经由造血祖细胞以及原单核细胞分化为单核细胞。造血干细胞还经由造血祖细胞、成髓细胞、早幼粒细胞、骨髓细胞、晚幼粒细胞以及杆状细胞分化为嗜中性白细胞。造血干细胞还经由造血祖细胞以及成髓细胞分化为嗜酸性粒细胞或者嗜碱性粒细胞等颗粒细胞系白细胞或巨噬细胞。造血干细胞还经由造血祖细胞、原成红细胞、嗜碱性成红细胞、多色性成红细胞以及正染色成红细胞分化为红细胞。造血干细胞还经由造血祖细胞、前巨核细胞以及巨核细胞产生血小板。从这些造血干细胞分化产生的细胞均为血球系细胞。作为血球系细胞可列举癌细胞以及非癌细胞。作为癌细胞例如可列举慢性骨髓性白血病(CML)细胞或CML干细胞。
本说明书中“体外”意味着活体外。本说明书中体外是与体内(活体内)相比较使用的,是指将存在于活体内的细胞从活体内取出至活体外的状态。培养是指在体外进行的。
本说明书中“阳性”意指公认分子是由细胞表达的,该分子是用在其之前存在的术语指定的。在本说明书中,“阳性”可以简称为“+”。
本说明书中“聚乙烯醇”(PVA)意味着乙烯醇的聚合物。聚乙烯醇可通过将聚合乙酸乙烯酯单体得到的聚乙酸乙烯酯皂化得到。聚乙烯醇的重均分子量(MW)例如可以为1kDa～20kDa、3kDa～17kDa、5kDa～15kDa或7kDa～13kDa。用上述方法皂化聚乙酸乙烯酯得到PVA时,皂化率可以为80％以上、85％以上、90％以上、95％以上或99％以上。
本说明书中“白蛋白”是称为血浆成分的蛋白质。白蛋白占比血浆蛋白质的六成,大量存在于血液、血清以及血浆中。白蛋白被认为负责维持活体内血液渗透压,并负责与脂肪酸以及激素等活体物质结合从而搬运这些物质。造血干细胞的维持培养中血清白蛋白的重要性被广泛认知。人类血清白蛋白(以下被称为“HSA”)为人的血清白蛋白,例如可以是具有以GenBank注册号:AAN17825.1注册的氨基酸序列的蛋白质或具有与这些对应的氨基酸序列的人类血清白蛋白。
本说明书中“激动剂”是指激活受体或酶等蛋白质的物质。
本说明书中“PI3K”意味着磷脂酰肌醇3-激酶。PI3K是磷酸化作为细胞的构成成分的肌醇磷脂的酶。磷酸化产生的磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(PIP3)磷酸化Akt(也称为蛋白激酶B),将其信号传输到下游。本说明书中“PI3K激活剂”意味着受体酪氨酸激酶的激动剂以及激活PI3K的物质。PI3K激活剂可能对PI3K具有选择性。
本说明书中“TPO”意味着血小板生成素。TPO是负责将造血干细胞分化为巨核细胞的蛋白质。已知,TPO参与造血干细胞的正式维持。人类血小板生成素可以是例如具有以GenBank注册号:AAB33390.1注册的氨基酸序列的蛋白质或具有与此相对应的氨基酸序列的血小板生成素。
本说明书中“TPO受体激动剂”意味着TPO以外的物质,激活TPO受体的物质。作为TPO受体激动剂可列举TPO以外的TPO的变种、肽以及激活TPO受体的化合物。本说明书中“化合物”包括有机化合物。TPO受体激动剂可能对TPO受体具有选择性。
本说明书中干细胞因子(SCF)为在造血功能的早期阶段起作用的造血细胞生长因子。人类干细胞因子可以是例如具有以GenBank注册号:AAA85450.1注册的氨基酸序列的蛋白质或具有与此相对应的氨基酸序列的SCF。
本说明书中“培养”意味着在适合其增殖或维持的条件下培养细胞。人体细胞的情况下,优选在37℃以及5％CO2环境下进行培养。“培养”伴随增殖时,“培养”可理解为增殖的细胞的生产。本说明书中“培养”可在无血清培养基中进行。本说明书中“培养”可在化学成分确定的培养基中(或完全合成培养基中)进行。化学成分确定的培养基为无血清培养基。
本说明书中“培养基”意味着用于细胞培养的培养基。培养基通过向基本培养基增加必要成分的方式制备。必要成分可以是pH调节剂、葡萄糖等糖源、抗生素(例如、青霉素、以及链霉素等)、以及谷氨酰胺等必需氨基酸以及胰岛素、转铁蛋白、硒(例如、亚硒酸钠)以及乙醇胺等培养添加物。
本说明书中“不含有”意味着不含有检测限以上的浓度或完全不含有。例如,血清或白蛋白无添加的无血清培养基为无白蛋白,不含有血清或白蛋白。“无白蛋白”是指以检测限以上的浓度不含有白蛋白,或不含有白蛋白。另外,“无细胞因子”是指以检测限以上的浓度不含有细胞因子,或不含有细胞因子。培养基可以是无白蛋白。培养基可以是无细胞因子。培养基可以是无白蛋白且无细胞因子。
本说明书中“细胞伤害性”意味着在培养过程中具有减少细胞数量或杀死细胞的效果的性质。本说明书中“非细胞伤害性”是指不通过培养减少细胞数量的性质。根据物质可通过提高浓度产生细胞伤害性,此时,如果该物质即使浓度降低到不产生细胞伤害性也能产生预期效果,则可定义为非细胞伤害性。本说明书中,培养基不含有细胞损伤剂或不含有具有细胞伤害性的药剂意味着,细胞损伤剂或具有细胞伤害性的药剂的含量不足以引起细胞伤害性。因此,即使某个药剂在高浓度具有细胞伤害性,如果以不产生细胞伤害性的浓度使用时,该药剂不是细胞损伤剂,也不是具有细胞伤害性的药剂。
本发明人等发现并报道了通过在不含白蛋白的无血清培养基中添加聚乙烯醇(PVA)可以在很长一段时间内大量增殖小鼠的造血干细胞(由于其分离方法,它有时被称为KSL细胞)(Wilkinson et al.,Nature,571:117-121,2019)。然而,对于人的造血干细胞,即使在不含有白蛋白的无血清培养基中尚未确立增殖它们的方法。这次,本发明人等发现,人造血干细胞在由聚乙烯基己内酰胺嵌段以及聚乙酸乙烯酯嵌段的共聚物修饰的聚乙二醇存在下,维持干细胞性的同时显示了显著的增殖性。本发明人等还发现,人造血干细胞即使在不含有白蛋白的无血清培养基中,在PVA、SCF以及TPO存在下,包括PI3K通路以及Akt通路的各种信号通路的激活弱的情况。本发明人等还发现,即使在不含有白蛋白的无血清培养基中,在PVA、SCF以及TPO存在下,通过添加PI3K激活剂可使人造血干细胞以及人血球系细胞增殖。本发明人等还发现,即使在不含有白蛋白的无血清培养基中,在PVA存在下,PI3K激活剂可彻底替代SCF。本发明人等还发现,即使在不含有白蛋白的无血清培养基中,在PVA以及PI3K激活剂存在下,可用TPO受体激动剂替代TPO。本发明人等还发现,即使在不含有白蛋白的无血清培养基中,由聚乙烯基己内酰胺嵌段以及聚乙酸乙烯酯嵌段的共聚物修饰的聚乙二醇、PI3K激活剂以及TPO受体激动剂的存在下,人造血干细胞以及人血球系细胞可良好的增殖,但此时,无需向培养基添加SCF以及TPO。本发明人等还发现,通过向培养基添加UM171可长期维持以及增殖人造血干细胞。
根据本发明,可提供一种一种培养人体细胞的方法,其包括在培养基中培养人体细胞,培养基为无血清白蛋白培养基,含有添加剂,添加剂选自聚乙烯醇以及修饰聚亚烷基二醇,且含有,
(1)磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)激活剂和选自血小板生成素(TPO)以及TPO受体激动剂的一种以上；
(2)选自干细胞因子(SCF)以及PI3K激活剂的一种以上和TPO受体激动剂；或
(3)PI3K激活剂和TPO受体激动剂,
根据上述培养维持或增加人造血干细胞或人血球系细胞的数量。
人体细胞为选自人造血干细胞以及人血球系细胞的细胞。另外,人体细胞可以是造血干细胞以外的血球系细胞。血球系细胞可以是选自造血祖细胞以及血液细胞的细胞。血液系细胞可以是选自淋巴母细胞、淋巴细胞(例如、T细胞、B细胞、NK细胞、以及NKT细胞)、例如、CD3阳性细胞、成髓细胞、早幼粒细胞、骨髓细胞、晚幼粒细胞、杆状细胞、以及嗜中性白细胞、成髓细胞、嗜酸性粒细胞以及嗜碱性粒细胞等颗粒细胞系白细胞、巨噬细胞、原成红细胞、嗜碱性成红细胞、多色性成红细胞、正染色成红细胞、以及红细胞、以及前巨核细胞、以及巨核细胞的一种以上的细胞。人体细胞例如可以是选自慢性骨髓性白血病(CML)细胞以及CML干细胞的一种以上。
在一实施方式中,添加剂是可以替代白蛋白的添加物。在一实施方式中,添加剂为修饰聚亚烷基二醇。另外,在一实施方式中,修饰聚亚烷基二醇例如可以是修饰聚乙二醇。修饰聚亚烷基二醇或修饰聚乙二醇优选为由聚乙烯基己内酰胺嵌段以及聚乙酸乙烯酯嵌段的共聚物修饰的。
在一实施方式中,添加剂可以是聚乙烯醇。
根据本发明,通过添加PVA或修饰聚亚烷基二醇,可降低培养基的血清白蛋白等白蛋白的添加量,优选为,使培养基成为无白蛋白。在一实施方式中,培养基可以是无血清培养基,例如可以是无白蛋白的无血清培养基。
根据本发明,PI3K激活剂可替代SCF。根据本发明,TPO受体激动剂还可替代TPO。通过这种方式,根据本发明可降低添加于培养基的SCF以及TPO的量,优选为,使培养基成为无细胞因子。在一实施方式中,培养基可以是无血清培养基,例如可以是无细胞因子的无血清培养基。
在另一实施方式中,通过添加PVA或修饰聚亚烷基二醇,可降低培养基的血清白蛋白等白蛋白的添加量,且通过添加PI3K激活剂以及TPO受体激动剂,可降低培养基的SCF以及TPO添加量。在一实施方式中,培养基可以是无白蛋白,且可以是无细胞因子的无血清培养基。
