CN114989191A

CN114989191A - 利福平半抗原、完全抗原及其合成与应用

Info

Publication number: CN114989191A
Application number: CN202210842365.3A
Authority: CN
Inventors: 吴迪; 陈智卿; 赵荣茂; 杨晓霞; 李川敏; 李金戈
Original assignee: Beijing Nabai Bio Tech Co ltd
Current assignee: Beijing Nabai Bio Tech Co ltd
Priority date: 2022-07-18
Filing date: 2022-07-18
Publication date: 2022-09-02

Abstract

本发明公开了利福平半抗原、完全抗原及其合成与应用。利福平半抗原的结构如式

所示。本发明提供的利福平完全抗原能充分暴露利福平的抗原决定簇，并保持利福平的空间构象，具有较好的免疫原性。本发明提供的利福平单克隆抗体以利福平完全抗原为免疫原制备得到，具有特异性强、灵敏度高等特点，可作为酶联免疫检测和胶体金免疫检测的原料。

式

。

Description

利福平半抗原、完全抗原及其合成与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种利福平半抗原、完全抗原及其合成与应用。

背景技术

利福平（Rifampin），CAS：13292-46-1，为利福霉素类半合成广谱抗菌药，对多种病原微生物均有抗菌活性。该药对结核分枝杆菌和部分非结核分枝杆菌（包括麻风分枝杆菌等）在宿主细胞内外均有明显的杀菌作用。利福平对需氧革兰阳性菌具良好抗菌作用，包括葡萄球菌产酶株及甲氧西林耐药株、肺炎链球菌、其他链球菌属、肠球菌属、李斯特菌属、炭疽杆菌、产气荚膜杆菌、白喉杆菌、厌氧球菌等。

利福平是安莎霉素抗生素家族的一个子类别，是一组由细菌Amycolatopsisrifamycinica天然合成或人工合成的抗生素。利福平对分枝杆菌特别有效，并且因此用于治疗结核病、麻风和鸟分枝杆菌复合群（MAC）感染。利福霉素类抗生素抑制细菌RNA聚合酶（RNAP），并对金黄色葡萄球菌具有有效的活性。然而，使用这类抗生素的单一疗法可能导致在治疗期间选择出耐受群体。因此，利福霉素抗生素可以与一线抗生素联合使用以改善预后，通常用于涉及假肢或外来装置的感染。

正因为利福平为广谱抗菌药，除了能杀灭代谢旺盛的活泼结核杆菌还能杀死静止期的结核菌。我国水产禁药名单中并没有利福平，在水产养殖过程中，添加兽药利福平可降低各种淡、海水鱼类的败血症、肿嘴病溃烂病、肠道病、烂鳃病和虾、蟹红体病等细菌性疾病。但利福平在养殖中会有耐药性和药残问题，而出口水产品养殖全程是不能使用利福平的。对于人类而言，长期食用含利福平的水产品也可能会使人体内利福平沉积。

同时，利福平作为一种药物长期使用也会有副作用，如对肝脏有一定毒性；胃肠道反应如恶心、呕吐、腹痛、腹泻；过敏反应如皮疹、药热；神经系统反应、头痛、视力模糊、嗜睡、肢体麻木；有酶促作用，可使双香豆素类抗血凝药、口服降糖药、洋地黄类、皮质激素、氨苯砜等药物加速代谢而降效；长期服用本品，可降低口服避孕药的作用而导致避孕失败。

因此，对利福平含量的高效、快速检测具有重要的意义。目前抗菌药的检测方法主要有化学发光免疫分析法（CLIA）、酶联免疫吸附法（ELISA）、放射免疫法（RIA）及胶体金免疫层析测定法（GICT）。采用CLIA、ELISA方法分析具有较低的检测限，但仪器检测操作复杂，费用昂贵，无法达到现场规模快速检测的要求。采用RIA方法容易造成放射污染。而免疫分析方法具有成本低，效率高，灵敏度高，对技术人员要求相对低等优点，适用于大量样品的快速检测。

发明内容

为此，本发明提供一种利福平半抗原、完全抗原及其合成与应用。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

根据本发明实施例的第一方面，提供一种利福平半抗原，所述利福平半抗原的结构如式I所示，

式

。

根据本发明实施例的第二方面，提供制备如上所述的利福平半抗原的方法，利福平与赖氨酸在碱存在的条件下，于有机溶剂中进行羟氨基化反应。

进一步地，所述碱为吡啶。

进一步地，所述有机溶剂为甲醇。

进一步地，所述利福平、赖氨酸与碱的质量体积比为1g：200-300mg：1-3ml。

进一步地，所述羟氨基化反应的温度为60-70℃，时间为12-18h。

在一些具体的实施例中，所述方法包括：

将利福平溶解于甲醇中，缓慢加入赖氨酸，搅拌10min，加入吡啶，于65℃下反应15h，加入冰水淬灭，调节pH至3，乙酸乙酯萃取，FLASH纯化，得所述利福平半抗原，其中，利福平、赖氨酸与吡啶的质量体积比为1g：256mg：2ml。

