CN115003685A - 乙型肝炎病毒相关疾病的治疗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了衍生自乙型肝炎病毒(HBV)的X蛋白和聚合酶蛋白的新颖免疫原性肽。这些肽含有跨多种HBV变体非常保守的表位并且衍生自病毒复制所必需的蛋白区。此外，已鉴定与多种HLA类型和表位结合的新颖HBV抗原，这些HLA类型和表位在来自HBV消退者的PBMC中引起IFNγ响应。

Description

乙型肝炎病毒相关疾病的治疗
技术领域
本发明涉及传染性疾病领域。特别地，本发明涉及用于治疗乙型肝炎病毒(HBV)相关疾病的免疫原性肽、多核苷酸、免疫原性组合物和方法。
发明背景
乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染是一个主要的全球健康问题。HBV是嗜肝DNA病毒科的原型成员，其对感染肝细胞有强烈的偏好(Ganem等人,2004N Engl J Med[新英格兰医学杂志]350:1118)。
尽管30年以来可获得针对乙型肝炎的保护的有效预防疫苗，但估计有20亿人感染了HBV，并且目前超过2.4亿人感染了慢性(长期)乙型肝炎，主要的地域在西欧和北美以外的地区(世界卫生组织，2013年7月)。
人与人之间的病毒传播通过直接的血液与血液接触或经由感染者的精液或阴道流体发生。在流行地区，感染发生的特点是通过从母亲到儿童的围产期传播。因此，虽然HBV不会随意传播，但病毒可容易地通过围产期、经皮或性暴露传播。因此，与受感染个体的频繁人与人接触对如卫生工作者的群体构成严重风险。
HBV感染可发展为急性病毒性肝炎，这种疾病始于一般健康状况不佳、食欲不振、恶心、呕吐、身体疼痛、轻度发烧和尿色深，然后进展而发生黄疸。在大多数受影响的成年人中，该疾病会持续数周，然后逐渐好转，尽管有些人可患有更严重的、可导致死亡的肝病(暴发性肝衰竭)。该感染可以完全没有症状，并且可能未被意识到。
乙型肝炎病毒的慢性感染可以是无症状的，或者可以与肝脏的慢性炎症(慢性肝炎)相关，导致在多年的时间段内肝硬化。这种类型的感染会大幅增加肝细胞癌(肝癌)的发生率，也可潜伏多年。用抗病毒药物(如核苷/核苷酸类似物(例如恩替卡韦和替诺福韦)或干扰素(IFN)α)治疗慢性HBV感染个体可有效降低血清病毒载量。然而，抗病毒疗法很少产生持续的病毒学响应，并且发生耐药性(Zoulim等人,2012B J Hepatol[肝病杂志]56增刊1S112；EASL 2017Clinical Practice Guidelines on the management of hepatitis Bvirus infection.[EASL 2017乙型肝炎病毒感染管理的临床实践指南]J.Hepatology[肝病杂志]67:370)。此外，绝大多数HBV携带者仍未得到治疗。
大约15％-40％的慢性HBV携带者将在其一生中发展出临床上显著的肝病，具有死于肝硬化和相关肝衰竭或肝细胞癌的高风险(Huang等人,2011Curr Opin Immunol[免疫学的当前观点]23:237)。由于抗病毒药物无法根除感染，并因此需要长期(如果不是终生的话)抗病毒疗法，具有毒副作用和高成本等缺点，因此迫切需要新的治疗方法(Grimm等人,2013Clin Sci[临床科学](伦敦)124:77)。
治疗性疫苗接种构成了治疗慢性乙型肝炎的有希望的策略。除了针对HBV的体液免疫响应(其主要参与当前预防性疫苗针对HBV感染的保护)(Lok,2002N Engl J Med[新英格兰医学杂志]346:1682)，细胞免疫响应明确参与了针对HBV感染的自然抗性。
HBV从母亲到新生儿的围产期传播和生命最初几年期间的感染导致超过90％的儿童持续感染。相比之下，成年期间的感染在超过90％的病例中会自发清除，并导致终生保护性免疫(Rehermann等人,2005Nat Rev Immunol[自然评论免疫学]5:215)。
在急性、自限性乙型肝炎病毒感染中，外周血中很容易显示响应于许多HBV抗原的强烈的多克隆和多特异性CD8+细胞毒性T细胞(CTL)和CD4+T-辅助(Th)细胞响应(Michel等人,2011J Hepatol[肝病杂志]54:1286)。
这些T细胞响应在HBV清除和控制中至关重要。在受HBV感染的黑猩猩中进行的实验示出了HBV特异性CD8+T细胞在该过程中作为效应细胞的必要作用(Thimme等人,2003JVirol[病毒学杂志]77:68)。与HBV感染消退的患者的响应相比，慢性乙型肝炎患者的T细胞响应通常非常弱，仅集中在少数表位上并且功能受损(Michel等人,2011J Hepatol[肝病杂志]54:1286)。治疗性疫苗接种的目标是建立针对多种HBV抗原的强烈且稳健的多价CTL和T辅助细胞响应，从而实现病毒清除、肝炎控制和治愈。
尽管在理解该疾病的病因学和流行病学方面取得了巨大进展，但仍然需要有效的治疗性HBV疫苗。
包含限制于特定HLA类型的推定T细胞表位的HBV蛋白衍生肽已在本领域中描述(WO 0219986、WO 2002020035、WO 2014102540、WO 15187009)。然而，这些提议的抗原中的多种抗原具有以下一个或多个缺点：
·跨HBV基因型的序列保守性差，导致仅对HBV基因型的(小)子集有功效，
·衍生它们的抗原区与病毒复制没有功能性联系，降低了针对该区的免疫响应干扰病毒复制的可能性，
·由于抗原过度暴露导致免疫耗竭，免疫响应无效，
·总共仅涵盖一种或几种HLA类型，导致在某些缺乏这些HLA类型的群体中缺乏功效，
·难以制造(特别是对于较长的肽)，
·没有经确认的诱导T细胞响应的潜力，
·没有关于以下的指示：针对肽抗原的免疫响应是否具有消退感染的潜力。
发明内容
本发明提供了衍生自HBV-X和HBV聚合酶蛋白的新长肽抗原，其克服了与先前描述的肽抗原相关的所有或大部分缺点。
本文所述的HBV长肽抗原含有新的HLA结合肽序列，这些HLA结合肽序列跨多种HBV基因型非常保守、源自病毒复制所必需的蛋白的保守区、并因此不太可能从HBV特异性免疫响应逃逸。此外，新的HBV衍生的长肽抗原拥有多种HLA结合肽序列，这些HLA结合肽序列具有被多种HLA类型呈递的能力。此外，描述了含有这些HLA结合肽序列的合成长肽(SLP)，这些合成长肽(SLP)可以以足够的产率和足够的纯度制造。此外，已发现含有新鉴定的HLA结合肽序列的SLP在HBV感染已消退的人(HBV消退者)的PBMC中引起IFNγ响应。
在第一主要方面，本发明涉及一种包含HBV蛋白的片段的免疫原性肽，其中所述片段的长度为20-34个氨基酸，并且其中所述片段包含：
a)来自HBV-X的位置57至位置78的区的至少10个连续的氨基酸，优选地包含：
-SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列(x70-78)，和/或
-SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列(x67-75)，和/或
-SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列(x62-73)，和/或
-SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列(x58-66)，和/或
-SEQ ID NO:5中列出的氨基酸序列(x57-66)，
或
b)来自HBV-X的位置103至位置120的区的至少11个连续的氨基酸，优选地包含：
-SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列(x103-111)，和/或
-SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列(x104-113)，和/或
-SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列(x105-113)，和/或
-SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列(x110-120)，
或
c)SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列(x132-140)，
或
d)SEQ ID NO:11中列出的氨基酸序列(p124-133)，
或
e)SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列(p164-173)，
或
f)SEQ ID NO:13中列出的氨基酸序列(p275-283)，
或
g)来自HBV聚合酶的位置403至位置415的区的至少10个连续的氨基酸，优选地包含：
-SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列(p403-412)，和/或
-SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列(p404-412)，和/或
-SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列(p407-415)，
或
h)来自HBV聚合酶的位置509至位置523的区的至少9个连续的氨基酸，优选地包含：
-SEQ ID NO:17中列出的氨基酸序列(p509-517)，和/或
-SEQ ID NO:18中列出的氨基酸序列(p515-523)，
或
i)来自HBV聚合酶的位置649至位置658的区的至少10个连续的氨基酸，包含：
-SEQ ID NO:19中列出的氨基酸序列(p649-658)，和/或
-SEQ ID NO:20中列出的氨基酸序列(p650-658)，
或
j)来自HBV聚合酶的位置693至位置706的区的至少10个连续的氨基酸，优选地包含：
-SEQ ID NO:21中列出的氨基酸序列(p693-701)，和/或
-SEQ ID NO:22中列出的氨基酸序列(p697-706)，
或
k)SEQ ID NO:23中列出的氨基酸序列(p723-731)，
或
l)来自HBV聚合酶的位置755至位置765的区的至少10个连续的氨基酸，包含：
-SEQ ID NO:24中列出的氨基酸序列(p755-764)，和/或
-SEQ ID NO:25中列出的氨基酸序列(p756-765)，
或
m)SEQ ID NO:26中列出的氨基酸序列(p829-837)。
在另外的方面，本发明涉及包含编码根据本发明所述的肽的核苷酸序列的多核苷酸、包含本发明的免疫原性肽或多核苷酸的免疫原性组合物以及本发明的肽、多核苷酸、重组病毒或免疫原性组合物在治疗HBV相关疾病中的用途。
附图说明
图1.经验证的HLA-I表位和预测的HLA结合肽序列针对HBx的蛋白保守性和功能的比对。居中的条形图描绘了HBx蛋白共有序列的长度(方法)，其中跨病毒基因型的保守性评分由每个氨基酸的灰度代码(图例)指示。将从Hepitopes数据库获得的报告的经过验证的表位序列与该共有蛋白序列进行比对并示出在顶部。在此之下，针对每个HLA超型代表描绘了由NetMHCpan预测的潜在新结合物(9-11个氨基酸)。在比对的结合物下方，我们绘制了蛋白序列上所有预测的结合物(长度为8-14个氨基酸)内每个氨基酸的频率分布。每个氨基酸的保守性评分(图例)示出为水平灰度编码条形图。其突变导致病毒持久性丧失的必需氨基酸通过与保守性评分的颜色匹配的箭头指示。根据HBVdb的命名法，将功能性结构域描绘在底部。
图2.经验证的HLA-I表位和预测的HLA结合肽序列针对聚合酶的蛋白保守性和功能的比对。描绘了前200个氨基酸(A、E)、氨基酸201-474(B、F)、475-631(C、G)和氨基酸632-843(D、H)。将从Hepitopes数据库获得的报告的经过验证的表位序列示出在顶部。在此之下，针对每个HLA超型(A-D)描绘了由NetMHCpan预测的潜在新结合物(9-11个氨基酸)。此外，我们绘制了蛋白序列上预测的结合物(长度为8-14个氨基酸)的频率分布(E-H)。每个氨基酸的保守性评分(图例)示出为水平灰度编码条形图。其单个或组合的突变导致病毒持久性丧失(≥50％)的必需氨基酸通过与该特定氨基酸的保守性评分的颜色匹配的箭头指示。预测对病毒蛋白的正确折叠至关重要的氨基酸用星号指示。根据先前确定的命名法(Cao等人2014J Viral Hepat[病毒性肝炎杂志]21:882)描述了一般结构域，其中还表示了T3结构域和YMDD基序。
图3.选定的预测的HLA结合肽序列的体外结合能力。预测的HLA结合肽序列的结合表示为对指示的HLA类型具有高亲和力的阳性对照肽(pos.ct.)的结合百分比。描绘了对照(黑色)、结合物(>25％的阳性对照；灰色)和非结合物(≤25％的阳性对照；白色)的平均值和标准偏差。评估了6个超型代表的结合能力，此外，考虑到HLA*11:01在慢性乙型肝炎患者群体中的高患病率，将其包括在内。这些都在单独的图(A-G)中对每一个进行了描绘。作为阴性对照，我们包括了每种HLA类型的已知非结合肽(neg.ct.)和不存在肽的情况。加闭合下划线的肽很少被描述为与所测试的HLA类型有关的表位序列。加虚线下划线的肽是迄今为止仅被描述与另一HLA类型有关的表位序列，表(H)中总结了其中的交叉反应性结合物。星号指示哪些肽不符合我们的长度和保守性阈值。
图4.选定的预测的HLA结合肽序列的结合能力相比于计算机预测衍生的等级评分。如图3所描绘，根据体外HLA结合测定的预测的HLA结合序列的结合能力针对根据NetMHCpan的计算机预测的HLA结合能力(表示为等级评分)作图。指示了阳性对照截止值的25％结合，以将已确认的结合物与低/非结合物分开。
图5.HLA结合肽序列的免疫原性。测量通过来自9个HBV消退者的扩增的PBMC实现的IFNγ产量(减去DMSO)，该IFNγ产量响应于与已确认的HLA结合肽序列和良好建立的c18-27和p549-557表位序列的孵育(分图B)。灰色框呈现了响应性供体的数目，作为针对每个HLA结合肽序列测试的受试者总数目的分数。加闭合下划线的表位序列很少被描述用于测试的HLA类型。加虚线下划线的表位序列迄今为止仅被描述与另一HLA类型有关。星号指示哪些HLA结合肽序列不符合我们的长度和保守性阈值。
图6.通过ELISpot测量的SLP刺激后的IFNγ响应。将来自过去已HBV感染消退的15名供体的PBMC与10uM SLP或等同浓度的DMSO一起孵育20-24小时，并随后通过ELISpot测量IFNγ的产量。描绘了来自4个重复孔的累积斑点形成单位(SFU)减去来自DMSO对照条件的4个重复孔的累积SFU。每个点代表一个供体，并且每个供体都用不同的符号描绘。将阴性SFU描绘为0。图6中的供体编号不一定与图5中的供体编号对应。
图7.新的SLP可以在体外加强来自HBV消退者和慢性HBV患者的白细胞中的功能性CD8+和CD4+T细胞响应。将从先前清除HBV、rHBV的健康供体的血沉棕黄层中分离的PBMC(A)或从就诊于我们门诊的慢性HBV患者(cHBV)的全血中分离的PBMC(B)暴露于含有指示的SLP(1、2、4和6)的SLP池中并允许在IL-2存在下扩增14天。14天后，用指定的SLP单独地再刺激扩增的细胞22小时，在此之后，分别评估细胞和培养上清液两者的、指示功能性T细胞活化的表面标志物和细胞因子。示出了表达活化标志物CD69的CD4+和CD8+T细胞的百分比和表达CD107a的CD8+T细胞的百分比(减去了针对DMSO媒介物对照样品观察到的百分比)，该CD107a指示最近的CD8+T细胞细胞毒活性。还绘制了SLP再刺激导致的在上清液中的T细胞细胞因子IFNγ和TNFα的分泌。细胞因子的值减去针对DMSO/不相关肽对照样品观察到的平均值+2x这些对照的标准偏差。
图8.清除HBV感染的新治疗方案。在开始治疗性疫苗接种(T)之前，通过核苷/核苷酸类似物(NA)处理降低病毒载量。当病毒载量稳定低时，给予治疗性疫苗接种。为了进一步改善T细胞效应子功能，治疗性疫苗接种可以任选地与以下组合：抑制性骨髓细胞(MDSC)靶向药物(在治疗性疫苗接种之前给予)、siRNA(在治疗性疫苗接种之前)、T细胞代谢修饰药物(在治疗性疫苗接种之前或期间)或检查点阻断(在治疗性疫苗接种期间或之后)。作为“天然”加强剂，停止NA治疗以增加病毒抗原的存在，原位加强HBV特异性T细胞以驱动剩余受感染肝细胞的清除。优选地进行病毒载量的充分监测以评价疫苗功效并决定后续(组合)疗法和/或NA停止。线提供了指示的参数随时间发展的示意性指示。箭头指示干预或监测的优选时刻。
具体实施方式
定义
术语“HBV”是指乙型肝炎病毒。已经描述了八种不同的HBV基因型，称为A至H。这些基因型共享显著的序列同源性，但相差至少8％的序列。在基因型内，已经描述了亚型：这些相差4％-8％的基因组。
术语“HBV聚合酶”或简单地“聚合酶”或“Pol”是指由乙型肝炎基因组编码的聚合酶。GenBank NCBI参考文献NC_003977.2描述了通常用作参考的HBV聚合酶序列，其也在本文的SEQ ID NO:27中列出。SEQ ID NO:28示出了基于7489个基因型的HBV聚合酶的共有序列。在本发明的一个实施例中，存在于本发明的肽中的HBV聚合酶片段与SEQ ID NO:27中列出的对应序列超过85％、如超过90％、例如超过95％、如超过98％相同。在本发明的另一实施例中，该HBV聚合酶片段与SEQ ID NO:28中列出的对应序列超过85％、如超过90％、例如超过95％、如超过98％相同。在另一实施例中，提到的HBV聚合酶是选自由A、B、C、D、E、F、G和H组成的组的基因型的HBV聚合酶。
术语“HBV-X”、“HBx”、“HBxAg”、“HBV-X蛋白”或“X-蛋白”等是指由乙型肝炎基因组编码的X蛋白。GenBank NCBI参考文献NC_003977.2描述了通常用作参考的HBV-X序列，其也在本文的SEQ ID NO:29中列出。SEQ ID NO:30示出了基于8127个基因型的HBV-X蛋白的共有序列。在本发明的一个实施例中，存在于本发明的肽中的HBV-X片段与SEQ ID NO:29中列出的对应序列超过85％、如超过90％、例如超过95％、如超过98％相同。在本发明的另一实施例中，该HBV-X片段与SEQ ID NO:30中列出的对应序列超过85％、如超过90％、例如超过95％、如超过98％相同。在另一实施例中，提到的HBV-X蛋白是选自由A、B、C、D、E、F、G和H组成的组的基因型的HBV-X蛋白。
本文的HBV聚合酶和HBV-X内的位置编号分别参考SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:30中列出的共有序列。换言之，HBV聚合酶和HBV-X蛋白内的氨基酸位置的编号对应于分别在SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:30中列出的共有序列中的编号。一个序列中“对应于”另一序列中的氨基酸位置的氨基酸位置是使用典型地在默认设置下的标准序列比对程序(如ALIGN、ClustalW或类似程序)与另一氨基酸比对的氨基酸位置。针对在HBV聚合酶或HBV-X序列中的特定位置，如何比对序列并由此确定共有序列中的对应位置是什么，在本领域中被认为是熟知的。例如，如果在给定的HBV聚合酶中相对于共有序列存在缺口，则比对可以示出该给定的HBV聚合酶中从氨基酸位置20至位置40的片段对应于共有序列中的位置20至41。为避免疑义：虽然位置的编号参考共有序列，但片段的实际氨基酸序列可以与该共有序列不同，并且取决于HBV基因型而变化。
“序列同一性”在本文中定义为两个或更多个氨基酸序列之间的关系，如通过比较序列确定的。序列同一性可以通过两个肽序列的比对来确定。相似长度的序列优选使用全局比对算法(例如尼德曼-翁施(Needleman Wunsch))进行比对，该算法在整个长度上最优化地进行序列比对，而长度区别非常大的序列优选使用局部比对算法进行比对(例如史密斯-沃特曼(Smith Waterman))。
“治疗(Treatment或treating)”是指施用有效量的免疫原性组合物，目的是减轻、缓解、阻止、根除(治愈)或预防症状、障碍或疾病状态。“有效量”是指在必要的剂量下和时间段内有效实现所希望的治疗性结果的量。
当在本文中使用时，术语“免疫原性肽”意指能够触发或加强免疫响应的肽。本发明的免疫原性肽可以是未缀合的或未修饰的，即，是通过肽键连接的简单氨基酸链，或者它可以被进一步修饰，例如缀合，如与另一分子(例如佐剂)共价结合。
在本发明的上下文中，“长度为20-34个氨基酸”意指氨基酸残基的数目为从20至34个，即20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34个氨基酸残基。本发明中的肽(也称为长肽)超过了I类和II类人白细胞抗原(HLA)呈递的表位肽序列的长度。优选地，本发明的长肽是合成的肽，在本文中也称为合成的长肽(SLP)。
在本发明的上下文中，术语“HBV蛋白的片段”意指对应于HBV蛋白的部分序列(即与其相同)的氨基酸序列。因此，它是指没有插入、缺失或取代的天然HBV蛋白的连续序列。如果指定了肽包含HBV蛋白的某个长度的片段，则意味着该片段不更短或不更长。例如，如果指定了片段的长度为20-34个氨基酸，这意指所述片段的长度不小于20个氨基酸或大于34个氨基酸。因此，这种肽例如不包含所述HBV蛋白的长度为35个氨基酸或更多的连续序列。然而，为避免疑义，“包含”在本领域具有其通常的含义，即“包含HBV蛋白的片段的肽”可以包含超出指定片段的额外的序列，例如不衍生自所述HBV蛋白的序列或与该HBV蛋白中的所述片段不邻接的HBV蛋白的其他部分序列。
在本发明的上下文中，术语“HLA结合肽”或“HLA结合物”或“结合物”是指HBV-X或HBV聚合酶的短蛋白片段部分，其可与HLA分子特异性地结合。
在本发明的上下文中，“表位”定义为与指定的HLA分子结合的短HLA结合肽，当其存在于细胞表面时，能够在个体中引起T细胞响应。
通过不定冠词“一”(“a”或“an”)提及要素并不排除存在多于一个/一种要素的可能性，除非上下文明确要求存在一个/一种并且仅一个/一种要素。因此，不定冠词“一”(“a”或“an”)通常意指“至少一个/一种”。
本发明另外的方面和实施例
如上所述，在第一主要方面，本发明涉及一种包含HBV蛋白的片段的免疫原性肽，其中所述片段的长度为20-34个氨基酸，并且其中所述片段包含：
a)来自HBV-X的位置57至位置78的区的至少10个连续的氨基酸，优选地包含：
-SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列(x70-78)，和/或
-SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列(x67-75)，和/或
-SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列(x62-73)，和/或
-SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列(x58-66)，和/或
-SEQ ID NO:5中列出的氨基酸序列(x57-66)，
或
b)来自HBV-X的位置103至位置120的区的至少11个连续的氨基酸，优选地包含：
-SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列(x103-111)，和/或
-SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列(x104-113)，和/或
-SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列(x105-113)，和/或
-SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列(x110-120)，
或
c)SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列(x132-140)，
或
d)SEQ ID NO:11中列出的氨基酸序列(p124-133)，
或
e)SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列(p164-173)，
或
f)SEQ ID NO:13中列出的氨基酸序列(p275-283)，
或
g)来自HBV聚合酶的位置403至位置415的区的至少10个连续的氨基酸，优选地包含：
-SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列(p403-412)，和/或
-SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列(p404-412)，和/或
-SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列(p407-415)，
或
h)来自HBV聚合酶的位置509至位置523的区的至少9个连续的氨基酸，优选地包含：
-SEQ ID NO:17中列出的氨基酸序列(p509-517)，和/或
-SEQ ID NO:18中列出的氨基酸序列(p515-523)，
或
i)来自HBV聚合酶的位置649至位置658的区的至少10个连续的氨基酸，包含：
-SEQ ID NO:19中列出的氨基酸序列(p649-658)，和/或
-SEQ ID NO:20中列出的氨基酸序列(p650-658)，
或
j)来自HBV聚合酶的位置693至位置706的区的至少10个连续的氨基酸，优选地包含：
-SEQ ID NO:21中列出的氨基酸序列(p693-701)，和/或
-SEQ ID NO:22中列出的氨基酸序列(p697-706)，
或
k)SEQ ID NO:23中列出的氨基酸序列(p723-731)，
或
l)来自HBV聚合酶的位置755至位置765的区的至少10个连续的氨基酸，包含：
-SEQ ID NO:24中列出的氨基酸序列(p755-764)，和/或
-SEQ ID NO:25中列出的氨基酸序列(p756-765)，
或
m)SEQ ID NO:26中列出的氨基酸序列(p829-837)。
在一个实施例中，该肽由HBV蛋白的所述片段组成。
在另一实施例中，所述肽的长度为20-34个氨基酸，如长度为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34个氨基酸，如长度为20-33个氨基酸，例如长度为20-32个氨基酸，如长度为20-31个氨基酸，例如长度为20-30个氨基酸，如长度为20-29个氨基酸，例如长度为20-28个氨基酸，如长度为20-27个氨基酸，例如长度为20-26或20-25个氨基酸。
在另外的实施例中，所述片段的长度为20-33个氨基酸，如长度为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34个氨基酸，例如长度为20-32个氨基酸，如长度为20-31个氨基酸，例如长度为20-30个氨基酸，如长度为20-29个氨基酸，例如长度为20-28个氨基酸，如长度为20-27个氨基酸，例如长度为20-26或20-25个氨基酸。
在另外的方面，本发明涉及一种包含HBV蛋白的片段的免疫原性肽，其中所述片段的长度为20-34个氨基酸，如长度为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个氨基酸，并且其中所述片段包含一个或多个选自由以下组成的组的序列：
-SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列(x70-78)，
-SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列(x67-75)，
-SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列(x62-73)，
-SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列(x58-66)，
-SEQ ID NO:5中列出的氨基酸序列(x57-66)，
-SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列(x103-111)，
-SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列(x104-113)，
-SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列(x105-113)，
-SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列(x110-120)，
-SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列(x132-140)，
-SEQ ID NO:11中列出的氨基酸序列(p124-133)，
-SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列(p164-173)，
-SEQ ID NO:13中列出的氨基酸序列(p275-283)，
-SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列(p403-412)，
-SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列(p404-412)，
-SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列(p407-415)，
-SEQ ID NO:17中列出的氨基酸序列(p509-517)，
-SEQ ID NO:18中列出的氨基酸序列(p515-523)，
-SEQ ID NO:19中列出的氨基酸序列(p649-658)，
-SEQ ID NO:20中列出的氨基酸序列(p650-658)，
-SEQ ID NO:21中列出的氨基酸序列(p693-701)，
-SEQ ID NO:22中列出的氨基酸序列(p697-706)，
-SEQ ID NO:23中列出的氨基酸序列(p723-731)，
-SEQ ID NO:24中列出的氨基酸序列(p755-764)，
-SEQ ID NO:25中列出的氨基酸序列(p756-765)，和
-SEQ ID NO:26中列出的氨基酸序列(p829-837)，
优选地其中所述片段包含：
-SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列(x70-78)和SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列(x67-75)，或
-SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列(x70-78)和SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列(x62-73)，或
-SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列(x70-78)和SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列(x58-66)，或
-SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列(x70-78)和SEQ ID NO:5中列出的氨基酸序列(x57-66)，或
-SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列(x67-75)和SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列(x62-73)，或
-SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列(x67-75)和SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列(x58-66)，或
-SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列(x67-75)和SEQ ID NO:5中列出的氨基酸序列(x57-66)，或
-SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列(x62-73)和SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列(x58-66)，或
-SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列(x62-73)和SEQ ID NO:5中列出的氨基酸序列(x57-66)或
-SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列(x103-111)和SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列(x104-113)，或
-SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列(x103-111)和SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列(x105-113)，或
-SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列(x103-111)和SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列(x110-120)，或
-SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列(x104-113)和SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列(x110-120)，或
-SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列(x105-113)和SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列(x110-120)，或
-SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列(p403-412)和SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列(p407-415)，或
-SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列(p404-412)和SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列(p407-415)。
如所描述的，在一个实施例中，该免疫原性肽包含HBV-X的片段，其中所述片段的长度为20-34，如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34个氨基酸，并且所述片段包含来自HBV-X的位置57至位置78的区的至少10个连续的氨基酸，包含：
-SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列(x70-78)，和/或
-SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列(x67-75)，和/或
-SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列(x62-73)，和/或
-SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列(x58-66)，和/或
-SEQ ID NO:5中列出的氨基酸序列(x57-66)。
在另外的实施例中，该免疫原性肽包含HBV-X的片段，其中所述片段的长度为20-34，如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34个氨基酸，所述片段包含来自HBV-X的位置57至位置78的区的至少10个连续的氨基酸，并且所述片段包含：
-SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列(x70-78)和SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列(x67-75)，或
-SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列(x70-78)和SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列(x62-73)，或
-SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列(x70-78)和SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列(x58-66)，或
-SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列(x70-78)和SEQ ID NO:5中列出的氨基酸序列(x57-66)，或
-SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列(x67-75)和SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列(x62-73)，或
-SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列(x67-75)和SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列(x58-66)，或
-SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列(x67-75)和SEQ ID NO:5中列出的氨基酸序列(x57-66)，或
-SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列(x62-73)和SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列(x58-66)，或
-SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列(x62-73)和SEQ ID NO:5中列出的氨基酸序列(x57-66)。
在另外的实施例中，该片段的最N-末端的氨基酸是在HBV-X的位置53处的氨基酸，或该片段的最N-末端的氨基酸是在HBV-X的比53更C-末端的位置(即位置54、位置55、位置56等)处的氨基酸。
在另一另外的实施例中，该片段的最C-末端的氨基酸是在HBV-X的位置91处的氨基酸，或该片段的最C-末端的氨基酸是在HBV-X的比91更N-末端的位置(即位置90、位置89、位置88等)处的氨基酸。
在甚至另外的实施例中：
-该片段的最N-末端的氨基酸是在HBV-X的位置53处的氨基酸或在HBV-X的比53更C-末端的位置处的氨基酸，并且
-该片段的最C-末端的氨基酸是在HBV-X的位置91处的氨基酸或在HBV-X的比91更N-末端的位置处的氨基酸。
因此，在该后一实施例中，包含在本发明的肽内的HBV-X片段不延伸超过HBV-X的位置53和91。
在另一实施例中，该免疫原性肽包含HBV-X的片段，其中所述片段的长度为20-34，如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34个氨基酸，并且所述片段包含来自HBV-X的位置103至位置120的区的至少11个连续的氨基酸，包含：
-SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列(x103-111)，和/或
-SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列(x104-113)，和/或
-SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列(x105-113)，和/或
-SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列(x110-120)。
在另外的实施例中，该免疫原性肽包含HBV-X的片段，其中所述片段的长度为20-34，如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34个氨基酸，所述片段包含来自HBV-X的位置103至位置120的区的至少11个连续的氨基酸，并且所述片段包含：
-SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列(x103-111)和SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列(x104-113)，或
-SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列(x103-111)和SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列(x105-113)，或
-SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列(x103-111)和SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列(x110-120)，或
-SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列(x104-113)和SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列(x110-120)，或
-SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列(x105-113)和SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列(x110-120)。
在另外的实施例中，该片段的最N-末端的氨基酸是在HBV-X的位置103处的氨基酸，或该片段的最N-末端的氨基酸是在HBV-X的比103更C-末端的位置(即位置104、位置105、位置106等)处的氨基酸。
在另一另外的实施例中，该片段的最C-末端的氨基酸是在HBV-X的位置122处的氨基酸，或该片段的最C-末端的氨基酸是在HBV-X的比122更N-末端的位置(即位置121、位置120、位置119等)处的氨基酸。
在甚至另外的实施例中，包含在本发明的肽内的HBV-X片段不延伸超过HBV-X的位置103和122。
在另一实施例中，该免疫原性肽包含HBV-X的片段，其中所述片段的长度为20-34，如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34个氨基酸，并且所述片段包含SEQID NO:10中列出的氨基酸序列(x132-140)。
在另外的实施例中，该片段的最N-末端的氨基酸是在HBV-X的位置116处的氨基酸，或该片段的最N-末端的氨基酸是在HBV-X的比116更C-末端的位置(即位置117、位置118、位置119等)处的氨基酸。
在另一另外的实施例中，该片段的最C-末端的氨基酸是在HBV-X的位置140处的氨基酸，或该片段的最C-末端的氨基酸是在HBV-X的比140更N-末端的位置(即位置139、位置138、位置137等)处的氨基酸。
在甚至另外的实施例中：
-该片段的最N-末端的氨基酸是在HBV-X的位置116处的氨基酸或在HBV-X的比116更C-末端的位置处的氨基酸，并且
-该片段的最C-末端的氨基酸是在HBV-X的位置140处的氨基酸或在HBV-X的比140更N-末端的位置处的氨基酸。
因此，在该后一实施例中，包含在本发明的肽内的HBV-X片段不延伸超过HBV-X的位置116和140。
在另一实施例中，该免疫原性肽包含HBV聚合酶的片段，其中所述片段的长度为20-34，如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34个氨基酸，并且所述片段包含SEQ ID NO:11中列出的氨基酸序列(p124-133)。
在另外的实施例中，该片段的最C-末端的氨基酸是在HBV聚合酶的位置155处的氨基酸，或该片段的最C-末端的氨基酸是在HBV聚合酶的比155更N-末端的位置(即位置154、位置153、位置152等)处的氨基酸。
在另一实施例中，该免疫原性肽包含HBV聚合酶的片段，其中所述片段的长度为20-34，如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34个氨基酸，并且所述片段包含SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列(p164-173)。
在另外的实施例中，该片段的最N-末端的氨基酸是在HBV聚合酶的位置151处的氨基酸，或该片段的最N-末端的氨基酸是在HBV聚合酶的比151更C-末端的位置(即位置152、位置153、位置154等)处的氨基酸。
在另一另外的实施例中，该片段的最C-末端的氨基酸是在HBV聚合酶的位置174处的氨基酸，或该片段的最C-末端的氨基酸是在HBV聚合酶的比174更N-末端的位置(即位置173、位置172、位置171等)处的氨基酸。
在另一实施例中，该免疫原性肽包含HBV聚合酶的片段，其中所述片段的长度为20-34，如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34个氨基酸，并且所述片段包含SEQ ID NO:13中列出的氨基酸序列(p275-283)。
在另外的实施例中，该片段的最N-末端的氨基酸是在HBV聚合酶的位置262处的氨基酸，或该片段的最N-末端的氨基酸是在HBV聚合酶的比262更C-末端的位置(即位置263、位置264、位置265等)处的氨基酸。
在另一实施例中，该免疫原性肽包含HBV聚合酶的片段，其中所述片段的长度为20-34，如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34个氨基酸，并且所述片段包含来自HBV聚合酶的位置403至位置415的区的至少10个连续的氨基酸，包含：
-SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列(p403-412)，和/或
-SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列(p404-412)，和/或
-SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列(p407-415)。
在另外的实施例中，该免疫原性肽包含HBV聚合酶的片段，其中所述片段的长度为20-34，如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34个氨基酸，所述片段包含来自HBV聚合酶的位置403至位置415的区的至少10个连续的氨基酸，包含：
-SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列(p403-412)和SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列(p407-415)，或
-SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列(p404-412)和SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列(p407-415)。
在另外的实施例中，该片段的最N-末端的氨基酸是在HBV聚合酶的位置390处的氨基酸，或该片段的最N-末端的氨基酸是在HBV聚合酶的比390更C-末端的位置(即位置391、位置392、位置393等)处的氨基酸。
在另一另外的实施例中，该片段的最C-末端的氨基酸是在HBV聚合酶的位置425处的氨基酸，或该片段的最C-末端的氨基酸是在HBV聚合酶的比425更N-末端的位置(即位置424、位置423、位置422等)处的氨基酸。
在甚至另外的实施例中：
