CN114981452A - 生物标志物及其用于诊断阿尔茨海默病静默期的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及阿尔茨海默病静默期的分子标识；以及使用其用于诊断受试者中阿尔茨海默病的静默阶段，将受试者中的阿尔茨海默病静默期分级为静默期的不同级别，预测受试者中阿尔茨海默病静默期的进展，和确定对患有阿尔茨海默病静默期的受试者的个体化治疗过程的方法。它还涉及计算机系统，其包含经训练的机器学习算法，用于诊断受试者中的阿尔茨海默病静默期。

Description

生物标志物及其用于诊断阿尔茨海默病静默期的用途
发明领域
本发明涉及阿尔茨海默病静默期的分子标识(molecular signature)；以及使用其用于诊断受试者中阿尔茨海默病的静默阶段，将受试者中的阿尔茨海默病静默期分级为静默期的不同级别，预测受试者中阿尔茨海默病静默期的进展，和确定对患有阿尔茨海默病静默期的受试者的个体化治疗过程(personalized course of treatment)的方法。它还涉及包含机器学习算法的计算机系统，所述算法经训练用于诊断受试者阿尔茨海默病的静默期。
发明背景
阿尔茨海默病(AD)在西方世界是最常见的痴呆原因。在临床方面，AD的特征在于通常始于记忆障碍的进行性认知减退。随着疾病的进展，AD不可避免地影响包括执行功能在内的所有智力功能，导致日常生活的基本活动的完全依赖性和过早死亡。全世界有约5000万人患有AD，如果我们无法找到治愈方法，则预测患者人数到2050年将激增至1.315亿(Prince et al.,2015.World Alzheimer Report 2015.The global impact ofdementia:An analysis of prevalence,incidence,cost and trends(Rep.).London:Alzheimer’s disease international(ADI))。
目前这种疾病的花费为每年约1万亿美元，预计到2030年将翻一倍。在美国，患有AD的家庭的自付费用平均每年超过8,000美元。它使AD成为生命最后五年中对于家庭来说最昂贵的疾病(Kelley et al.,2013.J Gen Intern Med.28(2):304-9)。不幸的是，没有针对AD的有效治疗方法，尽管一些药物可以缓解与它相关的症状。
一个世纪前，Alois Alzheimer博士描述了第一位AD患者
Alois Alzheimer博士在一个多世纪前就鉴别出了这种疾病的脑病变(Shampo etal.,2013.Mayo Clin Proc.88(12):e155)。他的病人Auguste Deter表现出进行性记忆丧失、思维障碍、迷失方向和性格变化。在微观显微镜水平上，Alzheimer博士鉴定出了该疾病的两种主要脑聚集体：老年斑(senile plaque)和神经原纤维缠结(neurofibrillarytangle)。然而，直到1984年，研究人员才发现老年斑的主要组分是淀粉样蛋白前体蛋白(APP)裂解产生的淀粉样肽(McKhann et al.,1984.Neurology.34(7):939-44)。在这些发现之后仅仅数年，神经原纤维缠结就被确定为过度磷酸化的Tau聚集体(Jellinger,2006.JNeural Transm(Vienna).113(11):1603-23)。这些重大发现标志着三十多年深入研究的开始。
尽管进行了30年的深入研究，但几乎100％的临床试验都失败了
截至今天，明确确定了AD的两个主要事件。AD的特征在于β-淀粉样肽(Aβ)的逐渐积累，这导致了Tau的逐渐过度磷酸化。因此，患者表现出其认知功能逐渐减退，随后出现老年斑沉积和纤维缠结形成。在最终阶段，出现痴呆，事件顺序被称为“淀粉样蛋白级联”(图1)。
患者的神经学评估仅在诊断的同时在已出现痴呆的最初体征后才进行。尽管在R&D中投入了数十亿美元寻找有效的治疗方法，但AD临床试验的成功率仍然是任何疾病领域中最低的—低于1％，而癌症为19％(Cummings et al.,2017.Alzheimers Dement(N Y).3(3):367-384)。这种高失败率归因于临床试验中针对的阶段“过晚”(即，痴呆阶段)、对该病症缺乏基本了解以及当前的动物模型没有完全复制人AD的过程。尤其是，APP加工(包括可溶性Aβ肽的产生)和Tau病理学之间的病理生理学联系在AD动物模型中仍然面临挑战。
因此，模拟人AD中观察到的关键事件的动物模型的缺乏引发了所用建模技术有效性的质疑。
没有早期诊断，就不可能挽救
直到如今，AD的诊断还完全基于神经心理学评估。尽管最近在生物标志物方面取得了进展，但它们的灵敏度和特异性仍然不足。
该疾病的第一个生物学体征(biological sign)出现在临床诊断之前的至少20年(图2)。因此，诊断确立时，大多数损伤已经在脑中发生并且患者已经患有严重的痴呆(Sperling et al.,2014.Neuron.84(3):608-22)，从而导致治疗的成功机率非常低。无论如何，不可能从经诊断的AD患者中鉴定出静默AD生物标志物。事实上，血液生物标志物的演变贯穿了病理学的进展。因此，不可能基于被诊断为AD的患者的变化而推测在症状前阶段期间的变化。这就解释了为什么鉴定静默期的生物标志物如此困难，以及为什么科学家们未能早期诊断。
目前，正在研究的大多数生物标志物有3种主要类型，并且是基于被诊断为AD的患者的研究：
(1)脑β淀粉样蛋白成像或血液Aβ42测定；
(2)脑Tau成像或血液Tau测定；或
(3)所有神经退行性病症的共同生物标志物
(1)脑β淀粉样蛋白成像或血液Aβ42测定
例如，Koichi Tanaka博士和他的团队开发了一种强大的技术来测定血液中淀粉样蛋白生成最多的β淀粉样肽(Aβ42肽)，已知Aβ42在该血液中的浓度非常低。得益于简单的血液检测，这项技术开辟了一种更好地鉴定具有脑β淀粉样蛋白斑块负荷的人的新方法。他们寻求在不久的将来取代目前由体内成像(PIB-PET)和腰椎穿刺后的脑脊液生物标志物组成的昂贵且不安全的Aβ42肽测定技术。
然而，该技术在用作AD静默期和晚期的合适诊断工具时存在重大限制。
首先，已知脑β淀粉样蛋白斑块负荷与AD状况相关性较差。在论文(Nakamura etal.,2018.Nature.554(7691):249-254)中，作者认为：“在NCGG数据集中，29个患者中有9个(31％)被诊断为AD但却是PIB-PET Aβ-”和“一个新的临床数据集，由31例AD(22Aβ+和9Aβ-，由PIB-PET分类)和20例非AD(8Aβ+和12Aβ-)病例组成”。总结来说，约30％的AD患者是PIB-PET Aβ-，约40％的健康个体是PIB-PET Aβ+(图3)。
Nakamura等人总结到：“这些结果证明了血浆生物标志物在预测个体水平的脑β淀粉样蛋白负荷方面的潜在临床效用”，但由于脑β淀粉样蛋白负荷与AD状况之间缺乏相关性，该技术无法准确诊断患有AD的个体。
其次，该技术没有测定AD中涉及的其他主要病理的后果：tau蛋白病(tauopathy)。在脑中β淀粉样蛋白的量相同时，有些人会发展为AD(包括tau蛋白病部分)，但有些人不会，这取决于他们对β淀粉样蛋白毒性的个体敏感性。所述个体越“响应”于β淀粉样肽毒性，其发展AD的可能性就越高，并且这与(在脑、脑脊液或血液中的)β淀粉样肽的量无关。
(2)脑Tau成像或血液Tau测定
脑Tau负荷目前正在研究中。然而，由于Tau成像的准确度差，聚集的Tau仅在进展的后期阶段(即当缠结的数量很大时)可见。Tau成像不能用作静默期生物标志物。
此外，由于其特定的细胞定位，Tau和磷酸化-Tau只能在神经元细胞死亡后在血液中测量。因此，它是晚期生物标志物，且不能用于检测处于AD静默期(远在萎缩出现之前)的患者。
(3)所有神经退行性病症的共同生物标志物
所有这些生物标志物主要是通过先验方法(priori approach)鉴定的。这种方法限制了与淀粉样蛋白、神经营养因子(NFT)或神经炎症生物标志物无关的新生物标志物的发现。重要的是要记住，淀粉样蛋白血液浓度与AD状况的相关性差(不能将其用作AD诊断)，并且神经营养因子和神经炎症过程均仅在AD的临床期涉及。这些生物标志物也与检测处于AD静默期的患者无关。此外，生长因子和神经炎症生物标志物对AD的特异性差，且不能用作AD的鉴别诊断。
因此为了找到静默期的合适生物标志物，需要再现该无症状期的可靠AD模型。但是，转基因动物模型与人AD病理学不一致。
转基因AD模型的局限性降低了它们开发静默期AD诊断的能力
实验室中使用的大多数AD模型是转基因小鼠，其表达与AD的家族性形式相关的人突变基因(例如淀粉样蛋白前体[APP]、早老蛋白-1[PSEN1]和早老蛋白-2[PSEN2])。因为这些突变中的每一个均导致Aβ的产生增加，所以这些模型适宜于在很短的时间内快速模拟淀粉样斑块沉积。此外，它们是开发相关正电子发射断层扫描(PET)或磁共振成像(MRI)示踪剂用以鉴定患者脑中的老年斑或神经原纤维缠结的适宜模型。
然而，现有的这些转基因动物模型具有至少三个主要限制。
首先，数项研究已表明，转基因小鼠中AD标志事件的发展取决于转基因的表达。因此，衰老(AD的最强风险因素)在AD研究中经常被忽略，因为大多数小鼠模型仅在几个月内就表现出AD样表型。所有这些小鼠均发展出与人疾病不类似的加速衰老的事实，是第一个限制。
其次，在AD患者中未发现MAPT基因(编码Tau蛋白)的基因突变。因此，使用在tau蛋白病的子集中发现的MAPT突变以发展神经原纤维缠结，形成了小鼠模型。已经进行了数个品系之间的杂交，以生成同时发展淀粉样蛋白和tau病理学的转基因模型，例如3xTg-AD小鼠(Duyckaerts et al.,2008.Acta Neuropathol.115(1):5-38)。但在人疾病中，这两种病理是独立出现的：Aβ是一种基于淀粉样蛋白级联的致病因子，它触发tau病理。在这些小鼠模型中没有再现淀粉样蛋白级联，这是第二个限制。
第三，在转基因动物中过表达的转基因不会在患者中过表达(除了在唐氏综合征患者中发展的AD形式之外)，这就是为什么这些转基因模型中神经毒性肽(例如Aβ)的水平远高于在AD患者的脑中(Audrain et al.,2016.Mol Neurodegener.11:5)。因此，最后一个限制是转基因AD模型表达的病理代谢物的超病理浓度。
此外，还开发了其他建模策略，例如基于注射的动物模型，通过将淀粉样蛋白或tau肽直接脑内注射到脑中来诱导(Puzzo et al.,2017.Elife.6.pii:e2699)。所述转基因模型的类似限制也可以在此解决。尽管存在这些限制，但现有的AD动物模型已经提供了大量数据，这些数据有助于了解神经性AD病变和评估各种潜在的治疗策略。总的来说，研究界对缺乏合适的模型感到痛惜。这种缺乏接近于人的AD模型似乎是开发诊断的限制因素(Lecanu&Papadopoulos,2013.Alzheimers Res Ther.5(3):17)。在任何情况下，包括衰老、可溶性Aβ肽对tau病理学的影响以及可靠的临床Aβ浓度在内的关键因素仍然面临挑战，并且应当在合适的AD动物模型中进行设计。
更接近于人病理学的非转基因模型的出现
为了在体内模型中并以更可靠地再现临床观察结果的方式来模拟疾病发展，最近通过注射腺相关病毒(AAV)开发了一种创新的AD大鼠模型，即AgenT大鼠，所述腺相关病毒将人突变APP蛋白和早老蛋白-1(PS1)编码到成年啮齿动物的海马体中(美国专利US10,159,227和欧洲专利EP3066203)。
此模型可以被描述为一种颠覆性技术，也更接近于人AD发展的时间过程。
事实上，所用技术并非基于转基因方法。因为仅在成年动物上进行AD诱导，所以AgenT大鼠不会遭受发育补偿(developmental compensation)或遗传漂变(geneticdrift)。此外，AgenT大鼠中APP表达的模式可模仿最近在人AD的散发形式中描述的基因组嵌合型(genomic mosaicism)，其中观察到了APP基因在神经元的有限子集中的拷贝数增加(Bushman et al.,2015.Elife.4)，并且描述了已知与阿尔茨海默病的家族形式相关的体细胞突变的出现(Lee et al.,2018.Nature.563(7733):639-645)。因此，与转基因动物相比，AgenT大鼠可以被认为是更接近于AD的散发形式的模型。
此外，就淀粉样蛋白肽的量和Aβ42/40比率而言，诱导的APP病理似乎与人相似。诱导的淀粉样蛋白病理导致包括进行性Tau过度磷酸化在内的病理生理机制。APP病理的缓慢进展允许发生内源性Tau病理的进行性发展，而不会发生可能的干扰性早期炎症和斑块形成。这些步骤可以被认为是AD的静默期，在患者中开始于目前临床前诊断之前的至少18年(Rajan et al.,2015.Neurology.85(10):898-904)。AD疾病发展的下一时期由与AD相关的脑病变例如老年斑、脑淀粉样蛋白血管病和缠结样聚集体的出现组成，这些仅出现在老年AgenT大鼠中。
所有这些特征使AgenT大鼠模型成为能根据发展阶段更好地预测血液生物标志物行为的强力工具。因此，该模型是一个表征新生物标志物或生物标志物组以开发早期诊断的合适的研究系统。
正是在这个意义上，发明人使用人工智能方法鉴定了一组119种适于预测AD的同类最佳(best-in-class)生物标志物。令人惊讶的是，发明人已经能够证明，使用来自AgenT大鼠(即，患有AD但仍无症状的大鼠)和健康大鼠的数据训练的人工神经网络最终能够根据约五种或更少种生物标志物的子集(从119种同类最佳生物标志物的完整列表中随机挑选)来预测处于无症状期或静默期的AD。
发明人进一步令人惊讶地证明，使用这些约五种或更少种生物标志物的随机子集，经训练的人工神经网络不仅能够预测处于静默期的AD，而且能够进一步将静默AD分级为不同的级别。
发明内容
本发明涉及阿尔茨海默病静默期的分子标识，其中所述分子标识包含选自表1A的生物标志物的至少五种生物标志物。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期的分子标识包含表10A、表10B、表10C或表10D的生物标志物。
本发明进一步涉及一种诊断受试者中阿尔茨海默病静默期的方法，其包括以下步骤：
a)通过测量先前从所述受试者获得的样品中选自表1A的生物标志物组的至少五种生物标志物的水平、量或浓度，来确定分子标识，
b)将在步骤a)中获得的分子标识与参考标识进行比较，和
c)基于分子标识与参考标识的相关性，诊断受试者为患有阿尔茨海默病静默期。
本发明进一步涉及一种预测受试者中阿尔茨海默病静默期的进展的方法，其包括以下步骤：
a)通过测量从所述受试者获得的样品中选自表1A的生物标志物的至少五种生物标志物的水平、量或浓度，来确定分子标识，
b)将在步骤a)中获得的分子标识与参考标识进行比较，和
c)基于分子标识与参考标识的相关性来预测阿尔茨海默病的进展。
本发明进一步涉及一种确定对患有阿尔茨海默病静默期的受试者的个体化治疗过程的方法，其包括以下步骤：
a)通过测量从所述受试者获得的样品中选自表1A的生物标志物的至少五种生物标志物的水平、量或浓度，来确定分子标识，
b)将在步骤a)中获得的分子标识与参考标识进行比较，和
c)基于分子标识与参考标识的相关性来确定对受试者的个体化治疗过程。
本发明进一步涉及一种将受试者的阿尔茨海默病静默期分级为静默期的不同级别，优选S1、S2或S3级的方法，其包括以下步骤：
a)通过测量从所述受试者获得的样品中选自表1A的生物标志物组的至少五种生物标志物的水平、量或浓度，来确定分子标识，
b)将在步骤a)中获得的分子标识与参考标识进行比较，和
c)基于分子标识与参考标识的相关性，将受试者分级到阿尔茨海默病静默期的一个级别。
在将受试者的阿尔茨海默病静默期分级到静默期的不同级别的方法的一个具体实施方案中，分子标识包含选自表1A的生物标志物组的至少14种生物标志物。
在一个实施方案中，参考标识包含在先前从基本上健康的受试者获得的样品中测量的、优选在先前从基本上健康的受试者群体获得的样品中测量的相同的至少五种生物标志物的水平、量或浓度。
在一个实施方案中，步骤c)中的相关性是通过将分子标识中和参考标识中所述至少五种生物标志物的水平、量或浓度的变化与表3的生物标志物变化谱进行比较来测量。
在一个实施方案中，所述分子标识包含表10A、表10B、表10C或表10D的生物标志物。
在一个实施方案中，其中步骤b)中的比较使用至少一种机器学习算法进行。
在一个实施方案中，所述至少一种机器学习算法选自人工神经网络(artificialneural network，ANN)、感知器算法(perceptron algorithm)、深度神经网络(deep neuralnetwork)、聚类算法(clustering algorithm)、k最近邻算法(k-nearest neighborsalgorithm，k-NN)、决策树算法(decision tree algorithm)、随机森林算法(randomforest algorithm)、线性回归算法(linear regression algorithm)、线性判别分析(linear discriminant analysis，LDA)算法、二次判别分析(quadratic discriminantanalysis，QDA)算法、支持向量机(support vector machine，SVM)、贝叶斯算法(Bayesalgorithm)、简单规则算法(simple rule algorithm)、聚类算法、元分类器算法(meta-classifier algorithm)、高斯混合模型(Gaussian mixture model，GMM)算法、最近质心算法(nearest centroid algorithm)、极端梯度提升(extreme gradient boosting，XGBoost)算法、线性混合效应模型算法(linear mixed effects model algorithm)及其组合。
在一个实施方案中，用训练数据集训练所述至少一种机器学习算法，所述训练数据集包含与先前从基本上健康的受试者和从已知患有阿尔茨海默病静默期的受试者获得的样品中表1A的相同的至少五种生物标志物的水平、量或浓度有关的信息。
在一个实施方案中，所述至少一种机器学习算法是用包含表3的生物标志物变化谱(biomarker variation profile)的训练数据集来训练的。
本发明进一步涉及一种用于诊断受试者的阿尔茨海默病静默期的计算机系统，所述计算机系统包含：
(i)至少一个处理器，和
(ii)至少一种存储介质，其存储至少一种可由处理器读取的代码，并且当由处理器执行时，其使所述处理器进行以下：
a.接收在先前从所述受试者获得的样品中测定的选自表1A的生物标志物组的至少五种生物标志物的输入水平、量或浓度，
b.通过组织和/或调整(organizing and/or modifying)每个输入水平、量或浓度来分析和转换所述至少五种生物标志物的输入水平、量或浓度，以通过机器学习算法得出概率得分和/或分类标签，
其中机器学习算法是用训练数据集训练的，
其中训练数据集包含与先前从已知阿尔茨海默病状态的受试者获得的样品中表1A的相同的至少五种生物标志物的水平、量或浓度有关的信息，
c.生成输出，其中所述输出是分类标签或概率得分，和
d.基于所述输出，提供受试者是否患有阿尔茨海默病静默期的诊断。
本发明进一步涉及一种用于诊断受试者中阿尔茨海默病静默期的计算机实施的方法，所述方法包括：
a.接收在先前从所述受试者获得的样品中测定的选自表1A的生物标志物组的至少五种生物标志物的输入水平、量或浓度，
b.通过组织和/或调整每个输入水平、量或浓度来分析和转换所述至少五种生物标志物的输入水平、量或浓度，以通过机器学习算法得出概率得分(probability score)和/或分类标签(classification label)，
其中机器学习算法是用训练数据集训练的，
其中训练数据集包含与先前从已知阿尔茨海默病状态的受试者获得的样品中表1A的相同的至少五种生物标志物的水平、量或浓度有关的信息，
c.生成输出，其中所述输出是分类标签或概率得分，和
d.基于所述输出，提供所述受试者是否患有阿尔茨海默病静默期的诊断。
在一个实施方案中，训练数据集包含与先前从基本上健康的受试者和从已知患有阿尔茨海默病静默期的受试者获得的样品中表1A的相同至少五种生物标志物的水平、量或浓度有关的信息。
在一个实施方案中，在步骤d.提供诊断包括提供将患有阿尔茨海默病静默期的受试者分级为所述阿尔茨海默病静默期的级别，优选S1、S2或S3级。
在一个具体的实施方案中，其中步骤d.包括提供分级，步骤a.包括接收选自表1A的生物标志物组的至少14种生物标志物的输入水平、量或浓度。
在一个实施方案中，训练数据集包含表3的生物标志物变化谱。
本发明进一步涉及计算机程序，其包含可由处理器读取的软件代码，所述软件代码经调试而由所述处理器执行时实施本发明的计算机实施的方法。
