CN114990167A - 一种利用酿酒酵母发酵生产乙醇的方法 - Google Patents

Abstract

本申请提供一种利用酿酒酵母发酵生产乙醇的方法，其包括如下步骤：提供具有初始葡萄糖浓度的发酵培养基；将酿酒酵母接种至发酵培养基中进行发酵以产生乙醇，并在发酵过程中监控发酵培养基中的葡萄糖浓度；在葡萄糖浓度降低至初始葡萄糖浓度的10％至50％的情况下，向发酵培养基补加浓度相当于初始葡萄糖浓度8.5％至8.9％的葡萄糖，在进行至少10次补加后结束发酵。本申请通过多次间歇式补加葡萄糖，使葡萄糖维持在设定浓度下进行发酵，降低副产物甘油产量，进行提高了目标产物乙醇的生产水平。

Description

一种利用酿酒酵母发酵生产乙醇的方法

技术领域

本申请涉及生物工程领域，具体涉及一种利用酿酒酵母发酵生产乙醇的方法。

背景技术

化石燃料的使用过程会向大气中释放温室气体如一氧化碳、二氧化碳等，对全球气候变化产生了巨大的影响。在过去的20年里，世界各国一直致力于开发与利用新的可持续能源来替代化石燃料，每个国家都在寻找更环保、更高效的替代燃料。燃料乙醇的应用和开发引起了全球的关注。燃料乙醇是当今世界上使用最多的液体生物燃料，与化石燃料相比，它可以将温室气体的排放量减少30％到85％，并有助于减少大气中颗粒物的产生，最高可减少50％。燃料乙醇与其他标准燃料混合，如汽油，可以减轻石油进口的压力。与标准化石燃料相比，燃料乙醇含有更高的氧，其燃烧过程更加清洁。因此，燃料乙醇的产量在过去20年中不断增加。但是，目前燃料乙醇在生产经济性上相较于化石燃料仍存在一定劣势。因此，开发高效的乙醇发酵过程优化与放大技术是实现低成本生产的重要举措。

目前已经有许多不同类型的乙醇发酵工艺，常用的发酵方式有分批发酵、连续发酵、补料分批发酵。其中，补料分批发酵可用于防止由于高初始底物浓度而引起的抑制。为此，在整个培养过程中，营养物质间歇地或连续地供应给生物反应器，以优化细胞生长，并在发酵过程中最大限度地提高产品产量，提高细胞生物量、提高生产率、减少底物或终产物抑制、降低培养液粘度和提高溶解氧速率。在酿酒酵母酒精发酵过程中，葡萄糖转化为乙醇和二氧化碳。发酵过程中的副产物如甘油、有机酸和羰基化合物的形成取决于酵母菌株、发酵培养基的成分和不同的发酵条件。

在酿酒酵母发酵过程中，底物控制在合适的浓度对发酵过程具有重要意义。底物浓度不足，会使酵母细胞生长较早达到平衡期，使得发酵提前结束，产物达不到理想浓度。反之，底物浓度过高将造成较高的渗透压不利于细胞生长，同时会产生更多副产物甘油。甘油是酿酒酵母生产乙醇的主要副产物，其作用主要在于调节渗透压以及维持细胞内的还原力平衡。在厌氧生长条件下，氧不能用于从NADH(还原型辅酶Ⅰ)再生NAD⁺(辅酶Ⅰ)；因此，在厌氧条件下，部分NAD⁺再生是通过将磷酸二羟丙酮还原为甘油-3-磷酸来实现的。酵母中甘油的这些重要作用给减少甘油产量带来了挑战。糖酵解过程中得到的磷酸二羟丙酮经过GPD和GPP两步的催化最终生成甘油，而GPD和GPP各有两个同工酶，其中GPD1和GPP2在高渗透压的时候被诱导表达，从而导致甘油产量上升。研究者通过构建缺失GPD1或GPD2，以及同时缺失两个基因的工程菌株以来阻断甘油形成路径中的关键步骤，但是这种工程菌株的生长速度会严重受阻。