另外,根据本发明可提供一种培养人造血干细胞或人血球系细胞的方法,
其包括在培养基中培养人造血干细胞或人血球系细胞,
培养基含有聚乙烯醇不含有白蛋白,且含有,
(1)磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)激活剂和选自血小板生成素(TPO)以及TPO受体激动剂的一种以上；
(2)选自干细胞因子(SCF)以及PI3K激活剂的一种以上和TPO受体激动剂；或
(3)PI3K激活剂和TPO受体激动剂,
在这个实施方式中,根据上述培养维持或增加人造血干细胞或人血球系细胞的数量。
根据本发明,可提供一种在培养基中培养人造血干细胞或人血球系细胞的方法,
在培养基中,使人造血干细胞或人血球系细胞与聚乙烯醇接触,
在培养基中,使人造血干细胞或人血球系细胞与以下物质接触
(1)磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)激活剂和选自血小板生成素(TPO)以及TPO受体激动剂的一种以上；
(2)选自干细胞因子(SCF)以及PI3K激活剂的一种以上和TPO受体激动剂；或
(3)PI3K激活剂和TPO受体激动剂。
在这个实施方式中,根据上述培养增加或维持人造血干细胞或人血球系细胞的数量。
本发明中,PI3K激活剂不使用在白蛋白不存在下且PVA存在下对人造血干细胞或人血球系细胞具有细胞伤害性的激活剂。即,本发明所使用的PI3K激活剂为非细胞伤害性的。
另外,本发明所使用的TPO受体激动剂在白蛋白不存在下且PVA存在下对人造血干细胞或人血球系细胞具有非细胞伤害性。本领域技术人员可以通过人造血干细胞或人血球系细胞的培养试验适当地确认PI3K激活剂是否为非细胞伤害性。在此,人造血干细胞或人血球系细胞的培养试验可使用含有1％胰岛素转铁蛋白硒、1％青霉素链霉素谷氨酰胺、100ng/mL TPO以及0.1％PVA的IMDM培养基确认。另外,本领域技术人员可以通过人造血干细胞或人血球系细胞的培养试验适当地确认TPO受体激动剂是否为非细胞伤害性。在此,人造血干细胞或人血球系细胞的培养试验可使用含有1％胰岛素转铁蛋白硒、1％青霉素链霉素谷氨酰胺、10ng/mL SCF以及0.1％PVA的IMDM培养基确认。
在本发明的一实施方式中,本发明的培养方法使用的培养基含有,
(1)PI3K激活剂和选自TPO以及TPO受体激动剂的一种以上；
(2)选自SCF以及PI3K激活剂的一种以上和TPO受体激动剂；或
(3)PI3K激活剂和TPO受体激动剂,
可以是用于人造血干细胞或人血球系细胞的培养基。
在本发明的一实施方式中,本发明的培养方法使用的培养基含有聚乙烯醇或修饰聚亚烷基二醇,含有
(1)PI3K激活剂和选自TPO以及TPO受体激动剂的一种以上；
(2)选自SCF以及PI3K激活剂的一种以上和TPO受体激动剂；或
(3)PI3K激活剂和TPO受体激动剂,
可以是用于人造血干细胞或人血球系细胞的培养基。
在本发明的一实施方式中,本发明的培养方法使用的培养基为无白蛋白(特别是血清白蛋白),含有
(1)PI3K激活剂和选自TPO以及TPO受体激动剂的一种以上；
(2)选自SCF以及PI3K激活剂的一种以上和TPO受体激动剂；或
(3)PI3K激活剂和TPO受体激动剂,
可以是用于人造血干细胞或人血球系细胞的培养基。
在本发明的一实施方式中,本发明的培养方法使用的培养基含有聚乙烯醇,不含白蛋白,且含有,
(1)PI3K激活剂和选自TPO以及TPO受体激动剂的一种以上；
(2)选自SCF以及PI3K激活剂的一种以上和TPO受体激动剂；或
(3)PI3K激活剂和TPO受体激动剂,
可以是用于人造血干细胞或人血球系细胞的培养基。
为了使人造血干细胞或人血球系细胞在白蛋白不存在下增殖,本发明的培养基可以含有非细胞伤害性的PI3K激活剂的有效量和PVA的有效量。本发明的培养基可含有SCF以及TPO中任一项或全部。本发明的培养基可含有非细胞伤害性的TPO受体激动剂的有效量代替TPO。本发明的培养基可含有非细胞伤害性的PI3K激活剂的有效量、PVA的有效量、TPO以及非细胞伤害性的TPO受体激动剂的有效量中任一项或全部、UM171。
根据本发明,培养人造血干细胞的方法可以是从人造血干细胞制备巨核细胞系列的细胞的方法。在此实施方式中,培养方法所使用的培养基含有PI3K激活剂以及TPO受体激动剂,PI3K激活剂为740Y-P且TPO受体激动剂为Butyzamide的培养基。通过这特定的方式,培养基可以不含UM171。
在本发明的一实施方式中,本发明的培养方法还可以包括在4-N-[2-苄基-7-(2-甲基四唑-5-基)-9H-嘧啶[4,5-b]吲哚-4-基]环己烷-1,4-二胺(以下称为“UM171”)的存在下的培养。在本发明的一实施方式中,本发明的培养方法所使用的培养基还可以包括UM171。由此,人造血干细胞可易于维持作为人造血干细胞的性质,或可抑制分化为巨核细胞系列的细胞(例如巨核细胞祖细胞以及巨核细胞)。
在本发明的一实施方式中,本发明的培养方法可以不包括在4-N-[2-苄基-7-(2-甲基四唑-5-基)-9H-嘧啶[4,5-b]吲哚-4-基]环己烷-1,4-二胺(以下称为“UM171”)的存在下的培养。在本发明的一实施方式中,本发明的培养方法所使用的培养基还可以不含有UM171。由此,人造血干细胞可易于分化为巨核细胞系列的细胞(例如巨核细胞祖细胞以及巨核细胞)。
另外,根据本发明可提供一种培养人造血干细胞或人血球系细胞的方法,其包括在培养基中培养人造血干细胞或人血球系细胞,
培养基含有由聚乙烯基己内酰胺嵌段以及聚乙酸乙烯酯嵌段的共聚物修饰的聚乙二醇。在此方法中,人造血干细胞或人血球系细胞的培养基可不含有白蛋白。在此方法中,培养基还含有,
(1)磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)激活剂和选自血小板生成素(TPO)以及TPO受体激动剂的一种以上；
(2)选自干细胞因子(SCF)以及PI3K激活剂的一种以上和TPO受体激动剂；或
(3)PI3K激活剂和TPO受体激动剂。在此实施方式中,根据上述培养可增加或维持人造血干细胞或人血球系细胞的数量。
根据本发明,可提供一种在培养基中培养人造血干细胞或人血球系细胞的方法,
该方法包括,在培养基中人造血干细胞或人血球系细胞与由聚乙烯基己内酰胺嵌段以及聚乙酸乙烯酯嵌段的共聚物修饰的聚乙二醇的接触。在此方法中人造血干细胞或人血球系细胞的培养基可以不含有白蛋白。该方法可包括,
在培养基中人造血干细胞或人血球系细胞还与以下物质接触,
(1)磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)激活剂和选自血小板生成素(TPO)以及TPO受体激动剂的一种以上；
(2)选自干细胞因子(SCF)以及PI3K激活剂的一种以上和TPO受体激动剂；或
(3)PI3K激活剂和TPO受体激动剂。在此实施方式中,根据上述培养可增加或维持人造血干细胞或人血球系细胞的数量。
本发明人等明确了在白蛋白不存在下且PVA存在下,含有部分TPO受体激动剂的多种化合物可对人造血干细胞或人血球系细胞具有细胞伤害性。
因此,根据本发明本发明中PI3K激活剂在白蛋白不存在下且PVA存在下对人造血干细胞或人血球系细胞具有非细胞伤害性。
本发明中,TPO受体激动剂在白蛋白不存在下且PVA存在下对人造血干细胞或人血球系细胞具有非细胞伤害性。本领域技术人员可以通过人造血干细胞或人血球系细胞的培养试验适当地确认PI3K激活剂是否为非细胞伤害性。在此,人造血干细胞或人血球系细胞的培养试验可使用含有1％胰岛素转铁蛋白硒、1％青霉素链霉素谷氨酰胺、100ng/mL TPO以及0.1％PVA的IMDM培养基确认。另外,本领域技术人员可以通过人造血干细胞或人血球系细胞的培养试验适当地确认TPO受体激动剂是否为非细胞伤害性。在此,人造血干细胞或人血球系细胞的培养试验可使用含有1％胰岛素转铁蛋白硒、1％青霉素链霉素谷氨酰胺、10ng/mL SCF以及0.1％PVA的IMDM培养基确认。
在本发明的一实施方式中,PI3K激活剂可以是由氨基酸序列RQIKIWFQNRRMKWKKSDGGYMDMS表示的肽,Y可以是磷酸化的肽(也被称为“740Y-P”)。
在本发明的一实施方式中,TPO受体激动剂可以是3-[4-[[[4-[2-甲氧基-3-(1-叔丁基-2-氧杂戊烷-1-基)苯基]噻唑-2-基]氨基]羰基]-2,6-二氯苯基]-2-甲基丙烯酸(以下被称为“Butyzamide”)。
在本发明的一实施方式中,PI3K激活剂为740Y-P且TPO,受体激动剂为Butyzamide。