本发明进一步涉及非暂时性计算机可读存储介质，其包含当由计算机执行时使处理器实施本发明的计算机实施的方法的代码。
发明详述
本发明涉及阿尔茨海默病静默期的分子标识或分子谱。
如本文所用，在提到阿尔茨海默病时，术语“静默期/阶段”、“痴呆前时期/阶段”或“临床前时期/阶段”是可互换的，并且是指认知尚未出现障碍但表现出至少一种以下阿尔茨海默病特征的受试者的临床前状态：可溶性Aβ肽失调(dysregulation)、过度磷酸化Tau蛋白增加、出现老年斑和缠结。这些术语涵盖阿尔茨海默病的“无症状期”和“前驱期(prodromal phase)”。“静默期”跨越了受试者中第一个分子事件(即Aβ肽产生或清除的失调)至出现阿尔茨海默病的第一个临床症状。有关详细定义，参见Dubois et al.,2016(Alzheimers Dement.12(3):292-323)或Sperling et al.,2011(Alzheimers Dement.7(3):280-292)，其内容通过引用以其整体并入本文。
如本文所用，在提到阿尔茨海默病时，术语“无症状期/阶段”或“症状前时期/阶段”是可互换的，并且是指认知尚未出现障碍但在脑水平上表现出以下至少一种阿尔茨海默病特征的受试者的临床前状态：可溶性Aβ肽失调、过度磷酸化Tau蛋白增加、以及在一些情况下出现老年斑和缠结。这些受试者将在数年或数十年后发展出阿尔茨海默病的临床症状(Hubbard et al.,1990.Neuropathol Appl Neurobiol.16(2):111-21)。
在所述疾病的这个阶段，大脑的改变完全是分子上的。患者尽管实际上病了，但并没有表现出任何客观的认知障碍。脑脊液(CSF)生物标志物和PET成像生物标志物通常为阴性。
如本文所用，在提到阿尔茨海默病时，术语“前驱期/阶段”或“轻度认知障碍(MCI)阶段/时期”是可互换的，并且是指第一次认知异常(相对于正常衰老认知下降来说异常)和痴呆状发作之间的阶段。它的特征在于记忆、语言、思维或判断出现问题，但没有AD痴呆的症状。淀粉样肽的脑内浓度持续增加，而CSF浓度趋于下降。但是，基本水平因人而异。这解释了为什么32％的认知正常人超出了淀粉样蛋白阳性阈值，而35％至52％的前驱患者为阴性(Landau,2020 July 28.Imaging biomarkers and Alzheimer's disease prevention.在2020年阿尔茨海默病协会国际会议(AAIC)上发表的在线演讲)。因此，淀粉样蛋白浓度不具有足够特异性来识别阿尔茨海默病患者。在这个阶段，一些患者会开始表现出脑和外周水平(CSF、血液)中Tau蛋白浓度的增加。但是，它仍然很低，因此不能诊断所有前驱阿尔茨海默病患者。
在提到阿尔茨海默病时，术语“临床症状”、“临床期的症状”、“AD痴呆”、“由于阿尔茨海默病导致的痴呆”、“AD痴呆的症状”是指但不限于以下症状：影响日常生活的记忆力损失，计划或解决问题有困难，难以完成在家、工作或闲暇时的熟悉任务，时间或地点混乱，难以理解视觉图像和空间关系，口语或写作中出现新的单词问题，将物品放错地方并丧失回溯的能力，判断力下降或差，退出工作或社交活动，或情绪和性格改变。此类临床症状描述在例如阿尔茨海默病协会网站https://www.alz.org/alzheimers-dementia/10_signs。
在一个实施方案中，本发明的分子标识或分子谱包含当与参考标识或参考谱比较时，其水平、量或浓度的平均谱是阿尔茨海默病静默期的特征的生物标志物。
当提到生物标志物的水平、量或浓度时，“是……的特征”意指给定生物标志物的水平、量或浓度，或生物标志物的水平、量或浓度的平均谱，与来自参考受试者的相同生物标志物的水平、量或浓度，或生物标志物的水平、量或浓度的平均谱显著不同或基本上相似。“特征”应理解为“显著不同”还是“基本上相似”取决于参考受试者及其疾病状态。
在一个实施方案中，如果给定生物标志物的水平、量或浓度比参考受试者中相同生物标志物的水平、量或浓度高了超过约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多；或者如果低了超过约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多，则它是“显著不同”的。在一个实施方案中，如果给定生物标志物的水平、量或浓度比参考受试者中相同生物标志物的水平、量或浓度高出超过约5％或低于超过5％，则它是“显著不同”的。
在一个实施方案中，如果给定生物标志物的水平、量或浓度比参考受试者中相同生物标志物的水平、量或浓度高了少于约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％或更多；或者如果低了少于约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％或更多，则它是“基本上相似”的。在一个实施方案中，如果给定生物标志物的水平、量或浓度比参考受试者中相同生物标志物的水平、量或浓度高了少于约5％或低了少于5％，则它是“基本上相似”的。
在一个实施方案中，生物标志物的水平、量或浓度可以通过本领域公知的方法测量。此类方法包括但不限于质谱(例如，串联质谱[MS/MS]，色谱辅助质谱及其组合)、免疫组织化学、多重方法(Luminex)、蛋白印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、夹心ELISA、荧光免疫吸附测定(FLISA)、酶免疫测定(EIA)、放射免疫测定(RIA)、RT-PCR、RT-qPCR、NorthernBlot、杂交技术(例如使用微阵列及其组合，包括但不限于通过RT-PCR获得的扩增子的杂交、测序例如下一代DNA测序(NGS)或RNA-seq(也称为“全转录组鸟枪法测序”))等。
在一个实施方案中，本发明的分子标识或分子谱(profile)包含当与参考标识或参考谱进行比较时，其水平、量或浓度是阿尔茨海默病静默期S1级、阿尔茨海默病静默期S2级和/或阿尔茨海默病静默期S3级的特征的生物标志物。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期定义为阿尔茨海默病静默期S1级。因此，本发明涉及阿尔茨海默病静默期S1级的分子标识或分子谱。
如本文所用，术语“阿尔茨海默病静默期S1级”或“S1级”是指受试者没有表现出诸如轻度认知障碍(mild cognitive impairments，MCI)和痴呆的临床症状，但可观察到病理生理学特征的阿尔茨海默病的静默期的级别。S1级的此类病理生理学特征包括脑可溶性Aβ42浓度失调和焦虑样综合征中的至少一种。S1级的病理生理学特征不包括下文定义的S2级和/或S3级的那些病理生理学特征。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期定义为阿尔茨海默病静默期S2级。因此，本发明涉及阿尔茨海默病静默期S2级的分子标识或分子谱。
如本文所用，术语“阿尔茨海默病静默期S2级”或“S2级”是指受试者没有表现出诸如轻度认知障碍(MCI)和痴呆的临床症状，但可观察到病理生理学特征的阿尔茨海默病的静默期的级别。S2级的此类病理生理学特征包括S1级的那些，以及可溶性Aβ42肽的积累、Tau的过度磷酸化和加速遗忘中的至少一种。S2级的病理生理学特征不包括下文定义的S3级的那些病理生理学特征。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期定义为阿尔茨海默病静默期S3级。因此，本发明涉及阿尔茨海默病静默期S3级的分子标识或分子谱。
如本文所用，术语“阿尔茨海默病静默期S3级”或“S3级”是指受试者没有表现出诸如痴呆的临床症状，但可观察到病理生理学特征的阿尔茨海默病的静默期的级别。S3级的此类病理生理学特征包括S1级和S2级的那些，以及过度磷酸化Tau增加、老年斑、缠结和轻度或重度记忆障碍中的至少一种。在一些情况下，轻度认知障碍可被视为S3级症状。
图1总结了阿尔茨海默病静默期的这三个级别。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少一种选自表1A的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含一种选自表1A的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由一种选自表1A的生物标志物组的生物标志物组成。
表1A：阿尔茨海默病静默期的生物标志物
Figure BDA0003690741530000131
Figure BDA0003690741530000141
Figure BDA0003690741530000151
Figure BDA0003690741530000161
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱不包含选自包含以下或由以下组成的组的至少1种生物标志物，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15种生物标志物：1-甲基腺苷、3,4-二羟基丁酸酯、3-氨基-2-哌啶酮、4-甲基-2-氧代戊酸酯、阿拉伯糖酯/木糖酯、肌酸、肌酐、半胱氨酸-谷胱甘肽二硫化物、二甲基砜、赤藓糖酯、葡萄糖、N-乙酰基丙氨酸、1-磷酸鞘氨醇和酒石酸酯(羟基丙二酸酯)。
如本文所用，术语“14-3-3蛋白”是指以下蛋白中的任何一种或多种：14-3-3蛋白β/α、14-3-3蛋白γ、14-3-3蛋白ε、14-3-3蛋白ζ/δ、14-3-3蛋白η和14-3-3蛋白θ。
如本文所用，术语“载脂蛋白”是指以下蛋白中的任何一种或多种：载脂蛋白A-I、载脂蛋白A-II、载脂蛋白A-IV、载脂蛋白B-100、载脂蛋白C-I、载脂蛋白C-II(预测)、载脂蛋白C-III、载脂蛋白C-IV、载脂蛋白D、载脂蛋白E、大鼠载脂蛋白E蛋白、载脂蛋白H(β-2-糖蛋白I)、载脂蛋白M和载脂蛋白N。
如本文所用，术语“Arp2/3复合蛋白”是指以下蛋白中的任何一种或多种：肌动蛋白相关蛋白2、肌动蛋白相关蛋白2/3复合物亚基1B、肌动蛋白相关蛋白2/3复合物亚基3、肌动蛋白相关蛋白2/3复合物亚基4、肌动蛋白相关蛋白2/3复合物亚基5、肌动蛋白相关蛋白3和arp2/3复合物34kDa亚基。
如本文所用，术语“羧酸酯酶1家族”是指以下蛋白中的任何一种或多种：羧酸酯酶1、羧酸酯酶1C和羧酸酯酶1E。
如本文所用，术语“肉碱及缀合物”是指以下分子中的任何一种或多种：2-甲基丁酰基肉碱(C5)、乙酰基肉碱(C2)、花生四烯酰基肉碱(C20:4)、丁酰基肉碱(C4)、肉碱、顺-4-癸烯酰基肉碱(C10:1)、异丁酰基肉碱(C4)、异戊酰基肉碱(C5)、月桂基肉碱(laurylcarnitine，C12)、亚油酰基肉碱(C18:2)、肉豆蔻酰基肉碱(C14)、辛酰基肉碱(C8)、油酰基肉碱(C18)、棕榈油酰基肉碱(C16:1)、棕榈酰基肉碱(C16)、丙酰基肉碱(C3)、硬脂酰基肉碱(C18)、(S)-3-羟基丁酰基肉碱和脱氧肉碱。
如本文所用，术语“胆酸盐(cholate)及缀合物”是指以下分子中的任何一种或多种：鹅去氧胆酸盐、胆酸盐、脱氧胆酸盐、甘胆酸盐、牛磺鹅去氧胆酸盐、牛磺胆酸盐和牛磺去氧胆酸盐。
如本文所用，术语“凝血因子家族”是指以下蛋白中的任何一种或多种：凝血因子V、凝血因子IX、凝血因子VII、凝血因子X、凝血因子XI、凝血因子XII、凝血因子XIII A链和凝血因子XIII B链。
如本文所用，术语“补体系统家族”是指以下蛋白中的任何一种或多种：补体因子B、补体C1q亚组分亚基A、补体C1q亚组分亚基B、补体C1q亚组分亚基C、补体C1r亚组分、补体C1r亚组分样蛋白、补体C1s亚组分、补体C1s亚组分、补体C2、补体C3、补体C4、补体C4A、补体C4B、C4B结合蛋白α链、C4B结合蛋白β链、补体C4样、补体C5、补体C6、补体C7、补体C8α链、补体组分C8β链、补体C8γ链、补体组分C9、补体因子D、补体因子H、补体因子H相关蛋白、补体因子H相关蛋白1、补体因子H相关蛋白2、补体因子H相关蛋白3、补体因子H相关蛋白4和补体因子I。
如本文所用，术语“肌酸激酶家族”是指以下蛋白中的任何一种或多种：肌酸激酶B型和肌酸激酶M型。
如本文所用，术语“珠蛋白家族”是指以下蛋白中的任何一种或多种：珠蛋白a2、珠蛋白a4、珠蛋白c2、珠蛋白c3、珠蛋白d1、触珠蛋白(haptoglobin)、触珠蛋白相关蛋白、血红蛋白亚基α、血红蛋白亚基β、血红蛋白亚基δ和肌红蛋白。
如本文所用，术语“球蛋白家族”是指以下蛋白中的任何一种或多种：α-2抗纤溶酶(antiplasmin)、鼠球蛋白-2、维生素K依赖性蛋白C、血清白蛋白、血管紧张素原(angiotensinogen)、鼠球蛋白1、Igκ链C、Igh-6蛋白、α-2-巨球蛋白、鼠球蛋白-1、补体因子备解素(complement factor properdin)、触珠蛋白、β-2-微球蛋白、铜蓝蛋白(ceruloplasmin)、血清转铁蛋白、类似于免疫球蛋白κ链VK-1，丝氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制子进化枝A成员4、α-2-巨球蛋白、IgG-2a蛋白、凝血酶原、α-1-巨球蛋白、血清白蛋白、甲状腺素结合球蛋白、免疫球蛋白重链可变区、皮质类固醇结合球蛋白、Ig重链V区IR2、鼠球蛋白-2、Igγ-2B链C区、Ig-6蛋白、Igλ-2链C区、Igδ链C区、Igγ-2C链C区、Igh-6蛋白、免疫球蛋白J链、Igκ链V区S211、血清淀粉样蛋白A-1蛋白、血清淀粉样蛋白A-2蛋白、血清淀粉样蛋白A-4蛋白和血清淀粉样蛋白A蛋白。
如本文所用，术语“激肽原家族”是指以下蛋白中的任何一种或多种：激肽原、激肽原1和T-激肽原2。
如本文所用，术语“赖氨酸及缀合物”是指以下分子中的任何一种或多种：5-羟基赖氨酸、果糖基赖氨酸、γ-谷氨酰基-α-赖氨酸、赖氨酸、N6,N6,N6-三甲基赖氨酸、N6-乙酰基赖氨酸、N6-甲基赖氨酸、N,N,N-三甲基-5-氨基戊酸酯和哌啶甲酸酯(pipecolate)。
如本文所用，术语“蛋白酶体复合物家族”是指以下分子中的任何一种或多种：蛋白酶体亚基α型、蛋白酶体亚基α型-7、蛋白酶体亚基α型-1、蛋白酶体亚基α型-2、蛋白酶体亚基α型-3、蛋白酶体亚基α型-4、蛋白酶体亚基α型-6、蛋白酶体亚基β、蛋白酶体亚基β型、蛋白酶体亚基β型-1、蛋白酶体亚基β型-10和蛋白酶体亚基β型-3。
如本文所用，术语“丝氨酸蛋白酶抑制蛋白超家族成员”是指下蛋白中的任何一种或多种：α-1-抗蛋白酶、肝素辅因子2、血浆蛋白酶C1抑制子、蛋白Z依赖性蛋白酶抑制子、丝氨酸(或半胱氨酸)肽酶抑制子进化枝B成员10、丝氨酸(或半胱氨酸)肽酶抑制子进化枝B成员6a、丝氨酸(或半胱氨酸)肽酶抑制子进化枝C成员1、丝氨酸蛋白酶抑制子A3C、丝氨酸蛋白酶抑制子A3F、丝氨酸蛋白酶抑制子A3K、丝氨酸蛋白酶抑制子A3L、丝氨酸蛋白酶抑制子A3M、丝氨酸蛋白酶抑制子A3N、丝氨酸蛋白酶抑制子Kazal-3型-样、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白A11、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白家族F成员2和甲状腺素结合球蛋白。
如本文所用，术语“戊酸酯及缀合物”是指以下分子中的任何一种或多种：2,3-二羟基异戊酸酯、2-羟基-3-甲基戊酸酯、3-甲基-2-氧代戊酸酯、α-羟基异戊酸酯、β-羟基异戊酸酯和N,N,N-三甲基-5-氨基戊酸酯。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少一种选自表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含一种选自表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由一种选自表1B的生物标志物组的生物标志物组成。
表1B：阿尔茨海默病静默期的生物标志物
Figure BDA0003690741530000191
Figure BDA0003690741530000201
Figure BDA0003690741530000211
Figure BDA0003690741530000221
Figure BDA0003690741530000231
Figure BDA0003690741530000241
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少一种选自表2A的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含一种选自表2A的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由一种选自表2A的生物标志物组的生物标志物组成。
表2A：阿尔茨海默病静默期的生物标志物
Figure BDA0003690741530000251
Figure BDA0003690741530000261
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少一种选自表2B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含一种选自表2B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由一种选自表2B的生物标志物组的生物标志物组成。
表2B：阿尔茨海默病静默期的生物标志物
Figure BDA0003690741530000262
Figure BDA0003690741530000271
Figure BDA0003690741530000281
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少一种选自表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含一种选自表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由一种选自表2C的生物标志物组的生物标志物组成。
表2C：阿尔茨海默病静默期的生物标志物
Figure BDA0003690741530000291
Figure BDA0003690741530000301