因此，在不利用代谢工程手段敲除甘油合成途径条件下，如何使酿酒酵母尽可能避免产生副产物甘油，而尽可能产生乙醇是当前迫切要解决的问题。

发明内容

为解决上述问题，本申请提供一种利用酿酒酵母发酵生产乙醇的方法，在不敲除酿酒酵母的甘油发酵途径的前提下，降低副产物甘油的含量，进而提高乙醇产率。

本申请提供一种利用酿酒酵母发酵生产乙醇的方法，其包括如下步骤：

提供具有初始葡萄糖浓度的发酵培养基；

将酿酒酵母接种至所述发酵培养基中进行发酵以产生乙醇，并在发酵过程中监控所述发酵培养基中的葡萄糖浓度；在所述葡萄糖浓度降低至所述初始葡萄糖浓度的10％至50％的情况下，向所述发酵培养基补加浓度相当于所述初始葡萄糖浓度8.5％至8.9％的葡萄糖，在进行至少10次所述补加后结束所述发酵。

可选的，在本申请一些实施例中，所述初始葡萄糖浓度为80g/L-100g/L。

可选的，在本申请一些实施例中，在所述葡萄糖浓度降低至10g/L、30g/L或50g/L时进行所述补加。

可选的，在本申请一些实施例中，所述酿酒酵母的接种量为30％；和/或，所述酿酒酵母在进行所述接种时的OD₆₀₀为8-9；和/或，所述发酵的温度为30℃-32℃；和/或，所述发酵培养基在所述发酵过程中持续旋转，旋转的转速为150rpm-160rpm；和/或，所述发酵的总时间为27h-33h。

可选的，在本申请一些实施例中，所述补加的次数为20次-30次；和/或，所述监控的频率为每5至10分钟一次。

可选的，在本申请一些实施例中，所述监控的频率为每5至10分钟一次；和/或，所述监控包括如下步骤：

从所述发酵培养基中取发酵液样品，对所述发酵液样品进行离心处理，取上清经过滤膜过滤后，稀释成待测样品；

利用检测柱测定所述待测样品，获得当前所述发酵培养基中的葡萄糖浓度以及目标产物乙醇浓度和副产物甘油浓度。

可选的，在本申请一些实施例中，利用检测柱测定所述待测样品，其中，

流动相流速为0.6mL/min；检测温度为50℃，进样量为15μL；和/或，流动相为5mM的稀硫酸。

可选的，在本申请一些实施例中，每次进行所述补加的葡萄糖的浓度相当于所述初始葡萄糖浓度8.81％至8.85％。

可选的，在本申请一些实施例中，在将所述酿酒酵母接种于发酵培养基之前，还包括：培养得到所述酿酒酵母，所述培养的过程包括：

取活化后的酿酒酵母菌种的单菌落，接种于种子培养基上，在转速为210rpm-230rpm，温度为28℃-32℃的培养条件下进行培养，培养的时间13h-15h，得到所述酿酒酵母；和/或，

所述种子培养基的成分包括：KH₂PO₄ 8g/L-12g/L，MgSO₄·7H₂O 0.8g/L-1.2g/L，酵母提取物3g/L-7g/L，CaCl₂ 0.08g/L-0.12g/L，(NH₄)₂SO₄ 4.5g/L-5.5g/L，葡萄糖38g/L-42g/L。

可选的，在本申请一些实施例中，所述发酵培养基的成分包括：蛋白胨3g/L-7g/L，酵母提取物15.5g/L-17g/L，KH₂PO₄ 0.8g/L-1.2g/L，尿素0.3g/L-0.65g/L，葡萄糖80g/L-100g/L。

本申请具有以下一种或多种有益效果：

本申请，利用酿酒酵母发酵生成乙醇，发酵过程中通过间歇式多次补充葡萄糖，监测并调控葡萄糖浓度使其始终维持在一指定浓度下(30g/L-50g/L)进行发酵生产乙醇，降低了副产物甘油的产量，进而提高目标产物乙醇的产量。

本申请，通过控制葡萄糖浓度以提高酿酒酵母发酵乙醇的产量，填补了葡萄糖浓度对酿酒酵母发酵乙醇影响研究中的空白。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本申请的实验例与对照例发酵过程中葡萄糖浓度参数变化示意图；