在本发明的一实施方式中,本发明的培养方法所使用的培养基为无血清培养基。在本发明的一实施方式中,本发明的培养方法所使用的培养基为化学成分确定的培养基。在本发明的一实施方式中,本发明的培养方法所使用的培养基为无白蛋白、无细胞因子或无白蛋白且无细胞因子的培养基(优选为无血清培养基、更优选为化学成分确定的培养基)。在本发明的一实施方式中,本发明的培养方法所使用的培养基为无血清培养基(优选为化学成分确定的培养基),是无白蛋白的培养基。在本发明的一实施方式中,本发明的培养方法所使用的培养基为无血清培养基(优选为化学成分确定的培养基),是无细胞因子的培养基。在本发明的一实施方式中,本发明的培养方法所使用的培养基为无血清培养基(优选为化学成分确定的培养基),是无白蛋白且无细胞因子的培养基。在本发明的一实施方式中,本发明的培养方法所使用的培养基可含有PI3K激活剂以及TPO受体激动剂。在本发明的一实施方式中,本发明的培养方法所使用的培养基为无血清培养基(优选为化学成分确定的培养基),是无白蛋白且无细胞因子的培养基,可含有聚乙烯醇、PI3K激活剂以及TPO受体激动剂。在本发明的一实施方式中,本发明的培养方法所使用的培养基为无血清培养基(优选为化学成分确定的培养基),是含有由聚乙烯基己内酰胺嵌段以及聚乙酸乙烯酯嵌段的共聚物修饰的聚乙二醇的培养基。在本发明的一实施方式中,本发明的培养方法所使用的培养基为无血清培养基(优选为化学成分确定的培养基),可含有PI3K激活剂代替由聚乙烯基己内酰胺嵌段以及聚乙酸乙烯酯嵌段的共聚物修饰的聚乙二醇、SCF,以及可含有TPO受体激动剂代替TPO。在本发明的一实施方式中,本发明的培养方法所使用的培养基为无白蛋白且无细胞因子的无血清培养基(优选为化学成分确定的培养基),可含有由聚乙烯基己内酰胺嵌段以及聚乙酸乙烯酯嵌段的共聚物修饰的聚乙二醇、PI3K激活剂以及TPO受体激动剂。在本发明的一实施方式中,本发明的培养方法所使用的培养基为无血清培养基(优选为化学成分确定的培养基),可含有PI3K激活剂代替由聚乙烯基己内酰胺嵌段以及聚乙酸乙烯酯嵌段的共聚物修饰的聚乙二醇、SCF,可含有TPO受体激动剂代替TPO,以及4-N-[2-苄基-7-(2-甲基四唑-5-基)-9H-嘧啶[4,5-b]吲哚-4-基]环己烷-1,4-二胺(UM171)。在本发明的一实施方式中,本发明的培养方法所使用的培养基为无白蛋白且无细胞因子的无血清培养基(优选为化学成分确定的培养基),可含有由聚乙烯基己内酰胺嵌段以及聚乙酸乙烯酯嵌段的共聚物修饰的聚乙二醇、PI3K激活剂、TPO受体激动剂、以及UM171。本说明书中,培养液为“含有B代替A”意味着培养液不含A,但该培养液含有B。
在本发明的一实施方式中,用于培养人造血干细胞或人血球系细胞的培养基含有由聚乙烯基己内酰胺嵌段以及聚乙酸乙烯酯嵌段的共聚物修饰的聚乙二醇,且含有,
(1)PI3K激活剂和选自TPO以及TPO受体激动剂的一种以上；
(2)选自SCF以及PI3K激活剂的一种以上和TPO受体激动剂；或
(3)PI3K激活剂和TPO受体激动剂。
此方式中,培养基可以不含有白蛋白。上述用于培养人造血干细胞或人血球系细胞的培养基可进一步含有UM171。上述用于培养人造血干细胞或人血球系细胞的培养基可使用于本发明的培养方法。本发明的用于培养人造血干细胞或人血球系细胞的培养基可使人造血干细胞或人血球系细胞增殖。本发明的用于培养人造血干细胞或人血球系细胞的培养基可维持人造血干细胞的干细胞性。本发明的用于培养人造血干细胞或人血球系细胞的培养基可以维持人造血干细胞的干细胞性的同时使其增殖。
培养基可适当使用适合培养人造血干细胞或人血球系细胞的培养基。作为基础培养基可使用S-clone SF-3培养基、F12培养基、StemSpan(Stem Cell technologies)、STEMα(STEM ALPHA)、StemPro-34无血清培养基(Gibco Invitrogen)、StemPro MSC无血清培养基(Invitorogen)、HSC-CFU培养基(Miltenyl Biotech)、S-Clone无血清培养基(SF-02、SF-03、CM-B、SF-B)(三光纯药)、HPGM培养基(三光纯药)、AIM V培养基(Invitorogen)、MarrowMAX骨髓培养基(Invitrogen)、KnockOut DMEM/F-12培养基(Invtrogen)、Stemline造血干细胞增殖培养基(Sigma)、SYN无血清培养基(SYN H、SYN B)(AbCys SA)、SPE IV培养基(AbCys SA)、MyeloCult培养基(StemCell Technologies)、HPG无血清培养基(Lonza)、UltraCULTURE培养基(Lonza)、Opti-MEM培养基(Gibco Invitrogen等)、MEM培养基(GibcoInvitrogen等)、MEMα(Gibco Invitrogen等)、DMEM培养基(Gibco Invitrogen等)、IMDM培养基(Gibco Invitrogen等)、PRMI1640培养基(Gibco Invitrogen等)、Ham F-12培养基(Gibco等)、RD培养基等。培养基含有基础培养基。培养基例如可含有选自胰岛素、转铁蛋白(APO)、亚硒酸钠以及乙醇胺的一种以上或全部。培养基可含有HEPES、丙酮酸钠、维生素类、氨基酸类、肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素等。培养基可含有抗生素(例如、青霉素以及链霉素)。培养基可含有谷氨酰胺。培养基例如可含有胰岛素、转铁蛋白(APO)、亚硒酸钠、乙醇胺以及抗生素,进一步含有HEPES。
本发明的培养基可含有由聚乙烯基己内酰胺嵌段以及聚乙酸乙烯酯嵌段的共聚物修饰的聚亚烷基二醇(例如聚乙二醇)。
本发明的所有方式中,由聚乙烯基己内酰胺嵌段以及聚乙酸乙烯酯嵌段的共聚物修饰的聚乙二醇可具有以下化学式:
【化1】
{式中,n为5～50中任一项的自然数,m为10～100中任一项的自然数,l为10～200中任一项的自然数。}
在一实施方式中,n为5～20或10～20中任一项的自然数,m为20～50或30～40中任一项的自然数,l为30～100或50～60中任一项的自然数。
应予说明,被修饰的聚亚烷基二醇可以是由上述乙二醇单元成为亚烷基二醇单元的化合物。亚烷基的碳原子数为1～10,例如可以是1～5的亚烷基,优选碳原子数为2或3。
为了在由聚乙烯基己内酰胺嵌段以及聚乙酸乙烯酯嵌段的共聚物修饰的聚乙二醇存在下的环境下增殖人造血干细胞或人血球系细胞,本发明的培养基可含有非细胞伤害性的PI3K激活剂的有效量和由聚乙烯基己内酰胺嵌段以及聚乙酸乙烯酯嵌段的共聚物修饰的聚亚烷基二醇(例如聚乙二醇)的有效量。在此,培养基可以不含有白蛋白。本发明的培养基可进一步含有SCF以及TPO中任一项或全部。本发明的培养基可含有非细胞伤害性的TPO受体激动剂的有效量代替TPO。本发明的培养基可含有非细胞伤害性的PI3K激活剂的有效量、PVA的有效量、TPO以及非细胞伤害性的TPO受体激动剂的有效量中任一项或全部、UM171。
根据本发明,培养人造血干细胞的方法可以是从人造血干细胞制备巨核细胞系列的细胞的方法。在此实施方式中,培养方法所使用的培养基可以是含有PI3K激活剂以及TPO受体激动剂,PI3K激活剂为740Y-P且TPO受体激动剂为Butyzamide的培养基。在这个特定方式中,培养基可不含有UM171。
在本发明的一实施方式中,本发明的培养方法可进一步包括在UM171的存在下的培养。在本发明的一实施方式中,本发明的培养方法所使用的培养基可进一步含有UM171。
本发明中人造血干细胞或人血球系细胞可在适合人造血干细胞或该人血球系细胞的增殖的条件下培养。本发明可进一步包括从培养物分离人造血干细胞或人血球系细胞的过程。人造血干细胞的分离可以通过本领域技术人员已知的方法来完成,例如可使用造血干细胞标记通过流式细胞技术等实施。人造血干细胞可作为人造血干细胞获得,也可以之后进一步使其分化为其他细胞再使用。从人造血干细胞分化为其他细胞时,可在适合该细胞分化的环境下培养想要分化的细胞。人血球系细胞的分离也可以通过本领域技术人员已知的方法来完成,例如可使用该人血球系细胞的标记通过流式细胞技术等实施。
根据本发明可提供一种由本发明的培养方法得到的人造血干细胞或人血球系细胞。由本发明的培养方法得到的人造血干细胞以CD34以及优选CD38为标记纯化而得。由本发明的培养方法得到的人造血干细胞相比于用常规方法得到的人造血干细胞移植于受体后的植入率更优。因此,根据本发明可提供一种由本发明的培养方法得到的人造血干细胞,其相比于培养前,移植于受体后的植入率得到了提升。
本发明的培养方法中培养可在纤连蛋白存在下进行。本发明的培养方法中,可在造血干细胞与纤连蛋白可接触的条件下进行。本发明的培养方法中优选例如培养容器的内测(例如底面)被纤连蛋白包覆。
本发明的培养方法所使用的不含有白蛋白的培养基只含有小于0.1(w/v)％、小于0.05(w/v)％、小于0.01(w/v)％、小于0.005(w/v)％、小于0.001(w/v)％、小于0.0005(w/v)％、或小于0.0001(w/v)％的血清白蛋白,或不完全含有。
