CN114990191A - 凝血酶定量检测酶试剂的制备方法及凝血酶定量检测卡 - Google Patents

凝血酶定量检测酶试剂的制备方法及凝血酶定量检测卡 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种凝血酶定量检测酶试剂的制备方法及凝血酶定量检测卡，所述凝血酶定量检测酶试剂的制备方法包括：向缓冲溶液中加入丙烯酰胺和过硫酸铵，得到第一混合溶液；向第一混合溶液中加入多肽底物和稳定剂，得到第二混合溶液；将WS2/C复合材料加入到水溶液中进行超声处理，再加入到第二混合溶液中，得到凝血酶定量检测酶试剂；所述凝血酶定量检测卡包括电极基片与亲水膜层，所述电极基片上设有检测区域和绝缘层，且所述检测区域上涂覆有上述制备方法制得的凝血酶定量检测酶试剂。本发明的优点在于，采用本发明提供的凝血酶定量检测酶试剂的制备方法及凝血酶定量检测卡，能够对凝血酶进行定量检测，灵敏度高且重复性好。

Description

凝血酶定量检测酶试剂的制备方法及凝血酶定量检测卡
技术领域
本发明涉及电化学检测技术领域，具体涉及一种凝血酶定量检测酶试剂的制备方法及凝血酶定量检测卡。
背景技术
凝血酶是一种多功能丝氨酸蛋白酶，在生理学和病理学中发挥着重要作用。凝血酶可作为激素调节血小板聚集、内皮细胞激活和生物血管中的重要响应，与多种疾病存在关联；也可作为尿液中的生物标志物，用于检测肾小球肾炎、肝炎、狼疮、糖尿病以及癌症等疾病信号。在血液凝血级联反应过程中，凝血酶作为主要效应蛋白酶，能够促使血浆中的可溶性纤维蛋白转变为不溶的纤维蛋白，实现快速止血。但是，凝血过度会导致体内血栓栓塞等疾病发生，甚至造成机体死亡。因此，对凝血酶进行定量检测对于疾病检测和临床诊断有重要的意义。
现有技术中，对凝血酶定量检测的方法主要有比色法、荧光法、磁共振成像法以及电化学法等。其中，比色法和荧光法虽然对凝血酶定量检测具有灵敏度高的优点，但是大多数比色法和荧光法是通过监测基于凝血酶适配体与凝血酶反应前后构象变化导致的荧光变化，从而实现对凝血酶的定量检测，故比色法和荧光法存在着操作繁琐、耗时较长且检测设备昂贵以及检测限高等问题，无法达到实际需求；磁共振成像法对凝血分析仪具有较高的精度要求，需要依赖大型且昂贵的分析设备和专业人员的技术操作，无法满足便捷的检测需求。而采用电化学法对凝血酶进行定量检测，其检测原理是通过检测在酶反应的过程中电化学试纸产生的电信号，从而测定凝血酶浓度，具有方便快捷、简单易用且无需使用任何大型设备的特点。因此，大多采用电化学法对凝血酶进行定量检测，但是目前采用电化学法对凝血酶定量检测存在灵敏度不够的问题。
综上所述，在电化学法定量检测凝血酶中，急需一种凝血酶定量检测酶试剂，所述凝血酶定量检测酶试剂能够应用于凝血酶定量检测卡中，以解决现有技术中存在的问题。
发明内容
本发明目的在于提供一种凝血酶定量检测酶试剂的制备方法，所述制备方法制得的凝血酶定量检测酶试剂能够应用于凝血酶定量检测卡中，提高对凝血酶定量检测的灵敏度以及精密度，具体技术方案如下：
一种凝血酶定量检测酶试剂的制备方法，具体包括如下步骤：
步骤S1.1：向缓冲溶液中依次加入丙烯酰胺和过硫酸铵，溶解后得到第一混合溶液；其中，在第一混合溶液中：丙烯酰胺的质量分数为2~15%，过硫酸铵的质量分数为0.05~1.5%；
步骤S1.2：向第一混合溶液中依次加入多肽底物和稳定剂，得到第二混合溶液；其中，在第二混合溶液中：多肽底物的摩尔浓度为0.005~120mmol/L，稳定剂的质量分数为0.1~15%；