根据本发明实施例的第三方面，提供一种利福平完全抗原，由如上所述的利福平半抗原与载体蛋白偶联制得，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、血蓝蛋白或鸡卵白蛋白中的任一种。

根据本发明实施例的第四方面，提供一种制备如上所述的利福平完全抗原的方法，当所述载体蛋白为牛血清白蛋白时，所述方法包括：

将所述利福平半抗原、SMCC溶解于CB缓冲液中，搅拌0.5-1h，得第一溶液；

将牛血清白蛋白溶解于CB缓冲液中，搅拌0.5-1h，得第二溶液；

将所述第二溶液缓慢滴加到第一溶液中，搅拌3-5h，透析，得所述利福平完全抗原。

在一些优选的实施例中，所述CB缓冲液的浓度为0.4-0.6mol/L，pH值为7.0-8.0，更优选地，所述CB缓冲液的浓度为0.5mol/L，pH值为7.4，更有利于促进利福平完全抗原与牛血清白蛋白偶联反应。

根据本发明实施例的第五方面，提供一种制备如上所述的利福平完全抗原的方法，当所述载体蛋白为血蓝蛋白或鸡卵白蛋白时，所述方法包括：

将所述利福平半抗原溶解于甲醇中，缓慢滴加三乙胺，搅拌0.4-1h，加入氯甲酸异丁酯，搅拌1-3h之后加入血蓝蛋白或鸡卵白蛋白，搅拌3-5h，透析，得所述利福平完全抗原。

根据本发明实施例的第六方面，提供一种利福平单克隆抗体，由如上所述的利福平半抗原或如上所述的利福平完全抗原制备得到。

根据本发明实施例的第七方面，提供如上所述的利福平单克隆抗体在检测利福平中的应用。

本发明具有如下优点：

1、本发明提供的利福平半抗原在利福平结构的萘环酚羟基衍生出具有特定长度，同时含有活性基团-COOH、-NH₂的连接臂，该半抗原与载体蛋白连接后，所得完全抗原能充分暴露利福平的抗原决定簇，并保持利福平的空间构象，具有较好的免疫原性。

2、本发明提供的利福平单克隆抗体以利福平完全抗原为免疫原制备得到，具有特异性强、灵敏度高等特点，可作为酶联免疫检测和胶体金免疫检测的原料。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

图1为本发明实施例提供的利福平半抗原LCMS图谱；

图2为本发明实施例提供的利福平半抗原的HNMS图谱；

图3为本发明实施例提供的BSA、OVA、利福平-BSA、利福平-OVA的紫外全波长扫描结果。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

利福平半抗原的制备

利福平半抗原的结构如式I所示：

式

合成路线如下：

称取1g利福平，用12ml MeOH溶解，缓慢加入256mg赖氨酸，搅拌10min，滴加2ml吡啶，65℃反应15h。LCMS监测，加入冰水淬灭，调节pH至3，乙酸乙酯萃取，收集有机相，干燥，FLASH纯化，极性：DCM:MEOH=1:1，干燥，得到153mg半抗原，纯度为95%。

LCMS图谱及HNMS图谱分别见图1和图2，表明所得半抗原即为式

所示结构的利福平半抗原。

实施例2

利福平完全抗原的制备

1、福平半抗原-牛清蛋白偶联物（利福平-BSA）的制备

合成路线如下：

(1)称取实施例1的利福平半抗原50mg，溶解于1ml CB缓冲液（0.5 mol/L，pH为7.4）中，加入17mg SMCC，室温搅拌1h。

(2)称取150mg BSA，溶解至2ml CB缓冲液（0.5mol/L，pH为7.4）中，室温反应1h。

(3)将步骤(2)所得活化好的BSA缓慢滴加至步骤(1)所得含有利福平半抗原和SMCC的混合体系中，室温搅拌4h。

(4)用0.01mol/L，pH=7.2的CB缓冲液透析，两小时换一次缓冲溶液，4度透析48h，得到利福平半抗原-牛清蛋白偶联物（利福平-BSA）。

2、利福平半抗原-血蓝蛋白偶联物（利福平-KLH）的制备

(1)称取实施例1的利福平半抗原3mg，溶解于500μl的甲醇中，缓慢滴加三乙胺80μl，搅拌30min，加入氯甲酸异丁酯30μl，反应2h。

(2)称取6mg KLH，加入到步骤(1)所得溶液中，反应4h。

(3)纯化透析，用0.01mol/L，pH=7.4的PBS缓冲液透析，两小时换一次缓冲溶液，透析48h，得到利福平半抗原-血蓝蛋白偶联物（利福平- KLH）。

3、利福平半抗原-鸡卵白蛋白偶联物（利福平- OVA）的制备

(2)称取4mg OVA，加入到步骤(1)所得溶液中，反应4h。

(3)纯化透析，用0.01mol/L，pH=7.4的PBS缓冲液透析，两小时换一次缓冲溶液，透析48h，得到利福平半抗原-鸡卵白蛋白偶联物（利福平-OVA）。

利福平完全抗原的鉴定

将BSA、OVA、利福平-BSA、利福平-OVA（各蛋白浓度稀释至1mg/ml）进行紫外全波长扫描，结果见图3。可以看出，与BSA和OVA的紫外吸收相比较，利福平-BSA和利福平-OVA在530nm和650nm波长时的紫外吸收峰均发生了明显的偏移，说明利福平半抗原成功偶联到载体蛋白BSA和OVA上。