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子特征或谱包含至少2种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含2种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由2种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少2种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含2种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由2种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少3种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含3种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由3种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少3种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含3种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由3种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少4种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含4种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由4种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少4种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含4种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由4种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少5种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含5种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由5种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少5种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含5种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由5种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个示例性和非限制性实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少5种选自以下的生物标志物，或由以下5种生物标志物组成：果糖基赖氨酸、整合蛋白β、异丁酰基肉碱(C4)、肌球蛋白调节性轻链RLC-A和talin2。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少6种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含6种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由6种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少6种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含6种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由6种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个示例性和非限制性实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少6种选自以下的生物标志物或由以下6种生物标志物组成：果糖基赖氨酸、Igh-6蛋白、肌球蛋白调节性轻链RLC-A、十八烷二酸酯(C18)、核糖酸酯(核糖酸内酯)和talin 2。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少7种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含7种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由7种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少7种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含7种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由7种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少8种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含8种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由8种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少8种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含8种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由8种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少9种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含9种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由9种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少9种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含9种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由9种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少10种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含10种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由10种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少10种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含10种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由10种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少11种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含11种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由11种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少11种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含11种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由11种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少12种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含12种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由12种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少12种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含12种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由12种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少13种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含13种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由13种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少13种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含13种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由13种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少14种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含14种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由14种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少14种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含14种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由14种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个示例性和非限制性实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少14种选自以下的生物标志物或由以下14种生物标志物组成：线粒体的10kDa热休克蛋白；5-羟基赖氨酸；线粒体的腺苷酸激酶4；钙网蛋白；肌酸激酶B型；麦角硫因；肽基脯氨酰基顺反异构酶FKBP1A；果糖基赖氨酸；珠蛋白c2；整合蛋白亚基αV；肌红蛋白；视黄酸受体应答子2；Tmprss13蛋白；和转铁蛋白受体蛋白1。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少15种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含15种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由15种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少15种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含15种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由15种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少16种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含16种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由16种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少16种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含16种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由16种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少17种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含17种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由17种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少17种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含17种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由17种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少18种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含18种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由18种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少18种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含18种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由18种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少19种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含19种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由19种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少19种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含19种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由19种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少20种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含20种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由20种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少20种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含20种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由20种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少21种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含21种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由21种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少21种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含21种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由21种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少22种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含22种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由22种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少22种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含22种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由22种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少23种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含23种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由23种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少23种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含23种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由23种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少24种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含24种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由24种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少24种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含24种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由24种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少25种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含25种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由25种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少25种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含25种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由25种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少26种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含26种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由26种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少26种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含26种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由26种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个示例性和非限制性实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少26种选自以下的生物标志物或由以下26种生物标志物组成：大鼠载脂蛋白E蛋白；Arp2/3复合物34kDa亚基；肉碱；异丁酰基肉碱(C4)；异戊酰基肉碱(C5)；凝血因子VII；丝氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制子进化枝A成员4；Igh-6蛋白；血清淀粉样蛋白P组分；尿囊酸；钙蛋白酶小亚基1；羧肽酶B2；肌肽；网格蛋白重链；补体C6；细胞外基质蛋白1；果糖-二磷酸醛缩酶；角蛋白II型细胞骨架5；甘露糖结合蛋白A；肌球蛋白调节性轻链RLC-A；N-乙酰基天冬酰胺；十八烷二酸酯(C18)；核糖酸酯(核糖酸内酯)；核酮糖酯；talin 2；和Xaa-Pro氨基肽酶2。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少27种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含27种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由27种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少27种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含27种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由27种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少28种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含28种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由28种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少28种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含28种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由28种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少29种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含29种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由29种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少29种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含29种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由29种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少30种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含30种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由30种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含至少30种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱包含30种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物。在一个实施方案中，阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的分子标识或分子谱由30种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物组成。