-该片段的最N-末端的氨基酸是在HBV聚合酶的位置390处的氨基酸或在HBV聚合酶的比390更C-末端的位置处的氨基酸，并且
-该片段的最C-末端的氨基酸是在HBV聚合酶的位置425处的氨基酸或在HBV聚合酶的比425更N-末端的位置处的氨基酸。
因此，在该后一实施例中，包含在本发明的肽内的HBV聚合酶片段不延伸超过HBV聚合酶的位置390和425。
在另一实施例中，该免疫原性肽包含HBV聚合酶的片段，其中所述片段的长度为20-34，如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34个氨基酸，并且所述片段包含来自HBV聚合酶的位置509至位置523的区的至少9个连续的氨基酸，包含：
-SEQ ID NO:17中列出的氨基酸序列(p509-517)，和/或
-SEQ ID NO:18中列出的氨基酸序列(p515-523)。
在另外的实施例中，该片段的最N-末端的氨基酸是在HBV聚合酶的位置503处的氨基酸，或该片段的最N-末端的氨基酸是在HBV聚合酶的比503更C-末端的位置(即位置504、位置505、位置506等)处的氨基酸。
在另一另外的实施例中，该片段的最C-末端的氨基酸是在HBV聚合酶的位置532处的氨基酸，或该片段的最C-末端的氨基酸是在HBV聚合酶的比532更N-末端的位置(即位置531、位置530、位置529等)处的氨基酸。
在另一实施例中，该免疫原性肽包含HBV聚合酶的片段，其中所述片段的长度为20-34，如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34个氨基酸，并且所述片段包含来自HBV聚合酶的位置649至位置658的区的至少10个连续的氨基酸，包含：
-SEQ ID NO:19中列出的氨基酸序列(p649-658)，和/或
-SEQ ID NO:20中列出的氨基酸序列(p650-658)。
在另外的实施例中，该片段的最N-末端的氨基酸是在HBV聚合酶的位置624处的氨基酸，或该片段的最N-末端的氨基酸是在HBV聚合酶的比624更C-末端的位置(即位置625、位置626、位置627等)处的氨基酸。
在另一另外的实施例中，该片段的最C-末端的氨基酸是在HBV聚合酶的位置658处的氨基酸，或该片段的最C-末端的氨基酸是在HBV聚合酶的比658更N-末端的位置(即位置657、位置656、位置655等)处的氨基酸。
在甚至另外的实施例中：
-该片段的最N-末端的氨基酸是在HBV聚合酶的位置624处的氨基酸或在HBV聚合酶的比624更C-末端的位置处的氨基酸，并且
-该片段的最C-末端的氨基酸是在HBV聚合酶的位置658处的氨基酸或在HBV聚合酶的比658更N-末端的位置处的氨基酸。
因此，在该后一实施例中，包含在本发明的肽内的HBV聚合酶片段不延伸超过HBV聚合酶的位置624和658。
在另一实施例中，该免疫原性肽包含HBV聚合酶的片段，其中所述片段的长度为20-34，如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34个氨基酸，并且所述片段包含来自HBV聚合酶的位置693至位置706的区的至少10个连续的氨基酸，包含：
-SEQ ID NO:21中列出的氨基酸序列(p693-701)，和/或
-SEQ ID NO:22中列出的氨基酸序列(p697-706)。
在另外的实施例中，该片段的最N-末端的氨基酸是在HBV聚合酶的位置672处的氨基酸，或该片段的最N-末端的氨基酸是在HBV聚合酶的比672更C-末端的位置(即位置671、位置670、位置696等)处的氨基酸。
在另一实施例中，该免疫原性肽包含HBV聚合酶的片段，其中所述片段的长度为20-34，如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34个氨基酸，并且所述片段包含SEQ ID NO:23中列出的氨基酸序列(p723-731)。
在另外的实施例中，该片段的最C-末端的氨基酸是在HBV聚合酶的位置751处的氨基酸，或该片段的最C-末端的氨基酸是在HBV聚合酶的比751更N-末端的位置(即位置750、位置749、位置748等)处的氨基酸。
在另一实施例中，该免疫原性肽包含HBV聚合酶的片段，其中所述片段的长度为20-34，如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34个氨基酸，并且所述片段包含来自HBV聚合酶的位置755至位置765的区的至少10个连续的氨基酸，包含：
-SEQ ID NO:24中列出的氨基酸序列(p755-764)，和/或
-SEQ ID NO:25中列出的氨基酸序列(p756-765)。
在另一实施例中，该免疫原性肽包含HBV聚合酶的片段，其中所述片段的长度为20-34，如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34个氨基酸，并且所述片段包含SEQ ID NO:26中列出的氨基酸序列(p829-837)。
在另外的实施例中，该片段的最N-末端的氨基酸是在HBV聚合酶的位置815处的氨基酸，或该片段的最N-末端的氨基酸是在HBV聚合酶的比815更C-末端的位置(即位置816、位置817、位置818等)处的氨基酸。
在另外的实施例中，本发明的肽包含选自由以下组成的组的序列或由其组成：
SEQ ID NO:31：HLSLRGLPVCAFSSAGPCALRFTSA(SLP1)，
SEQ ID NO:32：LSAMSTTDLEAYFKDCLFKDWEELG(SLP2)，
SEQ ID NO:33：ASSSSSCLHQSAVRKAAYSHLSTSK(SLP3)，
SEQ ID NO:34：RKLHLYSHPIILGFRKIPMGVGLSP(SLP4)，
SEQ ID NO:35：GFAAPFTQCGYPALMPLYACIQAKQA(SLP5)，
SEQ ID NO:36：ARQRPGLCQVFADATPTGWGLAIGH(SLP6)和
SEQ ID NO:37：SPSVPSHLPDRVHFASPLHVAWRPP(SLP7)。
在另外的实施例中，本发明的肽包含选自由以下组成的组的序列或由其组成：
SEQ ID NO:121：KLHLYSHPIILGFRKIPMGVGLSPFLL(SLP8)，
SEQ ID NO:122：GLLGFAAPFTQCGYPALMPLYACIQAKQAFT(SLP9)，和
SEQ ID NO:123：ARQRPGLCQVFADATPTGWGLAIGHQRMR(SLP10)。
SEQ ID NO:121、122和123分别是SLP4、SLP5和SLP6的变体。这些变体中的潜在改善包括：通过延伸N-末端/C-末端引入的额外的推定表位/配体，或通过延伸或缩短N-末端/C-末端而不丧失(推定)表位/配体来增加可制造性。
在另外的实施例中，本发明的肽不包含以下或不由以下组成：在WO 15187009中的SEQ ID NO:53、54、59、70、76和79下描述的任一肽，即
SEQ ID NO:38：VVNEKRRLKLIMPARFYPTHTKYLPLDKGIKPYY(WO 15187009中的SEQ IDNO:53)，
SEQ ID NO:39：YPTHTKYLPLDKGIKPYYPDQVVNHYFQTRHYL(WO 15187009中的SEQ IDNO:54)，
SEQ ID NO:40：TAESRLVVDFSQFSRGISRVSWPKFAVPNLQSL(WO 15187009中的SEQ IDNO:59)，
SEQ ID NO:41：QRMRGTFVAPLPIHTAELLAACFARSRSGAKL(WO 15187009中的SEQ IDNO:70)，
SEQ ID NO:42：ALPSPSPSAVPADHGAHLSLRGLPVCAFSSAGP(WO 15187009中的SEQ IDNO:76)，或
SEQ ID NO:43：LEAYFKDCVFKDWEELGEEIRLKVFVLGGCRHKL(WO 15187009中的SEQ IDNO:79)。
在另外的主要方面，本发明涉及一种包含HBV蛋白的片段的免疫原性肽，其中所述肽的长度为20-34个氨基酸，并且其中所述片段包含选自由以下组成的组的序列：SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:26。
优选地，当向人受试者施用时，本发明的免疫原性肽能够诱导强效的、组合的、针对抗原的CD4+T辅助细胞和CD8+细胞毒性T细胞响应。优选地，这些肽可以有效地用于预防、部分清除和/或治疗或完全清除受试者中的HBV、HBV相关疾病或病症，优选地如可通过以下检测：
-如通过ELISpot或ELISA测定或相关的合适技术或通过CD4+或CD8+T细胞的HLA-多聚体染色建立的、免疫系统的活化或诱导和/或外周血或组织中抗原特异性活化的CD4+和/或CD8+T细胞的增加，或如在治疗至少一周后通过流式细胞术中CD4+和CD8+T细胞的细胞内细胞因子染色或细胞因子捕获建立的、由这些T细胞产生的细胞因子的增加；和/或
-抗原相关感染的增殖的抑制，或抗原表达细胞的可检测的减少，或抗原表达细胞的细胞活力的降低；和/或
-抗原表达细胞的细胞死亡的诱导或增加的诱导；和/或
-抗原表达细胞的增加的抑制或预防；和/或
-疾病的癌变前阶段的病毒载量的减少(例如血清病毒DNA、病毒RNA或病毒蛋白的减少)；和/或
-拥有整合的病毒DNA和/或共价闭合的环状DNA(cccDNA)的肝细胞的减少
-参考病变大小的减少；和/或
-参考肿瘤大小的减少；和/或
-生存率(例如无进展生存、总体生存)的增加。
在优选的实施例中，本发明中使用的肽包含如上所述的CTL表位和T辅助表位，该T辅助表位对II类HLA分子示出结合亲和力、优选地至少中等结合亲和力、更优选地高结合亲和力，该II类HLA分子由在待治疗的人受试者群体中主导的HLA等位基因编码。
在优选的实施例中，本发明中使用的肽在该肽的N-末端或C-末端处不具有半胱氨酸残基。
此外，在另一优选的实施例中，本发明中使用的肽不包含多于两个半胱氨酸残基。
在另一优选的实施例中，本发明中使用的肽不包含多于三个甲硫氨酸。
在另一优选的实施例中，本发明中使用的肽在N-末端处不具有谷氨酰胺。
优选地，本发明中使用的肽是分离的肽，其中“分离的”不反映该肽被纯化的程度，而是指示该肽已从其天然环境中去除(即，已经受人工操作)，并且可以是重组产生的肽或合成产生的肽。
典型地，肽是合成产生的。这可以通过固相肽合成或通过任何其他合适的方法来完成。
在另外的方面，本发明涉及一种多核苷酸，该多核苷酸包含编码根据本发明所述的肽的核苷酸序列。如上所解释，术语“HBV蛋白的片段”意指对应于HBV蛋白的部分序列的氨基酸序列。如果指定了肽包含HBV蛋白的某个长度的片段，则意味着该片段不更短或不更长。例如，如果指定了片段的长度为20-34个氨基酸，这意指这种肽不包含所述HBV蛋白的长度为35个氨基酸或更多的连续的序列。因此，本发明的肽将不包含HBV蛋白的长度多于34个氨基酸的片段。因此，应当理解，包含编码根据本发明所述的肽的核苷酸序列的本发明的多核苷酸也将不会编码包含HBV蛋白的长度多于34个氨基酸的片段的肽。
在另外的方面，本发明涉及一种免疫原性组合物，该免疫原性组合物包含：
-如本文所述的根据本发明所述的肽或如本文所述的根据本发明所述的多核苷酸，和
-药学上可接受的运载体，
任选地进一步包含佐剂。
用于基于多核苷酸的疫苗接种的合适方法已例如描述于Trimble等人2015Lancet[柳叶刀]386:2078；Kranz等人2016Nature[自然]534:396；WO 2011015656A2；Kratzer等人2018AASLD,The Liver Meeting 2018[2018年肝脏会议],摘要编号426；WO 2017080920；和Boni等人2019Int J Mol Sci[国际分子科学杂志]20(11):2754。
在另外的方面，本发明涉及一种重组病毒，该重组病毒包含根据本发明所述的多核苷酸。
本发明中使用的免疫原性组合物优选地用于向人受试者施用并且因此配制为适合于向人受试者施用。优选地，该施用是肠胃外的，例如静脉内、皮下、肌内、真皮内、皮内和/或肿瘤内施用，即通过注射。
免疫原性组合物优选地是化学稳定的，即该组合物中的肽不会化学降解或分解。因此，优选地，在溶液或液体组合物在室温下储存至少约0.5、1、1.5、2或至少3小时后，如与其原始情况相比，按重量计，该溶液和/或组合物内未降解、未分解和/或未反应的肽的量为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％。化学稳定性可以使用本领域已知的任何合适的技术(例如使用如本文所示例的UPLC/MS)评估。当使用UPLC/MS时，如果在室温下储存至少约0.5、1、1.5、2或至少3小时后，如与其原始情况相比，在UV光谱中不代表所希望的肽产物的峰的总面积％为最多20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0％，则溶液/组合物被定义为化学稳定的。
免疫原性组合物优选地也是物理稳定的，即该组合物中的肽不会沉淀或再分散。物理稳定性可以如下评估：使用本领域已知的任何合适的技术，例如通过目视检查或如本文示例使用Malvern Mastersizer通过粒子分布，其中平均粒径以D(0.5)表示。当如本文示例使用Malvern Mastersizer评估物理稳定性时，如果在室温下储存至少约0.5、1、1.5、2或至少3小时后，如与其原始情况(即直接在制备后的新鲜制备的溶液)相比，平均D(0.5)增加最多50％、40％、30％、20％、10％或5％，则溶液/组合物被定义为物理稳定的。优选地，如果在室温下储存3小时后，如与其原始情况相比，平均D(0.5)增加最多50％、40％、30％、20％、10％或5％，优选地最多20％，则溶液/组合物被定义为物理稳定的。
在一个实施例中，免疫原性组合物包含待一起施用的干燥或冻干的肽的混合物或由其组成。
可通过任何合适的方法制备用于本发明的免疫原性组合物。在一些实施例中，一种或多种免疫原性组合物由干燥的、优选冻干的肽制备。
例如，该组合物可以通过包括以下步骤的方法制备：
a)提供包含干燥的、优选冻干的肽的小瓶；
b)解冻这些肽，优选持续约5-30min；
c)将重构组合物添加到包含这些肽的小瓶中，优选地不涡旋小瓶；
d)允许混合，优选地持续约0.5-5分钟；以及
e)旋转直至获得澄清溶液，优选地持续约1-3分钟。
优选地，步骤b)至e)在室温下进行。
优选地，在用于预防和/或治疗的方法(优选地如本文定义的治疗和/或预防的方法)中，所述小瓶包含作为单一体积的注射量的肽，即单一药物剂量单位，或其一部分(在基本相同的时间点在受试者身体的不同位置进行多次注射的情况下)。
在一个实施例中，步骤c)的重构组合物包含DMSO和/或注射用水或由其组成。在另一实施例中，用于重构肽的方法的步骤c)的重构组合物包含约60％-80％v/v的水性溶液或由其组成，该水性溶液包含有机酸、约5％-10％v/v的丙二醇(CAS号57-55-6)、约10％-20％v/v的低级醇和约5％-10％v/v的非离子亲水性表面活性剂。在一个实施例中，该有机酸是柠檬酸并且该柠檬酸以约0.05-0.1M的浓度存在于该水性溶液中。在一个实施例中，该低级醇为乙醇。在一个实施例中，该非离子亲水性表面活性剂：
a.是甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯，优选地乙氧基化甘油三酯，和/或
b.具有在9与14之间的亲水性-亲油性平衡(HLB)值。在另外的实施例中，该非离子亲水表面活性剂是乙氧基化蓖麻油，优选地聚氧乙烯甘油三蓖麻油酸酯35(CAS号61791-12-6)。
在一个实施例中，该组合物包含约75％v/v的水性溶液或由其组成，该水性溶液包含约0.1M的柠檬酸、约6.25％v/v的丙二醇(CAS号57-55-6)、约12.5％v/v的乙醇和约6.25％v/v的聚氧乙烯甘油三蓖麻油酸酯35(CAS号61791-12-6)。
优选地，步骤c)中重构组合物的量在从约0.5至2mL的范围内，优选地1mL。优选地，步骤(a)中重构的肽的量是如在步骤e)之后获得的重构的肽的总量，即在步骤e)之后获得的澄清溶液内。
在一个实施例中，重构的组合物包含以下或由以下组成：在水中的约1-2mg/mL的肽、0.038M的柠檬酸、约3.13％v/v的丙二醇(CAS号57-55-6)、约6.25％v/v的乙醇、约3.13％v/v的聚氧乙烯甘油三蓖麻油酸酯35(CAS号61791-12-6)和约50％的油基佐剂(优选地Montanide ISA 51VG(赛比克公司(Seppic)))。
干燥的肽可以是无另外的成分的肽，但也可以包含缓冲组分，如三氟乙酸(TFA)、盐(如钠盐、钾盐或磷酸盐(例如NaCl、KCl和NaPO4))。另外的成分的量优选地是待重构的干燥肽的总重量的小于30％，更优选地小于25％。待重构的干燥的肽可以处于物理干燥的状态，如可以通过多种过程获得，这些过程如但不限于转子蒸发、冻干(冷冻干燥)和喷雾干燥。
佐剂
在一个实施例中，本发明的组合物进一步包含佐剂，或根据本发明所述的治疗或用途进一步包括施用佐剂。术语“佐剂”在本文中用于指具有免疫增强作用的物质，并且其与抗原共同施用、或添加至抗原或与抗原共同配制以在向受试者施用时增强、诱导、引起和/或调节针对该抗原的免疫学响应。在一个实施例中，佐剂与待重构的一种或多种肽物理连接，如共价连接。
在一个实施例中，佐剂是乳化佐剂。例如，在一个实施例中，佐剂是油基佐剂。油基佐剂可用于形成乳剂(例如油包水或水包油乳剂)并且在本领域中被认为可以增强和指导免疫响应。优选地，油基佐剂是矿物油基佐剂。油基佐剂的非限制性实例是生物基油佐剂(基于植物油/鱼油等)、基于角鲨烯的佐剂(例如MF59)、Syntex佐剂配制品(SAF；在以下中的Lidgate,Deborah M,Preparation of the Syntex Adjuvant Formulation(SAF,SAF-m,and SAF-1)[Syntex佐剂配制品(SAF、SAF-m和SAF-1)的制备]：Vaccine Adjuvants,Volume42of the series Methods in Molecular MedicineTM[分子医学方法TM系列第42卷，疫苗佐剂]第229-237页,ISSN1543-1894)，弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)、基于花生油的佐剂(例如佐剂65)、Lipovant(Byars,N.E.,Allison,A.C.,1990.在以下中的Immunologic adjuvants:general properties,advantages,and limitations.[免疫佐剂：一般特性、优点和局限性]：Zola,H.(编辑),Laboratory Methods in Immunology[免疫学实验室方法].第39-51页)、ASO4(A.Tagliabue,R.Rappuoli Vaccine adjuvants:thedream becomes real[疫苗佐剂：梦想成真]Hum.Vaccine[人疫苗],4(5),2008,第347-349页)、Montanide佐剂，该Montanide佐剂基于纯化的角鲨烯和用高纯度的甘露醇单油酸酯乳化的角鲨烯(例如Montanide ISA 25VG、28VG、35VG、50V、50V2、51VG、61VG、70VG、70M VG、71VG、720VG、760VG、763A VG、775VG、780VG、201VG、206VG、207VG)。更优选地，油基佐剂是Montanide ISA 51VG(赛比克公司)，其为Drakeol VR和甘露醇单油酸酯的混合物。
其他合适的佐剂是活化抗原呈递细胞(如树突状细胞)的佐剂。例如，这种佐剂可以经由Toll样受体和/或经由RIG-I(视黄酸诱导型基因-1)蛋白和/或经由内皮素受体。能够活化先天免疫系统的免疫修饰化合物可以经由Toll样受体(TLR)(包括TLR 1-10)被特别良好地活化。能够活化TLR受体的化合物及其修饰物和衍生物在本领域中有充分的记录。TLR1可以被细菌脂蛋白及其乙酰化形式活化，TLR2还可以被以下活化：革兰氏阳性细菌糖脂、LPS、LPA、LTA、菌毛、外膜蛋白、来自细菌或来自宿主的热休克蛋白、和分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖。TLR3可以被特别是病毒来源的dsRNA活化，或被化学化合物聚(I:C)活化。TLR4可以被以下活化：革兰氏阴性LPS、LTA、来自宿主或来自细菌来源的热休克蛋白、病毒外壳或包膜蛋白、紫杉醇或其衍生物、含有寡糖和纤连蛋白的透明质酸。TLR5可以被细菌鞭毛或鞭毛蛋白活化。TLR6可以被以下活化：分枝杆菌脂蛋白和B群链球菌(Streptococcus)不耐热可溶性因子(GBS-F)或葡萄球菌(Staphylococcus)调节蛋白。TLR7可以被以下活化：咪唑喹啉，如咪喹莫特(imiquimod)、雷西莫特(resiquimod)和衍生物咪喹莫特或雷西莫特(例如3M-052)。TLR9可以被未甲基化的CpG DNA或染色质-IgG复合物活化。特别优选的佐剂包含但不限于合成产生的化合物，这些化合物包含dsRNA、聚(I:C)、聚I:CLC，触发TLR3和TLR9受体的未甲基化的CpG DNA、IC31，TLR 9激动剂，IMSAVAC，TLR4激动剂，Montanide ISA-51、Montanide ISA 720(由法国赛比克公司生产的佐剂)。已知RIG-I蛋白与TLR3一样被ds-RNA活化(Kato等人,(2005)Immunity[免疫],1:19-28)。
进一步特别优选的TLR配体是pam3cys和/或其衍生物，优选地pam3cys脂肽或其变体或衍生物，优选地如描述于WO 2013051936A1中，更优选地U-Pam12或U-Pam14或
Figure BDA0003681204490000281
Pam3cys和/或其衍生物可以任选地与一种或多种肽抗原共价连接。
进一步优选的佐剂是环状二核苷酸(CDN)、胞壁酰二肽(MDP)和聚ICLC。在优选的实施例中，本发明的佐剂是非天然存在的佐剂，如pam3cys脂肽衍生物(如描述于WO2013051936A1中)、聚ICLC、咪唑喹啉如咪喹莫特、雷西莫特或其衍生物、具有非天然存在的序列的CpG寡脱氧核苷酸(CpG-ODN)、和包含非天然存在的氨基酸的肽基佐剂，如胞壁酰二肽(MDP)或破伤风类毒素肽。
进一步优选的是选自由以下组成的组的佐剂：1018ISS、铝盐、Amplivax、AS 15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、ImuFact EV1P321、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、Juvlmmune、脂质复合物、脂质体、LipoVac、MF59、单磷酰脂质A、MontanideIMS 1312、纳米颗粒(如其中已整合佐剂的纳米颗粒)、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、
Figure BDA0003681204490000282
载体系统、PLGA微粒、SRL172、病毒体和其他病毒样颗粒、Pam3Cys-GDPKHPKSF、YF-17D、VEGF陷阱、R848、β-葡聚糖、Aquila公司的QS21 stimulon、vadimezan、AsA404(DMXAA)、STING(IFN基因的刺激剂)激动剂(例如c-di-GMP VacciGradeTM)、PCI、NKT(自然杀伤T细胞)激动剂(例如α-半乳糖苷神经酰胺或α-GalCer、
Figure BDA0003681204490000283
(Curevac公司)、视黄酸诱导型蛋白I配体(例如3pRNA或5'-三磷酸RNA)。
治疗方法和用途
本发明的免疫原性肽、本发明的多核苷酸、本发明的重组病毒和本发明的免疫原性组合物可用于治疗HBV感染(如慢性HBV感染)和/或治疗HBV相关疾病。
将使用本发明的免疫原性肽、多核苷酸和免疫原性组合物治疗的疾病的实例包括但不限于乙型肝炎感染，如慢性乙型肝炎感染、乙型肝炎相关肝硬化和乙型肝炎相关肝细胞癌。
因此，在另外的方面，本发明涉及根据本发明所述的肽、根据本发明所述的多核苷酸或根据本发明所述的免疫原性组合物，其用作药物。
在另外的方面，本发明涉及根据本发明所述的肽、根据本发明所述的多核苷酸或根据本发明所述的免疫原性组合物，其用于治疗或预防HBV相关疾病。