图2是本申请的实验例与对照例发酵过程中OD₆₀₀参数变化示意图；

图3是本申请的实验例与对照例发酵过程中乙醇浓度参数变化示意图；

图4是本申请的实验例与对照例发酵过程中甘油浓度参数变化示意图；

图5是本申请的实验例与对照例发酵过程中菌体干重参数拟合曲线示意图；

图6是本申请的实验例与对照例发酵过程中乙醇浓度参数拟合曲线示意图；

图7是本申请的实验例与对照例发酵过程中胞内PDC酶活性变化示意图；

图8是本申请的实验例与对照例发酵过程中胞内ADH酶活性变化示意图；

图9是本申请的实验例与对照例发酵过程中胞内GPD酶活性变化示意图；

图10是本申请的实验例与对照例发酵过程中胞内GPP酶活性变化示意图。

具体实施方式

下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本申请保护的范围。此外，应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本申请，并不用于限制本申请。在本申请中，在未作相反说明的情况下，使用的方位词如“上”、“下”、“左”、“右”通常是指装置实际使用或工作状态下的上、下、左和右，具体为附图中的图面方向。

本申请提供一种利用酿酒酵母发酵生产乙醇的方法，以下分别进行详细说明。需要说明的是，以下实施例的描述顺序不作为对本申请实施例优选顺序的限定。且在以下实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详述的部分，可以参见其它实施例的相关描述。

本申请实施例提供一种利用酿酒酵母发酵生产乙醇的方法，其步骤如下：

S1，提供具有初始葡萄糖浓度的发酵培养基。初始葡萄糖浓度为80g/L-100g/L。

在一些实施例中，发酵培养基的成分包括：蛋白胨3g/L-7g/L，酵母提取物15.5g/L-17g/L，KH₂PO₄ 0.8g/L-1.2g/L，尿素0.3g/L-0.65g/L，葡萄糖80g/L-100g/L。在一具体示例中，发酵培养基的成分包括：蛋白胨5g/L，酵母提取物16.5g/L，KH₂PO₄ 1g/L，尿素0.5g/L，葡萄糖100g/L。可以采用以下方法配制发酵培养基：在发酵罐内配制发酵培养基。需要说明的是，将葡萄糖与发酵培养基中的其他物质分开配制，以防止葡萄糖与氮源等物质在高温条件下发生反应。在发酵罐中配制葡萄糖溶液，称一水合葡萄糖660g，用去离子水溶解后定容到1.7L装于5L罐中，115℃，20min灭菌。将蛋白胨15g、酵母提取物49.5g,、KH₂PO₄ 6g和尿素4.5g分别用去离子水定容到400ml，在121℃温度下，灭菌30min，后再加入发酵罐内与葡萄糖溶液混合均匀后，得到发酵培养基。

S2,将酿酒酵母接种至发酵培养基中进行发酵以产生乙醇，并在发酵过程中监控发酵培养基中的葡萄糖浓度；在葡萄糖浓度降低至初始葡萄糖浓度的10％至50％的情况下，向发酵培养基补加浓度相当于初始葡萄糖浓度8.5％至8.9％的葡萄糖，在进行至少10次补加后结束发酵。

需要说明的是，S2步骤中，酿酒酵母(S.cerevisiae B1)是来自国家生化工程技术研究中心(上海)的保藏菌株。在发酵过程中，当葡萄糖浓度从初始葡萄糖浓度为80g/L-100g/L耗至8g/L-50g/L时，例如，具体为10g/L、30g/L、50g/L、40g/L或50g/L的任一浓度时。第一次向发酵培养基补加葡萄糖的浓度为6.8g/L-8.9g/L，使发酵培养基的葡萄糖浓度维持于8g/L-50g/L继续发酵；当再次快耗至相应浓度时，再次补加与第一次补加相同浓度的葡萄糖浓度，继续发酵；依照上述步骤，进行至少10次间歇式补加相同浓度的葡萄糖，使得发酵罐中总糖为285g/L，结束发酵。在另一些实施例中，酿酒酵母的接种量为30％；和/或，酿酒酵母在进行接种时的OD₆₀₀为8-9，菌体处在对数生长期，更适宜接入发酵，最优选的OD₆₀₀为8。和/或，发酵的温度为30℃-32℃，最优选的发酵的温度为30℃；转速为150rpm-160rpm；最优选的转速为150rpm。和/或，补加的次数为20次-30次，最优选的补加次数为21次；和/或，发酵的总时间为27h-33h。