在一个实施方案中，与参考标识或参考谱进行比较，来决定给定生物标志物的水平、量或浓度，或者生物标志物的水平、量或浓度的平均谱是否是阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的特征。该参考标识或参考谱可以在软件中执行，或者可以构建跨越测定的总体中值或其他算术平均值。
在一个实施方案中，参考标识或参考谱可以与来源于群体研究的标识或谱相关，所述群体研究包括但不限于具有相似年龄范围的此类受试者、相同或相似种族的受试者、相似的癌症病史等。
在一个实施方案中，参考标识或参考谱来源于对源自或获自一个或多个参考受试者的参考样品中的表1A或表1B的生物标志物的水平、量或浓度的测定。
在一个实施方案中，参考标识或参考谱来源于对源自或获自一个或多个参考受试者的参考样品中的表2A、表2B或表2C的生物标志物的水平、量或浓度的测定。
在一个实施方案中，参考受试者是动物，优选哺乳动物。
哺乳动物的实例包括但不限于人、非人灵长类动物(例如，黑猩猩和其他猿类以及猴物种)、农场动物(例如，牛、马、绵羊、山羊和猪)、家养动物(例如，兔、狗和猫)、实验室动物(例如，大鼠、小鼠和豚鼠)等。所述术语不表示特定的年龄或性别，除非另有明确说明。
在一个实施方案中，参考受试者是灵长类动物，包括人和非人灵长类动物。在一个实施方案中，参考受试者是人。
在一个实施例中，参考受试者是基本上健康的受试者。
如本文所用，“基本上健康的受试者”先前未曾被或将不会被诊断或鉴定为具有或患有阿尔茨海默病。优选地，“基本上健康的受试者”先前未曾被或将不会被诊断或鉴定为患有或具有阿尔茨海默病静默期。优选地，“基本上健康的受试者”先前未曾被或将不会被诊断或鉴定为患有阿尔茨海默病相关的轻度认知障碍(MCI)、阿尔茨海默病痴呆、S1级的病理生理学特征、S2级的病理生理学特征和S3级的病理生理学特征(如上文所定义)中的任意一种。
在一个实施方案中，参考受试者是未曾被诊断或鉴定为患有或具有阿尔茨海默病的受试者，无论是在死亡前(ante-mortem)还是在尸检时(post-mortem)。在一个实施方案中，参考受试者是未曾被诊断或鉴定为患有或具有阿尔茨海默病静默期的受试者，无论是在死亡前还是在尸检时。优选地，参考受试者是未曾被诊断或鉴定为患有阿尔茨海默病相关的轻度认知障碍(MCI)、阿尔茨海默病痴呆、S1级的病理生理学特征、S2级的病理生理学特征和S3级的病理生理学特征(如上文所定义)中的任何一种的受试者，无论是在死亡前还是在尸检时。
在一个实施方案中，参考标识或参考谱来源于对源自或获自参考群体中的参考受试者的参考样品中的表1A或表1B的生物标志物的水平、量或浓度的测定。
在一个实施方案中，参考标识或参考谱来源于对源自或获自参考群体中的参考受试者的参考样品中的表2A、表2B或表2C的生物标志物的水平、量或浓度的测定。
在一个实施方案中，参考群体包含基本上健康的受试者，优选至少25个、更优选至少30个、更优选至少35个、更优选至少40个、更优选至少45个、更优选至少50个、更优选至少75个、更优选至少100个、更优选至少150个、更优选至少200个并且甚至更优选至少500个基本上健康的受试者，如上文所定义。
在一个实施方案中，参考群体包含未曾被诊断或鉴定为患有或具有阿尔茨海默病的受试者，无论是在死亡前还是在尸检时，优选至少25个、更优选至少30个、更优选至少35个、更优选至少40个、更优选至少45个、更优选至少50个、更优选至少75个、更优选至少100个、更优选至少150个、更优选至少200个并且甚至更优选至少500个未曾被诊断或鉴定为患有或具有阿尔茨海默病的受试者，无论是在死亡前还是在尸检时。在一个实施方案中，参考群体包含未曾被诊断或鉴定为患有或具有阿尔茨海默病静默期的受试者，无论是在死亡前还是在尸检时，优选至少50个、更优选至少100个、更优选至少200个并且甚至更优选至少500个未曾被诊断或鉴定为患有或具有阿尔茨海默病静默期的受试者，无论是在死亡前还是在尸检时。在一个实施方案中，参考群体包含未曾被诊断或鉴定为患有轻度认知障碍(MCI)、痴呆、S1级的病理生理学特征、S2级的病理生理学特征和S3级的病理生理学特征(如上文所定义)中的任何一种的受试者，无论是在死亡前还是在尸检时，优选至少25个、更优选至少30个、更优选至少35个、更优选至少40个、更优选至少45个、更优选至少50个、更优选至少75个、更优选至少100个、更优选至少150个、更优选至少200个并且甚至更优选至少500个未曾被诊断或鉴定为患有轻度认知障碍(MCI)、痴呆、S1级的病理生理学特征、S2级的病理生理学特征和S3级的病理生理学特征(如上文所定义)中的任何一种的受试者，无论是在死亡前还是在尸检时。
在一个实施方案中，参考受试者是S1级受试者。
如本文所用，“S1级受试者”先前已被诊断或鉴定为患有或具有阿尔茨海默病静默期S1级。优选地，“S1级受试者”先前未曾被或将不会被诊断或鉴定为患有或具有阿尔茨海默病静默期S2级或S3级。优选地，“S1级受试者”先前已被诊断或鉴定为患有S1级的病理生理学特征，但没有S2级的病理生理学特征或S3级的病理生理学特征(如上文所定义)，也没有轻度认知障碍(MCI)和痴呆。
在一个实施方案中，S1级受试者是动物，优选哺乳动物。
哺乳动物的实例包括但不限于人、非人灵长类动物(例如，黑猩猩和其他猿类以及猴物种)、农场动物(例如，牛、马、绵羊、山羊和猪)、家养动物(例如，兔、狗和猫)、实验室动物(例如，大鼠、小鼠和豚鼠)等。所述术语不表示特定的年龄或性别。
在一个实施方案中，参考受试者是先前已被诊断或鉴定为患有或具有阿尔茨海默病静默期S1级的受试者，无论是在死亡前还是在尸检时。
在一个实施方案中，参考标识或参考谱来源于对源自或获自参考群体中的参考受试者的参考样品中的表1A或表1B的生物标志物的水平、量或浓度的测定。
在一个实施方案中，参考标识或参考谱来源于对源自或获自参考群体中的参考受试者的参考样品中的表2A、表2B或表2C的生物标志物的水平、量或浓度的测定。
在一个实施方案中，参考群体包含S1级受试者，优选至少25个、更优选至少30个、更优选至少35个、更优选至少40个、更优选至少45个、更优选至少50个、更优选至少75个、更优选至少100个、更优选至少150个、更优选至少200个并且甚至更优选至少500个S1级受试者，如上文所定义。
在一个实施方案中，参考群体包含先前已被诊断或鉴定为患有或具有阿尔茨海默病静默期S1级的受试者，无论是在死亡前还是在尸检时，优选至少25个、更优选至少30个、更优选至少35个、更优选至少40个、更优选至少45个、更优选至少50个、更优选至少75个、更优选至少100个、更优选至少150个、更优选至少200个并且甚至更优选至少500个先前已被诊断或鉴定为患有或具有阿尔茨海默病静默期S1级的已故受试者，无论是在死亡前还是在尸检时。
在一个实施方案中，参考受试者是S2级受试者。
如本文所用，“S2级受试者”先前已被诊断或鉴定为患有或具有阿尔茨海默病静默期S2级。优选地，“S2级受试者”先前未曾被或将不会被诊断或鉴定为患有或具有阿尔茨海默病静默期S3级。优选地，“S2级受试者”先前已被诊断或鉴定为患有S2级的病理生理学特征，但没有S3级的病理生理学特征(如上文所定义)，也没有阿尔茨海默病相关的轻度认知障碍(MCI)和阿尔茨海默病痴呆。
在一个实施方案中，S2级受试者是动物，优选哺乳动物。
哺乳动物的实例包括但不限于人、非人灵长类动物(例如，黑猩猩和其他猿类以及猴物种)、农场动物(例如，牛、马、绵羊、山羊和猪)、家养动物(例如，兔、狗和猫)、实验室动物(例如，大鼠、小鼠和豚鼠)等。所述术语不表示特定的年龄或性别。
在一个实施方案中，参考受试者是先前已被诊断或鉴定为患有或具有阿尔茨海默病静默期的S2级的受试者，无论是在死亡前还是在尸检时。
在一个实施方案中，参考标识或参考谱来源于对源自或获自参考群体中的参考受试者的参考样品中的表1A或表1B的生物标志物的水平、量或浓度的测定。
在一个实施方案中，参考标识或参考谱来源于对源自或获自参考群体中的参考受试者的参考样品中的表2A、表2B或表2C的生物标志物的水平、量或浓度的测定。
在一个实施方案中，参考群体包含S2级受试者，优选至少25个、更优选至少30个、更优选至少35个、更优选至少40个、更优选至少45个、更优选至少50个、更优选至少75个、更优选至少100个、更优选至少150个、更优选至少200个并且甚至更优选至少500个S2级受试者，如上文所定义。
在一个实施方案中，参考群体包含先前已被诊断或鉴定为患有或具有阿尔茨海默病静默期S2级的受试者，无论是在死亡前还是在尸检时，优选至少25个、更优选至少30个、更优选至少35个、更优选至少40个、更优选至少45个、更优选至少50个、更优选至少75个、更优选至少100个、更优选至少150个、更优选至少200个并且甚至更优选至少500个先前已被诊断或鉴定为患有或具有阿尔茨海默病静默期S2级的已故受试者，无论是在死亡前还是在尸检时。
在一个实施方案中，参考受试者是S3级受试者。
如本文所用，“S3级受试者”先前已被诊断或鉴定为患有或具有阿尔茨海默病静默期S3级。优选地，“S3级受试者”先前已被诊断或鉴定为患有S3级的病理生理学特征，但没有阿尔茨海默病痴呆。在一些情况下，可以将阿尔茨海默病相关的MCI视为S3级受试者。
在一个实施方案中，S3级受试者是动物，优选哺乳动物。
哺乳动物的实例包括但不限于人、非人灵长类动物(例如，黑猩猩和其他猿类以及猴物种)、农场动物(例如，牛、马、绵羊、山羊和猪)、家养动物(例如，兔、狗和猫)、实验室动物(例如，大鼠、小鼠和豚鼠)等。所述术语不表示特定的年龄或性别。
在一个实施方案中，参考受试者是先前已被诊断或鉴定为患有或具有阿尔茨海默病静默期S3级的受试者，无论是在死亡前还是在尸检时。
在一个实施方案中，参考标识或参考谱来源于对源自或获自参考群体中的参考受试者的参考样品中的表1A或表1B的生物标志物的水平、量或浓度的测定。
在一个实施方案中，参考标识或参考谱来源于对源自或获自参考群体中的参考受试者的参考样品中的表2A、表2B或表2C的生物标志物的水平、量或浓度的测定。
在一个实施方案中，参考群体包含S3级受试者，优选至少25个、更优选至少30个、更优选至少35个、更优选至少40个、更优选至少45个、更优选至少50个、更优选至少75个、更优选至少100个、更优选至少150个、更优选至少200个并且甚至更优选至少500个S3级受试者，如上文所定义。
在一个实施方案中，参考群体包含先前已被诊断或鉴定为患有或具有阿尔茨海默病静默期S3级的受试者，无论是在死亡前还是在尸检时，优选至少25个、更优选至少30个、更优选至少35个、更优选至少40个、更优选至少45个、更优选至少50个、更优选至少75个、更优选至少100个、更优选至少150个、更优选至少200个并且甚至更优选至少500个先前已被诊断或鉴定为患有或具有阿尔茨海默病静默期S3级的已故受试者，无论是在死亡前还是在尸检时。
通过表明来自参考群体的大量样品，可想到计算出表1A或表1B(或表2A、表2B或表2C)中每种生物标志物的中值的和/或平均的水平、量或浓度——或者，可以创建表1A或表1B(或表2A、表2B或表2C)中生物标志物的水平、量或浓度的参考标识或参考谱。关于这些结果，给定生物标志物的相应水平、量或浓度——或者，生物标志物的水平、量或浓度的相应参考标识或参考谱——可以经监测为显著不同(例如显著更高或显著更低)或基本上相似。
在一个实施方案中，参考标识或参考谱是使用算法和其他统计上和结构上分类的方法构建的。来自参考群体的样品用于计算至少1种，优选至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物的平均谱。在一个实施方案中，参考标识或参考谱是使用算法和其他统计上和结构上分类的方法构建的。来自参考群体的样品用于计算至少1种，优选至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物的平均谱。这些参考标识或参考谱是针对以下四个参考组计算的：(1)健康受试者，(2)S1级受试者，(3)S2级受试者和(4)S4级受试者，并且其此后被称为“组质心(group centroid)”。
在一个实施方案中，质心居中。在一个实施方案中，质心通过生物标志物进行缩放。在一个实施方案中，质心居中并通过生物标志物进行缩放。
基于质心分类的基因表达谱型的癌症类别预测是本领域技术人员公知的技术。可以参考例如Tibshirani et al.,2002.Proc Natl Acad Sci U S A.99(10):6567-72；Dabney,2005.Bioinformatics.21(22):4148-54；和Shen et al.,2009.J BiomedInform.42(1):59-65。
在一个实施方案中，如果至少1种，优选至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多种选自表1A或表1B(或表2A、表2B或表2C)的生物标志物组的生物标志物的水平、量或浓度在与源自或获自基本上健康的受试者的参考标识或参考谱相比时如表3所述地变化，则本发明的分子标识或分子谱是阿尔茨海默病静默期、其S1级、其S2级和/或其S3级的特征。
表3：阿尔茨海默病静默期在S1级、S2级和S3级与基本上健康相比的生物标志物变化谱
“+”表示显著更高(即，与基本上健康相比>+5％)；
“-”表示显著更低(即，与基本上健康相比>-5％)；
“＝”表示基本上相似(即，与基本上健康者相比<±5％)。
Figure BDA0003690741530000521
Figure BDA0003690741530000531
Figure BDA0003690741530000541
Figure BDA0003690741530000551
Figure BDA0003690741530000561
Figure BDA0003690741530000571
Figure BDA0003690741530000581
Figure BDA0003690741530000591
Figure BDA0003690741530000601
Figure BDA0003690741530000611
在一个实施方案中，如果至少1种，优选至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多种选自表4A的生物标志物组的生物标志物的水平、量或浓度，当与基本上健康的受试者或基本上健康的受试者群体中的相同标志物的水平、量或浓度相比时显著更低(即，低5％以上)，则本发明的分子标识或分子谱是阿尔茨海默病静默期S1级的特征。
表4A
Figure BDA0003690741530000621
Figure BDA0003690741530000631
Figure BDA0003690741530000641
在一个实施方案中，如果至少1种，优选至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多种选自表4B的生物标志物组的生物标志物的水平、量或浓度，当与基本上健康的受试者或基本上健康的受试者群体中的相同标志物的水平、量或浓度相比时显著更高(即，高5％以上)，则本发明的分子标识或分子谱是阿尔茨海默病静默期S1级的特征。
表4B
Figure BDA0003690741530000642
Figure BDA0003690741530000651
Figure BDA0003690741530000661
在一个实施方案中，如果至少1种，优选至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23种选自表4C的生物标志物组的生物标志物的水平、量或浓度，当与基本上健康的受试者或基本上健康的受试者群体中的相同标志物的水平、量或浓度相比时基本上相似(即，不低于或高于5％以上)，则本发明的分子标识或分子谱是阿尔茨海默病静默期S1级的特征。
表4C
Figure BDA0003690741530000662
Figure BDA0003690741530000671
在一个实施方案中，如果满足以下，则本发明的分子标识或分子谱是阿尔茨海默病静默期S1级的特征：
-至少1种，优选至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多种选自表4A的生物标志物组的生物标志物的水平、量或浓度，当与基本上健康的受试者或基本上健康的受试者群体中的相同标志物的水平、量或浓度相比时显著更低(即，低5％以上)，
-至少1种，优选至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多种选自表4B的生物标志物组的生物标志物的水平、量或浓度，当与基本上健康的受试者或基本上健康的受试者群体中的相同标志物的水平、量或浓度相比时显著更高(即，高5％以上)，和/或
-至少1种，优选至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23种选自表4C的生物标志物组的生物标志物的水平、量或浓度，当与基本上健康的受试者或基本上健康的受试者群体中的相同标志物的水平、量或浓度相比时基本上相似(即，不低于或高于5％以上)。
在一个实施方案中，如果至少1种，优选至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多种选自表5A的生物标志物组的生物标志物的水平、量或浓度，当与基本上健康的受试者或基本上健康的受试者群体中的相同标志物的水平、量或浓度相比时显著更低(即，低5％以上)，则本发明的分子标识或分子谱是阿尔茨海默病静默期S2级的特征。
表5A
Figure BDA0003690741530000681
Figure BDA0003690741530000691
Figure BDA0003690741530000701
在一个实施方案中，如果至少1种，优选至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多种选自表5B的生物标志物组的生物标志物的水平、量或浓度，当与基本上健康的受试者或基本上健康的受试者群体中的相同标志物的水平、量或浓度相比时显著更高(即，高5％以上)，则本发明的分子标识或分子谱是阿尔茨海默病静默期S2级的特征。