步骤S1.3：将WS2/C复合材料加入到水溶液中进行超声处理，再加入到第二混合溶液中，得到凝血酶定量检测酶试剂；其中，在凝血酶定量检测酶试剂中，所述WS2/C复合材料的质量分数为0.01~2%，且WS2/C复合材料的粒度分布范围为50nm~20um。
优选的，所述WS2/C复合材料的制备方法具体包括如下步骤：
步骤S2.1：将含硫有机物、含钨化合物以及碳源混合，得到混合料一；其中，在混合料一中，含硫有机物、含钨化合物以及碳源的摩尔比为
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE002AA
；
步骤S2.2：将混合料一加入到氨水溶液中，进行球磨处理，得到混合料二；其中，所述氨水溶液的质量浓度为5~20%，所述混合料一和氨水溶液的质量比为
Figure DEST_PATH_IMAGE004AAAA
；
步骤S2.3：将混合料二放置于惰性气体环境中，进行高温烧结处理，得到混合料三；
步骤S2.4：将混合料三加入到水溶液中，进行球磨处理，得到WS2/C复合材料；其中，混合料三和水溶液的质量比为
Figure DEST_PATH_IMAGE006AAAA
；在WS2/C复合材料中，碳源的质量含量为1~20%。
优选的，所述含硫有机物包括硫脲；所述含钨化合物包括偏钨酸胺；所述碳源包括硬脂酸。
优选的，步骤S2.2中，所述球磨时间为4~6h；步骤S2.3中，所述高温烧结处理的条件为：以5~15℃/min的升温速率，升温至800-1000℃的焙烧温度，保持恒温焙烧2~6h；步骤S2.4中，所述球磨时间为4~72h。
优选的，所述多肽底物为S-2238，所述稳定剂为多糖保护剂。
优选的，所述多糖保护剂为蔗糖保护剂、葡聚糖保护剂以及海藻糖保护剂中的至少一种。
优选的，所述缓冲溶液包含Hepes缓冲液、Tris-Hcl缓冲液、TES缓冲液以及PBS缓冲液中的一种或者多种，且所述缓冲溶液的pH值为7.0~10.0。
优选的，还包括步骤S1.4：在凝血酶定量检测酶试剂中加入消泡剂；其中，在凝血酶定量检测酶试剂中，消泡剂的质量分数为0.02~1%。
本发明还提供了一种凝血酶定量检测卡，所述凝血酶定量检测卡上涂覆有上述制备方法制得的凝血酶定量检测酶试剂，具体技术方案如下：
一种凝血酶定量检测卡，包括电极基片与亲水膜层，所述电极基片上设有检测区域和绝缘层，且所述检测区域上涂覆有根据上述制备方法制得的凝血酶定量检测酶试剂；所述亲水膜层包括亲水膜和气孔，所述气孔设置在亲水膜上，所述亲水膜通过绝缘层附着在电极基片上。
优选的，所述电极基片上印刷有参比电极、工作电极以及对电极，所述工作电极设置于参比电极与对电极之间，且所述参比电极、工作电极以及对电极的材质均为碳、银-碳、金或者钯-碳。
应用本发明的技术方案，具有以下有益效果：
（1）根据本发明提供的凝血酶定量检测酶试剂的制备方法，制得的凝血酶定量检测酶试剂能够对凝血酶进行定量检测，其机理在于，所述凝血酶定量检测酶试剂中加入了多肽底物和WS2/C复合材料，所述多肽底物能够被凝血酶进行特异性识别，凝血酶对多肽底物进行特异性识别并切割后，形成了对硝基苯胺，所述WS2/C复合材料中的WS2能够电催化对硝基苯胺，在电催化的过程中产生了电信号，通过WS2/C复合材料中的碳源传递电信号，从而对凝血酶进行定量检测；