实施例3

利福平单克隆抗体的制备与鉴定

利福平单克隆抗体的制备

1、动物免疫

(1)使用实施例2制备的利福平-BSA完全抗原免疫Balb/c小鼠5只（分别编号为1#、2#、3#、4#、5#），每只小鼠单次免疫100μg利福平-BSA，共免疫4次，每次间隔两周，前三次的免疫方式为颈背部皮下多点注射，后三次的免疫方式为腹膜内注射。

(2)细胞融合与克隆化：第四次免疫7天后，取脾细胞，按5:1（数量配比）比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。间接竞争ELISA方法如下：

S1:采用实施例2制备的利福平-OVA完全抗原（采用碳酸盐缓冲液调节浓度）进行包被，100μL/孔；利福平-OVA的包被浓度为1.0μg/mL。

S2:4℃孵育16小时。

S3:封闭并洗板。

S4:每孔加入浓度为0.5ppb的利福平标准品溶液50μL。

S5:其中1个96孔板每孔加入50μL原倍细胞上清液，另1个96孔板每孔加入50μL经50倍稀释的细胞上清液。

S6:室温孵育2h，洗板。

S7:每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，室温孵育2h。

S8:洗板。

S9:加入TMB显色液，避光显色15min。

S10:每孔加入100μL 2mol/L硫酸中止反应，读OD_450nm值。

抑制率的测试结果见表1和表2。

表1

表2

(3)利用有限稀释法对上述抑制率＞50%的阳性孔进行克隆化，最终得到可以分泌利福平单克隆抗体的杂交瘤细胞。

2、细胞冻存和复苏

用冻存液将获得的杂交瘤细胞制成1×10⁶个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时，取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后移入培养瓶内培养。

3、利福平单克隆抗体的制备与纯化

细胞培养基的制备方法：向培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，小牛血清的终浓度为20％（质量百分含量），碳酸氢钠的终浓度为0.2％（质量百分含量），将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，37℃培养2天，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到利福平单克隆抗体溶液（-20℃保存）。

利福平单克隆抗体中的蛋白质浓度（mg/ml）＝1.45×OD_280nm-0.74×OD_260nm。

采用以上公式计算出筛选的利福平单克隆抗体中的蛋白质浓度为16.8mg/ml。

4、腹水制备：Balb/c小鼠腹腔注射灭菌石蜡油（0.4mL/只），7天后腹腔注射杂交瘤细胞株（5×10⁵个/只）。7天后采集腹水，用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，纯化后的腹水-20℃保存。

5、利福平单克隆抗体的鉴定

（1）抗体效价的测定

S2:4℃孵育16小时。

S3:封闭并洗板。

S4:每孔加入100μL利福平单克隆抗体溶液或其稀释液（采用PBS缓冲液进行梯度稀释），PBS缓冲液为阴性对照。

S5:室温孵育2h，洗板。

S6:每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，室温孵育2h。

S7:洗板。

S8:加入TMB显色液，避光显色15min。

S9:每孔加入100μL 2mol/L硫酸中止反应，读OD_450nm值。

S10:以利福平单克隆抗体溶液孔/PBS缓冲液孔比值大于2.1左右时判定为阳性。

经测定，抗体效价为1:102400，结果见表3。

表3

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种利福平半抗原，其特征在于，所述利福平半抗原的结构如式I所示，

式I。

2.一种制备权利要求1所述的利福平半抗原的方法，其特征在于，

利福平与赖氨酸在碱存在的条件下，于有机溶剂中进行羟氨基化反应。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，

所述碱为吡啶；

和/或，所述有机溶剂为甲醇；

和/或，所述利福平、赖氨酸与碱的质量体积比为1g：200-300mg：1-3ml；

和/或，所述羟氨基化反应的温度为60-70℃，时间为12-18h。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括：

将利福平溶解于甲醇中，缓慢加入赖氨酸，搅拌10min，加入吡啶，于65℃下反应15h，加入冰水淬灭，调节pH至3，乙酸乙酯萃取，FLASH纯化，得所述利福平半抗原；其中，利福平、赖氨酸与吡啶的质量体积比为1g：256mg：2ml。

5.一种利福平完全抗原，其特征在于，由权利要求1所述的利福平半抗原与载体蛋白偶联制得，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、血蓝蛋白或鸡卵白蛋白中的任一种。

6.一种制备权利要求5所述的利福平完全抗原的方法，其特征在于，当所述载体蛋白为牛血清白蛋白时，所述方法包括：

7.一种制备权利要求5所述的利福平完全抗原的方法，其特征在于，当所述载体蛋白为血蓝蛋白或鸡卵白蛋白时，所述方法包括：

8.一种利福平单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述的利福平半抗原或权利要求5所述的利福平完全抗原制备得到。

9.权利要求8所述的利福平单克隆抗体在检测利福平中的应用。