本发明的培养方法所使用的培养基可含有重组TPO。重组TPO例如可以是哺乳动物的重组TPO,也可以是重组人类TPO。在本发明的一实施方式中,TPO浓度为20～200ng/mL、更优选为30～150ng/mL、进一步优选为40～150ng/mL,例如可以是100ng/mL。
本发明的培养方法所使用的培养基可进一步含有重组SCF。重组SCF例如可以是哺乳动物的重组SCF,也可以是重组人类SCF。在本发明的一实施方式中,SCF浓度为1～200ng/mL,更优选为1～150ng/mL,进一步优选为1～100ng/mL,例如为1～50ng/mL,更优选为1～30ng/mL,进一步优选为1～20ng/mL,例如可以是5～15ng/mL。
本发明的培养方法所使用的培养基可含有重组TPO和重组SCF。在这个方式中,TPO浓度为20～200ng/mL,更优选为30～150ng/mL,进一步优选为40～150ng/mL,例如可以是100ng/mL,且SCF浓度为1～200ng/mL,更优选为1～150ng/mL,进一步优选为1～100ng/mL,例如为1～50ng/mL,更优选为1～30ng/mL,进一步优选为1～20ng/mL,例如可以是5～15ng/mL。在某个优选的方式中,本发明的培养方法所使用的培养基可含有40～150ng/mL的重组TPO和1～50ng/mL的重组SCF。在某个优选的方式中,本发明的培养方法所使用的培养基中TPO浓度高于SCF浓度,例如可以是上述浓度范围内的任何浓度,且可以高于2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上或10倍以上。
本发明的培养方法所使用的培养基还可以含有Flt3L(特别是人类Flt3L)。FLT3是称为FMS相关酪氨酸激酶3的细胞表面受体(也称为CD135)。FLT3例如在造血干细胞表面表达。FLT3L是FLT3的配体,例如参与造血干细胞以及造血祖细胞的正常产生。本发明的培养方法所使用的培养基除Flt3L之外,还可含有IL-3以及/或GM-CSF。白细胞介素3(IL-3)是造血生长因子,在骨髓系祖细胞的增殖以及存活中起到重要作用。GM-CSF是颗粒细胞单核细胞菌落刺激因子,是促进分化为造血干细胞的细胞因子。GM-CSF与IL-3或IL-5起到协同作用,使造血干细胞分化为骨髓系祖细胞。例如,GM-CSF可以使造血干细胞分化为早期成红细胞系祖细胞(BFU-E)、颗粒细胞单核细胞菌落形成细胞(CFU-GM)、嗜酸性粒细胞菌落形成细胞(CFU-Eo)、以及嗜碱性粒细胞菌落形成细胞(CFU-Ba)。GM-CSF可以使CFU-GM分化为嗜中性白细胞和单核细胞,使CFU-Eo分化为嗜酸性粒细胞。CFU-Ba通过IL-3或IL-5分化为嗜碱性粒细胞。因此,本发明的培养方法所使用的培养基可含有Flt3L,可进一步含有IL-3以及/或GM-CSF。另外,本发明的培养方法可以在适合各血球系细胞的增殖以及/或分化分化的条件下进行。这种培养条件作为含有白蛋白的培养基的培养条件是公知的,同样可以适用于使用减少或缺失白蛋白的培养基的本案发明的培养方法。
本发明的培养方法所使用的培养基可含有PI3K激活剂替代SCF以及/或可含有TPO受体激动剂替代TPO。本发明的培养方法所使用的培养基可含有PI3K激活剂替代SCF且可含有TPO受体激动剂替代TPO。本发明的培养方法所使用的培养基为无细胞因子的培养基,可含有PI3K激活剂以及TPO受体激动剂。本发明的培养方法所使用的培养基可含有PI3K激活剂替代SCF且可含有TPO受体激动剂替代TPO且还可含有UM171。本发明的培养方法所使用的培养基为无细胞因子的培养基,可含有PI3K激活剂、TPO受体激动剂以及UM171。
本发明的人造血干细胞的培养方法还包括在充分维持以及/或增殖造血干细胞的条件下增殖造血干细胞。这种方式中,例如,造血干细胞可以从培养开始增殖至10倍以上、50倍以上、100倍以上、200倍以上、300倍以上、400倍以上或500倍以上。
充分维持以及/或增殖人造血干细胞的条件是指,例如在上述培养基中培养的条件。充分维持以及/或增殖人造血干细胞的条件是指,优选例如可以是纤连蛋白存在的条件,人造血干细胞与纤连蛋白可以接触的条件。
本发明的人血球系细胞的培养方法还包括在充分维持以及/或增殖造人血球系细胞的条件下增殖人血球系细胞。这种方式中,例如,人血球系细胞可以从培养开始增殖至10倍以上、50倍以上、100倍以上、200倍以上、300倍以上、400倍以上或500倍以上。
本发明的培养方法还可以包括从培养基回收增殖的人造血干细胞或人血球系细胞。回收的人造血干细胞或人血球系细胞可进一步浓缩或分离。人造血干细胞或人血球系细胞的浓缩或分离可使用细胞表面标记进行。作为可使用于人造血干细胞的浓缩或分离的细胞表面标记,可列举CD34或CD38。造血干细胞或人血球系细胞的浓缩或分离可使用细胞分选机进行。
根据本发明提供一种体外的人造血干细胞或人血球系细胞的制造方法,其包括本发明的培养方法。通过本发明的制造方法可得到功能性的人造血干细胞或人血球系细胞。
在此,功能性意味着通过人造血干细胞移植接受移植的人类个体(受体)中可以恢复造血系统。
【实施例】
参考例1:使用不含有白蛋白的培养基的造血干细胞的增殖试验本参考例中使用不含有白蛋白的培养基进行了使小鼠造血干细胞(KSL)和人造血干细胞(CD34+CD38-)增殖的试验。培养基含有Wilkinson et al.,Nature,571:117-121,2019公开的聚乙烯醇(PVA),不含有白蛋白的无血清培养基。
具体而言,小鼠造血干细胞的培养中,培养基是含有1％胰岛素转铁蛋白硒乙醇胺(ITSX)、10mM HEPES、1％青霉素链霉素谷氨酰胺、100ng/mL小鼠血小板生成素(mTPO)以及10ng/mL小鼠干细胞因子(mSCF)的F12培养基。上述培养基中PVA具有0.1％的最终浓度。人造血干细胞的培养中,培养基是含有1％胰岛素转铁蛋白硒乙醇胺(ITSX)、25mM HEPES、1％青霉素链霉素谷氨酰胺、100ng/mL人类血小板生成素(hTPO)以及10ng/mL人类干细胞因子(hSCF)的IMDM培养基。上述培养基中PVA具有0.1％的最终浓度。
以下实施例所使用的所有培养基中,除非另有说明均使用含有1％胰岛素转铁蛋白硒乙醇胺(ITSX)、25mM HEPES、1％青霉素链霉素谷氨酰胺以及PVA的IMDM培养基(以下也称为“共通培养基”)。因此,在下文中将着重于共通培养基的添加成分描述培养基。例如,上述培养基除了共通培养基之外含有TPO和SCF,为了方便称为TPO+SCF培养基。表示各因子的浓度时,可记为SCF10+TPO100或也可简写为S10+T100。
作为小鼠造血干细胞使用了小鼠骨髓的KSL细胞。具体而言,小鼠骨髓细胞从胫骨、股骨、骨盆分离,用APC-c-KIT抗体染色。使用抗APC磁珠和LS柱(Miltenyi Biotec)浓缩c-KIT+细胞。之后,用抗CD34、抗c-KIT、抗SCA1以及链霉亲和素APC/eFluor 780染色90分钟之前,用Lineage抗体混合物(生物素化CD4、CD8、CD45R、TER119、LY-6G/LY-6C以及CD127)染色c-KIT浓缩细胞。之后,使用FACS AriaII(BD)纯化细胞群,使用碘化丙啶作为灭火染色剂,直接分选到含有培养基的孔中。
作为人造血干细胞使用了人类骨髓的CD34+CD38-细胞。具体而言,购买了市售的人类骨髓CD34阳性细胞(Lonza 2C-101)。
结果如图1。Wilkinson et al.,2019中,小鼠造血干细胞在不含有白蛋白的无血清培养基中即使在SCF以及TPO存在下也无法维持长期的增殖。然而,Wilkinson et al.,2019中表明,通过向培养基添加PVA,小鼠造血干细胞可在不含有白蛋白的无血清培养基中长期增殖。如图1所示,小鼠造血干细胞在含有PVA的不含有白蛋白的无血清培养基中增殖良好,但人造血干细胞在此培养基中没有观察到良好的增殖。
参考例2:小鼠造血干细胞与人造血干细胞的信号转导的差异在SCF以及TPO存在下分析小鼠造血干细胞以及人造血干细胞的信号通路。
通过磷酸化免疫染色法分析在白蛋白不存在下且PVA存在下将小鼠以及人类各自的造血干细胞在10ng/mL的组织因子(SCF)以及100ng/mL的血小板生成素(TPO)存在下培养的造血干细胞中SCF以及TPO下游的信号因子的磷酸化程度。首先,使用每个因子磷酸化形式特异的抗体检测出SCF以及TPO信号下游各因子的磷酸化状态。具体而言,使用Akt、PI3K以及Stat5等具有代表性的信号转导分子的磷酸化抗体与用细胞因子刺激的细胞反应后,通过荧光显微镜对与细胞反应的抗体的荧光强度进行定量分析。