（2）根据本发明提供的凝血酶定量检测酶试剂的制备方法，制得的凝血酶定量检测酶试剂能够提高对凝血酶进行定量检测的灵敏度和精密度，其机理在于，所述凝血酶定量检测酶试剂中加入了WS2/C复合材料，所述WS2/C复合材料为电子媒介体，同时结合了WS2的电催化活性和碳源的高导电性，具有协同作用：WS2本身作为电催化物质，具有电催化活性强、环境适应性强的优点，而碳源则可以提高WS2的导电性，进而提高凝血酶定量检测酶试剂的电子传输能力，降低凝血酶定量检测卡的背景电流，提升灵敏度和精密度；
（3）本发明提供的凝血酶定量检测卡的稳定性和对环境的抗干扰能力较强，其机理在于，所述凝血酶定量检测卡上涂敷有凝血酶定量检测酶试剂，所述凝血酶定量检测酶试剂中加入的WS2/C复合材料为经过球磨处理后的纳米材料，同时，所述凝血酶定量检测酶试剂中还加入了丙烯酰胺和过硫酸铵，可以使得凝血酶定量检测酶试剂成为凝胶状态；将含有WS2/C复合材料的凝血酶定量检测酶试剂涂覆至凝血酶定量检测卡上时，所述WS2/C复合材料能够被均匀地涂覆在凝血酶定量检测卡的电极基片之上，不会堵塞网板，同时，具有较大的比表面积，使得电极重复性好。
除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明优选实施例1对应的凝血酶定量检测卡的爆炸示意图；
图2是本发明优选实施例1对应的凝血酶定量检测卡的结构示意图；
其中，1、电极基片，1.1、参比电极，1.2、工作电极，1.3、对电极，2、亲水膜层，2.1、亲水膜，2.2、气孔，3、绝缘层。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以根据权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。
实施例1：
本实施例提供了一种优选的凝血酶定量检测酶试剂的制备方法，具体包括如下步骤：
步骤S1.1：向缓冲溶液中依次加入丙烯酰胺和过硫酸铵，溶解后得到第一混合溶液；具体的，所述缓冲溶液包含Hepes缓冲液、Tris-Hcl缓冲液、TES缓冲液以及PBS缓冲液中的一种或者多种，且所述缓冲溶液的pH值为7.0~10.0，本实施例中优选的缓冲溶液为Hepes缓冲液，pH值为7.0~10.0；其中，在第一混合溶液中：丙烯酰胺的质量分数为5~10%，过硫酸铵的质量分数为1.0%；
具体的，将丙烯酰胺加入到Hepes缓冲液后，在37℃的水浴环境中进行搅拌处理，使得丙烯酰胺在缓冲溶液中充分溶解。
步骤S1.2：向第一混合溶液中依次加入多肽底物和稳定剂，得到第二混合溶液；其中，所述多肽底物为S-2238，所述稳定剂为多糖保护剂；具体的，所述多糖保护剂为蔗糖保护剂、葡聚糖保护剂以及海藻糖保护剂中的至少一种；在本实施例中，采用蔗糖保护剂作为稳定剂；其中，在第二混合溶液中：多肽底物的摩尔浓度为100mmol/L；稳定剂质量分数为0.1~15%；具体的，所述多肽底物的分子式为625.6，则其在第二混合溶液中的质量分数为3%；
具体的，将S-2238和蔗糖保护剂加入到第一混合溶液中后，在37℃的水浴环境下进行搅拌处理，搅拌时间为2~4h。
步骤S1.3：将WS2/C复合材料加入到水溶液中进行超声处理，再加入到第二混合溶液中，得到凝血酶定量检测酶试剂；其中，在凝血酶定量检测酶试剂中，所述WS2/C复合材料的质量分数为0.3%。
步骤S1.4：在凝血酶定量检测酶试剂中加入消泡剂，所述消泡剂为antifoam消泡剂；其中，在凝血酶定量检测酶试剂中，消泡剂的质量分数为0.02~1%。
其中，所述WS2/C复合材料的制备方法具体包括如下步骤：