在另外的方面，本发明涉及一种用于治疗或预防HBV相关疾病的方法，该方法包括向有需要的人受试者施用根据本发明所述的免疫原性肽、根据本发明所述的多核苷酸、或根据本发明所述的免疫原性组合物的步骤。
优选地，施用是静脉内、皮下或肌内的，尽管可以设想其他施用途径，如粘膜施用或真皮内和/或皮内施用，例如通过注射。
优选地，一种或多种免疫原性组合物的施用诱导针对由包含在长肽中的I类HLA分子呈递的至少一种HLA结合肽序列的细胞毒性CD8+T细胞响应。更优选地，一种或多种免疫原性组合物的施用诱导针对由包含在该一种或多种免疫原性组合物中的II类HLA分子呈递的HLA结合肽序列的细胞毒性CD8+T细胞响应连同辅助CD4+T细胞响应。优选地，该施用用于预防、部分清除和/或治疗或完全清除受试者中的HBV相关感染或疾病，优选地如可通过以下检测：
-如通过ELISpot或ELISA测定或相关的合适技术或通过CD4+或CD8+T细胞的HLA-多聚体染色建立的、免疫系统的活化或诱导和/或外周血或组织中抗原特异性活化的CD4+和/或CD8+T细胞的增加，或如在治疗至少一周后通过流式细胞术中CD4+和CD8+T细胞的细胞内细胞因子染色或细胞因子捕获建立的、由这些T细胞产生的细胞因子的增加；和/或
-抗原相关感染的增殖的抑制，或抗原表达细胞的可检测的减少，或抗原表达细胞的细胞活力的降低；和/或
-抗原表达细胞的细胞死亡的诱导或增加的诱导；和/或
-抗原表达细胞的增加的抑制或预防；和/或
-病毒载量的减少(疾病的癌变前阶段)；和/或
-参考病变大小的减少；和/或
-参考肿瘤大小的减少；和/或
-生存率(例如PFS、OS)的增加。
组合
在一些实施例中，治疗包括施用本发明的免疫原性肽、多核苷酸或重组病毒与另外的免疫原性肽、多核苷酸或重组病毒的组合。例如，治疗可以包括施用两种或更多种，如三种、四种、五种、六种、七种、八种或更多种免疫原性肽。
两种或更多种肽可以全部包含在一种免疫原性组合物中，或者多种肽可以分在两种或更多种组合物中。如果将这些肽分在两种或更多种组合物中，则这些组合物可以在施用前混合并因此共同施用，或者它们可以分开施用。典型地，所有组合物以及因此多种肽中的所有肽将在24小时的时间框架内(优选地在4、2或1小时内)向受试者施用。
如果施用两种或更多种组合物，则施用可以在相同的位点(例如在相同的肢体)，或在两个或更多个不同的位点。在治疗的过程中，一种或多种组合物的施用可以进行一次，或者可替代地可以随后重复(加强)，如但不限于两次或三次。
在优选的实施例中，治疗方法包括长肽的组合，其中长肽的所述组合包含能够与至少70％、80％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的I类HLA分子结合的HLA结合肽序列，这些I类HLA分子由待治疗的人受试者群体中主导的HLA等位基因编码。根据本发明所述的长肽中优选的I类HLA HLA结合肽序列是能够与以下结合的HLA结合肽序列：I类HLA等位基因超型类别HLA-A*01、HLA-A*02、HLA-A*03、HLA-A*24、HLA-B*07、HLA-B*08、HLA-B*27、HLA-B*44、HLA-B*58、HLA-B*62、和HLA超型A*01组合HLA-A*01/A*03和HLA-A*01/A*24、及其各自的亚型(Sidney等人2008BMC Immunology[BMC免疫学]9)，优选地HLA-A0101、HLA-A0201、HLA-A0206、HLA-A0301、HLA-A1101、HLA-A2301、HLA-A2402、HLA-A2501、HLA-A2601、HLA-A2902、HLA-A3001、HLA-A3002、HLA-A3101、HLA-A3201、HLA-A3303、HLA-A6801、HLA-A6802、HLA-A7401、HLA-B0702、HLA-B0801、HLA-B1301、HLA-B1302、HLA-B1402、HLA-B1501、HLA-B1502、HLA-B1525、HLA-B1801、HLA-B2702、HLA-B2705、HLA-B3501、HLA-B3503、HLA-B3701、HLA-B3801、HLA-B3901、HLA-B4001、HLA-B4002、HLA-B4402、HLA-B4403、HLA-B4601、HLA-B4801、HLA-B4901、HLA-B5001、HLA-B5101、HLA-B5201、HLA-B5301、HLA-B5501、HLA-B5601、HLA-B5701、HLA-B5801和HLA-B5802。在优选的实施例中，治疗方法包括长肽的组合，其中长肽的所述组合包含能够与至少70％、80％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的I类HLA结合的HLA结合肽序列和能够与至少20％、30％、40％、42％、44％、45％、46％、47％、48％、49％或50％的II类HLA分子结合的HLA结合肽序列，这些II类HLA分子由待治疗的人受试者群体中主导的HLA等位基因编码。
在优选的实施例中，本发明中使用的长肽包含HLA结合肽序列，该HLA结合肽序列对I类HLA分子示出结合亲和力、优选地至少中等结合亲和力、更优选地高结合亲和力，并且引起细胞毒性CD8+T细胞响应，该I类HLA分子由在待治疗的人受试者群体中主导的HLA等位基因编码。优选地，本发明中使用的长肽包含HLA结合肽序列，该序列对由以下组成的I类HLA分子的组中的至少一种I类HLA分子示出结合亲和力、优选地至少中等结合亲和力、更优选地高结合亲和力：
HLA-A01(即A*0101 A*0112 A*2601 A*0114 A*2610 A*2602 A*0115 A*2611 A*2603 A*2604 A*2612 A*3002 A*2613 A*3003 A*0109 A*2606 A*3004 A*0110 A*2615 A*3201 A*0111 A*2618 A*3012 A*2619 A*3202 A*2621 A*3205 A*2623 A*3206 A*2624 A*3207 A*2626 A*3009 A*3601 A*2501 A*2502 A*2504 A*8001 A*2622 A*3110 A*0103 A*2609 A*0104 A*2605 A*2617 A*0106 A*3006 A*3210 A*0107 A*3204 A*3208 A*0108 A*2614 A*3203 A*2607 A*3603 A*7410 A*2608 A*3209 A*3602 A*3604)、
HLA-A02(即A*0201 A*0240 A*0271 A*0202 A*0243 A*0258 A*0203 A*0212 A*0259 A*0274 A*0204 A*0213 A*0227 A*0205 A*0215 A*0228 A*0206 A*0207 A*0218 A*0214 A*0219 A*0236 A*0267 A*0217 A*0220 A*0251 A*6802 A*0269 A*0285 A*6901 A*0256 A*0241 A*0260 A*0284 A*0209 A*0257 A*6827 A*0211 A*0224 A*0272 A*0225 A*0226 A*6828 A*0244 A*0261 A*0275 A*0245 A*0262 A*0230 A*0246 A*0216 A*0263 A*0231 A*0248 A*0266 A*0249 A*0282 A*0279 A*0237 A*0268 A*0221 A*0277 A*0247 A*0222 A*0270 A*0242 A*0273 A*6815 A*0283 A*0238 A*0254 A*0278 A*0239 A*0286 A*0250)、
HLA-A03(即A*0301 A*0317 A*3101 A*0307 A*6601 A*1107 A*7401 A*0312 A*1108 A*0313 A*1109 A*0314 A*1110 A*1112 A*1114 A*1116 A*1121 A*3103 A*1104 A*7402 A*3106 A*0280 A*3109 A*3111 A*6603 A*6816 A*7405 A*1106 A*3304 A*6604 A*6819 A*7407 A*1122 A*3305 A*6803 A*6821 A*3306 A*3307 A*6808 A*7411 A*3402 A*6825 A*6823 A*3403 A*6810 A*7406 A*0305 A*1102 A*3301 A*0306 A*1103 A*3303 A*0308 A*1105 A*6801 A*0310 A*0302 A*0316 A*1101 A*0304 A*6602 A*6814 A*7404 A*0309 A*6813 A*7403 A*3404 A*6812 A*6822 A*7409 A*6805 A*7408 A*6804 A*3112 A*6824 A*6820 A*6809 A*6826 A*1113 A*1115 A*1120 A*1123 A*3104 A*3105 A*0265 A*3406)、
HLA-A24(即A*2301 A*2410 A*2422 A*2402 A*2411 A*2423 A*2304 A*2427 A*2307 A*2408 A*2308 A*2421 A*2429 A*2305 A*2417 A*2452 A*2425 A*2405 A*2413 A*2426 A*2435 A*2446 A*2306 A*2406 A*2418 A*2302 A*2310 A*2433 A*2440 A*2303 A*2403 A*2434 A*2443 A*2420 A*2428 A*2438 A*2448 A*2430 A*2441 A*2442 A*2312 A*2444 A*2439 A*2449 A*2409 A*2437 A*2447)、
HLA-B07(即B*0702 B*0741 B*5134 B*5510 B*0703 B*0706 B*5135 B*5515 B*0705 B*0715 B*0743 B*3542 B*5136 B*1508 B*3507 B*3543 B*5116 B*5138 B*5519 B*3501 B*5117 B*5302 B*3503 B*0721 B*3511 B*3545 B*5118 B*5306 B*4201 B*3514 B*3546 B*5308 B*5101 B*3515 B*3554 B*5121 B*5310 B*5615 B*5102 B*3521 B*3555 B*5123 B*5403 B*5616 B*5103 B*3557 B*5124 B*5301 B*3561 B*5126 B*5406 B*5401 B*5128 B*5407 B*5501 B*3532 B*5129 B*5503 B*5502 B*3533 B*4204 B*5130 B*5601 B*3535 B*4205 B*5131 B*6701 B*3536 B*5132 B*7801 B*5133 B*5509 B*0707 B*3518 B*5112 B*0709 B*3529 B*5113 B*0712 B*3530 B*0714 B*3534 B*5120 B*0716 B*3537 B*5137 B*0717 B*3539 B*5304 B*0718 B*3551 B*0723 B*3553 B*5511 B*0736 B*5514 B*3502 B*3504 B*3807 B*5604 B*3505 B*3917 B*5609 B*3506 B*3509 B*4406 B*3512 B*5104 B*5612 B*3517 B*5106 B*8101 B*8102 B*5508 B*5602 B*5513 B*0737 B*3558 B*3560 B*3806 B*5610 B*4206 B*5611 B*0726 B*3522 B*5404 B*0730 B*3531 B*3910 B*7804 B*0731 B*7802 B*3524 B*0733 B*3916 B*5108 B*3538 B*0734 B*5114 B*0725 B*5504 B*0735 B*5505 B*0739 B*5105 B*5507 B*0740 B*0704 B*3540 B*5109 B*3541 B*5110 B*0742 B*3508 B*3544 B*5603 B*5111 B*5517 B*0719 B*5605 B*0722 B*0720 B*5119 B*5613 B*0724)、
HLA-B08(即B*0801 B*0815 B*0819 B*0821 B*0823 B*0818 B*0820 B*0822 B*0824 B*0825 B*0811 B*0813 B*0807 B*0802 B*0809 B*0803 B*0812 B*0808 B*0816)。
如所提到的，治疗可以涉及施用两种或更多种本发明的抗原。在一个实施例中，本发明提供了一种用于治疗或预防HBV相关疾病的方法，该方法包括向人受试者施用：
-如权利要求1a)中所述的肽和如权利要求1b)中所述的肽，或
-如权利要求1a)中所述的肽和如权利要求1c)中所述的肽，或
-如权利要求1a)中所述的肽和如权利要求1d)中所述的肽，或
-如权利要求1a)中所述的肽和如权利要求1e)中所述的肽，或
-如权利要求1a)中所述的肽和如权利要求1f)中所述的肽，或
-如权利要求1a)中所述的肽和如权利要求1g)中所述的肽，或
-如权利要求1a)中所述的肽和如权利要求1h)中所述的肽，或
-如权利要求1a)中所述的肽和如权利要求1i)中所述的肽，或
-如权利要求1a)中所述的肽和如权利要求1j)中所述的肽，或
-如权利要求1a)中所述的肽和如权利要求1k)中所述的肽，或
-如权利要求1a)中所述的肽和如权利要求1l)中所述的肽，或
-如权利要求1a)中所述的肽和如权利要求1m)中所述的肽，或
-如权利要求1b)中所述的肽和如权利要求1c)中所述的肽，或
-如权利要求1b)中所述的肽和如权利要求1d)中所述的肽，或
-如权利要求1b)中所述的肽和如权利要求1e)中所述的肽，或
-如权利要求1b)中所述的肽和如权利要求1f)中所述的肽，或
-如权利要求1b)中所述的肽和如权利要求1g)中所述的肽，或
-如权利要求1b)中所述的肽和如权利要求1h)中所述的肽，或
-如权利要求1b)中所述的肽和如权利要求1i)中所述的肽，或
-如权利要求1b)中所述的肽和如权利要求1j)中所述的肽，或
-如权利要求1b)中所述的肽和如权利要求1k)中所述的肽，或
-如权利要求1b)中所述的肽和如权利要求1l)中所述的肽，或
-如权利要求1b)中所述的肽和如权利要求1m)中所述的肽，或
-如权利要求1c)中所述的肽和如权利要求1d)中所述的肽，或
-如权利要求1c)中所述的肽和如权利要求1e)中所述的肽，或
-如权利要求1c)中所述的肽和如权利要求1f)中所述的肽，或
-如权利要求1c)中所述的肽和如权利要求1g)中所述的肽，或
-如权利要求1c)中所述的肽和如权利要求1h)中所述的肽，或
-如权利要求1c)中所述的肽和如权利要求1i)中所述的肽，或
-如权利要求1c)中所述的肽和如权利要求1j)中所述的肽，或
-如权利要求1c)中所述的肽和如权利要求1k)中所述的肽，或
-如权利要求1c)中所述的肽和如权利要求1l)中所述的肽，或
-如权利要求1c)中所述的肽和如权利要求1m)中所述的肽，或
-如权利要求1d)中所述的肽和如权利要求1e)中所述的肽，或
-如权利要求1d)中所述的肽和如权利要求1f)中所述的肽，或
-如权利要求1d)中所述的肽和如权利要求1g)中所述的肽，或
-如权利要求1d)中所述的肽和如权利要求1h)中所述的肽，或
-如权利要求1d)中所述的肽和如权利要求1i)中所述的肽，或
-如权利要求1d)中所述的肽和如权利要求1j)中所述的肽，或
-如权利要求1d)中所述的肽和如权利要求1k)中所述的肽，或
-如权利要求1d)中所述的肽和如权利要求1l)中所述的肽，或
-如权利要求1d)中所述的肽和如权利要求1m)中所述的肽，或
-如权利要求1e)中所述的肽和如权利要求1f)中所述的肽，或
-如权利要求1e)中所述的肽和如权利要求1g)中所述的肽，或
-如权利要求1e)中所述的肽和如权利要求1h)中所述的肽，或
-如权利要求1e)中所述的肽和如权利要求1i)中所述的肽，或
-如权利要求1e)中所述的肽和如权利要求1j)中所述的肽，或
-如权利要求1e)中所述的肽和如权利要求1k)中所述的肽，或
-如权利要求1e)中所述的肽和如权利要求1l)中所述的肽，或
-如权利要求1e)中所述的肽和如权利要求1m)中所述的肽，或
-如权利要求1f)中所述的肽和如权利要求1g)中所述的肽，或
-如权利要求1f)中所述的肽和如权利要求1h)中所述的肽，或
-如权利要求1f)中所述的肽和如权利要求1i)中所述的肽，或
-如权利要求1f)中所述的肽和如权利要求1j)中所述的肽，或
-如权利要求1f)中所述的肽和如权利要求1k)中所述的肽，或
-如权利要求1f)中所述的肽和如权利要求1l)中所述的肽，或
-如权利要求1f)中所述的肽和如权利要求1m)中所述的肽，或
-如权利要求1g)中所述的肽和如权利要求1h)中所述的肽，或
-如权利要求1g)中所述的肽和如权利要求1i)中所述的肽，或
-如权利要求1g)中所述的肽和如权利要求1j)中所述的肽，或
-如权利要求1g)中所述的肽和如权利要求1k)中所述的肽，或
-如权利要求1g)中所述的肽和如权利要求1l)中所述的肽，或
-如权利要求1g)中所述的肽和如权利要求1m)中所述的肽，或
-如权利要求1h)中所述的肽和如权利要求1i)中所述的肽，或
-如权利要求1h)中所述的肽和如权利要求1j)中所述的肽，或
-如权利要求1h)中所述的肽和如权利要求1k)中所述的肽，或
-如权利要求1h)中所述的肽和如权利要求1l)中所述的肽，或
-如权利要求1h)中所述的肽和如权利要求1m)中所述的肽，或
-如权利要求1i)中所述的肽和如权利要求1j)中所述的肽，或
-如权利要求1i)中所述的肽和如权利要求1k)中所述的肽，或
-如权利要求1i)中所述的肽和如权利要求1l)中所述的肽，或
-如权利要求1i)中所述的肽和如权利要求1m)中所述的肽，或
-如权利要求1j)中所述的肽和如权利要求1k)中所述的肽，或
-如权利要求1j)中所述的肽和如权利要求1l)中所述的肽，或
-如权利要求1j)中所述的肽和如权利要求1m)中所述的肽，或
-如权利要求1k)中所述的肽和如权利要求1l)中所述的肽，或
-如权利要求1k)中所述的肽和如权利要求1m)中所述的肽，或
-如权利要求1l)中所述的肽和如权利要求1m)中所述的肽，或
-一种或两种包含编码肽的上述组合中的任一种的序列的多核苷酸。
优选地，免疫原性组合物包含构成药物剂量的肽的量或由其组成。药物剂量在本文中定义为在给定时间点应用于受试者的活性成分的量(即基于肽的免疫原性组合物中肽的总量)。药物剂量可以以单一体积(即单次注射)向受试者应用、或可以以2、3、4、5或更多个单独的体积应用，这些体积优选地应用在身体的不同位置，例如右肢和左肢中。以单独的体积应用单一药物剂量的原因可以是多重的，如避免负面副作用、避免抗原竞争和/或组成分析的考虑。
药物剂量可以是有效量或有效量的一部分。“有效量”在本文中应理解为相对于未治疗患者，预防和/或减轻疾病(例如，慢性感染、癌前病症和/或癌症)的症状所需的活性成分的量或剂量。针对预防性和/或治疗性治疗疾病或病症的、用于实践本发明的一种或多种活性化合物的有效量取决于施用的方式、受试者的年龄、体重和一般健康状况而变化。最终，负责治疗的医师或兽医将决定适当的量和剂量方案。这种量被称为“有效”量。该有效量也可以是能够在待治疗的受试者中诱导有效的细胞性T细胞响应、或更优选地有效的全身性细胞性T细胞响应的量。
优选地，在给定时间点向受试者应用(在某个时间点以单次或多次注射或施用)的肽的药物剂量或总量包含以下范围内的肽量：从0.1微克至20mg，如约0.1微克、0.5微克、1微克、5微克、10微克、15微克、20微克、30微克、40微克、50微克、60微克、70微克、80微克、90微克、100微克、150微克、200微克、250微克、300微克、350微克、400微克、450微克、500微克、650微克、700微克、750微克、800微克、850微克、900微克、1mg、1.1mg、1.2mg、1.3mg、1.4mg、1.5mg、1.6mg、1.7mg、1.8mg、1.9mg、2mg、2.5mg、3mg、3.5mg、4mg、4.5mg、5mg、5.5mg、6mg、6.5mg、7mg、7.5mg、8mg、8.5mg、9mg、9.5mg、10mg、15mg或约20mg、或其间的任何值。优选的药物剂量的范围为从0.1微克至20mg、1微克至10mg、10微克至5mg、0.5mg至2mg、0.5mg至10mg、或1mg至5mg、或2至4mg。
在一个实施例中，本发明中使用的免疫原性组合物以每种肽在1微克与300微克之间(例如在50微克与150微克之间，如大约100微克)的剂量施用。
本发明的方法可以是与其他形式的HBV治疗的组合疗法的一部分，该其他形式的HBV治疗可以提供为单独的治疗或添加至本发明的免疫原性组合物中。本发明的方法可以与以下组合：抑制病毒复制的药物(例如核苷或核苷酸类似物，包括恩替卡韦、富马酸替诺福韦二吡呋酯、替诺福韦艾拉酚胺)，和/或防止HBV进入细胞的药物(例如myrcludex)，和/或抑制病毒蛋白产生的药物(例如基于siRNA、shRNA、CRISPR/CAS9)和/或调节免疫响应(例如PEG-干扰素α)、活化先天免疫响应(例如αGalCer)和/或乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG)以支持疫苗诱导的免疫响应和/或HBV预防性疫苗以诱导针对HBsAg的抗体的药物，和/或肝切除或移植和肿瘤消融疗法(例如经内皮栓塞、射频消融)和/或抑制VEGFR和/或激酶的药物，和/或抑制或阻断免疫检查点分子的药物(例如A2AR(腺苷A2A受体)、B7-H3/CD276、B7-H4/VTCN1、BTLA/CD272、CTLA-4/CD152、IDO(吲哚胺2,3-双加氧酶)、KIR(杀伤细胞免疫球蛋白样受体)、LAG3(淋巴细胞活化基因3)、NOX2(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADPH氧化酶异构体2)、PD-1(程序性死亡1)、PD-L1、TIM-3(T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3)、VISTA(T细胞活化的V结构域Ig抑制因子)、SIGLEC7/CD328和SIGLEC9/CD329、NKG2A)和/或刺激刺激性检查点分子的药物(例如选定的肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族成员(例如CD27、CD40、CD122、4-1BB/CD137、OX-40/CD134和GITR(糖皮质激素诱导的TNFR家族相关的))、CD28和ICOS/CD278)、免疫抑制性细胞因子(例如IL-10、TGF-β和IL-6)和/或γC细胞因子(例如IL-7、IL-15和IL-21或IL-2)、沙利度胺和/或其衍生物、另外的免疫调节剂(例如已知会消耗免疫抑制性Treg和/或MDSC的化合物)。
在一个实施例中，本发明的一种或多种免疫原性肽或组合物可以在包括以下步骤的治疗方案中与抗病毒化合物(如核苷/核苷酸类似物(NA))组合：
(i)给予受HBV感染的患者抗病毒(例如NA)治疗以降低病毒载量，
(ii)当该病毒载量显著降低(例如多于2、5或10倍)时，施用本发明的一种或多种免疫原性肽或组合物(优选地真皮内或皮下)，并且