然后,如图2所示,在所研究的7个因子中,发现了一些在小鼠造血干细胞和人造血干细胞之间具有磷酸化状态的不同因子。其中,对于PI3K以及Akt,在添加SCF以及TPO24小时后,小鼠造血干细胞中发现了许多磷酸化形态,而在人造血干细胞中几乎没有观察到磷酸化形态,或示出了少于小鼠造血干细胞中磷酸化形态的量。
在此,在添加0.3μM AKTa(销售公司名称Sigma-Aldrich、产品编号123871)或20μMPI3Ka的培养基中培养了人造血干细胞。培养3天后、5天后以及7天后进行细胞计数,求出培养第一天的细胞数量为1时各时间点的细胞数量之比。以下实施例中作为PI3Ka使用了740Y-P(销售公司名称Tocris、产品编号1983)。然后,如图3所示,在PI3Ka存在下,人造血干细胞表现出明显的增殖。另一方面,AKTa在本实验的环境下对人造血干细胞没有增殖作用。
接下来,关于人造血干细胞的培养,研究了PI3Ka是否完全替代了SCF。针对向用于人造血干细胞的上述培养基添加20μM的PI3Ka的情况(S10+PI3Ka20+T100)、向上述培养基添加20μM的PI3Ka去除SCF的情况(PI3Ka20+T100),培养人造血干细胞7天后,求出了细胞总数和使用抗CD34抗体的细胞分选分离CD34+细胞的数量。结果如图4所示。如图4所示,添加PI3Ka的情况下,根据SCF的有无,细胞总数以及CD34+细胞数量未观察到显著差异。
接下来,关于人造血干细胞的培养,研究了是否可以用TPO受体激动剂代替TPO。TPO受体激动剂公知为Butyzamide、艾曲波帕以及阿伐曲泊帕。再从上述培养基除去TPO的组成,在0.1％重组人类血清白蛋白(Albumin Biosciences)的存在下或PVA存在下,添加0.1μMButyzamide、3μg/mL艾曲波帕或3μM阿伐曲泊帕于培养基中培养人造血干细胞。本实验中作为人造血干细胞使用了Mpl32D细胞。结果如图5所示。如图5所示,在白蛋白存在下,Butyzamide、艾曲波帕以及阿伐曲泊帕在TPO不存在下可维持人造血干细胞的增殖。相比于此,在PVA存在下(白蛋白不存在下),在TPO不存在下Butyzamide相对于人造血干细胞具有显著的细胞增殖效果,但阿伐曲泊帕中其效果较小,艾曲波帕中几乎观察不到效果。
此外,培养实验中使用了购买的人骨髓CD34+细胞(销售公司名称Lonza、产品编号2C-101)或者使用微珠从受让的新鲜脐带血中分离出CD34+细胞。将每孔0.2～1.0×105细胞分装到24孔板中,从用于人造血干细胞的培养基除去TPO,可以使用上述TPO受体激动剂(以下称为“TPOago”)中任一项代替进行实验。
求出培养第7天的细胞数量与培养第一天之比。结果如图6所示。如图6所示,人造血干细胞在白蛋白不存在下PVA存在下,只有在Butyzamide存在下表现为显着的细胞增殖。在白蛋白不存在下PVA存在下,在阿伐曲泊帕存在下或艾曲波帕存在下造血干细胞引起细胞死。然而,这些TPO受体激动剂在活体内的环境中是一种安全性高的化合物,用于治疗经手术治疗的肝硬化患者和再生障碍性贫血患者。从本实施例的结果可知,在白蛋白不存在下PVA存在下,一些TPO受体激动剂可能对人造血干细胞表现出细胞伤害性。另外,由此可知TPO受体激动剂中存在对人造血干细胞具有细胞伤害性的物质,以及为了培养人造血干细胞,应该使用对人造血干细胞不具有细胞伤害性的细胞。
接下来,研究了在白蛋白不存在下PVA存在下能否用PI3Ka以及TPO受体激动剂替代SCF和TPO。以下实施例中,作为TPO受体激动剂使用了Butyzamide。将购买的人类骨髓CD34+细胞(销售公司名称Lonza、产品编号2C-101)或者、使用微珠从受让的新鲜脐带血中分离出CD34+细胞使用于培养实验。向24孔板以每孔0.2～1.0×105细胞进行分装,在20μM的PI3Ka替换SCF的培养基(PI3Ka20μM+TPO100)以及用20μM的PI3Ka替换SCF、用0.1μM的Butyzamide替换TPO的组成的培养基(PI3Ka20μM+TPOago0.1μM)中分别培养。7天后求出细胞总数,通过流式细胞技术求出CD34+细胞的数量。之后,求出相对于培养开始时的增殖率。结果如图7所示。如图7所示,Butyzamide能够完全替代TPO。进一步在培养前后用细胞分选机分类CD34+细胞,以每100细胞接种于MethocultH4415进行了菌落测定。2周后挑取菌落制作细胞涂片标本进行吉姆萨染色之后,在显微镜下确定了菌落的种类。计数每50个CD34+细胞的GEmM菌落并与培养前比较求出菌落数的增加率。然后,很明显,在GEmM菌落形成能中,Butyzamide可以完全替代TPO。
接下来,对不含有SCF和TPO的培养基,添加PI3Ka20μM以及TPOago 0.1μM中任一项或全部的培养基中,进行了人造血干细胞的培养实验。培养第7天时通过流式细胞技术计数总细胞数量以及含有的CD34+细胞数量,求出相对于培养开始时的增殖率。然后,如图8所示,单独使用PI3Ka或单独使用Butyzamide时细胞没有增加,但显然在PI3Ka和TPOago同时存在时可观察到细胞数量显著增加。
进一步研究了在用PI3Ka和TPOago替代SCF和TPO的培养基中,哪些细胞群容易增殖。使用微珠从受让的新鲜脐带血中分离出CD34+细胞用于培养实验。使用抗CD34-PE-Cy7抗体(销售公司名称BD Biosciences、产品编号348791)、抗CD38-V450抗体(销售公司名称BD Biosciences、产品编号646851)、抗CD133-PE抗体(销售公司名称Miltenyi Biotec、产品编号130-080-801)、抗CD45RA-APC抗体(销售公司名称BioLegend、产品编号304112)以及抗CD49f-PE抗体(销售公司名称BioLegend、产品编号313611)通过细胞分选机分级分离了细胞。对于作为人来源于类脐带血的造血干细胞的纯化标记报告的CD34+分级分离、CD34+CD38-CD133+分级分离、以及CD34+CD38-CD45RA-CD49f+分级分离的每一种,在培养开始后第7天通过流式细胞技术计数总细胞数量以及含有的CD34+细胞数量,求出相对于培养开始时的增殖率。结果如图9所示。如图9所示,所有细胞组分中观察到显著的细胞增殖,但在CD34+CD38-CD133+分级分离以及CD34+CD38-CD45RA-CD49f+分级分离中,特别是在CD34+CD38-CD45RA-CD49f+分级分离中细胞增殖显著。
参考例3:人造血干细胞的长期培养实验
在上述用于人造血干细胞的培养基用PI3Ka20μM以及TPOago 0.1μM替代SCF和TPO的培养基中培养了人造血干细胞。在培养开始后第7天以及第14天用和上述相同地方法求出了细胞总数以及CD34+细胞数量。结果如图10所示。如图10所示,细胞总数随着培养天数的增加而增加,而CD34+细胞数量在第14天而不是第7天减少。
使用光学显微镜观察了培养的细胞,在第14天观察到了巨大的细胞。为了确认该巨大的细胞为巨核细胞或巨核细胞祖细胞的可能性,使用抗CD41a-FITC抗体(销售公司名称BD Pharmingen、产品编号555466)以及抗CD42b抗体(销售公司名称BD Pharmingen、产品编号555473)通过流式细胞仪分级分离了细胞。其结果如图11所示,培养开始后第14天的细胞大部分为CD41a+CD42b+的细胞。但如图11所示,即使在此条件中CD34+CD38-细胞也在增殖。
另外,将培养开始后第14天获得的培养物中的每100个CD34+细胞接种到MethocultH4415进行了菌落测定。2周后采集菌落,制作细胞涂片标本。之后,对标本进行吉姆萨染色后,在显微镜下确定菌落种类。结果如图12所示。菌落的种类意味着G为含有“颗粒细胞”的菌落、E为含有成红细胞”的菌落、m为含有巨噬细胞”的菌落、M为含有巨核细胞”的菌落。如图12所示,多数细胞菌落含有巨核细胞。
参考例4:研究更适合人造血干细胞长期培养的条件
在能够使人造血干细胞增殖的化合物的存在下,尝试了人造血干细胞的长期培养。
在上述用于人造血干细胞的培养基,用PI3Ka20μM以及TPOago 0.1μM替代SCF和TPO,对该培养基(PI3Ka20μM+TPOago 0.1μM)进一步添加SR-1(500nM)以及UM171(35nM)中任一项或全部制备的培养基(+SR-1、+UM171以及+SR-1+UM171)。将购买的人类骨髓CD34+细胞(销售公司名称Lonza、产品编号2C-101)或者使用微珠从受让的新鲜脐带血中分离出CD34+细胞使用于培养实验。向24孔板以每孔0.2～1.0×105细胞进行分装,在准备的培养基培养了CD34+细胞。培养开始后第14天时,与上述同样的方法计数细胞总数以及CD34+细胞,求出自培养开始前的增殖率。结果如图13所示。如图13所示,在进一步含有UM171的培养基中,细胞总数以及CD34+细胞数量增加,相比于不含有UM171的培养基,含有UM171的培养基中CD34+细胞的增加率显著上升。与此相比,在本实验条件中SR-1灭活了细胞。