在本申请一些实施例中，在葡萄糖浓度降低至10g/L、30g/L或50g/L时进行补加。维持发酵过程葡萄糖浓度分别为10g/L、30g/L或50g/L，降低了副产物甘油的产量，提高了乙醇的生成速率，缩短了发酵时间，有利于促进发酵过程中产物乙醇生成进程，从而提高乙醇产量。

在本申请一些实施例中，监控的频率为每5至10分钟一次。

监控包括如下步骤：

从发酵培养基中取发酵液样品，对发酵液样品进行离心处理，弃去下层菌体，取上清经过滤膜过滤后，稀释一定倍数形成待测样品，待测。在具体实施时，可以取2mL发酵液样品。离心处理可以采用以下处理参数：转速为12000rpm，时间为5min。采用0.22μm过滤膜进行过滤。

利用检测柱测定待测样品，检测柱为Aminex HPX-87H，使用示差折光检测器进行乙醇、甘油和葡萄糖浓度的测定，获得当前发酵培养基中的葡萄糖浓度以及目标产物乙醇浓度和副产物甘油浓度。在另一些实施例中，利用检测柱测定待测样品，配制5mM的稀硫酸作为流动相，流动相流速为0.6mL/min，检测温度为50℃，进样量定为15μL。需要说明的是，配制的流动相，在使用前需要进行抽滤和超声，超声时长为30min。

在本申请一些实施例中，每次进行补加的葡萄糖的浓度相当于初始葡萄糖浓度8.81％至8.85％。最优选地，每次补加葡萄糖的浓度为8.81g/L。

在本申请一些实施例中，在将酿酒酵母接种于发酵培养基之前，还包括：培养得到酿酒酵母，培养的过程包括：

取活化后的酿酒酵母菌种的单菌落，接种于种子培养基上，在转速为210rpm-230rpm，温度为28℃-32℃的培养条件下进行培养，培养的时间13h-15h，得到酿酒酵母；最优选的培养条件：转速为220rpm，温度为30℃。培养时间为14h。在一具体示例中，采用250ml的摇瓶，装液量为100ml进行种子培养。从固体平板中挑取一个单菌落，接种入摇瓶中。固体平板培养基的成分包括：KH₂PO₄ 10g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，酵母提取物5g/L，CaCl₂ 0.1g/L，(NH₄)₂SO₄ 5g/L，琼脂20g/L和葡萄糖40g/L。在一实施例中，采用以下步骤活化酿酒酵母菌种：在超净台中，取0.3g酿酒酵母菌粉溶于10ml的无菌水中，待酿酒菌粉充分溶解后，将其用无菌水梯度稀释至106，取40μL涂布于固体平板上，将其在30℃培养箱中培养33h，取出后保存在4℃冰箱中。

种子培养基的成分包括：KH₂PO₄ 8g/L-12g/L，MgSO₄·7H₂O 0.8g/L-1.2g/L，酵母提取物3g/L-7g/L，CaCl₂ 0.08g/L-0.12g/L，(NH₄)₂SO₄ 4.5g/L-5.5g/L，葡萄糖38g/L-42g/L。在一具体示例，种子培养基的成分包括：KH₂PO₄10g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，酵母提取物5g/L，CaCl₂ 0.1g/L，(NH₄)₂SO₄ 5g/L和葡萄糖40g/L。种子培养基采用以下方法配制：称取一水合葡萄糖52.8g，用去离子水溶解后定容到240ml，分装20ml于50ml离心管中,115℃，20min灭菌。将KH₂PO₄ 12g，MgSO₄·7H₂O 1.2g，酵母提取物6g，CaCl₂ 0.12g，(NH₄)₂SO₄ 6g用去离子水溶解后定容至960ml，分装80ml于250ml摇瓶中，121℃，30min灭菌。需要说明的是，因葡萄糖与种子培养基中其他物质在高温条件下会发生反应，所以需要将葡萄糖溶液单独配制。在使用种子培养基时，将灭菌的葡萄糖加入摇瓶中混合均匀后即可使用。