步骤S2.1：将含硫有机物、含钨化合物以及碳源混合，得到混合料一；其中，所述含硫有机物包括硫脲；所述含钨化合物包括偏钨酸胺；所述碳源包括硬脂酸；在混合料一中，硫脲、偏钨酸胺以及硬脂酸的摩尔比为
Figure DEST_PATH_IMAGE008AA
。
步骤S2.2：将混合料一加入到氨水溶液中，进行球磨处理，得到混合料二；其中，所述氨水溶液的质量浓度为5~20%，所述混合料一和氨水溶液的质量比为
Figure DEST_PATH_IMAGE004_5A
；
具体的，进行球磨处理时，球磨时间为6h；所用球磨设备包括但不限于卧式球磨机、砂磨机、行星式球磨机以及震动研磨机，本实施例中优选为卧式球磨机；所用球磨介质包括但不限于不锈钢球以及氧化锆球，本实施例中优选为氧化锆球。
步骤S2.3：将混合料二放置于惰性气体环境中，进行高温烧结处理，得到混合料三；
具体的，所述惰性气体优选为氩气；进行高温烧结处理时，以5℃/min的升温速率，升温至900℃的焙烧温度，保持恒温焙烧3h；在进行高温烧结处理时，所用烧结炉包括但不限于气氛钢带炉、真空管式炉以及高温箱式气氛炉。
步骤S2.4：将混合料三加入到水溶液中，进行球磨处理，得到WS2/C复合材料；其中，混合料三和水溶液的质量比为
Figure DEST_PATH_IMAGE006_5A
；在WS2/C复合材料中，碳源的质量含量为1~20%；
具体的，进行球磨处理时，球磨时间为24h；所用球磨设备包括但不限于卧式球磨机、砂磨机、行星式球磨机、震动研磨机以及卧式棒磨机，本实施例中优选为卧式棒磨机；所用球磨介质包括但不限于不锈钢球以及氧化锆球，本实施例中优选为氧化锆球。
本实施例中获得的WS2/C复合材料的粒度分布范围为500nm~1.5um。
具体的，为了使凝血酶定量检测酶试剂内的组分稳定，同时进一步消除凝血酶定量检测酶试剂中所含的气泡，还包括将凝血酶定量检测酶试剂的pH值调节至7.0-10.0后，对凝血酶定量检测酶试剂进行冷藏处理，具体是：将制得的凝血酶定量检测酶试剂置于2~8℃的环境中进行冷藏处理，冷藏时间为1~3h。
实施例2~实施例9：
具体的，以实施例1为基础，实施例2~实施例9内，参照实施例1，实施例1~实施例9中在凝血酶定量检测酶试剂的制备方法中，所述WS2/C复合材料在凝血酶定量检测酶试剂中的质量分数及粒度，以及在WS2/C复合材料的制备方法中，部分物质的组成成分如表1所示：
表1 部分物质组成及含量表
Figure DEST_PATH_IMAGE010AA
实施例2~实施例9中其他步骤、参数以及条件均与实施例1中的凝血酶定量检测酶试剂的制备方法一致。
对比例1：
以实施例1为基础，省略加入多肽底物的步骤，在所述凝血酶定量检测酶试剂内仅加入WS2/C复合材料；其他步骤、参数以及条件均与实施例1中的凝血酶定量检测酶试剂的制备方法一致。
对比例2：
以实施例1为基础，省略加入WS2/C复合材料的步骤，在所述凝血酶定量检测酶试剂内不加入特定的电子媒介体；其他步骤、参数以及条件均与实施例1中的凝血酶定量检测酶试剂的制备方法一致。
对比例3：
以实施例1为基础，省略加入WS2/C复合材料的步骤，在所述凝血酶定量检测酶试剂内仅加入碳源；其他步骤、参数以及条件均与实施例1中的凝血酶定量检测酶试剂的制备方法一致。
对比例4：
以实施例1为基础，省略加入WS2/C复合材料的步骤，在所述凝血酶定量检测酶试剂内仅加入现有的WS2物质；其他步骤、参数以及条件均与实施例1中的凝血酶定量检测酶试剂的制备方法一致。
对比例5：
以实施例1为基础，省略加入丙烯酰胺和过硫酸铵的步骤；其他步骤、参数以及条件均与实施例1中的凝血酶定量检测酶试剂的制备方法一致。