(iii)当已经过去了足够长的时间用于使该患者中的初始T细胞响应发生时(例如在最后一次施用该免疫原性组合物后的2与16周之间，如2与12周之间，例如2与8周之间)，进行任选的免疫监测(例如外周和肝内T细胞的表征，特别是通过例如IFNγELISpot分析或抗原特异性T细胞增殖和/或基于FACS的抗原特异性T细胞的表型分析来确定针对施用的本发明组合物的一种或多种免疫原性肽的疫苗特异性T细胞响应。任选地伴随确定针对目的非疫苗抗原和不相关的对照微生物抗原的T细胞响应)以评估该疫苗是否已引起合适的T细胞响应(参见例如Rivino等人(2018)J Clin Invest[临床研究杂志]128:668)。随后，中断或停止抗病毒治疗以增加病毒抗原呈递，从而进一步原位加强HBV特异性T细胞并使受感染的肝细胞暴露于免疫系统(即通过增加肝细胞HBV蛋白表达和抗原呈递)以驱动那些剩余的受感染的肝细胞的清除。为了进一步改善T细胞效应子功能，治疗性疫苗接种可以任选地与以下组合：抑制性骨髓细胞(MDSC)靶向药物(在治疗性疫苗接种之前给予)、siRNA(在治疗性疫苗接种之前)、T细胞代谢修饰药物(在治疗性疫苗接种之前或期间)或检查点阻断(在治疗性疫苗接种期间或之后)。优选地进行病毒载量的充分监测以评价疫苗功效并决定后续(组合)疗法和/或NA停止。图8提供了根据该实施例的治疗方案的非限制性展示。该治疗方案特别适用于根据治疗指南建议接受抗病毒治疗的患者。对于具有持续但低病毒载量的感染患者，可以不需要在疫苗接种前进行抗病毒治疗。此类患者有资格在任何给定的时间接受治疗性疫苗接种，并且当已经过去了足够的时间用于使患者中的初始T细胞响应发生时，进行任选的免疫监测以评估疫苗是否已引起合适的T细胞响应。为了进一步改善T细胞效应子功能，治疗性疫苗接种可以任选地与以下组合：抑制性骨髓细胞(MDSC)靶向药物(在治疗性疫苗接种之前给予)、siRNA(在治疗性疫苗接种之前)、T细胞代谢修饰药物(在治疗性疫苗接种之前或期间)或检查点阻断(在治疗性疫苗接种期间或之后)。优选地进行病毒载量的充分监测以评价疫苗功效并决定后续(组合)疗法。
在另外的方面，该免疫原性肽或组合物可用于离体免疫方案中。在离体免疫方案中，该肽或组合物可用于生成载有抗原的抗原呈递细胞(APC)(如负载抗原的活化的树突状细胞(DC))，并随后刺激抗原特异性T细胞(例如CD4和CD8阳性循环T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL))的扩增。随后向人受试者施用这种负载抗原的APC或扩增的抗原特异性T细胞。
因此，在另外的方面，本发明涉及根据本发明所述的肽或包含选自由以下组成的组的序列的肽：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:26，用于离体刺激负载抗原的活化的抗原呈递细胞或扩增的抗原特异性T细胞。
类似地，在另一实施例中，本发明的方法涉及用负载抗原的活化的抗原呈递细胞(APC)或扩增的抗原特异性T细胞的群体治疗人受试者，其中所述细胞已使用本文所述的一种或多种免疫原性组合物离体(即在身体外)生成。这可以例如通过以下实现：培养患者的PBMC以生成自体活化的APC(例如DC)(其负载免疫原性组合物(即负载抗原的APC))，随后刺激并扩增从PBMC或肿瘤浸润淋巴细胞获得的T细胞。可替代地，抗原特异性T细胞可以通过与活化的APC一起孵育来扩增，这些活化的APC从HLA匹配的健康供体的PBMC培养、负载免疫原性组合物。合适的技术已在描述本领域中描述，例如McCormack等人(2018)Cytotherapy[细胞疗法]20:385；Stevanovic等人.(2015)J Clin Oncol[临床肿瘤学杂志]33:1543；和Stevanovic等人(2018)Clin Cancer Res[临床癌症研究],doi:10.1158/1078-0432。
在另外的实施例中，将用活化的抗原呈递细胞(APC)或扩增的抗原特异性T细胞的群体进行的治疗与用本文所述的免疫原性组合物进行的人受试者的直接免疫组合。这种组合方案可以涉及依序和/或同时施用。
本说明书中引用的所有专利和参考文献通过引用以其整体特此并入。
实例
实例1：HBV-X和HBV聚合酶的共有序列以及功能性结构域的比对
基于HBV-X(n＝8127)和HBV聚合酶(n＝7489)的所有基因型的HBV序列，从HBVdbV42.0(Hayer等人,2013Nucleic Acid Res[核酸研究]41:566)下载频率表。删除缺口(通过“-”指示)最频繁的位置，之后确定每个位置处的主导氨基酸。计算含有主导氨基酸的序列百分比作为保守性评分。
将HBV聚合酶的所有主导氨基酸组合，产生共有序列(SEQ ID NO:28)：
Figure BDA0003681204490000401
所得的HBV-X的共有序列确定为(SEQ ID NO:30)：
Figure BDA0003681204490000402
此外，将先前与病毒复制的丧失相关的单独的或组合的氨基酸与共有序列比对(图1和图2)。与HBV-X相比，Pol的功能相关氨基酸的数目更多。因此，针对Pol引入了病毒持久性丧失≥50％的额外阈值以选择最关键的氨基酸。表1和表2呈现了关于功能性结构域和氨基酸的参考文献。
表1：报告或综述HBV-x的功能性结构域和必需氨基酸的实验证据的参考文献。
Figure BDA0003681204490000403
Figure BDA0003681204490000411
表2：报告或综述HBV聚合酶的功能性结构域和必需氨基酸的实验证据的参考文献。
Figure BDA0003681204490000412
Figure BDA0003681204490000421
Figure BDA0003681204490000431
Figure BDA0003681204490000441
实例2：衍生自HBV-x和HBV聚合酶的新I类HLA结合肽的预测
我们着手鉴定可以与高加索人、非洲人或亚洲人中普遍存在的6种HLA超型中的至少1种结合的新肽，这些肽也可以随时通过体外测定来确认结合(即超型HLA-A*01、A*02、A*03、A*24、B*07、B*08)。我们首先使用已建立的计算机预测工具NetMHCpan(Nielsen和Andreatta 2016,Genome Med[基因组医学]8:33)预测针对超型代表性HLA类型的、跨8-14个氨基酸的结合物，以制作预测结合物的频率分布(图1和图2，灰色条形图)。Pol和HBx之间所有预测结合物/氨基酸的密度相似(平均值±SD Pol 16.36±12.62，HBx 15.60±9.49；Mann-Whitney；p＝0.57)。由于9-11聚体最有可能代表相关的表位(Trolle等人2016JImmunol[免疫学杂志]196:1480)，随后将预测的越9-11个氨基酸的结合物与我们的图进行比对，该图概述了实例1中所述的保守性和功能(图1和图2)。
该预测得到了总共251种针对HBx的潜在的新HLA结合物和1655种针对Pol的潜在的新HLA结合物。这些当中，我们选择了最有希望的肽，用于在基于UV诱导的肽交换的体外HLA结合测定中验证结合(Toebes等人2006 Nat Med[自然医学]12:246)。出于实用和经济原因，我们旨在测试96种独特的肽序列对两种蛋白以及跨HLA类型的结合。我们包括了两个描述良好的表位(核心18-27和Pol 549-557)，以将我们新鉴定的结合物的结合能力纳入上下文。基于肽的长度(优选9聚体)、预测的HLA结合强度、保守性和所包括的氨基酸的功能重要性选择了96种潜在的结合物。并非所有96种潜在的粘合物都始终满足所有的标准。对于HLA-A*01和HLA-A*24，针对HBx的预测的结合物数目令人不满意，无法维持我们对保守性和肽长度的严格阈值。因此，对于这些条件，我们还包括了一些不太保守的肽或跨8-12个氨基酸的肽(在图3中用星号指示，参见实例3)。此外，我们选择了几种在文献中不频繁(一次或两次)报告为表位并因此被认为未建立的肽(图3：闭合下划线，参见实例3)。这包括c123-130，因为这是在Hepitopes中注册的与HLA-B*08相关的唯一HBV衍生的表位。此外，经预测与几种HLA类型结合的肽在整个选择程序中被优先考虑，这导致总共测试113种潜在的结合物的组。总体而言，该选择程序得到了45种针对HBx的潜在的结合物和68种针对Pol的潜在的结合物，以通过体外结合试验进行验证。这些当中的大部分映射到具有已建立的功能重要性的高度保守区域。对于HBx，选定肽之间的保守性的中值高于93％，而对于Pol，该中值甚至高于96％。
实例3：衍生自HBx和聚合酶的选定肽的体外结合能力
3.1方法
如前所述(Karimzadeh等人2018J Virol[病毒学杂志]92:e01891)，在体外结合测定中使用选定的潜在的HLA结合物的合成肽(肽2.0公司(Peptide 2.0Inc))。简而言之，在指示的肽(50μM)存在或不存在下，通过使用366nm UV灯(Camag)将条件性肽-HLA复合物(pHLA)(0.53μM)暴露于长波UV持续30min来进行肽交换反应。随后，使用I类HLA酶联免疫吸附测定(ELISA)分析肽交换的效率，该测定检测交换反应混合物中肽稳定的I类HLA复合物的β-2微球蛋白。为此，将链霉亲和素(2μg/ml)结合到聚苯乙烯微量滴定孔(NuncMaxiSorp)上。在洗涤和封闭后，交换反应混合物或对照中的HLA复合物通过其生物素化的重链被微量滴定板上的链霉亲和素捕获(在37℃下孵育1h)。通过洗涤去除未结合的材料。随后，添加针对人β-2-微球蛋白的、辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗体(0.6μg/ml；桑昆试剂公司(Sanquin Reagents B.V.))(在37℃下孵育1h)。在通过洗涤去除未结合的HRP缀合物后，将ABTS[2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐](桑昆试剂公司)底物溶液添加到孔中。通过添加2％(w/v)的草酸二水合物终止溶液(桑昆试剂公司)在8min后(在室温下孵育)终止反应，并在美国热电公司(Thermo Electron)的Multiskan Ascent ELISA读取器中在414nm处读数。每种肽独立交换两次。在I类HLA ELISA中一式两份地测量每种交换混合物。将所有肽的吸光度归一化为对每个对应的等位基因具有高亲和力的已知HLA等位基因特异性配体的吸光度(代表100％；表3)。阴性对照包括HLA等位基因特异性非结合物和条件性I类HLA复合物在拯救肽不存在下的UV辐照。
表3：按HLA类型分类的、用于体外结合测定的参考肽。
Figure BDA0003681204490000461
3.2结果
如在3.1部分中所述，在基于板的体外结合测定中测试了选定肽的结合能力。当肽的结合能力高于已知高亲和力肽的25％时，将它们归类为HLA结合物。HLA-A*11:01和HLA-A*03:01两者都作为HLA-A*03超型的成员进行了测试，因为许多受HBV感染的患者是亚洲人，相对于在高加索人中更为普遍的超型代表性HLA-A*03:01，HLA-A*11:01在这种群体中更为普遍(Chang等人2013Eur J Immunol[欧洲免疫学杂志]43:1109)。
我们在HLA超型中鉴定了13种针对HBx的结合物和33种针对Pol的结合物(图3灰色条)。这包括先前在另一HLA类型的上下文中描述的新结合物(图3A-3G虚线下划线和3H)。值得注意的是，对于每种测试的HLA超型，都鉴定了HBx和Pol衍生的结合物。对于HLA-A*02，良好建立的表位c18-27和p549-557的评分甚至比阳性对照好(图3B)。相比之下，不频繁报告的表位的结合(图3：闭合下划线)并不总能得到确认。
通常，发现结合预测相当差，因为实际上只有三分之一的预测结合物具有高于阈值的结合能力。许多被预测为强烈结合的肽(计算机预测中的低等级评分)在体外测定中没有示出高于阈值的结合(图4)。
表4将针对每种HLA类型测试的肽的预测评分(等级)与测定结果(结合％)进行比较。
表4：
Figure BDA0003681204490000462
Figure BDA0003681204490000471
Figure BDA0003681204490000472
Figure BDA0003681204490000481
Figure BDA0003681204490000482
Figure BDA0003681204490000483
Figure BDA0003681204490000491
Figure BDA0003681204490000492
Figure BDA0003681204490000493
Figure BDA0003681204490000501
Figure BDA0003681204490000502
实例4：选定的HLA结合肽的免疫原性
4.1方法
评估在体外HLA结合测定中评分高于25％的肽的免疫原性。简而言之，通过Ficoll(通用医疗集团(GE Healthcare))密度离心从9个先前已HBV消退的供体的血沉棕黄层中分离出PBMC。血沉棕黄层由当地血库提供，具有对应的2位数HLA类型。使用全局筛选阵列(GSA)(依诺米那公司(Illumina)通过鹿特丹伊拉兹马斯大学医院人类基因组学设施(Human Genomics Facility Erasmus MC Rotterdam))在9个供体中的7个中进行4位数HLA分型(表5)。
表5：用于HLA结合物的免疫原性测试的HBV消退者供体的HLA-I型：
Figure BDA0003681204490000511
*仅以2位数的HLA类型可用
所有供体都给出了书面知情同意书。基于10μg/ml/肽处的HLA匹配在最高5种目的肽的肽池存在下，将PBMC在IMDM(龙沙公司(Lonza))+2％人血清(桑昆公司)+50IU/ml的hIL-2(美天旎公司(Miltenyi))中培养。14天后，用目的肽在37℃下以10μg/ml/肽再刺激200.000个细胞48hr，一式三份。随后根据制造商的说明将再刺激的上清液用于hIFNγELISA(博奇公司(BioLegend))中。使用Infinite 200Pro ELISA读取器在450nm波长处读板。使用衍生自先前用c18-27(其使用由制造商提供的hIFNγ标准品在单独的ELISA中进行了定量)成功再刺激的上清液，从减去背景的OD值计算hIFNγ水平(一式三份的平均值)。对平均OD值至少为DMSO对照的平均值+2x SD的HLA结合物进行定量。
4.2结果
随后，测试了HBx和Pol衍生的结合物的免疫原性是否可以得到确认。在肽池存在下将来自先前HBV感染已消退的血液供体的PBMC扩增2周，然后如4.1部分中所述进行单种肽再刺激和IFNγELISA。如所预期的，检测到响应于良好建立的表位c18-27和p549-557的IFNγ产生(图5B)。IFNγ产量的变化很大，并且一些供体通常似乎比其他供体响应更好(图5)。总的来说，我们观察到针对5种全新的HBx衍生的肽和17种新的Pol衍生的肽的响应。额外地，我们观察到响应于1种HBx衍生的表位和3种Pol衍生的表位的IFNγ产量，这些表位先前没有频繁的描述，尽管这些响应都不是很高(图5；闭合下划线)。重要的是，4种额外的Pol衍生的表位在对HLA类型阴性的供体中引起响应，这些表位先前被描述过(图5；虚线下划线和表3)，指示这些肽序列是多种HLA类型中的表位。在任一测试的供体中，对6种Pol衍生的HLA结合物和7种HBx衍生的HLA结合物没有可测量的响应(图5；灰色框)，但这可能是由于供体的数目少。因此，未来对另外的供体的测试可能会确认这些HLA结合物的免疫原性。
实例5：
5.1方法
为了评估要求保护的肽片段在人情况中是否具有免疫原性，使用来自过去已清除HBV感染的十五个不同供体的PBMC样品设计、制造并测试了七种含有一个或多个表位肽序列的SLP。
七种SLP的设计基于：1)HBV聚合酶基因型序列的天然存在的HBV-X，2)使用计算机机器学习算法预测的良好的可制造性，该算法基于通用合成原理(尤其是上文所述的原理)并用实际肽合成产率的大型集训练，和3)含有一个或多个表位肽序列(参见表6)。SLP的优选长度设置为25个AA。在认为必要的情况下，鉴于基于已建立的肽合成经验预测的不良可制造性，包括了沿对应的HBV-X或HBV聚合酶序列的侧翼区以提高可制造性。产生了六种长度为25个AA的SLP和一种长度为26个AA的SLP。
使用固相Fmoc/tBu化学合成单种SLP(表6)，用裂解混合物处理，通过HPLC纯化并根据已建立的方法通过UPLC-MS分析。用于固相肽合成(SPPS)的所有试剂和溶剂均购自默克公司(Merck)、西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)、Actu-All公司、巴亨公司(Bachem)和Biosolve公司、吉尔生化公司(GL Biochem)并按原样使用。在Tetras肽合成仪(高级化学技术公司(Advanced ChemTech))上进行肽合成。将树脂干燥、冷却并用基于三氟乙酸(TFA)的裂解混合物处理。在过滤树脂后，在室温下振荡反应混合物。随后，使肽在基于醚的溶液中沉淀，离心并去除上清液。将固体沉淀重悬于基于醚的溶液中，离心并去除上清液。将所得的沉淀物溶解在具有乙腈(ACN)和TFA的或具有乙酸的基于H2O的混合物中并冻干过夜。在通过HPLC纯化后，基于在H2O中的TFA和在ACN中的TFA、或在H2O中的TFA和在ACN中的TFA与叔丁醇的溶剂系统，汇集选定的纯化级分并冻干过夜。通过UPLC-MS确定纯肽的身份和纯度。在使用前，将SLP在10％的DMSO和90％的H2O中重构以达到2mM的浓度。
使用IFNγELISpot测定来测试SLP在24小时刺激后诱导PBMC产生IFNγ的能力。简言之，将PBMC通过密度梯度离心从15个HLA型供体的血沉棕黄层中分离出来，这些供体先前已清除了HBV感染(桑昆试剂公司血库)。在10uM的SLP或等同的DMSO对照存在下，在用IFNγ捕获抗体(5ug/ml，Mab-1-D1K，抗体技术公司(Mabtech))包被的PVDF板(MSIPS4510，密理博公司(Millipore))中培养PBMC。将细胞以200.000个细胞/孔的密度接种在四个重复孔的IMDM+8％的人血清中。在孵育20-24小时后，添加IFNγ检测抗体(0.3ug/ml，Mab-7-B6-1-生物素，抗体技术公司)，然后添加链霉亲和素-ALP(1ug/ml，抗体技术公司)。通过添加BCIP/NBT-plus底物(100ul/孔，抗体技术公司)进行斑点的显现，并用CTL Immunospot S6Ultimate分析仪(免疫斑点公司(Immunospot))对斑点进行计数。将来自四个重复孔的斑点形成单位(SFU)的数目相加，并减去四个重复DMSO对照孔中的累积斑点数目。
5.2结果
为了测试SLP诱导IFNγ响应的能力，对来自15个HBV消退者的PBMC进行了IFNγELISpot测定。这些供体在过去已经消退了HBV感染，并因此预期具有HBV特异性T细胞响应。衍生自聚合酶和HBx两者的所有SLP都能够诱导IFNγ响应(图6)。
表6：
Figure BDA0003681204490000531
Figure BDA0003681204490000541
实例6.新的SLP可以在体外加强来自HBV消退者和慢性HBV患者的白细胞中的功能性CD8+和CD4+T细胞响应
6.1方法
在扩增实验中测试了新的SLP的功能性加强能力。简而言之，从衍生自先前清除了HBV的健康供体(n＝6)的血沉棕黄层或从鹿特丹伊拉兹马斯大学医院(Erasmus MedicalCenter Rotterdam)门诊就诊的慢性HBV患者的血液(n＝5)中分离出PBMC。在SLP池(3uM/SLP)存在下，将PBMC在IMDM(龙沙公司)+2％人血清(桑昆试剂公司)中培养14天。在2天后，将50IU/ml的IL-2添加到培养物中，重复3次/周直到第14天。在14天后，用单种SLP(10uM/SLP)或DMSO作为媒介物对照一式四份再刺激200.000个细胞/孔。在22小时后，收获上清液用于细胞因子分析，并将细胞用于流式细胞仪分析。将细胞汇集并在4℃下用以下成员在黑暗中染色30分钟：来自eBiosciences公司的CD3(SK7)和CD8(RPA-T8)、来自BD公司的CD4(SK3)、来自博奇公司(Biolegend)的CD69(FN50)和CD107a(H4A3)以及来自英杰公司(Invitrogen)的LIVE/DEAD Green，在BD FACSCanto仪器上获取并使用FlowJo v10(BD公司)分析。通过减去在DMSO对照中观察到的对应标志物的百分比来确定标志物表达的百分比。使用Luminex技术确定培养上清液中分泌的细胞因子。用赛默飞世尔公司(ThermoFisher)的定制Procarta板分析细胞因子，并使用MAGPIX仪器(默克密理博公司(Merck Millipore))进行分析。使用标准品计算分泌的细胞因子的数量。通过将计算值减去以下来减去背景：平均值(DMSO和不相关的肽)+2x SD(DMSO和不相关的肽)。
6.2结果
模拟疫苗接种的体外扩增实验指示，所有四种新的SLP(SLP1、SLP2、SLP4和SLP6)都能够在体外加强来自HBV消退者(rHBV1-6)和慢性HBV患者(cHBV1-5)的白细胞中的功能性CD8+和CD4+T细胞响应，因为每种SLP在至少一个供体中触发了响应。T细胞活化通过响应SLP在两种细胞类型上CD69的增加的存在来表明(图7)。这种供体T细胞扩增和活化也产生了功能性T细胞，这通过以下得到表明：CD8+T细胞显示了响应于SLP的CD107a的事实，其指示最近的细胞毒性剂的分泌；以及T细胞效应子功能所必需的I型T细胞细胞因子IFNγ和TNFα的存在。
序列表
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鹿特丹伊拉斯姆斯大学医疗中心
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Gly Pro Cys Ala Leu Arg Phe Thr Ser
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Met Ser Thr Thr Asp Leu Glu Ala Tyr
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Thr Thr Asp Leu Glu Ala Tyr Phe Lys
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<221> 尚未归类的特征
<223> p404-412
<400> 15
Trp Pro Lys Phe Ala Val Pro Asn Leu
1 5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p407-415
<400> 16
Phe Ala Val Pro Asn Leu Gln Ser Leu
1 5
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p509-517
<400> 17
Ile Leu Gly Phe Arg Lys Ile Pro Met
1 5
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p515-523
<400> 18
Ile Pro Met Gly Val Gly Leu Ser Pro
1 5
<210> 19
<211> 10
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p649-658
<400> 19
Cys Gly Tyr Pro Ala Leu Met Pro Leu Tyr
1 5 10
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p650-658
<400> 20
Gly Tyr Pro Ala Leu Met Pro Leu Tyr
1 5
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p693-701
<400> 21
Gly Leu Cys Gln Val Phe Ala Asp Ala
1 5
<210> 22
<211> 10
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p697-706
<400> 22
Val Phe Ala Asp Ala Thr Pro Thr Gly Trp
1 5 10
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p723-731
<400> 23
Leu Pro Ile His Thr Ala Glu Leu Leu
1 5
<210> 24
<211> 10
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p755-764
<400> 24
Arg Lys Tyr Thr Ser Phe Pro Trp Leu Leu
1 5 10
<210> 25
<211> 10