为使本发明上述实施细节和操作能清楚地被本领域技术人员理解，以及本发明实施例的利用酿酒酵母发酵生产乙醇的方法的进步性能显著的体现，以下通过多个实验例和对照例来举例说明上述技术方案。

实验例1

提供一种利用酿酒酵母发酵生产乙醇的方法，具体步骤如下：

配制如下表1中的试验组的培养基：

表1

菌种活化:

在超净台中，取0.3g酿酒酵母菌粉溶于10ml的无菌水中，待菌粉充分溶解后，将其用无菌水梯度稀释至106，取40μL涂布于固体平板上，将其在30℃培养箱中培养33h，取出后保存在4℃冰箱中。

种子培养：

采用250ml的摇瓶，装液量为100ml进行种子培养。从固体平板中挑取一个单菌落，接入摇瓶中。在转速为220rpm，温度为30℃的培养条件下进行培养。培养14h后，测量此时，种子的OD₆₀₀,此时菌体处在对数生长期，OD₆₀₀为8左右，比较适合接入发酵培养基1发酵。

发酵罐培养：

将培养的种子接种至发酵培养基1中进行发酵，接种量为30％，在温度为30℃，转速为150rpm条件下进行发酵。采用多次间歇性补加葡萄糖的补料分批发酵过程，初始葡萄糖浓度为100g/L，待其耗至10g/L时，补加葡萄糖8.81g/L，再次快耗至10g/L浓度时，再次补加葡萄糖8.81g/L，共补加21次葡萄糖，使得发酵罐中总糖为285g/L。

实验例2

本实验例与实验例1不同的是，在葡萄糖浓度降低至30g/L进行补加，使葡萄糖的浓度维持在30g/L发酵。其余实验步骤及条件均与实验例1相同。

实验例3

本实验例与实验例1不同的是，在葡萄糖浓度降低至50g/L进行补加，使葡萄糖的浓度维持在50g/L发酵。其余实验步骤及条件均与实验例1相同。

对照例

提供一种现有相关的利用酿酒酵母发酵生产乙醇的方法，具体步骤如下：

配制如下表2中的对照例的培养基：

对照例的菌种活化、种子培养的步骤均与实验例1完全相同，故不在此赘述。对照例的发酵罐培养的接种量及发酵条件均与实验例1相同，不同的是采用葡萄糖的初始浓度为285g/L的分批发酵过程。

1、对实验例1-3和对照例进行细胞干重(DCW)测定：

分别取10mL发酵液样品，4℃、4000rpm条件下离心5min，去除上清液，收集菌体。用10mL去离子水重悬菌体，再次离心，弃去上清液后，重复重悬两次后收集菌体。将其放置于65℃烘箱中烘干，至到菌体达到恒重后，用分析天平称重。DCW计算公式如下：

2、对实验例1-3和对照例进行光密度测定：

分光光度仪的线性范围在0.2-0.8之间，因此发酵液样品需要用蒸馏水稀释一定比例后，才能测定，不同时间稀释的倍数不同，需要根据菌浓来判断。用分光光度计的测定波长为600nm，OD₆₀₀计算公式如下：

OD₆₀₀＝吸光值×稀释倍数。

具体测定结果请参见图2所示。

3、对实验例1-3和对照例进行发酵动力学分析：

1)使用logistic方程对菌体干重进行拟合，从而描述菌体的生长情况。

公式如下：

式中，X(t):菌体浓度，X₀:菌体初始浓度，X_m:菌体最大浓度，μ_m:最大比生长速率。具体分析结果请参见图5所示。

2)产物乙醇的拟合采用Luedeking-Piret动力学模型，经整合后得到公式：

式中，P(t)：产物乙醇浓度，P₀：初始乙醇浓度，α：菌体生长相关的产物形成系数，β：菌体生长无关的产物形成系数。具体分析结果请参见图6所示。

4、对实验例1-3和对照例进行细胞内关键酶活性的测定：

1)细胞粗酶液制备：

取5ml发酵液样品在4℃，4000rpm条件下离心5min弃去上清。菌体用5ml 50mMTris-HCl缓冲液重悬3次,3次离心条件均为4℃，4000rpm。收集的菌体用1ml 50mM Tris-HCl进行富集。加入500μl的玻璃珠。使用冷冻研磨仪进行破碎，破碎参数及周期为65Hz，180s。破碎后，于4℃，12000rpm条件下离心10min后收集上清，待测。