表5B
Figure BDA0003690741530000702
Figure BDA0003690741530000711
Figure BDA0003690741530000721
在一个实施方案中，如果至少1种，优选至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29种选自表5C的生物标志物组的生物标志物的水平、量或浓度，当与基本上健康的受试者或基本上健康的受试者群体中的相同标志物的水平、量或浓度相比时基本上相似(即，不低于或高于5％以上)，则本发明的分子标识或分子谱是阿尔茨海默病静默期S2级的特征。
表5C
Figure BDA0003690741530000731
在一个实施方案中，如果满足以下，则本发明的分子标识或分子谱是阿尔茨海默病静默期S2级的特征：
-至少1种，优选至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多种选自表5A的生物标志物组的生物标志物的水平、量或浓度，当与基本上健康的受试者或基本上健康的受试者群体中的相同标志物的水平、量或浓度相比时显著更低(即，低5％以上)，
-至少1种，优选至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多种选自表5B的生物标志物组的生物标志物的水平、量或浓度，当与基本上健康的受试者或基本上健康的受试者群体中的相同标志物的水平、量或浓度相比时显著更高(即，高5％以上)，和/或
-至少1种，优选至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29种选自表5C的生物标志物组的生物标志物的水平、量或浓度，当与基本上健康的受试者或基本上健康的受试者群体中的相同标志物的水平、量或浓度相比时基本上相似(即，不低于或高于5％以上)。
在一个实施方案中，如果至少1种，优选至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多种选自表6A的生物标志物组的生物标志物的水平、量或浓度，当与基本上健康的受试者或基本上健康的受试者群体中的相同标志物的水平、量或浓度相比时显著更低(即，低5％以上)，则本发明的分子标识或分子谱是阿尔茨海默病静默期S3级的特征。
表6A
Figure BDA0003690741530000741
Figure BDA0003690741530000751
Figure BDA0003690741530000761
在一个实施方案中，如果至少1种，优选至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多种选自表6B的生物标志物组的生物标志物的水平、量或浓度，当与基本上健康的受试者或基本上健康的受试者群体中的相同标志物的水平、量或浓度相比时显著更高(即，高5％以上)，则本发明的分子标识或分子谱是阿尔茨海默病静默期S3级的特征。
表6B
Figure BDA0003690741530000771
Figure BDA0003690741530000781
Figure BDA0003690741530000791
在一个实施方案中，如果至少1种，优选至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25种选自表6C的生物标志物组的生物标志物的水平、量或浓度，当与基本上健康的受试者或基本上健康的受试者群体中的相同标志物的水平、量或浓度相比时基本上相似(即，不低于或高于5％以上)，则本发明的分子标识或分子谱是阿尔茨海默病静默期S3级的特征。
表6C
Figure BDA0003690741530000792
在一个实施方案中，如果满足以下，则本发明的分子标识或分子谱是阿尔茨海默病静默期S3级的特征：
-至少1种，优选至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多种选自表6A的生物标志物组的生物标志物的水平、量或浓度，当与基本上健康的受试者或基本上健康的受试者群体中的相同标志物的水平、量或浓度相比时显著更低(即，低5％以上)，
-至少1种，优选至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多种选自表6B的生物标志物组的生物标志物的水平、量或浓度，当与基本上健康的受试者或基本上健康的受试者群体中的相同标志物的水平、量或浓度相比时显著更高(即，高5％以上)，和/或
-至少1种，优选至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25种选自表6C的生物标志物组的生物标志物的水平、量或浓度，当与基本上健康的受试者或基本上健康的受试者群体中的相同标志物的水平、量或浓度相比时基本上相似(即，不低于或高于5％以上)。
本发明还涉及使用本发明的分子标识或分子谱诊断有此需要的受试者中的阿尔茨海默病静默期的方法。
本发明还涉及使用本发明的分子标识或分子谱将受试者的阿尔茨海默病静默期分级为级别，优选分级为S1、S2或S3级的方法。
本发明还涉及使用本发明的分子标识或分子谱来预测受试者中阿尔茨海默病静默期的进展的方法。
在一个实施方案中，本发明的方法包括提供来自受试者的样品的步骤。
如本文所用，术语“样品”通常是指对其测试生物标志物，优选选自表1A或表1B(或表2A、表2B或表2C)的生物标志物组的生物标志物的表达水平的任何样品。
在一个实施方案中，本发明的方法包括提供来自受试者的样品的步骤。
在一个实施方案中，样品是身体组织样品或体液样品。
在一个实施方案中，样品是身体组织样品。身体组织的实例包括但不限于肌肉、神经、脑、心脏、肺、肝、胰腺、脾、胸腺、食道、胃、肠、肾、睾丸、前列腺、卵巢、毛发、皮肤、骨骼、乳房、子宫、膀胱和脊髓。
在一个优选的实施方案中，样品不是身体组织样品。
在一个优选实施例中，样品是体液。体液的实例包括但不限于血液、血浆、血清、淋巴液、腹水、囊液、尿液、胆汁、乳头渗出液、滑液、支气管肺泡灌洗液、痰液、羊水、腹膜液、脑脊液、胸水(pleural fluid)、心包液、精液、唾液、汗液、粪便、排泄物和肺泡巨噬细胞。
在一个优选的实施方案中，样品是选自血液、血浆和血清的体液。
在一个优选的实施方案中，样品不是脑脊液样品。
在一个优选的实施方案中，样品不是粪便或排泄物。
在一个实施方案中，样品先前取自受试者，即，本发明的方法不包括从受试者回收样品的步骤。因此，根据该实施方案，本发明的方法是非侵入性方法或“体外方法”。
在一个实施方案中，本发明的方法包括根据本发明在来自受试者的所述样品中确定受试者的分子标识或分子谱的步骤。
在一个实施方案中，确定受试者的分子标识或分子谱的步骤包括如上文所述地测定至少1种，优选至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多种选自表1A或表1B的生物标志物组的生物标志物的水平、量或浓度的子步骤。
在一个实施方案中，确定受试者的分子标识或分子谱的步骤包括如上文所述地测定至少1种，优选至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物组的生物标志物的水平、量或浓度的子步骤。
在一个实施方案中，生物标志物的水平、量或浓度可以通过本领域公知的方法测定。这样的方法包括但不限于质谱(例如，串联质谱[MS/MS]、色谱辅助质谱及其组合)、免疫组织化学、多重方法(Luminex)、蛋白印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、夹心ELISA、荧光酶联免疫吸附测定(FLISA)、酶免疫测定(EIA)、放射免疫测定(RIA)、RT-PCR、RT-qPCR、Northern Blot、杂交技术(例如使用微阵列及其组合，包括但不限于通过RT-PCR获得的扩增子的杂交、测序例如下一代DNA测序(NGS)或RNA-seq(也称为“全转录组鸟枪法测序”))等。
在一个实施方案中，本发明的方法包括将受试者的分子标识或分子谱与至少一种参考标识或参考谱相关联的步骤，如上文所述。
参考标识或参考谱可以在软件中执行，或者可以构建跨测定的总体中值或其他算术平均值。
在一个实施方案中，将受试者的分子标识或分子谱与至少一种参考标识或参考谱相关联的步骤可以通过将受试者的分子标识或分子谱输入到先前用参考受试者中测定的生物标志物的水平、量或浓度训练以解读每种参考标识或参考谱的算法中来执行。经训练的算法会将受试者的分子标识或分子谱与参考标识或参考谱进行比较。
在一个实施方案中，算法得出受试者的分子标识或分子谱与至少一种参考标识或参考谱中的每一种，优选与四种参考标识或参考谱(即健康、S1级、S2级和S3级)中的每一种的拟合(fitting)百分比。
在一个实施方案中，如果受试者的分子标识或分子谱与健康参考标识或参考谱相拟合，则将受试者归为未患有阿尔茨海默病静默期。
在一个实施方案中，如果受试者的分子标识或分子谱与S1级、S2级或S3级参考标识或参考谱中的任一种相拟合，则将受试者归为患有阿尔茨海默病静默期，优选阿尔茨海默病静默期S1级、S2级或S3级。
在一个实施方案中，如果受试者的分子标识或分子谱与表3的S1级、S2级或S3级生物标志物变化谱中的任一种相拟合，则将受试者归为患有阿尔茨海默病静默期，优选阿尔茨海默病静默期S1级、S2级或S3级。
在一个实施方案中，如果受试者的分子标识或分子谱包含：
-至少1种，优选至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多种选自表4A的生物标志物组的生物标志物，其水平、量或浓度与基本上健康的受试者或基本上健康的受试者群体中的相同标志物的水平、量或浓度相比时显著更低(即，低5％以上)，
-至少1种，优选至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多种选自表4B的生物标志物组的生物标志物，其水平、量或浓度与基本上健康的受试者或基本上健康的受试者群体中的相同标志物的水平、量或浓度相比时显著更高(即，高5％以上)，和/或
-至少1种，优选至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23种选自表4C的生物标志物组的生物标志物，其水平、量或浓度与基本上健康的受试者或基本上健康的受试者群体中的相同标志物的水平、量或浓度相比时基本上相似(即，不低于或高于5％以上)，
则将受试者归为患有阿尔茨海默病静默期S1级。
在一个实施方案中，如果受试者的分子标识或分子谱包含：
-至少1种，优选至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多种选自表5A的生物标志物组的生物标志物，其水平、量或浓度与基本上健康的受试者或基本上健康的受试者群体中的相同标志物的水平、量或浓度相比时显著更低(即，低5％以上)，
-至少1种，优选至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多种选自表5B的生物标志物组的生物标志物，其水平、量或浓度与基本上健康的受试者或基本上健康的受试者群体中的相同标志物的水平、量或浓度相比时显著更高(即，高5％以上)，和/或
-至少1种，优选至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29种选自表5C的生物标志物组的生物标志物，其水平、量或浓度与基本上健康的受试者或基本上健康的受试者群体中的相同标志物的水平、量或浓度相比时基本上相似(即，不低于或高于5％以上)，
则将受试者归为患有阿尔茨海默病静默期S2级。
在一个实施方案中，如果受试者的分子标识或分子谱包含：
-至少1种，优选至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多种选自表6A的生物标志物组的生物标志物，其水平、量或浓度与基本上健康的受试者或基本上健康的受试者群体中的相同标志物的水平、量或浓度相比时显著更低(即，低5％以上)，
-至少1种，优选至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多种选自表6B的生物标志物组的生物标志物，其水平、量或浓度与基本上健康的受试者或基本上健康的受试者群体中的相同标志物的水平、量或浓度相比时显著更高(即，高5％以上)，和/或
-至少1种，优选至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25种选自表6C的生物标志物组的生物标志物，其水平、量或浓度与基本上健康的受试者或基本上健康的受试者群体中的相同标志物的水平、量或浓度相比时基本上相似(即，不低于或高于5％以上)，
则将受试者归为患有阿尔茨海默病静默期S3级。
在一个实施方案中，相关性与四种参考标识或参考谱(即健康、S1级、S2级和S3级)中的每一种的拟合得分相关，从而允许二级分级(secondary stratification)。
在一个实施方案中，本发明的方法包括基于受试者的单独标识或谱与参考标识或参考谱的相关性，将受试者诊断为患有阿尔茨海默病静默期的步骤。
在一个实施方案中，本发明的方法包括基于受试者的单独标识或谱与参考标识或参考谱的相关性，例如基于与表3中所示的至少1种生物标志物，优选至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多种生物标志物的相关性，将受试者中的阿尔茨海默病静默期分级为级别，优选S1、S2或S3级的步骤。
在一个实施方案中，本发明的方法包括基于受试者的单独标识或谱与参考标识或参考谱的相关性，来预测受试者中阿尔茨海默病静默期的进展的步骤。
在一个实施方案中，本发明的方法包括基于受试者的单独标识或谱与参考标识或参考谱的相关性，来确定针对受试者的个体化治疗过程的步骤。
本发明还涉及使用本发明的分子标识或分子谱来治疗患有阿尔茨海默病静默期的受试者的方法。本发明还涉及使用本发明的分子标识或分子谱来治疗患有阿尔茨海默病静默期，例如阿尔茨海默病静默期S1、S2或S3级的受试者的方法。
本发明还涉及使用本发明的分子标识或分子谱确定对患有阿尔茨海默病静默期的受试者的个体化治疗过程的方法。本发明还涉及使用本发明的分子标识或分子谱确定对患有阿尔茨海默病静默期，例如阿尔茨海默病静默期S1、S2或S3级的受试者的个体化治疗过程的方法。
本发明还涉及使用本发明的分子标识或分子谱为患有阿尔茨海默病静默期的受试者界定临床管理(defining a clinical management)的方法。本发明还涉及使用本发明的分子标识或分子谱为患有阿尔茨海默病静默期，例如阿尔茨海默病静默期S1、S2或S3级的受试者界定临床管理的方法。
在一个实施方案中，治疗或确定个体化治疗过程或界定临床管理的方法包括诊断受试者中的阿尔茨海默病静默期的步骤，如上文所述。
在一个实施方案中，治疗或确定个体化治疗过程或界定临床管理的方法包括将受试者中的阿尔茨海默病静默期分级为级别，优选S1、S2或S3级的步骤，如上文所述。
在一个实施方案中，治疗或确定个体化治疗过程或界定临床管理的方法包括治疗受试者的进一步步骤。
在一个实施方案中，治疗受试者的步骤旨在预防或降低或减轻受试者中发展阿尔茨海默病或由于阿尔茨海默病引起的痴呆的临床症状的风险。
阿尔茨海默病静默期的治疗的实例包括但不限于β-分泌酶1(Bace1)抑制剂、抗淀粉样蛋白抗体、抗炎剂、抗Tau抗体、记忆增强剂、突触可塑性增强剂、神经保护增强剂、微生物群调节剂、Tau或Aβ聚集和晶种(seeding)的抑制剂以及抗焦虑药物。
阿尔茨海默病静默期S1级的治疗的实例包括但不限于β-分泌酶1(Bace1)抑制剂、抗淀粉样蛋白抗体、Aβ晶种的抑制剂、抗炎剂和抗焦虑药物。
阿尔茨海默病静默期S2级的治疗的实例包括但不限于β-分泌酶1(Bace1)抑制剂、抗淀粉样蛋白抗体、抗炎剂、抗Tau抗体、突触可塑性增强剂、神经保护增强剂、Tau或Aβ聚集和晶种的抑制剂、记忆增强剂、微生物群调节剂和抗焦虑药物。
阿尔茨海默病静默期S3级的治疗的实例包括但不限于β-分泌酶1(Bace 1)抑制剂、抗淀粉样蛋白抗体、抗炎剂、抗Tau抗体、记忆增强剂、突触可塑性增强剂、神经保护增强剂、Tau或Aβ聚集和晶种的抑制剂以及抗焦虑药物。
Bace 1抑制剂的实例包括但不限于CTS-21166(CoMentis Inc.)、维罗司他(verubecestat)(MK-8931；Merck&Co.,Inc.)、solanezumab(Eli Lilly&Co.)、lanabecestat(AZD3293；AstraZeneca and Eli Lilly&Co.)、Elenbecestat(Biogen)和LY2886721(Eli Lilly&Co.)。
抗淀粉样蛋白抗体的实例包括但不限于巴匹珠单抗(bapineuzumab)(Janssen/Pfizer)、solanezumab(Eli Lilly)、crenezumab(Genentech)、更汀芦单抗(gantenerumab)(Hoffman-La Roche)、BAN2401(Biogen/Eisai Inc.)、GSK 933776(GlaxoSmithKline)、AAB-003(Janssen/Pfizer)、SAR228810(Sanofi)、BIIB037/BART(Biogen)、ACI-24(ACImmune)和阿杜那单抗(aducanumab)(Biogen/Eisai Inc.)。
抗炎剂的实例包括但不限于非甾体抗炎药(NSAID)、甾体抗炎药(SAID)、β-激动剂、抗胆碱能药物和甲基黄嘌呤。
抗Tau抗体的实例包括但不限于ABBV-8E12(Abbvie)、ACI-35(AC Immune)、BIIB092(Biogen)和gosuranemab(Biogen)。
记忆增强剂的实例包括但不限于代谢底物(例如，葡萄糖、酮类、补氧)、生物碱(例如，可可碱、咖啡因)、维生素、氨基酸、矿物质、微量营养素、植物提取物及其衍生物、草药或草药营养补充剂(例如，银杏、人参根)。
Tau的聚集和晶种抑制剂的实例包括但不限于TRx0237(TauRx)和Morphomer Tau(AC Immune)。
突触可塑性增强剂的实例包括但不限于blarcamesine(Anavex Life Sciences)、CT1812(Cognition Therapeutics)、GRF6019(Alkahest)和LM11A-31-BHS(Pharmatrophix)。
微生物群调节剂的实例包括但不限于寡甘露酸钠(Green ValleyPharmaceuticals)、SLAB51、ProBiotic-4和来自基本上健康的受试者的粪便微生物群移植(FMT)。有关微生物群调节剂用于预防或治疗阿尔茨海默病的综述，参见Bonfili et al.,2020(FEBS J.印刷前电子发布)。
神经保护增强剂的实例包括但不限于石杉碱甲(huperzine A)、奈非西坦(nefiracetam)、丙戊茶碱(propentofylline)、ivastigmine和SGS-742。
抗焦虑药物的实例包括但不限于5-HT1AR激动剂(例如丁螺环酮(buspirone)、吉哌隆(gepirone)和坦度螺酮(tandospirone))、GABAA受体正变构调节剂(GABAAR PAM)(例如阿地唑仑(adinazolam)、阿普唑仑(alprazolam)、溴西泮(bromazepam)、卡马西泮(camazepam)、氯氮卓(chlordiazepoxide)、氯巴占(clobazam)、氯硝西泮(clonazepam)、氯拉卓酸(clorazepate)、氯噻西泮(clotiazepam)、氯恶唑仑(cloxazolam)、地西泮(diazepam)、氯氟卓乙酯(ethyl loflazepate)、依替唑仑(etizolam)、氟地西泮(fludiazepam)、哈拉西泮(halazepam)、凯他唑仑(ketazolam)、劳拉西泮(lorazepam)、美达西泮(medazepam)、去甲西泮(nordazepam)、奥沙西泮(oxazepam)、匹那西泮(pinazepam)、普拉西泮(prazepam)、阿吡坦(alpidem)、苯巴比妥(phenobarbital)、卡立普多(carisoprodol)、甲丙氨酯(meprobamate)、氯美扎酮(chlormezanone)、乙醇(酒精)、依替福辛(etifoxine)、伊匹妥英(imepitoin)、卡瓦(kava)、黄芩(skullcap)和缬草(valerian))、α2δ电压依赖性钙通道(VDCC)阻滞剂(例如，加巴喷丁(gabapentin)、加巴喷丁酯(gabapentin enacarbil)、菲尼布特(phenibut)和普瑞巴林(pregabalin))、抗抑郁药(例如，例如，依他普仑(escitalopram)、度洛西汀(duloxetine)、曲唑酮(trazodone)、氯米帕明(clomipramine)、米氮平(mirtazapine)、苯乙肼(phenelzine)、阿戈美拉汀(agomelatine)、安非他酮(bupropion)、噻奈普汀(tianeptine)、维拉佐酮(vilazodone)和沃替西汀(vortioxetine))、抗交感神经药(例如，哌唑嗪(prazosin)、可乐定(clonidine)、右美托咪定(dexmedetomidine)、胍法辛(guanfacine)和普萘洛尔(propranolol))、苯佐他明(benzoctamine)、大麻二酚(cannabidiol)、环丝氨酸(cycloserine)、阿莫唑(fabomotizole)、羟嗪(hydroxyzine)、kanna、薰衣草(lavender)、洛吡哌唑(lorpiprazole)、mebicar、美吡哌唑(mepiprazole)、尼古丁、奥匹哌醇(opipramol)、奥沙氟生(oxaflozane)、非那二醇(phenaglycodol)、菲尼布特、匹卡米隆(picamilon)、selank、噻加宾(tiagabine)、托非索泮(tofisopam)和validolum。