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p756-765
<400> 25
Lys Tyr Thr Ser Phe Pro Trp Leu Leu Gly
1 5 10
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p829-837
<400> 26
Arg Val His Phe Ala Ser Pro Leu His
1 5
<210> 27
<211> 832
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> HBV聚合酶序列
<400> 27
Met Pro Leu Ser Tyr Gln His Phe Arg Arg Leu Leu Leu Leu Asp Asp
1 5 10 15
Glu Ala Gly Pro Leu Glu Glu Glu Leu Pro Arg Leu Ala Asp Glu Gly
20 25 30
Leu Asn Arg Arg Val Ala Glu Asp Leu Asn Leu Gly Asn Leu Asn Val
35 40 45
Ser Ile Pro Trp Thr His Lys Val Gly Asn Phe Thr Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Ser Thr Val Pro Val Phe Asn Pro His Trp Lys Thr Pro Ser Phe Pro
65 70 75 80
Asn Ile His Leu His Gln Asp Ile Ile Lys Lys Cys Glu Gln Phe Val
85 90 95
Gly Pro Leu Thr Val Asn Glu Lys Arg Arg Leu Gln Leu Ile Met Pro
100 105 110
Ala Arg Phe Tyr Pro Lys Val Thr Lys Tyr Leu Pro Leu Asp Lys Gly
115 120 125
Ile Lys Pro Tyr Tyr Pro Glu His Leu Val Asn His Tyr Phe Gln Thr
130 135 140
Arg His Tyr Leu His Thr Leu Trp Lys Ala Gly Ile Leu Tyr Lys Arg
145 150 155 160
Glu Thr Thr His Ser Ala Ser Phe Cys Gly Ser Pro Tyr Ser Trp Glu
165 170 175
Gln Asp Leu Gln His Gly Ala Glu Ser Phe His Gln Gln Ser Ser Gly
180 185 190
Ile Leu Ser Arg Pro Pro Val Gly Ser Ser Leu Gln Ser Lys His Arg
195 200 205
Lys Ser Arg Leu Gly Leu Gln Ser Gln Gln Gly His Leu Ala Arg Arg
210 215 220
Gln Gln Gly Arg Ser Trp Ser Ile Arg Ala Gly Phe His Pro Thr Ala
225 230 235 240
Arg Arg Pro Phe Gly Val Glu Pro Ser Gly Ser Gly His Thr Thr Asn
245 250 255
Phe Ala Ser Lys Ser Ala Ser Cys Leu His Gln Ser Pro Val Arg Lys
260 265 270
Ala Ala Tyr Pro Ala Val Ser Thr Phe Glu Lys His Ser Ser Ser Gly
275 280 285
His Ala Val Glu Phe His Asn Leu Pro Pro Asn Ser Ala Arg Ser Gln
290 295 300
Ser Glu Arg Pro Val Phe Pro Cys Trp Trp Leu Gln Phe Arg Asn Ser
305 310 315 320
Lys Pro Cys Ser Asp Tyr Cys Leu Ser Leu Ile Val Asn Leu Leu Glu
325 330 335
Asp Trp Gly Pro Cys Ala Glu His Gly Glu His His Ile Arg Ile Pro
340 345 350
Arg Thr Pro Ser Arg Val Thr Gly Gly Val Phe Leu Val Asp Lys Asn
355 360 365
Pro His Asn Thr Ala Glu Ser Arg Leu Val Val Asp Phe Ser Gln Phe
370 375 380
Ser Arg Gly Asn Tyr Arg Val Ser Trp Pro Lys Phe Ala Val Pro Asn
385 390 395 400
Leu Gln Ser Leu Thr Asn Leu Leu Ser Ser Asn Leu Ser Trp Leu Ser
405 410 415
Leu Asp Val Ser Ala Ala Phe Tyr His Leu Pro Leu His Pro Ala Ala
420 425 430
Met Pro His Leu Leu Val Gly Ser Ser Gly Leu Ser Arg Tyr Val Ala
435 440 445
Arg Leu Ser Ser Asn Ser Arg Ile Leu Asn Asn Gln His Gly Thr Met
450 455 460
Pro Asp Leu His Asp Tyr Cys Ser Arg Asn Leu Tyr Val Ser Leu Leu
465 470 475 480
Leu Leu Tyr Gln Thr Phe Gly Arg Lys Leu His Leu Tyr Ser His Pro
485 490 495
Ile Ile Leu Gly Phe Arg Lys Ile Pro Met Gly Val Gly Leu Ser Pro
500 505 510
Phe Leu Leu Ala Gln Phe Thr Ser Ala Ile Cys Ser Val Val Arg Arg
515 520 525
Ala Phe Pro His Cys Leu Ala Phe Ser Tyr Met Asp Asp Val Val Leu
530 535 540
Gly Ala Lys Ser Val Gln His Leu Glu Ser Leu Phe Thr Ala Val Thr
545 550 555 560
Asn Phe Leu Leu Ser Leu Gly Ile His Leu Asn Pro Asn Lys Thr Lys
565 570 575
Arg Trp Gly Tyr Ser Leu Asn Phe Met Gly Tyr Val Ile Gly Cys Tyr
580 585 590
Gly Ser Leu Pro Gln Glu His Ile Ile Gln Lys Ile Lys Glu Cys Phe
595 600 605
Arg Lys Leu Pro Ile Asn Arg Pro Ile Asp Trp Lys Val Cys Gln Arg
610 615 620
Ile Val Gly Leu Leu Gly Phe Ala Ala Pro Phe Thr Gln Cys Gly Tyr
625 630 635 640
Pro Ala Leu Met Pro Leu Tyr Ala Cys Ile Gln Ser Lys Gln Ala Phe
645 650 655
Thr Phe Ser Pro Thr Tyr Lys Ala Phe Leu Cys Lys Gln Tyr Leu Asn
660 665 670
Leu Tyr Pro Val Ala Arg Gln Arg Pro Gly Leu Cys Gln Val Phe Ala
675 680 685
Asp Ala Thr Pro Thr Gly Trp Gly Leu Val Met Gly His Gln Arg Met
690 695 700
Arg Gly Thr Phe Ser Ala Pro Leu Pro Ile His Thr Ala Glu Leu Leu
705 710 715 720
Ala Ala Cys Phe Ala Arg Ser Arg Ser Gly Ala Asn Ile Ile Gly Thr
725 730 735
Asp Asn Ser Val Val Leu Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Phe Pro Trp Leu
740 745 750
Leu Gly Cys Ala Ala Asn Trp Ile Leu Arg Gly Thr Ser Phe Val Tyr
755 760 765
Val Pro Ser Ala Leu Asn Pro Ala Asp Asp Pro Ser Arg Gly Arg Leu
770 775 780
Gly Leu Ser Arg Pro Leu Leu Arg Leu Pro Phe Arg Pro Thr Thr Gly
785 790 795 800
Arg Thr Ser Leu Tyr Ala Asp Ser Pro Ser Val Pro Ser His Leu Pro
805 810 815
Asp Arg Val His Phe Ala Ser Pro Leu His Val Ala Trp Arg Pro Pro
820 825 830
<210> 28
<211> 843
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> HBV聚合酶共有序列
<400> 28
Met Pro Leu Ser Tyr Gln His Phe Arg Lys Leu Leu Leu Leu Asp Asp
1 5 10 15
Glu Ala Gly Pro Leu Glu Glu Glu Leu Pro Arg Leu Ala Asp Glu Gly
20 25 30
Leu Asn Arg Arg Val Ala Glu Asp Leu Asn Leu Gly Asn Leu Asn Val
35 40 45
Ser Ile Pro Trp Thr His Lys Val Gly Asn Phe Thr Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Ser Thr Val Pro Val Phe Asn Pro Glu Trp Gln Thr Pro Ser Phe Pro
65 70 75 80
Asp Ile His Leu Gln Glu Asp Ile Ile Asn Arg Cys Gln Gln Phe Val
85 90 95
Gly Pro Leu Thr Val Asn Glu Lys Arg Arg Leu Lys Leu Ile Met Pro
100 105 110
Ala Arg Phe Tyr Pro Asn Val Thr Lys Tyr Leu Pro Leu Asp Lys Gly
115 120 125
Ile Lys Pro Tyr Tyr Pro Glu His Val Val Asn His Tyr Phe Gln Thr
130 135 140
Arg His Tyr Leu His Thr Leu Trp Lys Ala Gly Ile Leu Tyr Lys Arg
145 150 155 160
Glu Thr Thr Arg Ser Ala Ser Phe Cys Gly Ser Pro Tyr Ser Trp Glu
165 170 175
Gln Glu Leu Gln His Gly Arg Leu Val Phe Gln Thr Ser Lys Arg His
180 185 190
Gly Asp Glu Ser Phe Cys Ser Gln Ser Ser Gly Ile Leu Ser Arg Ser
195 200 205
Pro Val Gly Pro Cys Ile Gln Ser Gln Leu Lys Gln Ser Arg Leu Gly
210 215 220
Leu Gln Pro Gln Gln Gly Ser Leu Ala Arg Arg Gln Gln Gly Arg Ser
225 230 235 240
Gly Ser Ile Arg Ala Arg Val His Pro Thr Thr Arg Arg Ser Phe Gly
245 250 255
Val Glu Pro Ser Gly Ser Gly His Ile Asp Asn Ser Ala Ser Ser Ser
260 265 270
Ser Ser Cys Leu His Gln Ser Ala Val Arg Lys Ala Ala Tyr Ser His
275 280 285
Leu Ser Thr Ser Lys Arg Gln Ser Ser Ser Gly His Ala Val Glu Leu
290 295 300
His Asn Ile Pro Pro Ser Ser Ala Arg Ser Gln Ser Glu Gly Pro Val
305 310 315 320
Phe Ser Cys Trp Trp Leu Gln Phe Arg Asn Ser Lys Pro Cys Ser Asp
325 330 335
Tyr Cys Leu Ser His Ile Val Asn Leu Leu Glu Asp Trp Gly Pro Cys
340 345 350
Thr Glu His Gly Glu His His Ile Arg Ile Pro Arg Thr Pro Ala Arg
355 360 365
Val Thr Gly Gly Val Phe Leu Val Asp Lys Asn Pro His Asn Thr Thr
370 375 380
Glu Ser Arg Leu Val Val Asp Phe Ser Gln Phe Ser Arg Gly Asn Thr
385 390 395 400
Arg Val Ser Trp Pro Lys Phe Ala Val Pro Asn Leu Gln Ser Leu Thr
405 410 415
Asn Leu Leu Ser Ser Asn Leu Ser Trp Leu Ser Leu Asp Val Ser Ala
420 425 430
Ala Phe Tyr His Leu Pro Leu His Pro Ala Ala Met Pro His Leu Leu
435 440 445
Val Gly Ser Ser Gly Leu Ser Arg Tyr Val Ala Arg Leu Ser Ser Asn
450 455 460
Ser Arg Ile Ile Asn Asn Gln His Gly Thr Met Gln Asn Leu His Asp
465 470 475 480
Ser Cys Ser Arg Asn Leu Tyr Val Ser Leu Leu Leu Leu Tyr Lys Thr
485 490 495
Phe Gly Arg Lys Leu His Leu Tyr Ser His Pro Ile Ile Leu Gly Phe
500 505 510
Arg Lys Ile Pro Met Gly Val Gly Leu Ser Pro Phe Leu Leu Ala Gln
515 520 525
Phe Thr Ser Ala Ile Cys Ser Val Val Arg Arg Ala Phe Pro His Cys
530 535 540
Leu Ala Phe Ser Tyr Met Asp Asp Val Val Leu Gly Ala Lys Ser Val
545 550 555 560
Gln His Leu Glu Ser Leu Tyr Thr Ala Val Thr Asn Phe Leu Leu Ser
565 570 575
Leu Gly Ile His Leu Asn Pro Asn Lys Thr Lys Arg Trp Gly Tyr Ser
580 585 590
Leu Asn Phe Met Gly Tyr Val Ile Gly Ser Trp Gly Thr Leu Pro Gln
595 600 605
Glu His Ile Val Gln Lys Ile Lys Gln Cys Phe Arg Lys Leu Pro Val
610 615 620
Asn Arg Pro Ile Asp Trp Lys Val Cys Gln Arg Ile Val Gly Leu Leu
625 630 635 640
Gly Phe Ala Ala Pro Phe Thr Gln Cys Gly Tyr Pro Ala Leu Met Pro
645 650 655
Leu Tyr Ala Cys Ile Gln Ala Lys Gln Ala Phe Thr Phe Ser Pro Thr
660 665 670
Tyr Lys Ala Phe Leu Cys Lys Gln Tyr Leu Asn Leu Tyr Pro Val Ala
675 680 685
Arg Gln Arg Pro Gly Leu Cys Gln Val Phe Ala Asp Ala Thr Pro Thr
690 695 700
Gly Trp Gly Leu Ala Ile Gly His Gln Arg Met Arg Gly Thr Phe Val
705 710 715 720
Ala Pro Leu Pro Ile His Thr Ala Glu Leu Leu Ala Ala Cys Phe Ala
725 730 735
Arg Ser Arg Ser Gly Ala Lys Leu Ile Gly Thr Asp Asn Ser Val Val
740 745 750
Leu Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Phe Pro Trp Leu Leu Gly Cys Ala Ala
755 760 765
Asn Trp Ile Leu Arg Gly Thr Ser Phe Val Tyr Val Pro Ser Ala Leu
770 775 780
Asn Pro Ala Asp Asp Pro Ser Arg Gly Arg Leu Gly Leu Tyr Arg Pro
785 790 795 800
Leu Leu Arg Leu Pro Phe Arg Pro Thr Thr Gly Arg Thr Ser Leu Tyr
805 810 815
Ala Val Ser Pro Ser Val Pro Ser His Leu Pro Asp Arg Val His Phe
820 825 830
Ala Ser Pro Leu His Val Ala Trp Arg Pro Pro
835 840
<210> 29
<211> 154
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> HBV-X序列
<400> 29
Met Ala Ala Arg Leu Cys Cys Gln Leu Asp Pro Ala Arg Asp Val Leu
1 5 10 15
Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Cys Gly Arg Pro Phe Ser Gly
20 25 30
Ser Leu Gly Thr Leu Ser Ser Pro Ser Pro Ser Ala Val Pro Thr Asp
35 40 45
His Gly Ala His Leu Ser Leu Arg Gly Leu Pro Val Cys Ala Phe Ser
50 55 60
Ser Ala Gly Pro Cys Ala Leu Arg Phe Thr Ser Ala Arg Arg Met Glu
65 70 75 80
Thr Thr Val Asn Ala His Gln Ile Leu Pro Lys Val Leu His Lys Arg
85 90 95
Thr Leu Gly Leu Ser Ala Met Ser Thr Thr Asp Leu Glu Ala Tyr Phe
100 105 110
Lys Asp Cys Leu Phe Lys Asp Trp Glu Glu Leu Gly Glu Glu Ile Arg
115 120 125
Leu Lys Val Phe Val Leu Gly Gly Cys Arg His Lys Leu Val Cys Ala
130 135 140
Pro Ala Pro Cys Asn Phe Phe Thr Ser Ala
145 150
<210> 30
<211> 154
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> HBV-X共有序列
<400> 30
Met Ala Ala Arg Leu Cys Cys Gln Leu Asp Pro Ala Arg Asp Val Leu
1 5 10 15
Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala Glu Ser Arg Gly Arg Pro Leu Ser Gly
20 25 30
Pro Leu Gly Thr Leu Pro Ser Pro Ser Pro Ser Ala Val Pro Ala Asp
35 40 45
His Gly Ala His Leu Ser Leu Arg Gly Leu Pro Val Cys Ala Phe Ser
50 55 60
Ser Ala Gly Pro Cys Ala Leu Arg Phe Thr Ser Ala Arg Arg Met Glu
65 70 75 80
Thr Thr Val Asn Ala His Gln Val Leu Pro Lys Val Leu His Lys Arg
85 90 95
Thr Leu Gly Leu Ser Ala Met Ser Thr Thr Asp Leu Glu Ala Tyr Phe
100 105 110
Lys Asp Cys Val Phe Lys Asp Trp Glu Glu Leu Gly Glu Glu Ile Arg
115 120 125
Leu Lys Val Phe Val Leu Gly Gly Cys Arg His Lys Leu Val Cys Ser
130 135 140
Pro Ala Pro Cys Asn Phe Phe Thr Ser Ala
145 150
<210> 31
<211> 25
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> SLP1
<400> 31
His Leu Ser Leu Arg Gly Leu Pro Val Cys Ala Phe Ser Ser Ala Gly
1 5 10 15
Pro Cys Ala Leu Arg Phe Thr Ser Ala
20 25
<210> 32
<211> 25
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> SLP2
<400> 32
Leu Ser Ala Met Ser Thr Thr Asp Leu Glu Ala Tyr Phe Lys Asp Cys
1 5 10 15
Leu Phe Lys Asp Trp Glu Glu Leu Gly
20 25
<210> 33
<211> 25
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> SLP3