2)酶活测定：

使用酶联免疫试剂盒对合成甘油步骤中的两个关键酶甘油磷酸酶(GPP)和甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)和生成乙醇途径中的乙醇脱氢酶(ADH)和丙酮酸脱羧酶(PDC)进行酶活测定。本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中四种关键酶的活性。用纯化的酶捕获抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被的微孔中依次加入待测酶，再与辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物3，3，5，5-四甲基联苯胺(TMB)显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的酶活性呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算样品中的酶活性，计算结果请参见图7-图10所示，将酶活除以样品的菌体干重即为单位菌体的酶活。

对上述实验例1-3和对照例的上述测定结果进行分析：

1、不同糖浓度对乙醇发酵过程的影响。

对照例为初始葡萄糖浓度为285g/L的分批发酵过程。实验例1、实验例2和实验例3均为多次间歇性补糖的补料分批发酵过程，实验例1、实验例2和实验例3的葡萄糖的初始浓度均为100g/L，维持过程葡萄糖浓度分别为10g/L、30g/L、50g/L，如图1所示。

实验例1、实验例2和实验例3的补糖策略通过分多次间歇式补加葡萄糖，能够很好地缓解发酵初期高底物浓度抑制。从而显著提高菌体生长速率和最终的生物量，三者的稳定期分别维持10g/L、30g/L、50g/L葡萄糖浓度，实验例1、实验例2和实验例3的菌浓分别是对照例的1.06倍、1.13倍和1.17倍，如图2所示。

由图3可知，实验例1、实验例2和实验例3分别维持10g/L、30g/L、50g/L葡萄糖浓度的乙醇产量分别为138.68g/L、139.33g/L、133.80g/L，对比对照例(131.80g/L)，乙醇产量分别提高了5.2％、5.7％、1.5％。同时，通过计算乙醇的生产速率，可以发现其值从对照例的3.35g/L/h，维持10g/L、30g/L、50g/L的不同糖浓度，分别提高到了4.21g/L/h、4.39g/L/h、4.89g/L/h，增加幅度达到25.7％、31.0％、46.0％。

除此以外，主要副产物甘油的浓度有了明显变化。由图4可知，实验例1、实验例2和实验例3的甘油的最终产量较对照例有明显下降，维持10g/L、30g/L、50g/L糖浓度的甘油浓度分别为6.13g/L、5.86g/L、5.92g/L，仅为对照例(11.45g/L)的53.5％、51.2％、51.7％。说明了实验例2维持30g/L糖浓度的发酵批次对于降低副产物甘油的作用更为明显。

通过对比葡萄糖消耗和乙醇生产也可以看出，实验例1、实验例2和实验例3分别维持10g/L、30g/L、50g/L葡萄糖浓度的补糖批次比对照例加快葡萄糖的消耗，缩短整体发酵时间，维持10g/L、30g/L、50g/L葡萄糖浓度的发酵时间从39h分别缩短为33h、32h、27h。

2、不同糖浓度下的发酵动力学分析。

通过对实验例1-3和对照例的细胞生长曲线进行Logistic拟合，如图5所示，可以发现维持10g/L、30g/L、50g/L不同葡萄糖浓度的最大比生长速率μ_m分别为0.54h^-1、0.50h^-1、0.46h^-1，三种葡萄糖浓度的μ_m较对照例(0.42h^-1)都有所增长，其中实验例1维持10g/L葡萄糖浓度的μ_m最高。另一方面，对实验例1-3和对照例的乙醇生产曲线进行Luedeking-Piret拟合后，可以发现乙醇合成是一个生长非常相关的过程，实验例1-3和对照例的生长相关系数α都要远远大于非生长相关系数β(如图6所示)。实验例1-3的α值大于对照例的α值，说明在补糖条件下，乙醇的生产和细胞生长更相关。在实验例1-3补糖批次中，实验例3维持30g/L葡萄糖浓度的α值更大，β值更小。