有关用于治疗阿尔茨海默病的临床试验(2020年)中药物和生物制剂的管线的综述，参见Cummings et al.,2020(Alzheimers Dement(NY).6(1):e12050)，其中列出了121种目前处于临床试验中的药物。Cummings et al.,2020的内容通过引用并入，尤其是图1和表1、2、3和4中列举的药物和生物制剂。
在一个具体实施方案中，治疗或确定个体化治疗过程或界定临床管理的方法包括向被诊断为患有阿尔茨海默病静默期，例如阿尔茨海默病的无症状期或前驱期的受试者施用至少一种如上文定义的β-分泌酶1(Bace 1)抑制剂、抗淀粉样蛋白抗体、抗炎剂、抗Tau抗体、记忆增强剂、突触可塑性增强剂、神经保护增强剂、微生物群调节剂、Tau或Aβ聚集和晶种的抑制剂或抗焦虑药物。
在一个具体的实施方案中，治疗或确定个体化治疗过程或界定临床管理的方法包括向被诊断为患有阿尔茨海默病静默期，例如阿尔茨海默病的无症状期或前驱期的受试者施用至少一种如上文定义的抗淀粉样蛋白抗体。
在一个具体的实施方案中，治疗或确定个体化治疗过程或界定临床管理的方法包括向被诊断为患有阿尔茨海默病静默期，例如阿尔茨海默病的无症状期或前驱期的受试者施用至少一种选自包含巴匹珠单抗、solanezumab、crenezumab、更汀芦单抗、BAN2401、GSK933776、AAB-003、SAR228810、BIIB037/BART、ACI-24和阿杜那单抗的组或由以上组成的组的抗淀粉样蛋白抗体的步骤。
在一个具体的实施方案中，治疗或确定个体化治疗过程或界定临床管理的方法包括将向被诊断为患有阿尔茨海默病静默期，例如阿尔茨海默病的无症状期或前驱期的受试者施用阿杜那单抗的步骤。
在一个具体的实施方案中，治疗或确定个体化治疗过程或界定临床管理的方法包括向被诊断为患有阿尔茨海默病静默期，例如阿尔茨海默病的无症状期或前驱期的受试者施用更汀芦单抗的步骤。
在一个具体的实施方案中，治疗或确定个体化治疗过程或界定临床管理的方法包括向被诊断为患有阿尔茨海默病静默期，例如阿尔茨海默病的无症状期或前驱期的受试者施用寡甘露酯的步骤。
在一个实施方案中，治疗受试者的步骤旨在预防或降低或减轻与阿尔茨海默病相关的心血管疾病的风险。
众所周知，心血管疾病是导致发展阿尔茨海默病或发展阿尔茨海默病的风险增加的因素。因此，预防或减少或减轻心血管疾病的风险可以是二级预防措施，以预防或减少或减轻受试者中发展阿尔茨海默病或由阿尔茨海默病引起的痴呆的临床症状的风险。
用于预防或降低或减轻心血管疾病风险的手段和方法是本领域已知的，并且包括但不限于停止吸烟、将酒精保持在最低限度、吃健康和均衡的饮食、每周锻炼至少150分钟、控制血压、定期进行健康检查、治疗糖尿病(如果适用)等。
在一个实施方案中，治疗受试者的步骤旨在减缓与阿尔茨海默病相关的认知衰退的风险。
已知认知衰退是导致受试者中发展阿尔茨海默病或由阿尔茨海默病引起的痴呆的临床症状或其风险增加的因素。
减缓认知衰退风险的手段和方法是本领域公知的，并且包括但不限于阅读、学习外语、演奏乐器和维持积极的社交生活(例如，通过在当地社区做志愿者、参加团体运动、尝试新的活动或爱好)等。
在一个实施方案中，治疗受试者的步骤旨在治疗或减轻与阿尔茨海默病相关的因素。
与阿尔茨海默病相关的因素是本领域已知的，并且包括但不限于听力丧失、抑郁、孤独或社会孤立、加剧的久坐不动的生活方式等。
本发明还涉及使用本发明的分子标识或分子谱来招募患有阿尔茨海默病静默期的受试者到临床试验中的方法。本发明还涉及使用本发明的分子标识或分子谱选择患有阿尔茨海默病静默期的受试者来参加临床试验的方法。
本发明还涉及使用本发明的分子标识或分子谱来招募患有阿尔茨海默病静默期，例如阿尔茨海默病静默期的S1、S2或S3级的受试者到临床试验中的方法。本发明还涉及使用本发明的分子标识或分子谱选择患有阿尔茨海默病静默期，例如阿尔茨海默病静默期S1、S2或S3级的受试者来参加临床试验的方法。
在一个实施方案中，招募受试者到临床试验中或选择受试者参加临床试验的方法包括如上文所述地诊断受试者中的阿尔茨海默病静默期的步骤。
在一个实施方案中，招募受试者到临床试验中或选择受试者参加临床试验的方法包括如上文所述地将受试者中的阿尔茨海默病静默期分级为级别，优选S1、S2或S3级的步骤。
在一个实施方案中，招募受试者到临床试验中或选择受试者参加临床试验的方法包括招募受试者到临床试验中或选择受试者参加临床试验的进一步步骤。
在一个实施方案中，临床试验涉及阿尔茨海默病静默期的治疗。在一个实施方案中，临床试验涉及对阿尔茨海默病静默期治疗的安全性和/或有效性的研究。
在一个实施方案中，任选在临床试验期间，至少还有一次或至少还有两次可以实施本发明的方法，例如在临床试验期间和/或在临床试验结束时，以在受试者用测试化合物治疗时监测本发明的分子标识或分子谱。
或者，本发明的方法也可以在临床试验结束时用作主要或次要结果量度：本发明的分子标识或分子谱的一种或多种生物标志物相对于基线的变化。
在一个实施方案中，受试者是动物，优选哺乳动物。
哺乳动物的实例包括但不限于人、非人灵长类动物(例如，黑猩猩和其他猿类以及猴物种)、农场动物(例如，牛、马、绵羊、山羊和猪)、家养动物(例如，兔、狗和猫)、实验室动物(例如，大鼠、小鼠和豚鼠)等。所述术语不表示特定的年龄或性别，除非另有明确说明。
在一个实施方案中，受试者是灵长类动物，包括人和非人灵长类动物。
在一个实施方案中，受试者是人。
在一个实施方案中，受试者是男人或女人。
在一个实施方案中，受试者是幼儿。在一个实施方案中，受试者是成年体。
在一个实施方案中，受试者处于发展阿尔茨海默病的风险中。阿尔茨海默病的风险因素包括但不限于年龄、家族史、遗传等。
年龄是阿尔茨海默病的最大已知因素。大多数有症状的阿尔茨海默病患者年龄在65岁及以上。65岁以后，阿尔茨海默病的风险每五年翻一倍。85岁以后，风险达到近三分之一。
因此，在一个实施方案中，受试者年龄为20岁以上。在一个实施方案中，受试者年龄为30岁以上。在一个实施方案中，受试者年龄为40岁以上。在一个实施方案中，受试者年龄为50岁以上。在一个实施方案中，受试者年龄为60岁以上。在一个实施方案中，受试者年龄为70岁以上。在一个实施方案中，受试者年龄为80岁以上。
在一个实施方案中，受试者年龄为0至20岁。在一个实施方案中，受试者年龄为20至40岁。在一个实施方案中，受试者年龄为40至50岁。在一个实施方案中，受试者年龄为50至55岁。在一个实施方案中，受试者年龄为55至60岁。在一个实施方案中，受试者年龄为60至65岁。在一个实施例中，受试者年龄为65岁至70岁。在一个实施方案中，受试者年龄为70至75岁。在一个实施方案中，受试者年龄为75至80岁。在一个实施方案中，受试者年龄为80至85岁。在一个实施方案中，受试者年龄为85岁至90岁。
家族史是阿尔茨海默病的另一个风险因素。
因此，在一个实施方案中，受试者具有亲属，优选为父母、祖父母、曾祖父母、兄弟、姐妹、姑姨、叔伯、甥侄女、甥侄子或第一个堂表亲已被诊断为患有或被鉴定为患有阿尔茨海默病。
遗传是阿尔茨海默病的另一个风险因素。研究已表明，一些基因座中的单核苷酸多态性(SNP)可能会影响阿尔茨海默病的风险。参见，例如，Jansen et al.,2019.NatGenet.51(3):404-413。
因此，在一个实施方案中，受试者具有在选自Jansen et al.,2019(其通过引用并入)的表1中定义的那些的至少一个基因座中的至少一个单核苷酸多态性(SNP)。
阿尔茨海默病的其他风险因素是已知的。这些包括但不限于唐氏综合征、睡眠剥夺、头部损伤、心脏病、糖尿病、卒中、高血压、高胆固醇血症。
本发明还涉及使用本发明的分子标识在有此需要的受试者中诊断阿尔茨海默病静默期的计算机系统。本发明还涉及使用本发明的分子标识来诊断受试者中的阿尔茨海默病静默期的计算机实施的方法。
本发明还涉及使用本发明的分子标识将受试者中的阿尔茨海默病静默期分级为级别，优选S1、S2或S3级的计算机系统。本发明还涉及使用本发明的分子标识将受试者中的阿尔茨海默病静默期分级为级别，优选S1、S2或S3级的计算机实施的方法。
本发明还涉及使用本发明的分子标识来预测受试者中阿尔茨海默病静默期的进展的计算机系统。本发明还涉及使用本发明的分子标识来预测受试者中阿尔茨海默病静默期的进展的计算机实施的方法。
本发明还涉及使用本发明的分子标识来确定对患有阿尔茨海默病静默期的受试者的个体化治疗过程的计算机系统。本发明还涉及使用本发明的分子标识来确定对患有阿尔茨海默病静默期的受试者的个体化治疗过程的计算机实施方法。
如本文所用，术语“计算机系统”是指能够存储和处理信息和/或能够使用存储的信息来控制设备本身的行为或执行的任何和所有设备，无论此类设备是否本质上是电子的、机械的、逻辑的或虚拟的。术语“计算机系统”可以指单个计算机，也可以指一起工作以执行被描述为在计算机系统上进行或由计算机系统进行的功能的多个计算机。使用计算机系统实施的方法被称为“计算机实施的方法”。
在一个实施方案中，本发明的计算机系统包括：
(i)至少一个处理器，和
(ii)至少一种计算机可读存储介质，其存储处理器可读的代码。
如本文所用，术语“处理器”旨在包括能够对至少一个指令语(instruction word)进行操作，例如执行其从存储介质访问的指令、代码、计算机程序和脚本的任何集成电路或其他电子设备。然而，术语“处理器”不应被解释为仅限于能够执行软件的硬件，而是以一般方式指代处理设备，其可以例如包括计算机、微处理器、集成电路或可编程的逻辑设备(PLD)。处理器还可以涵盖一个或多个图形处理单元(GPU)，无论是用于计算机图形和图像处理还是其他功能。此外，能够执行相关的和/或产生的功能性的指令和/或数据可以存储在任何处理器可读介质上，包括但不限于集成电路、硬盘、磁带(包括软盘和压缩磁盘)、光盘(包括蓝光、激光光盘和数字通用光盘)、闪存(包括存储卡和USB闪存驱动器)、随机存取存储器(RAM)(包括动态和静态RAM)、只读存储器(ROM)或高速缓存(cache)。指令尤其可以存储在硬件、软件、固件(firmware)或其任何组合中。
处理器的实例包括但不限于中央处理单元(CPU)、微处理器、数字信号处理器(DSP)、通用微处理器、专用集成电路(ASIC)、区域性可编程逻辑阵列(FPGA)和其他等价的集成或分立逻辑电路。
本发明还涉及包含处理器可读的软件代码的计算机程序，所述软件代码适于在由所述处理器执行时进行如本文所述的计算机实施的方法。
本发明还涉及一种计算机可读存储介质，其包含处理器可读的代码，所述代码在由所述处理器执行时使处理器进行如本文所述的计算机实施的方法的步骤。
计算机可读存储介质的实例包括但不限于集成电路、硬盘、磁带(包括软盘和压缩磁盘)、光盘(包括蓝光、激光光盘和数字通用光盘)、闪存(包括存储卡和USB闪存驱动器)、随机存取存储器(RAM)(包括动态和静态RAM)、只读存储器(ROM)或高速缓存。
在一个实施方案中，计算机可读存储介质是非暂时性计算机可读存储介质。
在一个实施方案中，存储在计算机可读存储介质上的代码，当由计算机系统的处理器执行时，其使处理器进行以下：
a.接收在先前从受试者获得的样品中测定的至少五种选自表1A或表1B的生物标志物的输入水平、量或浓度，
b.通过组织和/或调整每个输入水平来分析和转换所述至少五种生物标志物的输入水平、量或浓度，以通过至少一种机器学习算法得出概率得分和/或分类标签，
c.生成输出，其中所述输出是分类标签和/或概率得分，和
d.基于所述输出，提供受试者是否患有阿尔茨海默病静默期的诊断；或
基于所述输出，提供受试者中的阿尔茨海默病静默期的不同级别的分级，优选S1、S2或S3级；或
基于所述输出，提供阿尔茨海默病静默期进展的预后；或
基于所述输出，提供对受试者的个体化治疗过程或确定对受试者的个体化治疗过程的信息。
在一个实施方案中，存储在计算机可读存储介质上的代码，当由计算机系统的处理器执行时，其使处理器进行以下：
a.接收在先前从受试者获得的样品中测定的至少五种选自表2A、表2B或表2C的生物标志物的输入水平、量或浓度，
b.通过组织和/或调整每个输入水平来分析和转换所述至少五种生物标志物的输入水平、量或浓度，以通过至少一种机器学习算法得出概率得分和/或分类标签，
c.生成输出，其中所述输出是分类标签和/或概率得分，和
d.基于所述输出，提供受试者是否患有阿尔茨海默病静默期的诊断；或
基于所述输出，提供受试者中的阿尔茨海默病静默期的不同级别的分级，优选S1、S2或S3级；或
基于所述输出，提供阿尔茨海默病静默期进展的预后；或
基于所述输出，提供对受试者的个体化治疗过程或确定对受试者的个体化治疗过程的信息。
如本文所用，术语“学习算法”或“机器学习算法”是指自动分析模型构建的计算机执行算法，例如用于聚类、分类或谱识别。学习算法对提供给算法的训练数据集进行分析。学习算法输出“模型”，也称为“分类器”、“分类算法”或“诊断算法”。模型作为输入接收测试数据，并作为输出产生将输入数据推断或分类为属于一个或另一个类别、聚类组或标度上的位置，例如诊断、阶段、预后、疾病进展、对药物的应答性等。
“数据集”是用于构建机器学习数学模型以进行数据驱动的预测或决策的数据集合。在“监督学习(supervised learning)”(即，以标记的训练数据的形式从已知的输入-输出实例中推断函数)，三种类型的机器学习数据集通常专用于三项不同类型的任务：“训练”，即拟合参数；“验证”，即调整机器学习超参数(其是用于控制学习过程的参数)；和“测试”，即独立于用于构建数学模型(其提供令人满意的结果)的训练数据集进行检查。
可以使用多种学习算法来推断受试者的状况或状态。机器学习算法可以是有监督的或无监督的。学习算法包括但不限于人工神经网络(例如，反向传播网络)、判别分析(例如，贝叶斯分类器(Bayesian classifier)、费舍尔分析(Fischer analysis))、支持向量机、决策树(例如，递归分割过程，例如分类和回归树[CART])、随机森林、线性分类器(例如，多元线性回归[MLR]、偏最小二乘法[PLS]回归、主成分回归[PCR])、层次聚类和聚类分析。学习算法生成可用于进行推断，例如关于受试者疾病状态的推断的模型或分类器。
在一个实施方案中，所述至少一种机器学习算法先前用至少一个训练数据集训练过。
在一个实施方案中，所述至少一个训练数据集包含与先前从参考受试者(即，从已知阿尔茨海默病状态的受试者)获得的样品中表1A的相同的至少五种生物标志物(与计算机实施方法的步骤a.的至少五种生物标志物相同)的水平、量或浓度有关的信息。
在一个实施方案中，所述至少一个训练数据集包含与先前从基本上健康的受试者和已知患有阿尔茨海默病静默期的受试者获得的样品中表1A的相同的至少五种生物标志物的水平、量或浓度有关的信息。
在一个实施方案中，训练数据集包含表3的生物标志物变化谱。
在一个实施方案中，所述至少一种机器学习算法选自人工神经网络(ANN)、感知器算法、深度神经网络、聚类算法、k-最近邻算法(k-NN)、决策树算法、随机森林算法、线性回归算法、逻辑回归算法、线性判别分析(LDA)算法、二次判别分析(QDA)算法、支持向量机(SVM)、贝叶斯算法、简单规则算法、聚类算法、元分类器算法、高斯混合模型(GMM)算法、最近质心算法、梯度提升算法(例如，极端梯度提升[XG Boost]算法或自适应提升(adaptative boosting)[AdaBoost]算法)、线性混合效应模型算法及其组合。
附图简要说明
图1：阿尔茨海默病静默期在脑主要事件功能方面分级为S1、S2和S3级：可溶性Aβ肽产生、Tau过度磷酸化和聚集病变(老年斑和缠结)的出现。受试者中痴呆的发作表明所谓的临床阶段的开始。
图2：人、转基因小鼠和AgenT大鼠中阿尔茨海默病进展之间的比较。如图所示，转基因小鼠不适合再现在人中观察到的AD进展，尤其是其静默期。相比之下，AgenT大鼠模型的特征使其成为比转基因动物更接近于AD静默期的模型。所有这些特征使得AgenT大鼠模型成为更好地预测根据进展阶段的血液生物标志物行为的强力工具。因此，该模型构成了表征新的生物标志物或生物标志物组的合适的研究系统，用于形成早期诊断。
图3：大脑淀粉样蛋白成像并不构成检测阿尔茨海默病患者的强力方法。事实上，30％的AD患者是PIB-PET(使用匹兹堡化合物B[PIB]的正电子发射断层扫描[PET])Aβ-，40％的健康个体是PIB-PET Aβ+。这大大降低了其作为诊断的适切性(pertinence)。
图4：AgenT S3级血浆变化的临床验证。为了解读我们在AgenT大鼠中观察到的血浆变化的临床适切性，我们将在经诊断的患者中观察到的变化(基于Doecke et al.,2012.Arch Neurol.69(10):1318-25；Mapstone et al.,2014.Nat Med.20(4):415-8；Olazarán et al.,2015.J Alzheimers Dis.45(4):1157-73；Kim et al.,2017.JAlzheimers Dis.60(3):809-817的元分析)和在S3级大鼠中观察到的那些相关联。我们观察到75％的已描述变化也存在于AgenT大鼠中(***p<0.0001；***r2＝0.71)。这一结果有力地证实了在AgenT S3级大鼠中观察到的血浆变化的高水平临床适切性。
图5：AgentT S1级血浆变化的临床验证。为了解读我们在AgenT大鼠中观察到的血浆变化的临床适切性，我们将在年轻唐氏综合征个体中观察到的变化(Caracausi et al.,2018.Sci Rep.8(1):2977)与在S1级大鼠中观察到的那些相关联。我们观察到74％的已描述变化也存在于AgenT大鼠中(***p<0.0001；***r2＝0.76)。这一结果有力地证实了在AgenT S1级大鼠中观察到的血浆变化的高水平临床适切性。
图6：阿尔茨海默病进展期间的血液生物标志物变化的实例。血液生物标志物以非线性方式随着病理学进展而演变。因此，仅基于来自被诊断为AD的患者的变化来推测静默期期间的变化是不可能的。该图显示了三个典型实例(α-2-巨球蛋白、5-羟基赖氨酸和乙基丙二酸酯)的示例。用(1)表示的曲线上的点表示在AgenT大鼠血浆中观察到的变化，其通过质谱评估。
图7：血液生物标志物鉴定过程。适合检测AD静默期受试者的119种“同类最佳”血液生物标志物听起来是一种结合神经科学和人工智能的创新策略。
图8：科学文献怀疑一些已鉴定的血液生物标志物的诊断适切性。然而，它们的静默AD谱尚不清楚，尤其是它们在整个静默期的特定非线性变化，这无法从可用的临床前或临床数据中解读。因此，我们的方法产生了对AD静默期中生物标志物随时间的演变的理解，并具有高水平的置信度(ApoE、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白A1和补体C3)。用(1)表示的曲线上的点表示在AgenT大鼠血浆中观察到的变化，其通过质谱评估；用(2)表示的曲线上的点表示在诊断为阿尔茨海默病的患者的血浆中观察到的变化(改编自Thambisetty et al.,2011.PLoS One.6(12):e28527)；用(3)表示的曲线上的点表示在诊断为阿尔茨海默病的患者的血浆中观察到的变化(改编自Wang et al.,2014.PLoS One.9(2):e89041)；用(4)表示的曲线上的点表示在诊断为阿尔茨海默病的患者的血浆中观察到的变化(改编自Liao etal.,2007.Proteomics Clin Appl.1(5):506-12)。
图9：脑释放的生物标志物与外周器官产生的生物标志物之间的比较。在“淀粉样蛋白应激条件”下测量从外周器官释放的生物标志物极大地提高了测试的特异性(即，真阳性率)和灵敏度(即，真阴性率)。