进一步,在以下三种条件下培养CD34+细胞,求出了细胞总数以及CD34+细胞数量的增加率。条件1:在上述用于人造血干细胞的培养基,用含有PI3Ka20μM以及TPOago 0.1μM替代SCF和TPO的培养基(PI3Ka20μM+TPOago 0.1μM)培养14天；条件2:第7天之后以不含有Butyzamide的培养基(PI3Ka20μM)培养(Day7-无Buty)；条件3:进一步将UM171添加于培养基(PI3Ka20μM+TPOago 0.1μM)的培养基(+UM171)培养14天。结果如图14所示。如图14所示,用培养开始后第7天除去Butyzamide的培养基培养的条件2相比于条件1,CD34+细胞数量增加,CD41+细胞数量减少。如图14所示,用进一步添加UM171的培养基培养的条件3相比于条件1和2,CD34+细胞的增加率显著升高,CD41+细胞数量显著减少。由此可知,PVA、PI3Ka以及TPOago存在下的无血清培养基条件中,UM171使人造血干细胞增殖并抑制细胞分化为巨核细胞祖细胞和巨核细胞(参照图15)。
参考例5:培养后的CD34+细胞的移植实验
将在条件1～3的各条件下培养7天的人类CD34+细胞移植到辐照NOG小鼠中,确认了细胞的植入。具体而言,将1×104个培养后的人类CD34+细胞移植到用1.5Gy的γ射线辐照的NOG小鼠中。移植12周后,采集上述NOG小鼠的外周血,使用流式细胞仪分析了外周血中细胞成分。结果如图16所示。如图16所示,在条件1以及2中,移植培养前CD34+细胞时造血干细胞的植入率分别为14.9％以及11.1％,但移植培养后的CD34+细胞时造血干细胞的植入率分别增加至66.6％以及54.9％。另外,在条件3中,移植培养前CD34+细胞时造血干细胞的植入率为17％,但移植培养后的CD34+细胞时造血干细胞的植入率增加至67％。
由此可知,在白蛋白不存在下的无血清培养基条件中,在PVA存在下,PI3K激活剂以及TPO受体激动剂使人造血干细胞很好地增殖,以及增殖的人类CD34+细胞维持作为造血干细胞的性质,提高了移植到其他个体后的植入率。另外,在这种条件下长期培养人造血干细胞时其一部分分化为巨核细胞,由此可以获得巨核细胞,而一部分人造血干细胞倾向于增殖为CD34+细胞。还阐明了添加UM171提高了CD34+细胞的增殖率,并且可以抑制向巨核细胞的分化。
接下来,从新鲜人类脐带血分离人类单核细胞。培养由条件1以及条件3获得的细胞(5×105细胞),分别求出培养开始7天后以及14天后的总细胞数量、CD34+细胞数量、CD34+细胞占总细胞的比例以及细胞的存活率。结果如图17所示。如图17所示,在任何条件下,从人类脐带血获得的单核细胞伴随培养细胞总数减少。相反,相比于条件1,条件3中CD34+细胞占总细胞的比例显著提高。另外,条件3中细胞的存活率也明显高于条件1。此外,CD34+细胞数量在条件3中显示出显著增加,但在条件1中细胞数量保持不变但未观察到细胞数量增加。
实施例1:使用不含有白蛋白的培养基的造血干细胞的增殖试验
本实施例中进行了使用不含有白蛋白的培养基使小鼠造血干细胞(KSL)和人造血干细胞(CD34+CD38-)增殖的试验。培养基是记载于Wilkinson et al.,Nature,571:117-121,2019的不含有白蛋白的无血清培养基中,用各种聚合物替代聚乙烯醇(PVA)的培养基。
具体而言,小鼠造血干细胞的培养中,培养基是含有1％胰岛素转铁蛋白硒乙醇胺(ITSX)、10mM HEPES、1％青霉素链霉素谷氨酰胺、100ng/mL小鼠血小板生成素(mTPO)以及10ng/mL小鼠干细胞因子(mSCF)的Ham’s F12培养基。
人造血干细胞的培养中,培养基是含有1％胰岛素转铁蛋白硒乙醇胺(ITSX)、25mMHEPES、1％青霉素链霉素谷氨酰胺、100ng/mL人类血小板生成素(hTPO)以及10ng/mL人类干细胞因子(hSCF)的IMDM培养基。在以下实施例中,除非另有说明,造血干细胞的培养使用的是上述培养基。
添加于培养基的聚合物如下:聚乙烯吡咯烷酮K12、聚维酮K17、聚维酮、聚氧乙烯聚氧丙二醇、聚乙烯基己内酰胺-聚乙烯乙酸-聚乙二醇接枝共聚物(以下称为“聚合物A”)。更具体而言,准备了将BASF公司制造的同浓度的KOLLIPHOR(商标)P188 bio(188bio)、KOLLIPHOR(商标)P 188Geismar(188Geismar)、SOL-PLUS(Sol+)、KOLLIPHOR(商标)P407Geismar(407Geismar)、KOLLIDON(商标)30Origin USA(30USA)、KOLLIDON(商标)17PF(17PF)、KOLLIDON(商标)25(25)、KOLLIDON(商标)90F(90F)、以及KOLLIDON(商标)12PF(12PF)分别以最终浓度0.1％添加的上述培养基。
作为小鼠造血干细胞使用了CD34-CD150+的小鼠骨髓的KSL细胞组分。具体而言,小鼠骨髓细胞从自胫骨、股骨、骨盆分离,用APC-c-KIT抗体进行染色。c-KIT+细胞使用抗APC磁珠和LS柱(Miltenyi Biotec)进行浓缩。之后,用抗CD34、抗c-KIT、抗SCA1以及链霉亲和素APC/eFluor 780染色90分钟之前,用Lineage抗体混合物(生物素化CD4、CD8、CD45R、TER119、LY-6G/LY-6C以及CD127)染色c-KIT浓缩细胞。之后,细胞群使用FACS AriaII(BD),使用碘化丙啶作为灭活染色剂,直接选择并纯化到含有培养基的孔。
作为人造血干细胞使用了人类骨髓的CD34+CD38-细胞。具体而言,购买了市售的人类骨髓CD34阳性细胞(Lonza 2C-101)。
小鼠造血干细胞在各个培养基中培养1周,计数培养后的细胞数量。
结果如图18所示。如图18所示,小鼠造血干细胞在含有PVA不含有白蛋白的无血清培养基中很好地增殖,但在替代PVA的其他化合物的存在下不增殖,并且仅在化合物A的存在下才显示增殖。
SOL-PLUS(商标)是一种具有以下结构的化合物:
【化2】
{式中,n为13、m为30、l为57。}
应予说明,在Wilkinson et al.,2019中,小鼠造血干细胞在不含有白蛋白的无血清培养基中,即使是在SCF以及TPO存在下也无法维持长期的增殖。然而,在Wilkinson etal.,2019的Figure 2b表明,通过将PVA添加于培养基,小鼠造血干细胞可以在不含有白蛋白的无血清培养基中长时间增殖。
由此可知,即使在不含有白蛋白的无血清在培养基中,小鼠造血干细胞在PVA或聚合物A的存在下也能良好地增殖。
以50个/孔的比例分取小鼠造血干细胞,在0.1％的PVA或聚合物A和SCF以及TPO的存在下进行了培养。结果如图19所示。如图19所示,小鼠造血干细胞即使在不含有白蛋白的无血清在培养基中,在PVA或聚合物A的存在下可良好地形成菌落。由此可知,在PVA以及聚合物A的存在下,造血干细胞显示出细胞分裂能力。
增殖的细胞中的CD201阳性细胞的比例使用碱性磷酸酶标记抗小鼠CD201抗体(eBio1560)确认。则发现,如图20所示,在聚合物A存在下培养的小鼠造血干细胞具有比PVA更高比例的CD201阳性细胞。CD201被称为造血干细胞的标记,CD201阳性细胞的高比例表明干细胞性通过增殖得到了更好的维持。
进一步,在最终浓度0.1％的聚合物A或PVA存在下培养小鼠造血干细胞1周后移植于辐照小鼠。移植4周后分析被移植的辐照小鼠的外周血,并检查源于造血干细胞的血细胞的嵌合率。其结果显示,在聚合物A存在下培养的造血干细胞显示出与在PVA培养的造血干细胞相当的嵌合率(贡献率)。这表明,在聚合物A存在下培养的造血干细胞的骨髓重塑能力与在PVA存在下培养的造血干细胞的骨髓重塑能力相当。
实施例2:小鼠造血干细胞和人造血干细胞的信号转导的差异
分析了在SCF以及TPO存在下的小鼠造血干细胞以及人造血干细胞的信号通路。
在白蛋白不存在下且PVA存在下,将小鼠以及人类各自的造血干细胞培养于10ng/mL的组织因子(SCF)以及100ng/mL的血小板生成素(TPO)存在下,通过磷酸化免疫染色法分析了培养的造血干细胞中SCF以及TPO下游的信号因子的磷酸化程度。首先,使用每个因子的磷酸化形式特异的抗体检测出SCF以及TPO信号下游各因子的磷酸化状态。具体而言,Akt、PI3K以及Stat5等具有代表性的信号转导分子中的磷酸化抗体与细胞因子刺激的细胞反应后,通过荧光显微镜对与细胞反应的抗体的荧光强度进行了定量分析。
然后,如图24所示,在所研究的7个因子中,发现了一些在小鼠造血干细胞和人造血干细胞之间具有磷酸化状态的不同因子。其中,对于PI3K以及Akt,在添加SCF以及TPO24小时后,小鼠造血干细胞中发现了许多磷酸化形态,而在人造血干细胞中几乎没有观察到磷酸化形态,或示出了少于小鼠造血干细胞中磷酸化形态的量。