<400> 33
Ala Ser Ser Ser Ser Ser Cys Leu His Gln Ser Ala Val Arg Lys Ala
1 5 10 15
Ala Tyr Ser His Leu Ser Thr Ser Lys
20 25
<210> 34
<211> 25
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> SLP4
<400> 34
Arg Lys Leu His Leu Tyr Ser His Pro Ile Ile Leu Gly Phe Arg Lys
1 5 10 15
Ile Pro Met Gly Val Gly Leu Ser Pro
20 25
<210> 35
<211> 26
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> SLP5
<400> 35
Gly Phe Ala Ala Pro Phe Thr Gln Cys Gly Tyr Pro Ala Leu Met Pro
1 5 10 15
Leu Tyr Ala Cys Ile Gln Ala Lys Gln Ala
20 25
<210> 36
<211> 25
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> SLP6
<400> 36
Ala Arg Gln Arg Pro Gly Leu Cys Gln Val Phe Ala Asp Ala Thr Pro
1 5 10 15
Thr Gly Trp Gly Leu Ala Ile Gly His
20 25
<210> 37
<211> 25
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> SLP7
<400> 37
Ser Pro Ser Val Pro Ser His Leu Pro Asp Arg Val His Phe Ala Ser
1 5 10 15
Pro Leu His Val Ala Trp Arg Pro Pro
20 25
<210> 38
<211> 34
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<400> 38
Val Val Asn Glu Lys Arg Arg Leu Lys Leu Ile Met Pro Ala Arg Phe
1 5 10 15
Tyr Pro Thr His Thr Lys Tyr Leu Pro Leu Asp Lys Gly Ile Lys Pro
20 25 30
Tyr Tyr
<210> 39
<211> 33
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<400> 39
Tyr Pro Thr His Thr Lys Tyr Leu Pro Leu Asp Lys Gly Ile Lys Pro
1 5 10 15
Tyr Tyr Pro Asp Gln Val Val Asn His Tyr Phe Gln Thr Arg His Tyr
20 25 30
Leu
<210> 40
<211> 33
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<400> 40
Thr Ala Glu Ser Arg Leu Val Val Asp Phe Ser Gln Phe Ser Arg Gly
1 5 10 15
Ile Ser Arg Val Ser Trp Pro Lys Phe Ala Val Pro Asn Leu Gln Ser
20 25 30
Leu
<210> 41
<211> 32
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<400> 41
Gln Arg Met Arg Gly Thr Phe Val Ala Pro Leu Pro Ile His Thr Ala
1 5 10 15
Glu Leu Leu Ala Ala Cys Phe Ala Arg Ser Arg Ser Gly Ala Lys Leu
20 25 30
<210> 42
<211> 33
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<400> 42
Ala Leu Pro Ser Pro Ser Pro Ser Ala Val Pro Ala Asp His Gly Ala
1 5 10 15
His Leu Ser Leu Arg Gly Leu Pro Val Cys Ala Phe Ser Ser Ala Gly
20 25 30
Pro
<210> 43
<211> 34
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<400> 43
Leu Glu Ala Tyr Phe Lys Asp Cys Val Phe Lys Asp Trp Glu Glu Leu
1 5 10 15
Gly Glu Glu Ile Arg Leu Lys Val Phe Val Leu Gly Gly Cys Arg His
20 25 30
Lys Leu
<210> 44
<211> 8
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p166-173
<400> 44
Ala Ser Phe Cys Gly Ser Pro Tyr
1 5
<210> 45
<211> 9
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p549-557
<400> 45
Tyr Met Asp Asp Val Val Leu Gly Ala
1 5
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> x63-71
<400> 46
Phe Ser Ser Ala Gly Pro Cys Ala Leu
1 5
<210> 47
<211> 10
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> x102-111
<400> 47
Ala Met Ser Thr Thr Asp Leu Glu Ala Tyr
1 5 10
<210> 48
<211> 10
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p642-651
<400> 48
Phe Ala Ala Pro Phe Thr Gln Cys Gly Tyr
1 5 10
<210> 49
<211> 10
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p149-158
<400> 49
His Thr Leu Trp Lys Ala Gly Ile Leu Tyr
1 5 10
<210> 50
<211> 9
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> x104-112
<400> 50
Ser Thr Thr Asp Leu Glu Ala Tyr Phe
1 5
<210> 51
<211> 10
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> x103-112
<400> 51
Met Ser Thr Thr Asp Leu Glu Ala Tyr Phe
1 5 10
<210> 52
<211> 11
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> x63-73
<400> 52
Phe Ser Ser Ala Gly Pro Cys Ala Leu Arg Phe
1 5 10
<210> 53
<211> 10
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p646-655
<400> 53
Phe Thr Gln Cys Gly Tyr Pro Ala Leu Met
1 5 10
<210> 54
<211> 9
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p165-173
<400> 54
Ser Ala Ser Phe Cys Gly Ser Pro Tyr
1 5
<210> 55
<211> 9
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p55-63
<400> 55
Lys Val Gly Asn Phe Thr Gly Leu Tyr
1 5
<210> 56
<211> 10
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p54-63
<400> 56
His Lys Val Gly Asn Phe Thr Gly Leu Tyr
1 5 10
<210> 57
<211> 10
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> c18-27
<400> 57
Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val
1 5 10
<210> 58
<211> 9
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p368-376
<400> 58
Arg Val Thr Gly Gly Val Phe Leu Val
1 5
<210> 59
<211> 9
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> x15-23
<400> 59
Val Leu Cys Leu Arg Pro Val Gly Ala
1 5
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p730-738
<400> 60
Leu Leu Ala Ala Cys Phe Ala Arg Ser
1 5
<210> 61
<211> 9
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p411-419
<400> 61
Asn Leu Gln Ser Leu Thr Asn Leu Leu
1 5
<210> 62
<211> 9
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> x102-110
<400> 62
Ala Met Ser Thr Thr Asp Leu Glu Ala
1 5
<210> 63
<211> 10
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> x91-100
<400> 63
Lys Val Leu His Lys Arg Thr Leu Gly Leu
1 5 10
<210> 64
<211> 9
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p646-654
<400> 64
Phe Thr Gln Cys Gly Tyr Pro Ala Leu
1 5
<210> 65
<211> 10
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> x132-141
<400> 65
Phe Val Leu Gly Gly Cys Arg His Lys Leu
1 5 10
<210> 66
<211> 10
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> x51-60
<400> 66
Ala His Leu Ser Leu Arg Gly Leu Pro Val
1 5 10
<210> 67
<211> 10
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> x133-142
<400> 67
Val Leu Gly Gly Cys Arg His Lys Leu Val
1 5 10
<210> 68
<211> 9
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p59-67
<400> 68
Phe Thr Gly Leu Tyr Ser Ser Thr Val
1 5
<210> 69
<211> 9
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p547-555
<400> 69
Phe Ser Tyr Met Asp Asp Val Val Leu
1 5
<210> 70
<211> 10
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> x97-106
<400> 70
Thr Leu Gly Leu Ser Ala Met Ser Thr Thr
1 5 10
<210> 71
<211> 9
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p545-553
<400> 71
Leu Ala Phe Ser Tyr Met Asp Asp Val
1 5
<210> 72
<211> 10
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p665-674
<400> 72
Gln Ala Phe Thr Phe Ser Pro Thr Tyr Lys
1 5 10
<210> 73
<211> 10
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p150-159
<400> 73
Thr Leu Trp Lys Ala Gly Ile Leu Tyr Lys
1 5 10
<210> 74
<211> 10
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p549-558
<400> 74
Tyr Met Asp Asp Val Val Leu Gly Ala Lys
1 5 10
<210> 75
<211> 9
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p106-114
<400> 75
Arg Leu Lys Leu Ile Met Pro Ala Arg
1 5
<210> 76
<211> 10
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p369-378
<400> 76
Val Thr Gly Gly Val Phe Leu Val Asp Lys
1 5 10
<210> 77
<211> 10
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> x69-78
<400> 77
Cys Ala Leu Arg Phe Thr Ser Ala Arg Arg
1 5 10
<210> 78
<211> 10
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p730-739
<400> 78
Leu Leu Ala Ala Cys Phe Ala Arg Ser Arg
1 5 10
<210> 79
<211> 9
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p108-116
<400> 79
Lys Leu Ile Met Pro Ala Arg Phe Tyr
1 5
<210> 80
<211> 10
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p107-116
<400> 80
Leu Lys Leu Ile Met Pro Ala Arg Phe Tyr
1 5 10
<210> 81
<211> 9
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p771-779
<400> 81
Ile Leu Arg Gly Thr Ser Phe Val Tyr
1 5
<210> 82
<211> 9
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p756-764
<400> 82
Lys Tyr Thr Ser Phe Pro Trp Leu Leu
1 5
<210> 83
<211> 9
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p403-412
<400> 83
Ser Phe Cys Gly Ser Pro Tyr Ser Trp
1 5
<210> 84
<211> 10
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p166-175
<400> 84
Ala Ser Phe Cys Gly Ser Pro Tyr Ser Trp
1 5 10
<210> 85
<211> 10
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> x111-120
<400> 85
Tyr Phe Lys Asp Cys Val Phe Lys Asp Trp
1 5 10
<210> 86
<211> 9
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p752-760
<400> 86
Val Leu Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Phe
1 5
<210> 87
<211> 8
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> x110-117
<400> 87
Ala Tyr Phe Lys Asp Cys Val Phe
1 5
<210> 88
<211> 10
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p406-415
<400> 88
Lys Phe Ala Val Pro Asn Leu Gln Ser Leu
1 5 10
<210> 89
<211> 9
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p146-154
<400> 89
His Tyr Leu His Thr Leu Trp Lys Ala
1 5
<210> 90
<211> 9
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p548-556
<400> 90
Ser Tyr Met Asp Asp Val Val Leu Gly
1 5
<210> 91
<211> 9
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p387-395
<400> 91
Arg Leu Val Val Asp Phe Ser Gln Phe
1 5
<210> 92
<211> 9
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> x143-151
<400> 92
Cys Ser Pro Ala Pro Cys Asn Phe Phe
1 5
<210> 93
<211> 10
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p365-374
<400> 93
Thr Pro Ala Arg Val Thr Gly Gly Val Phe
1 5 10
<210> 94
<211> 9
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p651-659
<400> 94
Tyr Pro Ala Leu Met Pro Leu Tyr Ala
1 5
<210> 95
<211> 9
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p365-373
<400> 95
Thr Pro Ala Arg Val Thr Gly Gly Val
1 5
<210> 96
<211> 9
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> x52-60
<400> 96
His Leu Ser Leu Arg Gly Leu Pro Val
1 5
<210> 97
<211> 9
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> x92-100
<400> 97
Val Leu His Lys Arg Thr Leu Gly Leu
1 5
<210> 98
<211> 9
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> x94-102
<400> 98
His Lys Arg Thr Leu Gly Leu Ser Ala
1 5
<210> 99
<211> 9
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> x95-103
<400> 99
Lys Arg Thr Leu Gly Leu Ser Ala Met
1 5
<210> 100
<211> 9
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> x89-97
<400> 100
Leu Pro Lys Val Leu His Lys Arg Thr
1 5
<210> 101
<211> 9
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p712-720
<400> 101
His Gln Arg Met Arg Gly Thr Phe Val
1 5
<210> 102
<211> 9
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> x50-58
<400> 102
Gly Ala His Leu Ser Leu Arg Gly Leu
1 5
<210> 103
<211> 8
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> c123-130
<400> 103
Gly Leu Lys Ile Leu Gln Leu Leu
1 5
<210> 104
<211> 9
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p500-508
<400> 104
Lys Leu His Leu Tyr Ser His Pro Ile
1 5
<210> 105
<211> 9
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p502-510
<400> 105
His Leu Tyr Ser His Pro Ile Ile Leu
1 5
<210> 106
<211> 10
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> x89-98
<400> 106
Leu Pro Lys Val Leu His Lys Arg Thr Leu
1 5 10