图10A-B：基于表1A的生物标志物中随机选择的14种生物标志物的神经网络用于诊断受试者的阿尔茨海默病静默期的实例。生物标志物列表如下：线粒体的10kDa热休克蛋白；5-羟基赖氨酸(来自生物标志物家族“赖氨酸及缀合物”)；线粒体的腺苷酸激酶4；钙网蛋白；肌酸激酶B型(来自生物标志物家族“肌酸激酶家族”)；麦角硫因；果糖基赖氨酸(来自生物标志物家族“赖氨酸及缀合物”)；珠蛋白c2(来自生物标志物家族“珠蛋白家族”)；整合蛋白亚基αV；肌红蛋白(来自生物标志物家族“珠蛋白家族”)；肽基脯氨酰基顺反异构酶FKBP1A；视黄酸受体应答子2；Tmprss13蛋白；和转铁蛋白受体蛋白1。
图10A：经训练以鉴定AD状态和分级的神经网络结构。在这个说明性实例中，神经网络包括左侧的14个输入(即，在表1A的生物标志物中随机选择的14种生物标志物)和右侧的4个输出(即，健康、S1级、S2级和S3级的四种谱)。
图10B：经训练神经网络以5次交叉验证用于静默AD检测的准确度。
图11A-B：基于从表1A的生物标志物中随机选择的14种生物标志物的神经网络用于将受试者中的阿尔茨海默病静默期分级为静默期的不同级别的实例。所述14种生物标志物与图10中描述的相同。
图11A：以两个样品(A和B)为例的分级方法。所述方法包括测量生物标志物的水平、量或浓度的步骤；对经训练的神经网络的原始数据进行处理以将受试者的标识或谱与每种参考标识或参考谱(健康、S1级、S2级和S3级)进行比较；计算拟合得分；并根据其谱将受试者分级。
图11B：经训练的神经网络的Ad hoc混淆矩阵用于以5次交叉验证对静默AD分级。
图12：用于通过迁移学习验证人中的119种同类最佳生物标志物的实验设计。
图13：表1A或非表1A成分的2、5、15和25种随机选择的生物标志物的平均准确度。使用双向ANOVA通过250种随机选择实现分析。
图14：表1A或非表1A成分的2、5、15和25种随机选择的生物标志物的平均准确度。使用Mann Whitney的非参数检验通过1000种随机选择实现分析。
图15A-C：使用双向ANOVA通过1000种随机选择获得的性能。
图15A：表1A或非表1A成分的2、5、15和25种随机选择的生物标志物的准确度百分比。
图15B：准确度大于70％的生物标志物组合百分比。
图15C：表1A或非表1A成分的2、5、15和25种随机选择的生物标志物的平均准确度。
实施例
本发明通过以下实施例进一步示例。
实施例1
材料与方法
动物
通过将编码人突变APP(含有Swedish和London突变的双突变APP751cDNA)和早老蛋白1(PS1)(含有M146L突变的cDNA(pENTR4-PS1-S182M146L))基因的腺相关病毒(AAV)注射到成年啮齿动物(8周龄Wistar雄性大鼠)的海马体中，来诱导AgentT大鼠模型(美国专利US10,159,227；欧洲专利EP3066203)。
对照大鼠仅注射编码早老蛋白-1(PS1)的AAV。
这种颠覆性技术允许在少数神经元中局部产生外源APP和PS1突变蛋白。这些神经元产生Aβ42肽，其逐渐扩散到整个海马体组织。大多数海马体细胞因此不具有遗传修饰，使其成为所述疾病中占病例的92％以上的非遗传形式的相关模型(Prince et al.,2015.World Alzheimer Report 2015.The global impact of dementia:An analysis ofprevalence,incidence,cost and trends(Rep.).London:Alzheimer’s diseaseinternational(ADI))。
该模型的病理生理学相关性已通过将其与AD患者的尸检样品进行比较而得到验证。Aβ42肽的浓度逐渐增加，在晚期达到与在AD患者海马体中测量的浓度相当。随着内源性Tau蛋白的过度磷酸化逐渐发生，记忆能力同时下降，再现了临床中所见的大事记的进展。淀粉样斑块和脑淀粉样血管病仅在老年AgenT大鼠中出现。过度磷酸化的Tau蛋白的神经元内聚集证实了Tau病理学的完全体现(Audrain et al.,2018.Cereb Cortex.28(11):3976-3993)。
血浆提取
为了鉴定血浆生物标志物，从33只对照大鼠和33只AgentT大鼠采集血液样品。
已进行采样的年龄：
-注射后1至3月龄的16只对照大鼠(S1级)，
-注射后1至3月龄的16只AgenT大鼠(S1级)，
-注射后8至10月龄的10只对照大鼠(S2级)，
-注射后8至10月龄的10只AgenT大鼠(S2级)，
-注射后15至30月龄的7只对照大鼠(S3级)，和
-注射后15至30月龄的7只AgenT大鼠(S3级)。
为了避免批次效应，这些实验基于6个独立的大鼠群组。
每个血液样品均与对应于不同神经系统病症的特定进展级别(S1、S2、S3)相关。这种分级使得可以表征失调分子根据疾病进展的演变。
在以2,000x g离心10分钟后通过心脏穿刺获得EDTA血浆，并将其等分到0.5mL聚丙烯管中并储存在-80℃下。
通过质谱法定量血浆成分
蛋白组质谱
血浆样品在干冰上冷冻运输。使用Biognosys的变性和还原/烷基化缓冲液在37℃下对5μL样品进行变性、还原和烷基化30分钟。
随后，使用每个样品1.6μg胰蛋白酶(Promega)在37℃下消化80μg蛋白过夜。根据制造商的说明，使用C18MacroSpincolumns(The Nest Group)对肽进行脱盐，并使用SpeedVac系统进行干燥。
将肽重悬于22μL LC溶剂A(1％乙腈于含0.1％甲酸的水中)，并在质谱分析前加入Biognosys的iRT试剂盒校准肽。
使用microBCA(Thermo Fisher)和UV/Vis光谱仪(SPECTROstar Nano，BMGLabtech)测定肽浓度。
对于数据独立采集(DIA)液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)测量，将每个样品5μg肽注射到Waters M-Class LC上的C18柱(CSH-C18 1.7μm，300μm内径，150mm长)，其连接有配备有下一代nanoFlex电喷雾源的ThermoScientific Fusion Lumos Tribrid质谱仪。
LC溶剂是：
-LC溶剂A：1％乙腈于含0.1％甲酸的水中；
-LC溶剂B：15％水于含0.1％甲酸的乙腈中。
非线性LC梯度为1-49％溶剂B 40分钟内，然后是90％B 1分钟和1％B4分钟的步骤。
使用了具有一种全范围全谱扫描(one full range survey scan)和29个DIA窗口的DIA方法。
使用Spectronaut Pulsar X软件(Biognosys)来分析HRM质谱数据。将蛋白和肽水平上的错误发现率设置为1％，使用基于行的提取来过滤数据。该项目中生成的测定文库(蛋白库(protein inventory))用于分析。使用局部回归标准化(Callister et al.,2006.J Proteome Res.5(2):277-86)将经Spectronaut分析的HRM测定结果标准化。
热图中的距离是使用“Manhattan”方法计算的，聚类对两个轴均使用“ward.D”。
使用prcomp在R中进行主要组分分析，并使用改进的ggbiplot函数进行绘图，使用mixOMICSpackage进行偏最小二乘判别分析。
一般绘图是使用ggplot2包在R中完成的。
代谢组学质谱
使用Hamilton Company的自动化MicroLab
Figure BDA0003690741530001001
系统制备样品。出于质量控制目的，在提取方法的第一步之前添加了数种回收标准物。
在剧烈摇动下用甲醇提取样品2分钟(Glen Mills GenoGrinder 2000)以沉淀蛋白并解离与蛋白结合或捕获在沉淀的蛋白基质中的小分子，然后进行离心以回收在化学上不同的代谢物。
将所得提取物分为五个部分：
-两个部分用于通过使用正离子模式电喷雾电离(ESI)的两个单独的反相(RP)/超高效液相色谱(UPLC)-MS/MS方法进行分析，
-一个部分用于使用负离子模式ESI通过RP/UPLC-MS/MS进行分析，
-一个部分用于使用负离子模式ESI通过亲水相互作用液相色谱(HILIC)/UPLC-MS/MS进行分析；和
-一个部分留作备份。
将样品短暂置于
Figure BDA0003690741530001011
(Zymark)上以去除有机溶剂。在准备分析之前，将样品提取物在氮气下储存过夜。
所有方法均使用Waters ACQUITY UPLC和Thermo Scientific Q-Exactive高分辨/精确质谱仪，其与加热电喷雾电离(HESI-II)源和以35,000质量分辨率运行的Orbitrap质量分析仪相配合。
将样品提取物干燥，然后在与四种方法的每一种均兼容的溶剂中重构。每种重构溶剂均含有一系列固定浓度的标准物，以确保注入和色谱的一致性。
一个等分试样使用酸性正离子条件(针对更亲水的化合物进行色谱优化)分析。在这种方法中，提取物使用水和甲醇(含有0.05％全氟戊酸(PFPA)和0.1％甲酸(FA))从C18柱(Waters UPLC BEH C18-2.1x100mm,1.7μm)中梯度洗脱。
第二个等分试样也使用酸性正离子条件(但针对更疏水的化合物进行了色谱优化)分析。在该方法中，提取物使用甲醇、乙腈、水、0.05％PFPA和0.01％FA从上述C18柱中梯度洗脱，并在总体较高的有机物含量下操作。
第三个等分试样使用单独的专用C18柱，使用碱性负离子优化条件分析。碱性提取物使用甲醇和水(但具有6.5mM碳酸氢铵pH 8)从柱中梯度洗脱。
第四个等分试样通过使用包含水和乙腈以及10mM甲酸铵pH 10.8的梯度从HILIC柱(Waters UPLC BEH Amide 2.1x150mm,1.7μm)洗脱和随后的负离子化来分析。
MS分析在MS和依赖于数据的MSn扫描(使用动态排除)之间交替进行。不同方法之间的扫描范围略有不同，但覆盖了约70-1000m/z。使用硬件和软件对原始数据进行提取、峰识别和质量控制处理。通过与纯化标准物或重复出现的未知实体的文库录入进行比较，来鉴定化合物。质谱设备维护基于经验证的标准物的文库，其中含有文库中存在的所有分子的保留时间/指数(RI)、质荷比(m/z)和色谱数据(包括MS/MS光谱数据)。此外，生物化学鉴定基于三个标准：在提议的鉴定的窄RI窗口内的保留指数、与文库匹配的精确质量+/-10ppm，以及MS/MS正向和反向得分。MS/MS得分基于实验光谱中存在的离子与文库录入光谱中存在的离子的比较。虽然基于这些因素之一，这些分子之间可能存在相似之处，但可以利用所有三个数据点来区分和辨别生物化学物质。已获得超过4500种商业上可用的纯化标准化合物，并登记到LIMS中，以便在所有平台上进行分析，从而确定它们的分析性特征。进行多种策展(curation)程序以确保高质量的数据集可用于统计学分析和数据解释。质量控制和策展方法设计为确保准确和一致地识别真正的化学实体，并去除那些代表系统假象、错误分配、冗余和背景噪音的实体。数据分析师使用可视化和解释软件来确认各种样品之间峰识别的一致性。对每个样品检查每种化合物的文库匹配，并在必要时进行校正。将峰量化为曲线下面积检测器离子计数。对于跨越多天的研究，进行数据调整步骤以校正由仪器日间调整差异导致的区组变化，同时保留日内变化。本质上，通过将每日的中数登记为等于1(1.00)，并按比例调整每个数据点(称为“区组校正(block correction)”)，以在平衡的运行日区组中对每种化合物进行校正。对于不需要超过一天的分析的研究，除了为数据可视化目的进行缩放外，无需调整原始数据。
血浆生物标志物的鉴定
该分析的起点是排除不相关的生物标志物。为此，我们逐步进行了以下三个步骤：
(1)我们去除了所有变化未达到某个阈值的生物标志物，即在所有样品中具有几乎相同值的生物标志物；
(2)我们运行了数种线性聚类算法(线性SVM、梯度树增强、随机森林、逻辑回归等)，这些算法针对生物标志物给出了相对重要性，并且我们排除了那些重要性可以忽略不计的。在该步骤结束时，我们可以认为，所有非常不相关的生物标志物都被摒弃了。
(3)然后我们使用为剩余的生物标志物的特征分配权重的数种算法进行了不同的递归特征消除(RFE)与交叉验证，并且我们最终选择了那些生物标志物。更详细地说，RFE是一种特征选择方法，其拟合模型并通过递归去除最弱的生物标志物，直到达到相关数量的特征。
一旦确定了最相关的生物标志物，我们选择了信息最丰富(most informative)的生物标志物用于AD静默期，如下所示：
(1)我们使用两种不同的机器学习算法(多层感知器和具有三阶多项式核的支持向量机)，通过交叉验证递归测试了这些生物标志物的所有可能组合。因此，我们连续找到了n种生物标志物的最佳组合，其中n的范围为1至250。
(2)在使我们能够获得交叉验证预测的最佳平均得分的生物标志物组合中，我们选择了生物标志物数量最少的组合，以尽可能避免过度拟合。
通过这种最后的分析，我们获得了可以被认为是不同AD级别的最具特征性的119种生物标志物(或生物标志物家族)的列表。
结果
静默AD分级
通过结合AgenT大鼠的纵向行为和脑生物化学分析，我们将AD静默期分级为3个级别(图1和表7)。
表7：AD静默期的三个级别：脑的改变和病变、认知障碍和行为。
Figure BDA0003690741530001031
S1级定义为在脑组织中产生可溶性Aβ42，其浓度足以诱发焦虑样病症。
随后，S2级定义为Aβ42在脑组织中积累的浓度足以诱导tau表位的病理性过度磷酸化和促进加速长期遗忘。
最终，S3级定义为淀粉样肽(老年斑)和磷酸化-Tau(缠结)两者的聚集。
静默期分级似乎是生物标志物鉴定的成功关键，并且通过这种方式，允许形成对AD静默期的诊断。
确定血浆成分的整体谱
通过质谱分析，我们进行了整体分析。已经实现了蛋白组学、脂质组学和代谢组学方法，以便根据其进展级别鉴定每个大鼠血浆样品的具体的谱。
因此，已经测定了2400种成分。我们通过将血浆谱和实际进展阶段(S1、S2或S3级)相关联而生成了一个完整的数据集，以开始鉴定合适的血液生物标志物。
AgenT大鼠表现出高度的临床适切性
通过对4篇已发表论文(Doecke et al.,2012.Arch Neurol.69(10):1318-25；Mapstone et al.,2014.Nat Med.20(4):415-8；Olazarán et al.,2015.J AlzheimersDis.45(4):1157-73；Kim et al.,2017.J Alzheimers Dis.60(3):809-817)的元分析，在经诊断的AD患者的血浆中鉴定出90种失调分子。
在这90种分子中，有45种出现在S3级AgenT大鼠的质谱测定的测量中。
为了解读我们在AgenT大鼠中观察到的血浆变化的临床适切性，我们将在经诊断的患者中观察到的变化与在S3级大鼠中观察到的变化相关联。我们观察到75％的已描述变化也存在于AgenT大鼠中(***p<0.0001；***r2＝0.71)。这一结果有力地证实了在AgenT S3级大鼠中观察到的血浆变化的高水平临床适切性(图4和表8)。
表8：经诊断的患者中已描述的生物标志物的血浆变化。
Figure BDA0003690741530001041
Figure BDA0003690741530001051
Figure BDA0003690741530001061
AD/对照：在所指的参考中观察到的在经诊断的AD样品和对照样品之间的变化(％)。
S3级/对照：在AgenT大鼠中观察到的在AD S3级样品和对照样品之间的变化(％)。
Cer：神经酰胺；PC：磷脂酰胆碱；PCO：烷基醚取代的磷脂酰胆碱；LysoPC：溶血磷脂酰胆碱；TAG：甘油三酯；PE：磷脂酰乙醇胺。
流行病学证据表明，到40岁时，所有患有唐氏综合征(DS)的个体均患有AD神经病理(Lott&Head,2005.Neurobiol Aging.26(3):383-9)。DS个体中AD的完全外显率是由于由21号染色体三体引起的淀粉样前体蛋白(APP)基因的额外拷贝而导致的(Rovelet-Lecruxet al.,2006.Nat Genet.38(1):24-6；Sleegers et al.,2006.Brain.129(Pt 11):2977-83)。这种遗传易感性导致患有DS的个体从出生时就开始出现AD静默期。因此，我们认为患有DS的个体在其生命早期就迅速转换为AD S1级。
通过对据发明人所知的唯一一篇发表的关于年轻DS个体中血浆生物标志物变化的论文进行分析(Caracausi et al.,2018.Sci Rep.8(1):2977)，鉴定出46种失调分子。
在这些分子中，有23种分子出现在对S1级AgenT大鼠的质谱测定的测量中。
为了解读我们在AgenT大鼠中观察到的血浆变化的临床适切性，我们将在年轻DS个体中观察到的变化与在S1级大鼠中观察到的变化相关联。我们观察到74％的已描述变化也存在于AgenT大鼠中(***p<0.0001；***r2＝0.76)。该结果有力地证实了在AgenT S1级大鼠中观察到的血浆变化的高水平临床适切性(图5和表9)。
表9：DS受试者中的已描述生物标志物的血浆变化。
Figure BDA0003690741530001071
DS/对照：在所指的参考中观察到的在DS样品和对照样品之间的变化(％)。
S1级/对照：在AgenT大鼠中观察到的在AD S1级样品和对照样品之间的变化(％)。
有趣的是，血液生物标志物随着病理进展而演变。因此，仅基于来自被诊断为AD的患者的变化来推测静默期期间的变化是不可能的。这三个典型实例(α-2-巨球蛋白、5-羟基赖氨酸和乙基丙二酸酯)如图6所示。
阿尔茨海默病静默期的合适血浆生物标志物的鉴定
一旦AgenT大鼠的临床适切性得到证实，我们鉴定了适合使用人工智能方法检测静默AD的同类最佳生物标志物(图7)。
我们鉴定出119种适合检测AD静默期的同类最佳血浆生物标志物(生物标志物家族)(表1A)。
有趣的是，鉴定出的一些生物标志物已被怀疑是潜在的AD生物标志物。然而，它们的静默AD谱尚不清楚，尤其是它们在整个静默期的特定非线性变化(图8)，这无法从可用的临床前或临床数据中解读。
因此，我们的方法产生了对AD静默期中生物标志物随时间的演变的理解，并具有高水平的置信度。
在表1A的“生物标志物家族”中，以下簇的蛋白：
-14-3-3家族：14-3-3蛋白是在所有真核细胞中表达的保守性调节分子的家族。14-3-3蛋白能够结合多种功能多样的信号传导蛋白，包括激酶、磷酸酶和跨膜受体。超过200种信号传导蛋白已被报道为14-3-3配体。主要的13-3-3家庭成员是：14-3-3蛋白β/α、14-3-3蛋白ε、14-3-3蛋白η、14-3-3蛋白γ、14-3-3蛋白θ、14-3-3蛋白ζ/δ。
-Arp2/3复合物蛋白：Arp2/3复合物是一种在肌动蛋白细胞骨架的调控中起主要作用的七亚基蛋白复合物。它是肌动蛋白细胞骨架的主要组分，并存在于大多数含有肌动蛋白细胞骨架的真核细胞中。主要的Arp2/3复合物蛋白有：肌动蛋白相关蛋白2、肌动蛋白相关蛋白2/3复合物亚基1B、肌动蛋白相关蛋白2/3复合物亚基3、肌动蛋白相关蛋白2/3复合物亚基4、肌动蛋白相关蛋白2/3复合物亚基5、肌动蛋白相关蛋白3、Arp2/3复合物34kDa亚基。
-载脂蛋白：载脂蛋白是结合脂质(油溶性物质，例如脂肪和胆固醇)以形成脂蛋白的蛋白。它们在血液、脑脊液和淋巴液中运输脂质(和脂溶性维生素)。主要的载脂蛋白有：载脂蛋白A-I、载脂蛋白A-II、载脂蛋白A-IV、载脂蛋白B-100、载脂蛋白C-I、载脂蛋白C-II、载脂蛋白C-III、载脂蛋白C-IV、载脂蛋白D、载脂蛋白E、载脂蛋白H、载脂蛋白M、载脂蛋白N。
-凝血因子家族：凝血因子是血液中有助于控制出血的蛋白。
-补体系统家族：补体系统是免疫系统的一部分，其增强抗体和吞噬细胞从生物体中清除微生物和受损细胞、促进炎症和攻击病原体细胞膜的能力。它是先天免疫系统的一部分，其不具有适应性，并且在个体的一生中不会改变。然而，补体系统可以被由适应性免疫系统产生的抗体募集并发挥作用。
-珠蛋白家族：珠蛋白是含有血红素的球状蛋白的超家族，其参与结合和/或运输氧。
-球蛋白家族：球蛋白是具有比白蛋白更高的分子量且不溶于纯水但溶于稀释盐溶液的球状蛋白的家族。一些球蛋白是在肝脏中产生的，而另一些是由免疫系统产生的。球蛋白、白蛋白和纤维蛋白原是主要的血液蛋白。
-激肽原家族：激肽原是由其作为激肽前体的作用定义的蛋白，但其也可以具有其他作用。激肽是生物活性肽，母体形式是缓激肽(bradykinin)。主要的激肽原有：激肽原、激肽原1、T-激肽原2。
-蛋白酶体复合物家族：蛋白酶体是含有四个堆叠环的“核心”以形成中心孔的圆柱状复合物。每个环包含七个单独的蛋白。内部两个环由七个β亚基组成，外部两个环各包含七个α亚基。
-丝氨酸蛋白酶抑制蛋白超家族：丝氨酸蛋白酶抑制蛋白是具有相似结构的蛋白的超家族，其鉴定了蛋白酶抑制活性。