在添加了0.3μM AKTa(销售公司名称Sigma-Aldrich、产品编号123871)或20μMPI3Ka的培养基中培养了人造血干细胞。培养3天后、5天后以及7天后计数细胞,求出当培养第一天的细胞数量为1时各时间点的细胞数量之比。以下实施例中,作为PI3Ka使用了740Y-P(销售公司名称Tocris、产品编号1983)。则如图25所示,在PI3Ka存在下人造血干细胞显示出明确的增殖。相反,在本实验的环境下没有观察到AKTa对于人造血干细胞的增殖作用。
接下来,关于人造血干细胞的培养,研究了PI3Ka是否完全替代了SCF。分别求出向用于人造血干细胞的上述培养基添加20μM的PI3Ka的情况下(S10+PI3Ka20+T100)和向上述培养基添加20μM的PI3Ka除去SCF的情况下(PI3Ka20+T100),培养人造血干细胞7天之后的细胞总数以及使用抗CD34抗体通过细胞分选分离CD34+细胞的数量。结果如图26所示。如图26所示,在添加PI3Ka的情况下,根据SCF的有无细胞总数以及CD34+细胞数量未观察到显著差异。
接下来,关于人造血干细胞的培养,研究了是否可以用TPO受体激动剂代替TPO。作为TPO受体激动剂已知有Butyzamide、艾曲波帕以及阿伐曲泊帕。从上述培养基除去TPO的组成中,在0.1％重组人类血清白蛋白(Albumin Biosciences)的存在下或PVA存在下,在添加了0.1μMButyzamide、3μg/mL艾曲波帕或3μM阿伐曲泊帕的培养基中培养了人造血干细胞。本实验中作为人造血干细胞使用了Mpl32D细胞。结果如图27所示。如图27所示,在白蛋白存在下,Butyzamide、艾曲波帕以及阿伐曲泊帕可在TPO的不存在下支持人造血干细胞的增殖。相反,在PVA存在下(白蛋白不存在下),在TPO的不存在下,Butyzamide对于人造血干细胞具有显著的细胞增殖效果,但在阿伐曲泊帕中效果很小,在艾曲波帕中几乎观察不到效果。
此外,培养实验中使用了购买的人类骨髓CD34+细胞(销售公司名称Lonza、产品编号2C-101)或者使用微珠从受让的新鲜脐带血中分离出CD34+细胞。将每孔0.2～1.0×105细胞分装到24孔板中,从用于人造血干细胞的培养基除去TPO,可以使用上述TPO受体激动剂(以下称为“TPOago”)中任一项代替进行实验。
求出培养第7天的细胞数量与培养第一天之比。结果如图28所示。图28所示,人造血干细胞在白蛋白不存在下PVA存在下,只有在Butyzamide存在下表现为显着的细胞增殖。在白蛋白不存在下PVA存在下,在阿伐曲泊帕存在下或艾曲波帕存在下造血干细胞引起细胞死。然而,这些TPO受体激动剂在活体内的环境中是一种安全性高的化合物,用于治疗经手术治疗的肝硬化患者和再生障碍性贫血患者。从本实施例的结果可知,在白蛋白不存在下PVA存在下,一些TPO受体激动剂可能对人造血干细胞表现出细胞伤害性。另外,由此可知TPO受体激动剂中存在对人造血干细胞具有细胞伤害性的物质,以及为了培养人造血干细胞,应该使用对人造血干细胞不具有细胞伤害性的细胞。
接下来,研究了在白蛋白不存在下PVA存在下能否用PI3Ka以及TPO受体激动剂替代SCF和TPO。以下实施例中,作为TPO受体激动剂使用了Butyzamide。将购买的人类骨髓CD34+细胞(销售公司名称Lonza、产品编号2C-101)或者、使用微珠从受让的新鲜脐带血中分离出CD34+细胞使用于培养实验。向24孔板以每孔0.2～1.0×105细胞进行分装,在20μM的PI3Ka替换SCF的培养基(PI3Ka20μM+TPO100)以及用20μM的PI3Ka替换SCF、用0.1μM的Butyzamide替换TPO的组成的培养基(PI3Ka20μM+TPOago0.1μM)中分别培养。7天后求出细胞总数,通过流式细胞技术求出CD34+细胞的数量。之后,求出相对于培养开始时的增殖率。结果如图29所示。如图29所示,Butyzamide能够完全替代TPO。进一步在培养前后用细胞分选机分类CD34+细胞,以每100细胞接种于MethocultH4415进行了菌落测定。2周后挑取菌落制作细胞涂片标本进行吉姆萨染色之后,在显微镜下确定了菌落的种类。计数每50个CD34+细胞的GEmM菌落并与培养前比较求出菌落数的增加率。然后,很明显,在GEmM菌落形成能中,Butyzamide可以完全替代TPO。
接下来,对不含有SCF和TPO的培养基,添加PI3Ka20μM以及TPOago 0.1μM中任一项或全部的培养基中,进行了人造血干细胞的培养实验。培养第7天时通过流式细胞技术计数总细胞数量以及含有的CD34+细胞数量,求出相对于培养开始时的增殖率。然后,如图30所示,单独使用PI3Ka或单独使用Butyzamide时细胞没有增加,但显然在PI3Ka和TPOago同时存在时可观察到细胞数量显著增加。
进一步研究了在用PI3Ka和TPOago替代SCF和TPO的培养基中,哪些细胞群容易增殖。使用微珠从受让的新鲜脐带血中分离出CD34+细胞用于培养实验。使用抗CD34-PE-Cy7抗体(销售公司名称BD Biosciences、产品编号348791)、抗CD38-V450抗体(销售公司名称BD Biosciences、产品编号646851)、抗CD133-PE抗体(销售公司名称Miltenyi Biotec、产品编号130-080-801)、抗CD45RA-APC抗体(销售公司名称BioLegend、产品编号304112)以及抗CD49f-PE抗体(销售公司名称BioLegend、产品编号313611)通过细胞分选机分级分离了细胞。对于作为人来源于类脐带血的造血干细胞的纯化标记报告的CD34+分级分离、CD34+CD38-CD133+分级分离、以及CD34+CD38-CD45RA-CD49f+分级分离的每一种,在培养开始后第7天通过流式细胞技术计数总细胞数量以及含有的CD34+细胞数量,求出相对于培养开始时的增殖率。结果如图31所示。如图31所示,所有细胞组分中观察到显著的细胞增殖,但在CD34+CD38-CD133+分级分离以及CD34+CD38-CD45RA-CD49f+分级分离中,特别是在CD34+CD38-CD45RA-CD49f+分级分离中细胞增殖显著。
实施例3:人造血干细胞的长期培养实验
在上述用于人造血干细胞的培养基用PI3Ka20μM以及TPOago 0.1μM替代SCF和TPO的培养基中培养了人造血干细胞。在培养开始后第7天以及第14天用和上述相同地方法求出了细胞总数以及CD34+细胞数量。结果如图32所示。如图32所示,细胞总数随着培养天数的增加而增加,而CD34+细胞数量在第14天而不是第7天减少。
使用光学显微镜观察了培养的细胞,在第14天观察到了巨大的细胞。为了确认该巨大的细胞为巨核细胞或巨核细胞祖细胞的可能性,使用抗CD41a-FITC抗体(销售公司名称BD Pharmingen、产品编号555466)以及抗CD42b抗体(销售公司名称BD Pharmingen、产品编号555473)通过流式细胞仪分级分离了细胞。其结果如图33所示,培养开始后第14天的细胞大部分为CD41a+CD42b+的细胞。但如图33所示,即使在此条件中CD34+CD38-细胞也在增殖。
另外,将培养开始后第14天获得的培养物中的每100个CD34+细胞接种到MethocultH4415进行了菌落测定。2周后采集菌落,制作细胞涂片标本。之后,对标本进行吉姆萨染色后,在显微镜下确定菌落种类。结果如图34所示。菌落的种类意味着G为含有“颗粒细胞”的菌落、E为含有成红细胞”的菌落、m为含有巨噬细胞”的菌落、M为含有巨核细胞”的菌落。如图34所示,多数细胞菌落含有巨核细胞。
实施例4:研究更适合人造血干细胞长期培养的条件
在能够使人造血干细胞增殖的化合物的存在下,尝试了人造血干细胞的长期培养。
在上述用于人造血干细胞的培养基,用PI3Ka20μM以及TPOago 0.1μM替代SCF和TPO,对该培养基(PI3Ka20μM+TPOago 0.1μM)进一步添加SR-1(500nM)以及UM171(35nM)中任一项或全部制备的培养基(+SR-1、+UM171以及+SR-1+UM171)。将购买的人类骨髓CD34+细胞(销售公司名称Lonza、产品编号2C-101)或者使用微珠从受让的新鲜脐带血中分离出CD34+细胞使用于培养实验。向24孔板以每孔0.2～1.0×105细胞进行分装,在准备的培养基培养了CD34+细胞。培养开始后第14天时,与上述同样的方法计数细胞总数以及CD34+细胞,求出自培养开始前的增殖率。结果如图35所示。如图35所示,在进一步含有UM171的培养基中,细胞总数以及CD34+细胞数量增加,相比于不含有UM171的培养基,含有UM171的培养基中CD34+细胞的增加率显著上升。与此相比,在本实验条件中SR-1灭活了细胞。