对比例6：
选用市售的电化学检验仪及凝血酶定量检测卡。
将实施例1~实施例9与对比例1~对比例5中提供的14种制备方法制得的凝血酶定量检测酶试剂涂覆至凝血酶定量检测卡的电极基片1上的检测区域中，经烘干干燥后，贴附双面胶和亲水膜2.1，组装成凝血酶定量检测卡，分别对应实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6、实施例7、实施例8、实施例9、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4以及对比例5；具体的，所述烘干干燥的条件为：烘干温度为25-50℃，烘干时间为5~15min。
以实施例1为例，实施例1对应的凝血酶定量检测卡，参见图1，包括电极基片1与亲水膜层2，所述电极基片1上设有检测区域和绝缘层3，且所述检测区域上涂覆有凝血酶定量检测酶试剂；所述亲水膜层2包括亲水膜2.1和气孔2.2，所述气孔2.2设置在亲水膜2.1上，所述亲水膜2.1通过绝缘层3附着在电极基片1上；所述气孔2.2用于接收待测样品并使得待测样品流入检测区域中，所述亲水膜2.1用于待测样品的流动。具体的，所述电极基片1上还印刷有参比电极1.1、工作电极1.2以及对电极1.3，所述工作电极1.2设置于参比电极1.1与对电极1.3之间，且所述参比电极1.1、工作电极1.2以及对电极1.3的材质均为碳、银-碳、金或者钯-碳。
对实施例1~实施例9以及对比例1~对比例6对应的15种凝血酶定量检测卡进行检验，具体的检验过程如下：
将实施例1~实施例9以及对比例1~对比例6对应的15种凝血酶定量检测卡与配套电化学检验仪配合使用，首先在Hepes缓冲溶液中配置不同浓度梯度的凝血酶样本，所述凝血酶样本的浓度分别为0.5U/mL、1U/mL、2U/mL、3U/mL、4U/mL以及5U/mL，测试不同浓度的凝血酶样本的电流值和生理盐水，得到电流-浓度曲线方程，并计算其电流-浓度之间的灵敏度，数据见表2：
表2 灵敏度汇总表
Figure DEST_PATH_IMAGE012AA
其中，对比例5与对比例6的测试结果无数据显示，其机理在于：对比例5对应的凝血酶定量检测卡所涂覆的凝血酶定量检测酶试剂中未加入丙烯酰胺和过硫酸铵，因此在凝血酶定量检测酶试剂被涂覆至电极基片上时无法成膜，无法形成合格且完整的凝血酶定量检测卡；对比例6对应的凝血酶定量检测卡为市售的凝血酶定量检测卡，只能够显示最终结果，而不能够显示相应的电流均值，也就无法计算其灵敏度。
进一步的，根据表2中的凝血酶浓度值和测得的电流均值，对电流-浓度曲线方程进行拟合处理，得到一次性拟合曲线，所述一次性拟合曲线即为定码方程。将实施例1~实施例9以及对比例1~对比例6对应的定码方程输入至电化学检验仪中，对不同浓度的凝血酶样本进行测试，并记录测量结果，根据测量结果计算准确度以及精密度，数据见表3：
表3 不同浓度的凝血酶样本的测量结果
Figure DEST_PATH_IMAGE014AA
由表2和表3的分析结果表明，实施例1~实施例9对应的凝血酶定量检测卡与对比例1~对比例6对应的凝血酶定量检测卡相比，对凝血酶的浓度进行检测时的相对偏差保持在6.00%以内，精密度CV控制在5.00以内。
其中，对比例1、对比例2、对比例3以及对比例5对应的凝血酶定量检测卡无法检测到相应的凝血酶浓度，其机理在于：
①对比例1对应的凝血酶定量检测卡所涂覆的凝血酶定量检测酶试剂中未加入多肽底物，因此凝血酶无法对其进行特异性识别，故不能产生能够被WS2/C复合材料电催化的对硝基苯胺，无法形成电信号，从而不能对凝血酶进行定量检测；