<210> 107
<211> 10
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p751-760
<400> 107
Val Val Leu Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Phe
1 5 10
<210> 108
<211> 10
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> x54-63
<400> 108
Ser Leu Arg Gly Leu Pro Val Cys Ala Phe
1 5 10
<210> 109
<211> 10
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> x67-76
<400> 109
Gly Pro Cys Ala Leu Arg Phe Thr Ser Ala
1 5 10
<210> 110
<211> 9
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> x75-83
<400> 110
Ser Ala Arg Arg Met Glu Thr Thr Val
1 5
<210> 111
<211> 9
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> x134-142
<400> 111
Leu Gly Gly Cys Arg His Lys Leu Val
1 5
<210> 112
<211> 10
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p508-517
<400> 112
Ile Ile Leu Gly Phe Arg Lys Ile Pro Met
1 5 10
<210> 113
<211> 9
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> p482-490
<400> 113
Cys Ser Arg Asn Leu Tyr Val Ser Leu
1 5
<210> 114
<211> 9
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> NP 44-52
<400> 114
Cys Thr Glu Leu Lys Leu Ser Asp Tyr
1 5
<210> 115
<211> 9
<212> PRT
<213> RSV
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> NP 306-314
<400> 115
Asn Pro Lys Ala Ser Leu Leu Ser Leu
1 5
<210> 116
<211> 9
<212> PRT
<213> CMV
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> pp65 495-503
<400> 116
Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val
1 5
<210> 117
<211> 9
<212> PRT
<213> EBNA3B
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> 416-424
<400> 117
Ile Val Thr Asp Phe Ser Val Ile Lys
1 5
<210> 118
<211> 9
<212> PRT
<213> gp100
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> 614-622
<400> 118
Leu Ile Tyr Arg Arg Arg Leu Met Lys
1 5
<210> 119
<211> 9
<212> PRT
<213> GPR143
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> 126-134
<400> 119
Leu Tyr Ser Ala Cys Phe Trp Trp Leu
1 5
<210> 120
<211> 9
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> NP 380-388
<400> 120
Glu Leu Arg Ser Arg Tyr Trp Ala Ile
1 5
<210> 121
<211> 27
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<400> 121
Lys Leu His Leu Tyr Ser His Pro Ile Ile Leu Gly Phe Arg Lys Ile
1 5 10 15
Pro Met Gly Val Gly Leu Ser Pro Phe Leu Leu
20 25
<210> 122
<211> 31
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<400> 122
Gly Leu Leu Gly Phe Ala Ala Pro Phe Thr Gln Cys Gly Tyr Pro Ala
1 5 10 15
Leu Met Pro Leu Tyr Ala Cys Ile Gln Ala Lys Gln Ala Phe Thr
20 25 30
<210> 123
<211> 29
<212> PRT
<213> 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus）
<400> 123
Ala Arg Gln Arg Pro Gly Leu Cys Gln Val Phe Ala Asp Ala Thr Pro
1 5 10 15
Thr Gly Trp Gly Leu Ala Ile Gly His Gln Arg Met Arg
20 25

Claims (15)

1.一种包含HBV蛋白的片段的免疫原性肽，其中所述片段的长度为20-34个氨基酸，并且其中所述片段包含：
a)来自HBV-X的位置57至位置78的区的至少10个连续的氨基酸，优选地包含：
-SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列(x70-78)，和/或
-SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列(x67-75)，和/或
-SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列(x62-73)，和/或
-SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列(x58-66)，和/或
-SEQ ID NO:5中列出的氨基酸序列(x57-66)，
或
b)来自HBV-X的位置103至位置120的区的至少11个连续的氨基酸，优选地包含：
-SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列(x103-111)，和/或
-SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列(x104-113)，和/或
-SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列(x105-113)，和/或
-SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列(x110-120)，
或
c)SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列(x132-140)，
或
d)SEQ ID NO:11中列出的氨基酸序列(p124-133)，
或
e)SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列(p164-173)，
或
f)SEQ ID NO:13中列出的氨基酸序列(p275-283)，
或
g)来自HBV聚合酶的位置403至位置415的区的至少10个连续的氨基酸，优选地包含：
-SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列(p403-412)，和/或
-SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列(p404-412)，和/或
-SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列(p407-415)，
或
h)来自HBV聚合酶的位置509至位置523的区的至少9个连续的氨基酸，优选地包含：
-SEQ ID NO:17中列出的氨基酸序列(p509-517)，和/或
-SEQ ID NO:18中列出的氨基酸序列(p515-523)，
或
i)来自HBV聚合酶的位置649至位置658的区的至少10个连续的氨基酸，包含：
-SEQ ID NO:19中列出的氨基酸序列(p649-658)，和/或
-SEQ ID NO:20中列出的氨基酸序列(p650-658)，
或
j)来自HBV聚合酶的位置693至位置706的区的至少10个连续的氨基酸，优选地包含：
-SEQ ID NO:21中列出的氨基酸序列(p693-701)，和/或
-SEQ ID NO:22中列出的氨基酸序列(p697-706)，
或
k)SEQ ID NO:23中列出的氨基酸序列(p723-731)，
或
l)来自HBV聚合酶的位置755至位置765的区的至少10个连续的氨基酸，包含：
-SEQ ID NO:24中列出的氨基酸序列(p755-764)，和/或
-SEQ ID NO:25中列出的氨基酸序列(p756-765)，
或
m)SEQ ID NO:26中列出的氨基酸序列(p829-837)，
其中HBV聚合酶和HBV-X内的氨基酸位置的编号对应于分别在SEQ ID NO:28和SEQ IDNO:30中列出的共有序列中的编号。
2.根据权利要求1所述的肽，其中该肽由HBV蛋白的所述片段组成。
3.根据权利要求1或2所述的肽，其中所述肽的长度为20-34个氨基酸，如长度为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34个氨基酸，如长度为20-33个氨基酸，例如长度为20-32个氨基酸，如长度为20-31个氨基酸，例如长度为20-30个氨基酸，如长度为20-29个氨基酸，例如长度为20-28个氨基酸，如长度为20-27个氨基酸，例如长度为20-26或20-25个氨基酸。
4.根据前述权利要求中任一项所述的肽，其中所述片段的长度为20-33个氨基酸，如长度为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个氨基酸，如长度为20-32个氨基酸，如长度为20-31个氨基酸，例如长度为20-30个氨基酸，如长度为20-29个氨基酸，例如长度为20-28个氨基酸，如长度为20-27个氨基酸，例如长度为20-26或20-25个氨基酸。
5.根据前述权利要求中任一项所述的肽，其中
a)该片段包含来自HBV-X的位置57至位置78的区的至少10个连续的氨基酸，并且该片段包含：
-SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列(x70-78)和SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列(x67-75)，或
-SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列(x70-78)和SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列(x62-73)，或
-SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列(x70-78)和SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列(x58-66)，或
-SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列(x70-78)和SEQ ID NO:5中列出的氨基酸序列(x57-66)，或
-SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列(x67-75)和SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列(x62-73)，或
-SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列(x67-75)和SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列(x58-66)，或
-SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列(x67-75)和SEQ ID NO:5中列出的氨基酸序列(x57-66)，或
-SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列(x62-73)和SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列(x58-66)，或
-SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列(x62-73)和SEQ ID NO:5中列出的氨基酸序列(x57-66)
或
b)该片段包含来自HBV-X的位置103至位置120的区的至少11个连续的氨基酸，并且该片段包含：
-SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列(x103-111)和SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列(x104-113)，或
-SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列(x103-111)和SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列(x105-113)，或
-SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列(x103-111)和SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列(x110-120)，或
-SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列(x104-113)和SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列(x110-120)，或
-SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列(x105-113)和SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列(x110-120)，
或
c)该片段包含来自HBV聚合酶的位置403至位置415的区的至少10个连续的氨基酸，并且该片段包含：
-SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列(p403-412)和SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列(p407-415)，或
-SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列(p404-412)和SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列(p407-415)。
6.根据前述权利要求中任一项所述的肽，其中该肽包含选自由以下组成的组的序列或由其组成：
SEQ ID NO:31(SLP1)、SEQ ID NO:32(SLP2)、SEQ ID NO:33(SLP3)、SEQ ID NO:34(SLP4)、SEQ ID NO:35(SLP5)、SEQ ID NO:36(SLP6)和SEQ ID NO:37(SLP7)。
7.一种包含HBV蛋白的片段的免疫原性肽，其中所述肽的长度为20-34个氨基酸，并且其中所述片段包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:26。
8.一种多核苷酸，该多核苷酸包含编码根据前述权利要求中任一项所述的肽的核苷酸序列。
9.一种重组病毒，该重组病毒包含根据权利要求8所述的多核苷酸。
10.一种免疫原性组合物，该免疫原性组合物包含：
-根据权利要求1至7中任一项所述的肽、根据权利要求8所述的多核苷酸或根据权利要求9所述的重组病毒，和
-药学上可接受的运载体，
任选地进一步包含佐剂。
11.一种用于治疗或预防HBV相关疾病的方法，该方法包括向人受试者施用：
-如权利要求1a)中所述的肽和如权利要求1b)中所述的肽，或
-如权利要求1a)中所述的肽和如权利要求1c)中所述的肽，或
-如权利要求1a)中所述的肽和如权利要求1d)中所述的肽，或
-如权利要求1a)中所述的肽和如权利要求1e)中所述的肽，或
-如权利要求1a)中所述的肽和如权利要求1f)中所述的肽，或
-如权利要求1a)中所述的肽和如权利要求1g)中所述的肽，或
-如权利要求1a)中所述的肽和如权利要求1h)中所述的肽，或
-如权利要求1a)中所述的肽和如权利要求1i)中所述的肽，或
-如权利要求1a)中所述的肽和如权利要求1j)中所述的肽，或
-如权利要求1a)中所述的肽和如权利要求1k)中所述的肽，或
-如权利要求1a)中所述的肽和如权利要求1l)中所述的肽，或
-如权利要求1a)中所述的肽和如权利要求1m)中所述的肽，或
-如权利要求1b)中所述的肽和如权利要求1d)中所述的肽，或
-如权利要求1b)中所述的肽和如权利要求1e)中所述的肽，或
-如权利要求1b)中所述的肽和如权利要求1f)中所述的肽，或
-如权利要求1b)中所述的肽和如权利要求1g)中所述的肽，或
-如权利要求1b)中所述的肽和如权利要求1h)中所述的肽，或
-如权利要求1b)中所述的肽和如权利要求1i)中所述的肽，或
-如权利要求1b)中所述的肽和如权利要求1j)中所述的肽，或
-如权利要求1b)中所述的肽和如权利要求1k)中所述的肽，或
-如权利要求1b)中所述的肽和如权利要求1l)中所述的肽，或
-如权利要求1b)中所述的肽和如权利要求1m)中所述的肽，或
-如权利要求1c)中所述的肽和如权利要求1d)中所述的肽，或
-如权利要求1c)中所述的肽和如权利要求1e)中所述的肽，或
-如权利要求1c)中所述的肽和如权利要求1f)中所述的肽，或
-如权利要求1c)中所述的肽和如权利要求1g)中所述的肽，或
-如权利要求1c)中所述的肽和如权利要求1h)中所述的肽，或
-如权利要求1c)中所述的肽和如权利要求1i)中所述的肽，或
-如权利要求1c)中所述的肽和如权利要求1j)中所述的肽，或
-如权利要求1c)中所述的肽和如权利要求1k)中所述的肽，或
-如权利要求1c)中所述的肽和如权利要求1l)中所述的肽，或
-如权利要求1c)中所述的肽和如权利要求1m)中所述的肽，或
-如权利要求1d)中所述的肽和如权利要求1e)中所述的肽，或
-如权利要求1d)中所述的肽和如权利要求1f)中所述的肽，或
-如权利要求1d)中所述的肽和如权利要求1g)中所述的肽，或
-如权利要求1d)中所述的肽和如权利要求1h)中所述的肽，或
-如权利要求1d)中所述的肽和如权利要求1i)中所述的肽，或
-如权利要求1d)中所述的肽和如权利要求1j)中所述的肽，或
-如权利要求1d)中所述的肽和如权利要求1k)中所述的肽，或
-如权利要求1d)中所述的肽和如权利要求1l)中所述的肽，或
-如权利要求1d)中所述的肽和如权利要求1m)中所述的肽，或
-如权利要求1e)中所述的肽和如权利要求1f)中所述的肽，或
-如权利要求1e)中所述的肽和如权利要求1g)中所述的肽，或
-如权利要求1e)中所述的肽和如权利要求1h)中所述的肽，或
-如权利要求1e)中所述的肽和如权利要求1i)中所述的肽，或
-如权利要求1e)中所述的肽和如权利要求1j)中所述的肽，或
-如权利要求1e)中所述的肽和如权利要求1k)中所述的肽，或
-如权利要求1e)中所述的肽和如权利要求1l)中所述的肽，或
-如权利要求1e)中所述的肽和如权利要求1m)中所述的肽，或
-如权利要求1f)中所述的肽和如权利要求1g)中所述的肽，或
-如权利要求1f)中所述的肽和如权利要求1h)中所述的肽，或
-如权利要求1f)中所述的肽和如权利要求1i)中所述的肽，或
-如权利要求1f)中所述的肽和如权利要求1j)中所述的肽，或
-如权利要求1f)中所述的肽和如权利要求1k)中所述的肽，或
-如权利要求1f)中所述的肽和如权利要求1l)中所述的肽，或
-如权利要求1f)中所述的肽和如权利要求1m)中所述的肽，或
-如权利要求1g)中所述的肽和如权利要求1h)中所述的肽，或
-如权利要求1g)中所述的肽和如权利要求1i)中所述的肽，或
-如权利要求1g)中所述的肽和如权利要求1j)中所述的肽，或
-如权利要求1g)中所述的肽和如权利要求1k)中所述的肽，或
-如权利要求1g)中所述的肽和如权利要求1l)中所述的肽，或
-如权利要求1g)中所述的肽和如权利要求1m)中所述的肽，或
-如权利要求1h)中所述的肽和如权利要求1i)中所述的肽，或
-如权利要求1h)中所述的肽和如权利要求1j)中所述的肽，或
-如权利要求1h)中所述的肽和如权利要求1k)中所述的肽，或
-如权利要求1h)中所述的肽和如权利要求1l)中所述的肽，或
-如权利要求1h)中所述的肽和如权利要求1m)中所述的肽，或
-如权利要求1i)中所述的肽和如权利要求1j)中所述的肽，或
-如权利要求1i)中所述的肽和如权利要求1k)中所述的肽，或
-如权利要求1i)中所述的肽和如权利要求1l)中所述的肽，或
-如权利要求1i)中所述的肽和如权利要求1m)中所述的肽，或
-如权利要求1j)中所述的肽和如权利要求1k)中所述的肽，或
-如权利要求1j)中所述的肽和如权利要求1l)中所述的肽，或
-如权利要求1j)中所述的肽和如权利要求1m)中所述的肽，或
-如权利要求1k)中所述的肽和如权利要求1l)中所述的肽，或
-如权利要求1k)中所述的肽和如权利要求1m)中所述的肽，或
-如权利要求1l)中所述的肽和如权利要求1m)中所述的肽，或
-一种或两种包含编码肽的上述组合中的任一种的序列的多核苷酸。
12.根据权利要求1至7中任一项所述的肽、根据权利要求8所述的多核苷酸、根据权利要求9所述的重组病毒、或根据权利要求10所述的免疫原性组合物，其用作药物。
13.根据权利要求1至7中任一项所述的肽、根据权利要求8所述的多核苷酸、根据权利要求9所述的重组病毒、或根据权利要求10所述的免疫原性组合物，其用于治疗或预防HBV相关疾病。
14.根据权利要求1至7中任一项所述的肽或一种包含选自由以下组成的组的序列的肽：SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:26，用于离体刺激负载抗原的活化的抗原呈递细胞或扩增的抗原特异性T细胞。
15.根据权利要求1至7中任一项所述的肽、根据权利要求8所述的多核苷酸、根据权利要求9所述的重组病毒、或根据权利要求10所述的免疫原性组合物，其用于治疗HBV相关疾病，其中该治疗包括以下步骤：
(i)给予受HBV感染的患者抗病毒治疗以降低病毒载量，
(ii)当该病毒载量显著降低时，施用一种或多种该免疫原性肽、多核苷酸、重组病毒或免疫原性组合物并且
(iii)当已经过去了足够长的时间用于使该患者中的初始T细胞响应发生时，中断或停止抗病毒治疗。
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