通过对比维持不同糖浓度下的宏观代谢特性及发酵动力学分析，可以看出实验例2维持30g/L葡萄糖浓度的补糖发酵具有更高的乙醇产量，甘油也为三者最低。同时菌浓也高于实验例1维持10g/L葡萄糖浓度。通过综合比较，乙醇发酵生产期实验例2维持30g/L糖浓度更利于细胞利用碳源，生产更多乙醇，降低副产物甘油的产生。因此后续细胞特性研究选用维持30g/L糖浓度进行下一步葡萄糖调控策略对胞内关键酶活性的影响研究。

3、葡萄糖调控策略对胞内关键酶活性的影响。

实验例2维持30g/L葡萄糖控糖批次下和对照例相比，在宏观上，乙醇产量提升，副产物甘油产量也有了明显下降。通过对酿酒酵母中心碳代谢途径进行分析，1分子的葡萄糖经过糖酵解途径可以生成2分子的丙酮酸，丙酮酸在丙酮酸脱羧酶(PDC)和乙醇脱氢酶(ADH)的作用下生成乙醇；同时磷酸二羟丙酮(DHAP)作为糖酵解的中间产物，其可在甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)和甘油磷酸酶(GPP)的作用下合成副产物甘油。因此，PDC、ADH、GPD和GPP是酿酒酵母发酵生成乙醇过程的关键酶。

在30g/L实验例2和对照例条件下，对上述4种关键酶的酶活进行时序测定，结果如图7-图10所示。两种条件下胞内乙醇合成途径两种关键酶PDC和ADH的活性变化趋势相同，实验例2的PDC和ADH的酶活和对照例相比数值相差不大。都是在发酵初期酶活迅速下降，到生产期后，酶活力保持平稳。但是对于甘油合成途径中的关键酶GPD和GPP，实验例2的GPP和GPD酶活性整体要低于对照例，且酶活稳定的拐点补糖批次要早于对照例。两种酶的活力在对照例和实验例2的总体趋势相同。快速生长期(前10小时)，GPD和GPP酶的活性迅速下降。而后在生产期酶活保持稳定，都维持在较低状态，直至发酵终点。通过对比酶活，更好的说明了实验例2补糖批次中副产物甘油降低的原因，同时也说明生长期是甘油合成的主要时期。

综上所述，结果表明多次间歇式补加葡萄糖下，乙醇产量比对照例有所提升，甘油浓度也比对照例有所降低。

目前对于酿酒酵母生产期发酵乙醇最适糖浓度的研究几乎是空白的。上述实验例通过比较通过补糖将葡萄糖维持在不同浓度下(10g/L，30g/L和50g/L)的乙醇产量及副产物甘油的生成量。探究最适乙醇发酵的葡萄糖浓度。结果表明，不同的补糖策略均对乙醇产量提高，副产物甘油下降具有作用。经过宏观数据的多方面比较，维持30g/L的糖浓度为最优浓度，可将乙醇产量从131.80g/L提高至139.33g/L，并且副产物甘油浓度(5.86g/L)仅为对照例的51.2％。后续又通过对发酵过程宏观动力学分析以及胞内四种关键酶的活性进行测定，可以得出乙醇产量的提高一方面因为乙醇发酵是生长相关型发酵，产物形成与底物利用直接相关，低糖浓度可以很好的缓解初始高糖浓度的抑制作用，有助于酵母细胞更好的生长，促使乙醇的生成。另一方面低糖浓度使得胞内维持更低的甘油合成途径关键酶活性，使得更多碳源流向乙醇。