②对比例2与对比例3对应的凝血酶定量检测卡所涂覆的凝血酶定量检测酶试剂中分别未加入特定的WS2/C复合材料以及仅加入了碳源而未加入WS2/C复合材料，因此，在凝血酶对凝血酶定量检测酶试剂中的多肽底物进行特异性识别并切割形成对硝基苯胺后，因凝血酶定量检测酶试剂中不含所述WS2/C复合材料，故无法将对硝基苯胺进行电催化，无法形成电信号，从而不能对凝血酶进行定量检测；
③对比例5对应的凝血酶定量检测卡所涂覆的凝血酶定量检测酶试剂中未加入丙烯酰胺和过硫酸铵，因此在凝血酶定量检测酶试剂被涂覆至电极基片上时无法成膜，无法形成合格且完整的凝血酶定量检测卡，从而不能对凝血酶进行定量检测。
对比例4对应的凝血酶定量检测卡的灵敏度和精密度不及于实施例1~实施例9，其机理在于：对比例4对应的凝血酶定量检测卡所涂覆的凝血酶定量检测酶试剂中仅加入了现有的WS2物质，虽然此时能够催化对硝基苯胺形成电信号，但是凝血酶定量检测酶试剂中不含有导电物质，如C基导电物质，因此也难以对凝血酶进行定量检测。
综上所述，采用本发明实施例1~实施例9提供的制备方法制得的凝血酶定量检测酶试剂具有较高的优越性，实施例1~实施例9所对应的凝血酶定量检测卡具有较高的灵敏度以及精密度。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种凝血酶定量检测酶试剂的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
步骤S1.1：向缓冲溶液中依次加入丙烯酰胺和过硫酸铵，溶解后得到第一混合溶液；其中，在第一混合溶液中：丙烯酰胺的质量分数为2~15%，过硫酸铵的质量分数为0.05~1.5%；
步骤S1.2：向第一混合溶液中依次加入多肽底物和稳定剂，得到第二混合溶液；其中，在第二混合溶液中：多肽底物的摩尔浓度为0.005~120mmol/L，稳定剂的质量分数为0.1~15%；
步骤S1.3：将WS2/C复合材料加入到水溶液中进行超声处理，再加入到第二混合溶液中，得到凝血酶定量检测酶试剂；其中，在凝血酶定量检测酶试剂中，所述WS2/C复合材料的质量分数为0.01~2%，且WS2/C复合材料的粒度分布范围为50nm~20um。
2.根据权利要求1所述的凝血酶定量检测酶试剂的制备方法，其特征在于，所述WS2/C复合材料的制备方法具体包括如下步骤：
步骤S2.1：将含硫有机物、含钨化合物以及碳源混合，得到混合料一；其中，在混合料一中，含硫有机物、含钨化合物以及碳源的摩尔比为
Figure DEST_PATH_IMAGE002AA
；
步骤S2.2：将混合料一加入到氨水溶液中，进行球磨处理，得到混合料二；其中，所述氨水溶液的质量浓度为5~20%，所述混合料一和氨水溶液的质量比为
Figure DEST_PATH_IMAGE004AA
；
步骤S2.3：将混合料二放置于惰性气体环境中，进行高温烧结处理，得到混合料三；
步骤S2.4：将混合料三加入到水溶液中，进行球磨处理，得到WS2/C复合材料；其中，混合料三和水溶液的质量比为
Figure DEST_PATH_IMAGE006AA
；在WS2/C复合材料中，碳源的质量含量为1~20%。
3.根据权利要求2所述的凝血酶定量检测酶试剂的制备方法，其特征在于，所述含硫有机物包括硫脲；所述含钨化合物包括偏钨酸胺；所述碳源包括硬脂酸。