表1A簇代谢物的其他“生物标志物家族”：
-赖氨酸及衍生物：赖氨酸在人体中发挥多种作用，最重要的是蛋白生成，并且还有胶原蛋白多肽的交联、必需矿物质营养素的摄取以及肉碱(脂肪酸代谢的关键)的生成。
-肉碱及衍生物：肉碱是在能量产生和脂肪酸代谢中起至关重要作用的条件性必需营养素。非食物获得的肉碱是由赖氨酸和甲硫氨酸这两种必需氨基酸内源合成的。肉碱调控异常与糖尿病、血液透析、创伤、营养不良、心肌病、肥胖、禁食、药物相互作用、内分泌失衡及其他病症有关(Flanagan et al,2010.Role of carnitine in disease)。
-胆酸盐及衍生物：胆酸，也称为3α,7α,12α-三羟基-5β-胆烷-24-酸，是一种不溶于水的初级胆汁酸。胆酸的盐称为胆酸盐。胆酸和鹅去氧胆酸是肝脏中通过胆固醇合成产生的两种主要胆汁酸之一。这两种主要的胆汁酸在人体中的浓度大致相等。衍生物由胆酰-CoA产生，所述胆酰-CoA将其CoA与甘氨酸或牛磺酸交换，从而分别产生甘氨胆酸和牛磺胆酸。
-戊酸盐(酯)(valerate)及衍生物：戊酸盐(酯)化合物是戊酸的盐或酯。它也被称为pentanoate。许多基于类固醇的药物，例如基于倍他米松或氢化可的松的药物，都包括类固醇作为戊酸酯。
与脑释放的生物标志物相比，外周生物标志物与预测个体AD状态更相关
目前，所有正在开发的血液生物标志物都是基于脑释放的生物标志物，尤其是Aβ42肽、Tau或磷酸化-Tau、生长因子、神经炎症作用子(neuroinflammation player)或神经元细胞死亡标志物(例如，神经丝轻链(NfL))。这种类型的生物标志物存在许多局限性，大大降低了它们检测无症状AD患者的能力。
Aβ42肽与AD状态的相关性较差。事实上，对于脑中相同浓度的可溶性Aβ42肽，一个个体将发展AD，而另一个个体则不会。这是个体对“淀粉样蛋白应激”的敏感性的结果。如果不考虑这种个体敏感性，就不可能准确地检测静默AD。
对于血液Tau、磷酸化-Tau、生长因子、神经炎症作用子或神经元细胞死亡标志物，尽管它们有可能有助于改善当前的临床AD诊断，但它们后期的失调减少了它们在检测无症状患者方面的用途。
为了解决这些问题，使用外周血生物标志物似乎是最佳解决方案。在“淀粉样蛋白应激条件”下测定从外周器官释放的生物标志物极大地提高了检测的特异性(即，真阳性率)和灵敏度(即，真阴性率)。
事实上，只有处于“淀粉样蛋白应激”下并对此有反应的个体才会发展AD，并将出现失调的血液外周生物标志物。其中鉴定的主要生物标志物是外周生物标志物(图9)。
基于生物标志物的高精度预测神经网络
通过从已鉴定的119种同类最佳血浆生物标志物列表中随机选取一些生物标志物，可以利用参考受试者(训练集)训练神经元网络，以定义如先前所述的4种参考谱。使用该经训练的神经网络，可以使用一批新的受试者(未用于训练算法的测试集)或通过交叉验证技术来计算其准确性。使用人工神经网络获得的性能高于75％。这些性能是针对训练后的算法将健康受试者与静默阿尔茨海默病受试者区分开的能力进行计算的。
使用从表1A的生物标志物中随机选择的5种(表10A)、6种(表10B)、14种(表10C)和26种(表10D)的子集，和前馈神经网络(更准确地说是多层感知器)，以及逻辑激活函数，我们可以在5次交叉验证后获得高于75％的静默AD检测准确度。
表10A：通过基于从表1A中随机抽取的5种生物标志物的神经网络来预测阿尔茨海默病静默期的性能的实例。
Figure BDA0003690741530001111
表10B：通过基于从表1A中随机抽取的6种生物标志物的神经网络来预测阿尔茨海默病静默期的性能的实例。
Figure BDA0003690741530001112
表10C：通过基于从表1A中随机抽取的14种生物标志物的神经网络来预测阿尔茨海默病静默期的性能的实例。
Figure BDA0003690741530001121
表10D：使用基于从表1A中随机抽取的26种生物标志物的神经网络来预测阿尔茨海默病静默期的性能的实例。
Figure BDA0003690741530001122
Figure BDA0003690741530001131
使用14种生物标志物的子集(表10C和11)，和前馈神经网络(更准确地说是多层感知器(图10A))，以及逻辑激活函数，我们可以在5次交叉验证后获得静默AD检测的84％的准确度，84.9％的特异性(真阴性，即，如此鉴定为健康受试者)和81％的灵敏度(真阳性，即如此鉴定为静默AD受试者)(图10B)。
表11：选自表1A的生物标志物组的14种生物标志物的子集。S1、S2和S3级各自的水平、量或浓度相比于基本上健康的变化。
Figure BDA0003690741530001141
阿尔茨海默病静默期的分级
此外，还可以仍使用相同的14种随机选择的生物标志物来检测AD的分级，如图11B中的混淆矩阵所示，其仍然使用5次交叉验证进行。
分级方法在图11A中举例说明。总而言之，对于待测试的受试者，将血液生物标志物谱与每种参考标识或参考谱进行比较。“拟合”得分由经训练的算法基于测试的个体分子标识或分子谱与参考标识或参考谱之间的拟合百分比来计算。将受试者分配至拟合得分较高的分级(健康、S1级、S2级或S3级)。
实施例2：在人中验证119种同类最佳的血浆生物标志物
材料与方法
通过对成功在脑水平上再现了阿尔茨海默病进展的连续性的非转基因动物模型(Audrain et al.,2018.Cereb Cortex.28(11):3976-3993)的血浆进行采样，我们使用人工智能鉴定出119种同类最佳的血浆生物标志物。
然后，我们分析了在痴呆发作前长达13年收集的232个人血浆样品中这些生物标志物的行为(图12)。使用了三个独立的群组：两个具有散发形式的AD(一个来自法国，一个来自西班牙)，一个具有唐氏综合征个体(来自西班牙)。表12显示了所测试患者的类型：阿尔茨海默病患者(包括无症状、前驱和痴呆患者)和非阿尔茨海默病个体(健康对照和患有除AD以外的神经退行性疾病的患者，所述除AD以外的神经退行性疾病例如额颞叶痴呆(FTD)、路易体痴呆、血管性痴呆、心理疾病、疑似非阿尔茨海默病病理生理学(SNAP)、孤立性淀粉样变性(isolated amyloidosis)、原发性进行性失语、多系统萎缩、皮质基底节变性或混合性痴呆)作为阴性对照。表13A-C显示了三个群组的疾病特征。
表12：所测试患者的类型。
Figure BDA0003690741530001151
表13A：AD群组1的疾病特征。
MMSE：简易精神状态检查；HC：健康对照；OD：除阿尔茨海默病以外的其他痴呆；pAD：前驱阿尔茨海默病；AD：阿尔茨海默病；CSF：脑脊液。
Figure BDA0003690741530001161
表13B：AD群组2的疾病特征。
MMSE：简易精神状态检查；HC：健康对照；OD：除阿尔茨海默病以外的其他痴呆；pAD：前驱阿尔茨海默病；AD：阿尔茨海默病；CSF：脑脊液。
Figure BDA0003690741530001162
表13C：DS群组的疾病特征。
CAMCOG：剑桥认知检查；aAD：无症状阿尔茨海默病；pAD：前驱阿尔茨海默病；AD：阿尔茨海默病；CSF：脑脊液。
Figure BDA0003690741530001163
Figure BDA0003690741530001171
为了验证表1A的生物标志物的信息性，我们将它们与其余的血液成分(即未在表1A中鉴定的血浆成分，以下称为“非表1A成分”)进行了如下比较：
1)我们从表1A中随机选择了一组“n”种生物标志物(n＝2、5、15或25种生物标志物)，并且仅基于这n种生物标志物在5次交叉验证和逻辑回归上评估了检测阿尔茨海默病患者的性能。在这里，我们有意使用了逻辑回归，因为它是一种允许通过线性组合它们来考虑的随机选择的生物标志物的信息性的基本分类器，其与执行非线性组合的其他算法例如神经网络相比，过度学习的风险降低。
2)将该过程进行250次和1000次，使我们能够获得针对5000种随机选择的生物标志物组中每一者检测无症状期AD的准确度。我们选择进行两个独立的运行(250和1000种组合)以证明针对2、5、15和25种随机生物标志物获得的平均性能的稳健性。
3)考虑到非表1A成分，也进行了相同的过程。因此，可以比较表1A的生物标志物和非表1A成分的性能。
4)我们使用Mann Whitney非参数检验或双向ANOVA测试了分布差异。我们还将70％的正确诊断阈值设置为可用于临床的诊断性检测的性能阈值。我们比较了针对表1A生物标志物和非表1A成分达到此阈值的随机选择组合的百分比。
结果
250种随机选择
使用2、5、15和25种血浆组分的组合获得的平均性能如表14所示。
表14：250种随机选择的平均性能。
Figure BDA0003690741530001172
Figure BDA0003690741530001181
粗体值表示表1A生物标志物与非表1A成分之间的显著差异(p<0.0001，MannWhitney非参数检验)。
重要的是，使用表1A中的5种生物标志物获得的性能与针对15种和25种非表1A成分获得的性能相同(图13)。
1000种随机选择
对于2种随机生物标志物
对于1000种随机选择，使用2种生物标志物正确鉴定AD患者的性能对于表1A的生物标志物平均为56.92％±0.002％，对于非表1A成分为53.28％±0.002％。这种区别具有显著性差异，p值<0.0001(Mann Whitney非参数检验)。
这证实了无论采用表1A中的哪2种随机生物标志物，所获得的性能都将在统计学上优于用2种随机非表1A成分获得的性能(图14)。
因此，具有表1A中的至少2种生物标志物增加了对处于静默期的阿尔茨海默病的检测。这验证了表1A中所有119种生物标志物——当使用至少2种时——相比于所有其他血浆成分在检测静默期的AD患者方面的优越性。
对于5种随机生物标志物
使用5种生物标志物正确鉴定阿尔兹海默病患者的性能对于表1A的生物标志物平均为61.65％±0.002％，对于非表1A成分为56.17％±0.002％。这种区别具有显著性差异，p值<0.0001(Mann Whitney非参数检验)。
这证实了无论采用表1A中的哪5种随机生物标志物，所获得的性能都将在统计学上优于用5种随机非表1A成分获得的性能(图14)。
因此，具有表1A中的至少5种生物标志物增加了对处于静默期的阿尔茨海默病的检测。这验证了表1A中所有119种生物标志物——当使用至少5种时——相比于所有其他血浆成分在检测静默期的AD患者方面的优越性。
对于15种随机生物标志物
使用15种生物标志物正确鉴定阿尔兹海默病患者的性能对于表1A的生物标志物平均为68.27％±0.002％，对于非表1A成分为61.56％±0.002％。这种区别具有显著性差异，p值<0.0001(Mann Whitney非参数检验)。
这证实了无论采用表1A中的哪15种随机生物标志物，所获得的性能都将在统计学上优于用15种随机非表1A成分获得的性能(图14)。有趣的是，使用表1A中的5种随机生物标志物获得的准确度与使用15种非表1A成分获得的准确度相等。
因此，具有表1A中的至少15种生物标志物增加了对处于静默期的阿尔茨海默病的检测。这验证了表1A中所有119种生物标志物——当使用至少15种时——相比于所有其他血浆成分在检测静默期的AD患者方面的优越性。
对于25种随机生物标志物
使用25种生物标志物正确鉴定阿尔兹海默病患者的性能对于表1A的生物标志物平均为71.47％±0.001％，对于非表1A成分为64.08％±0.002％。这种区别具有显著性差异，p值<0.0001(Mann Whitney非参数检验)。
这证实了无论采用表1A中的哪25种随机生物标志物，所获得的性能都将在统计学上优于用25种随机非表1A成分获得的性能(图14)。
因此，具有表1A中的至少25种生物标志物增加了对处于静默期的阿尔茨海默病的检测。这验证了表1A中所有119种生物标志物——当使用至少25种时——相比于所有其他血浆成分在检测静默期的AD患者方面的优越性。
如图15A-B中所示，使用从表1A中随机选择的25种生物标志物有65％的机率达到高于70％的准确度，但使用25种随机的非表1A成分的机率仅有12％。这种提高的性能也可以从2种生物标志物观察到，从表1A中随机选择的2种生物标志物在4％的病例中达到70％的准确度阈值，相比之下，非表1A成分为0％。因此，与其他血浆成分相比，使用表1A中的至少2种生物标志物将诊断性能显著提高高于70％。
组合的双向ANOVA分析证实了表1A的生物标志物相比于所有血浆组分(非表1A成分)在诊断阿尔茨海默病患者方面的优越性(图15C)。
有趣的是，使用5种随机选择的表1A生物标志物获得的性能略微优于使用15种非表1A成分获得的性能。这些结果再次强调了表1A的生物标志物鉴定阿尔茨海默病患者和非阿尔茨海默病个体的能力。
包括患有其他神经退行性疾病的患者在内的对照证实了表1A的生物标志物对从其静默期起的阿尔茨海默病的特异性。
结论
总而言之，我们已经基于其从对照大鼠中鉴定阿尔茨海默病大鼠的高信息价值(实施例1)，鉴定出大鼠的血浆标志物。这提出了一个关键问题，即在大鼠中鉴定的这些生物标志物在人类中的可转化性(transferability)。
知晓转基因动物模型在鉴定AD的血液生物标志物的低相关性后，我们能否证明AgenT大鼠模型在鉴定具有关于从其静默期起的阿尔茨海默病状态的信息的生物标志物方面的优越性？
对在大鼠中预先鉴定的所有119种“同类最佳”生物标志物的分析(组合使用并与其他组合的血浆分子(非表1A成分)进行比较)证明了表1A的所有生物标志物的高信息价值。实施例2确实证明了从低至两种生物标志物的组合起，来自表1A的生物标志物的所有组合提供了在统计学上优于非表1A成分的信息价值的临床诊断价值。
总之，这些数据证明，在大鼠中预先鉴定的所有生物标志物(表1A)均是人类中AD的信息性和特异性生物标志物，从而验证了此处首次使用的AgenT大鼠模型和先进的学习转化方法(learning transfer approach)。

Claims (22)

1.阿尔茨海默病静默期的分子标识，其中所述分子标识包含选自表1A的生物标志物组的至少五种生物标志物。
2.根据权利要求1所述的阿尔茨海默病静默期的分子标识，其包含表10A、表10B、表10C或表10D的生物标志物。
3.一种诊断受试者中阿尔茨海默病静默期的方法，所述方法包括以下步骤：
a)通过测量先前从所述受试者获得的样品中选自表1A的生物标志物组的至少五种生物标志物的水平、量或浓度，来确定分子标识，
b)将在步骤a)中获得的所述分子标识与参考标识进行比较，和
c)基于所述分子标识与所述参考标识的相关性，诊断所述受试者为患有阿尔茨海默病静默期。
4.一种预测受试者中阿尔茨海默病静默期的进展的方法，所述方法包括以下步骤：
a)通过测量从所述受试者获得的样品中选自表1A的生物标志物组的至少五种生物标志物的水平、量或浓度，来确定分子标识，
b)将在步骤a)中获得的所述分子标识与参考标识进行比较，和
c)基于所述分子标识与所述参考标识的相关性，来预测阿尔茨海默病的进展。
5.一种确定对患有阿尔茨海默病静默期的受试者的个体化治疗过程的方法，所述方法包括以下步骤：
a)通过测量从所述受试者获得的样品中选自表1A的生物标志物组的至少五种生物标志物的水平、量或浓度，来确定分子标识，
b)将在步骤a)中获得的所述分子标识与参考标识进行比较，和
c)基于所述分子标识与所述参考标识的相关性，来确定对所述受试者的个体化治疗过程。
6.一种将受试者中的阿尔茨海默病静默期分级为所述静默期的不同级别，优选S1、S2或S3级的方法，所述方法包括以下步骤：
a)通过测量从所述受试者获得的样品中选自表1A的生物标志物组的至少五种生物标志物的水平、量或浓度，来确定分子标识，
b)将在步骤a)中获得的所述分子标识与参考标识进行比较，和
c)基于所述分子标识与所述参考标识的相关性，将所述受试者分级为阿尔茨海默病静默期的级别。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述分子标识包含选自表1A的生物标志物组的至少14种生物标志物。
8.根据权利要求3至7中任一项所述的方法，其中所述参考标识包含在先前从基本上健康的受试者获得的样品中测量的、优选在先前从基本上健康的受试者群体获得的样品中测量的相同的所述至少五种生物标志物的水平、量或浓度。
9.根据权利要求3至8中任一项所述的方法，其中步骤c)中的相关性通过将所述分子标识中和所述参考标识中所述至少五种生物标志物的水平、量或浓度的变化与表3的生物标志物变化谱进行比较来测量。
10.根据权利要求3至9中任一项所述的方法，其中所述分子标识包含表10A、表10B、表10C或表10D的生物标志物。
11.根据权利要求3至10中任一项所述的方法，其中步骤b)中的比较使用至少一种机器学习算法进行。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述至少一种机器学习算法选自人工神经网络(ANN)、感知器算法、深度神经网络、聚类算法、k最近邻算法(k-NN)、决策树算法、随机森林算法、线性回归算法、线性判别分析(LDA)算法、二次判别分析(QDA)算法、支持向量机(SVM)、贝叶斯算法、简单规则算法、聚类算法、元分类器算法、高斯混合模型(GMM)算法、最近质心算法、极端梯度提升(XG Boost)算法、线性混合效应模型算法及其组合。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中用训练数据集训练所述至少一种机器学习算法，所述训练数据集包含与先前从基本上健康的受试者和从已知患有阿尔茨海默病静默期的受试者获得的样品中表1A的相同的所述至少五种生物标志物的水平、量或浓度有关的信息。
14.根据权利要求11至13中任一项所述的方法，其中所述至少一种机器学习算法是用包含表3的生物标志物变化谱的训练数据集来训练的。
15.一种用于诊断受试者中阿尔茨海默病静默期的计算机系统，所述计算机系统包含：
(i)至少一个处理器，和
(ii)至少一种存储介质，其存储至少一种可由所述处理器读取的代码，并且当所述代码由所述处理器执行时使所述处理器进行以下：
a.接收在先前从所述受试者获得的样品中确定的选自表1A的生物标志物组的至少五种生物标志物的输入水平、量或浓度，
b.通过组织和/或调整每个所述输入水平、量或浓度来分析和转换所述至少五种生物标志物的输入水平、量或浓度，以通过机器学习算法得出概率得分和/或分类标签，
其中所述机器学习算法是用训练数据集训练的，
其中所述训练数据集包含与先前从已知阿尔茨海默病状态的受试者获得的样品中表1A的相同的所述至少五种生物标志物的水平、量或浓度有关的信息，
c.生成输出，其中所述输出是所述分类标签或所述概率得分，和
d.基于所述输出，提供所述受试者是否患有阿尔茨海默病静默期的诊断。
16.一种用于诊断受试者中阿尔茨海默病静默期的计算机实施的方法，所述方法包括：
a.接收在先前从所述受试者获得的样品中确定的选自表1A的生物标志物组的至少五种生物标志物的输入水平、量或浓度，
b.通过组织和/或调整每个所述输入水平、量或浓度来分析和转换所述至少五种生物标志物的输入水平、量或浓度，以通过机器学习算法得出概率得分和/或分类标签，
其中所述机器学习算法是用训练数据集训练的，
其中所述训练数据集包含与先前从已知阿尔茨海默病状态的受试者获得的样品中表1A的相同的所述至少五种生物标志物的水平、量或浓度有关的信息，
c.生成输出，其中所述输出是所述分类标签或所述概率得分，和
d.基于所述输出，提供所述受试者是否患有阿尔茨海默病静默期的诊断。
17.根据权利要求15所述的计算机系统或根据权利要求16所述的计算机实施的方法，其中所述训练数据集包含与先前从基本上健康的受试者和从已知患有阿尔茨海默病静默期的受试者获得的样品中表1A的相同的所述至少五种生物标志物的水平、量或浓度有关的信息。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的计算机系统或计算机实施的方法，其中在步骤d.提供诊断包括提供将正患有阿尔茨海默病静默期的受试者分级为所述阿尔茨海默病静默期的级别，优选S1、S2或S3级。
19.根据权利要求18所述的计算机系统或计算机实施的方法，其中步骤a.包括接收选自表1A的生物标志物组的至少14种生物标志物的输入水平、量或浓度。
20.根据权利要求15至19中任一项所述的计算机系统或计算机实施的方法，其中所述训练数据集包含表3的生物标志物变化谱。
21.计算机程序，其包含可由处理器读取的软件代码，所述软件代码经调试而由所述处理器执行时实施根据权利要求16至20中任一项所述的计算机实施的方法。
22.非暂时性计算机可读存储介质，其包含当由计算机执行时使处理器进行根据权利要求16至20中任一项所述的计算机实施的方法的代码。
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