上述实施例提供了一种新的通过控制葡萄糖浓度利用酿酒酵母发酵乙醇的方式，填补了葡萄糖浓度对酿酒酵母乙醇发酵影响研究中的空白。利用酿酒酵母，在初糖浓度一样的条件下，通过补料维持不同葡萄糖浓度，探究其对酿酒酵母发酵生产乙醇和合成甘油的影响，并结合发酵过程宏观动力学、胞内关键酶活性，系统解析酿酒酵母细胞在不同糖浓度下的代谢变化和规律，以期指导合适过程调控策略的开发，降低副产物甘油含量，进而提高乙醇生产水平。

以上对本申请进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本申请的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本申请的限制。

Claims (10)

1.一种利用酿酒酵母发酵生产乙醇的方法，其特征在于，

包括如下步骤：

提供具有初始葡萄糖浓度的发酵培养基；

将酿酒酵母接种至所述发酵培养基中进行发酵以产生乙醇，并在发酵过程中监控所述发酵培养基中的葡萄糖浓度；在所述葡萄糖浓度降低至所述初始葡萄糖浓度的10％至50％的情况下，向所述发酵培养基补加浓度相当于所述初始葡萄糖浓度8.5％至8.9％的葡萄糖，在进行至少10次所述补加后结束所述发酵。

2.根据权利要求1所述的利用酿酒酵母发酵生产乙醇的方法，其特征在于，所述初始葡萄糖浓度为80g/L-100g/L。

3.根据权利要求2所述的利用酿酒酵母发酵生产乙醇的方法，其特征在于，在所述葡萄糖浓度降低至10g/L、30g/L或50g/L时进行所述补加。

4.根据权利要求1所述的利用酿酒酵母发酵生产乙醇的方法，其特征在于，所述酿酒酵母的接种量为30％；和/或，

所述酿酒酵母在进行所述接种时的OD₆₀₀为8-9；和/或，

所述发酵的温度为30℃-32℃；和/或，

转速为150rpm-160rpm；和/或，

所述发酵的总时间为27h-33h。

5.根据权利要求1所述的利用酿酒酵母发酵生产乙醇的方法，其特征在于，所述补加的次数为20次-30次；和/或，

所述监控的频率为每5至10分钟一次。

6.根据权利要求1所述的利用酿酒酵母发酵生产乙醇的方法，其特征在于，所述监控包括如下步骤：

从所述发酵培养基中取发酵液样品，对所述发酵液样品进行离心处理，取上清经过滤膜过滤后，稀释成待测样品；

利用检测柱测定所述待测样品，获得当前所述发酵培养基中的葡萄糖浓度以及目标产物乙醇浓度和副产物甘油浓度。

7.根据权利要求6所述的利用酿酒酵母发酵生产乙醇的方法，其特征在于，利用检测柱测定所述待测样品，其中，流动相流速为0.6mL/min；检测温度为50℃，进样量为15μL；

和/或，流动相为5mM的稀硫酸。

8.根据权利要求1所述的利用酿酒酵母发酵生产乙醇的方法，其特征在于，每次进行所述补加的葡萄糖的浓度相当于所述初始葡萄糖浓度8.81％至8.85％。

9.根据权利要求1-8任一项所述的利用酿酒酵母发酵生产乙醇的方法，其特征在于，在将所述酿酒酵母接种于发酵培养基之前，还包括：培养得到所述酿酒酵母，所述培养的过程包括：

取活化后的酿酒酵母菌种的单菌落，接种于种子培养基上，在转速为210rpm-230rpm，温度为28℃-32℃的培养条件下进行培养，培养的时间13h-15h，得到所述酿酒酵母；和/或，

所述种子培养基的成分包括：KH₂PO₄8 g/L-12g/L，MgSO₄·7H₂O 0.8g/L-1.2g/L，酵母提取物3g/L-7g/L，CaCl₂0.08 g/L-0.12g/L，(NH₄)₂SO₄4.5 g/L-5.5g/L，葡萄糖38g/L-42g/L。

10.根据权利要求1-8任一项所述的利用酿酒酵母发酵生产乙醇的方法，其特征在于，所述发酵培养基的成分包括：蛋白胨3g/L-7g/L，酵母提取物15.5g/L-17g/L，KH₂PO₄0.8 g/L-1.2g/L，尿素0.3g/L-0.65g/L，葡萄糖80g/L-100g/L。

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