4.根据权利要求2所述的凝血酶定量检测酶试剂的制备方法，其特征在于，步骤S2.2中，所述球磨时间为4~6h；步骤S2.3中，所述高温烧结处理的条件为：以5~15℃/min的升温速率，升温至800-1000℃的焙烧温度，保持恒温焙烧2~6h；步骤S2.4中，所述球磨时间为4~72h。
5.根据权利要求1所述的凝血酶定量检测酶试剂的制备方法，其特征在于，所述多肽底物为S-2238，所述稳定剂为多糖保护剂。
6.根据权利要求5所述的凝血酶定量检测酶试剂的制备方法，其特征在于，所述多糖保护剂为蔗糖保护剂、葡聚糖保护剂以及海藻糖保护剂中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的凝血酶定量检测酶试剂的制备方法，其特征在于，所述缓冲溶液包含Hepes缓冲液、Tris-Hcl缓冲液、TES缓冲液以及PBS缓冲液中的一种或者多种，且所述缓冲溶液的pH值为7.0~10.0。
8.根据权利要求1所述的凝血酶定量检测酶试剂的制备方法，其特征在于，还包括步骤S1.4：在凝血酶定量检测酶试剂中加入消泡剂；其中，在凝血酶定量检测酶试剂中，消泡剂的质量分数为0.02~1%。
9.一种凝血酶定量检测卡，其特征在于，包括电极基片（1）与亲水膜层（2），所述电极基片（1）上设有检测区域和绝缘层（3），且所述检测区域上涂覆有根据权利要求1-8任意一项制备方法制得的凝血酶定量检测酶试剂；所述亲水膜层（2）包括亲水膜（2.1）和气孔（2.2），所述气孔（2.2）设置在亲水膜（2.1）上，所述亲水膜（2.1）通过绝缘层（3）附着在电极基片（1）上。
10.根据权利要求9所述的凝血酶定量检测卡，其特征在于，所述电极基片（1）上印刷有参比电极（1.1）、工作电极（1.2）以及对电极（1.3），所述工作电极（1.2）设置于参比电极（1.1）与对电极（1.3）之间，且所述参比电极（1.1）、工作电极（1.2）以及对电极（1.3）的材质均为碳、银-碳、金或者钯-碳。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101365802A (zh) * 2005-10-28 2009-02-11 生物梅里埃股份公司 癌症检测方法
CN106680339A (zh) * 2016-12-28 2017-05-17 北京乐普医疗科技有限责任公司 一种基于电化学方法的凝血酶原时间测试卡及其制备方法
CN108273523A (zh) * 2018-04-02 2018-07-13 张逸强 一种抗凝血药物中间体的生产方法
CN112326613A (zh) * 2020-10-30 2021-02-05 北京林业大学 凝血酶含量的检测方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101365802A (zh) * 2005-10-28 2009-02-11 生物梅里埃股份公司 癌症检测方法
CN106680339A (zh) * 2016-12-28 2017-05-17 北京乐普医疗科技有限责任公司 一种基于电化学方法的凝血酶原时间测试卡及其制备方法
CN108273523A (zh) * 2018-04-02 2018-07-13 张逸强 一种抗凝血药物中间体的生产方法
CN112326613A (zh) * 2020-10-30 2021-02-05 北京林业大学 凝血酶含量的检测方法

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