进一步,在以下三种条件下培养CD34+细胞,求出了细胞总数以及CD34+细胞数量的增加率。条件1:在上述用于人造血干细胞的培养基,用含有PI3Ka20μM以及TPOago 0.1μM替代SCF和TPO的培养基(PI3Ka20μM+TPOago 0.1μM)培养14天；条件2:第7天之后以不含有Butyzamide的培养基(PI3Ka20μM)培养(Day7-无Buty)；条件3:进一步将UM171添加于培养基(PI3Ka20μM+TPOago 0.1μM)的培养基(+UM171)培养36天。结果如图36所示。如图36所示,用培养开始后第7天除去Butyzamide的培养基培养的条件2相比于条件1,CD34+细胞数量增加,CD41+细胞数量减少。如图14所示,用进一步添加UM171的培养基培养的条件3相比于条件1和2,CD34+细胞的增加率显著升高,CD41+细胞数量显著减少。由此可知,PVA、PI3Ka以及TPOago存在下的无血清培养基条件中,UM171使人造血干细胞增殖并抑制细胞分化为巨核细胞祖细胞和巨核细胞(参照图37)。
实施例5:培养后的CD34+细胞的移植实验
将在条件1～3的各条件下培养7天的人类CD34+细胞移植到辐照NOG小鼠中,确认了细胞的植入。具体而言,将1×104个培养后的人类CD34+细胞移植到用1.5Gy的γ射线辐照的NOG小鼠中。移植12周后,采集上述NOG小鼠的外周血,使用流式细胞仪分析了外周血中细胞成分。结果如图38所示。如图38所示,在条件1以及2中,移植培养前CD34+细胞时造血干细胞的植入率分别为14.9％以及11.1％,但移植培养后的CD34+细胞时造血干细胞的植入率分别增加至66.6％以及54.9％。另外,在条件3中,移植培养前CD34+细胞时造血干细胞的植入率为17％,但移植培养后的CD34+细胞时造血干细胞的植入率增加至67％。
由此可知,在白蛋白不存在下的无血清培养基条件中,在PVA存在下,PI3K激活剂以及TPO受体激动剂使人造血干细胞很好地增殖,以及增殖的人类CD34+细胞维持作为造血干细胞的性质,提高了移植到其他个体后的植入率。另外,在这种条件下长期培养人造血干细胞时其一部分分化为巨核细胞,由此可以获得巨核细胞,而一部分人造血干细胞倾向于增殖为CD34+细胞。还阐明了添加UM171提高了CD34+细胞的增殖率,并且可以抑制向巨核细胞的分化。
接下来,从新鲜人类脐带血分离人类单核细胞。培养由条件1以及条件3获得的细胞(5×105细胞),分别求出培养开始7天后以及14天后的总细胞数量、CD34+细胞数量、CD34+细胞占总细胞的比例以及细胞的存活率。结果如图39所示。如图39所示,在任何条件下,从人类脐带血获得的单核细胞伴随培养细胞总数减少。相反,相比于条件1,条件3中CD34+细胞占总细胞的比例显著提高。另外,条件3中细胞的存活率也明显高于条件1。此外,CD34+细胞数量在条件3中显示出显著增加,但在条件1中细胞数量保持不变但未观察到细胞数量增加。
实施例6:人造血干细胞在聚合物A存在下的培养实验
根据上述实施例可以清楚地看出,人造血干细胞与小鼠造血干细胞不同,需要激活PI3K通路,并且可以用TPO受体激动剂Butyzamide替代TPO。另外,人造血干细胞在不进行长期培养的情况下,可以在UM171不存在下进行培养,但在长期培养的情况下,可以在UM171存在下进行培养,从而可以抑制分化为巨核细胞系列。
在此,本实施例中尝试了用聚合物A代替PVA培养人造血干细胞的实验,即,在聚合物A、PI3K激活剂、TPO受体激动剂以及UM171存在下培养人造血干细胞的实验。作为对照,进行了在PVA、PI3K激活剂、TPO受体激动剂、以及UM171存在下培养人造血干细胞的实验。作为PI3K激活剂使用了PI3Ka,作为TPO受体激动剂使用了Butyzamide,浓度如同上述实施例。
结果如图22所示。替代PVA在聚合物A存在下培养的人造血干细胞增殖良好,如图22所示,CD34阳性细胞的比例高。另外,相比于PVA存在下,在聚合物A存在下CD34阳性细胞的比例更高。由此可知,人造血干细胞在聚合物A存在下且在激活PI3K通路的条件下(且SCF不存在下)增殖良好。另外也有人提出,即使用TPO受体激动剂代替TPO,人造血干细胞在这种条件下也能良好地增殖。还揭示了人造血干细胞在UM171存在下可以良好地增殖。
此外,随着时间的推移,确认了细胞数量的变化。在此实验中,使用了向人的造血干细胞的培养基添加T cell expansion kit(Milteny Biotec)以及人类IL-2(Peprotech)的培养基,将人造血干细胞培养了3周。其结果如图23所示。如图23所示,在PVA存在下以及聚合物A存在下人造血干细胞同样增殖。
实施例7:人类CD3阳性细胞的培养
将人类CD3阳性细胞在通常条件下使用T Cell Activation/Expansion Kit,human(Miltenyi Biotec)由CD28抗体以及CD3抗体进行刺激,在含有0.1％PVA或者0.1％SOL-PLUS(商标)的无白蛋白且无细胞因子的基础培养基(添加了1％ITSX以及1％青霉素的IMDM培养基)培养了6周。早期细胞数量为1000个。结果如图40所示。
如图40所示,CD3阳性细胞(主要包括T细胞)在SOL-PLUS存在下以及PVA存在下均良好地增殖。由此可知无白蛋白的培养基可使用于人类T细胞的维持以及增殖。
实施例8:人类CD34阳性细胞分化为血细胞
用含有PVA或SOL-PLUS(商标)的无白蛋白的基础培养基培养了人类CD34阳性细胞(造血干细胞)。早期细胞数量为1000个。造血干细胞分化为血细胞通过向培养基添加细胞因子混合物进行。培养进行10天。结果如图41所示。
如图41的图A所示,培养CD34阳性细胞的培养液中的细胞数量在SOL-PLUS存在下以及PVA存在下均良好地增殖。如图41的图B所示,通过SOL-PLUS存在下的培养得到的培养液中的细胞含有巨核细胞、成红细胞、嗜中性白细胞以及巨噬细胞。从这个结果,获得了几乎所有血细胞系的细胞,并且每个细胞都在增殖,由此可知,即使在无白蛋白的环境下,在PVA或SOL-PLUS等添加剂的存在下,人血球系细胞可良好地增殖、维持和分化。
实施例9:慢性骨髓性白血病(CML)细胞的培养
CML(慢性骨髓性白血病)患者的骨髓细胞样品在无白蛋白且无细胞因子培养条件下培养了1周。作为培养基使用添加了0.1％PVA、PI3Ka20μM以及TPOago 0.1μM的基础培养基。培养在作为CML致病基因的Bcr-Abl抑制剂(伊马替尼(IM))的存在下和不存在下进行。结果如图42所示。
其结果如图42所示,与培养前的细胞总数量相比,在IM不存在下确认到0.5％的细胞增殖,特别是在作为白血病干细胞组分的CD34阳性细胞中确认到了30倍以上、绝对数为6倍以上的扩展/维持。相反,在IM存在下没有观察到细胞的大幅度的扩展,表明在IM+增殖的细胞是CML白血病干细胞。
Claims (14)
1.一种培养人体细胞的方法,其包括在培养基中培养人体细胞,
培养基为无血清白蛋白培养基,含有添加剂,添加剂选自聚乙烯醇以及修饰聚亚烷基二醇,且含有,
(1)磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)激活剂和选自血小板生成素(TPO)以及TPO受体激动剂的一种以上；
(2)选自干细胞因子(SCF)以及PI3K激活剂的一种以上和TPO受体激动剂；或
(3)PI3K激活剂和TPO受体激动剂,
通过上述培养,可维持或增加人造血干细胞或人血球系细胞的数量。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,
人体细胞为选自人造血干细胞以及人血球系细胞的细胞。
3.根据权利要求1所述的方法,其中,
人体细胞为造血干细胞以外的血球系细胞。
4.根据权利要求3所述的方法,其中,
添加剂为聚乙烯醇。
5.根据权利要求1或2所述的方法,其中,
添加剂为修饰聚亚烷基二醇。
6.根据权利要求5所述的方法,其中,
修饰聚亚烷基二醇是由聚乙烯基己内酰胺嵌段以及聚乙酸乙烯酯嵌段的共聚物修饰的聚亚烷基二醇。
7.根据权利要求6所述的方法,其中,
修饰聚亚烷基二醇是由聚乙烯基己内酰胺嵌段以及聚乙酸乙烯酯嵌段的共聚物修饰的聚乙二醇。
8.一种培养人体细胞的方法,其包括在培养基中培养人体细胞,
培养基含有由聚乙烯基己内酰胺嵌段以及聚乙酸乙烯酯嵌段的共聚物修饰的聚亚烷基二醇。
9.根据权利要求8所述的方法,其还包括得到增加的人体细胞。
10.根据权利要求8或9所述的方法,其中,
人体细胞为人造血干细胞。
11.一种组合物,其为用于培养人体细胞的培养基组合物,
含有由聚乙烯基己内酰胺嵌段以及聚乙酸乙烯酯嵌段的共聚物修饰的聚亚烷基二醇。
12.一种组合物,其含有人体细胞和由聚乙烯基己内酰胺嵌段以及聚乙酸乙烯酯嵌段的共聚物修饰的聚亚烷基二醇。
13.根据权利要求11或12所述的组合物,其中,
人体细胞为人造血干细胞。
14.通过权利要求8～10中任一项所述的方法得到的人体细胞。
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