CN114965636A - 激光直写富氧酶电极及基于其的电化学酶传感器的制备 - Google Patents
激光直写富氧酶电极及基于其的电化学酶传感器的制备 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了激光直写富氧酶电极及基于其的电化学酶传感器的制备。所述富氧电化学酶传感器中的酶电极构建主要包括以下步骤:首先选取适合的基底膜利用激光使其碳化,形成多孔疏松且导电的基底;其次将碳化后的基底疏水化处理;随后,在疏水的基底上修饰用于电化学还原过氧化氢的催化剂,再修饰氧化酶层,制成富氧酶电极,构建得到所述富氧电化学酶传感器。本发明优点制备工艺简单,无环境污染问题,可大批量生产。
Description
技术领域
本发明属于电极制备技术领域,尤其是指激光直写富氧酶电极及基于其的电化学酶传感器的制备。
背景技术
糖尿病已成为现代生活方式引起的最常见的慢性疾病之一。根据世界卫生组织的预测,糖尿病连同并发症每年都会导致大量人类过早死亡,是第七大死亡原因。血糖浓度作为患者健康的关键指标,准确测量血糖浓度对于维持人体生理水平健康具有重要意义。因此,各式各样的传统电化学葡萄糖生物传感器接种而至。然而对于传统固/液两相界面电化学生物传感器,酶促反应界面处的氧气水平依赖于液相,因此较低且容易受波动,这直接影响氧化酶动力学,进而限制了检测线性、准确性和选择性。
人们受到大自然的启发,设计了新型的三相界面富氧电化学酶传感器,因其具有充足且恒定的界面氧气,进而保证了氧化酶的高效运行和检测的顺利进行。然而三相电化学酶传感器制备较为复杂,在制备基底时常采用水热法、硬模板法、抽滤法等,且所得基底一般都没导电性,因此需在其表面再修饰一层导电层使其导电,例如,通过在多孔PVDF膜表面抽滤含有导电物质(碳纳米管水、石墨烯等)的溶液来制作导电层(CN110988080A)。但这样操作复杂、产品性能不稳定,而且生产效率低,难以做到大批量、低成本生产;另外过程中需要用到一些用于分散碳纳米管的有机溶剂,对环境造成一定破环;另外所得电化学酶传感器的检测线性范围小、重复性差。
发明内容
为解决上述技术问题,本发明提供激光直写富氧酶电极及基于其的电化学酶传感器的制备。本发明利用激光碳化技术,直接将高分子基底材料碳化得到多孔结构,将具有导电性多孔结构直接作为工作电极的基底,通过对该多孔基底进行疏水处理,解决酶促反应的供氧不足问题,进而实现电化学酶传感器检测性能的大幅提高(线性范围、灵敏度以及准确性等);同时相较于现有富氧酶电极的制备技术,该制备方法简单、易操作,大大降低了成本、便于批量化生产。
本发明的目的在于提供一种激光直写富氧电化学酶传感器的制备方法,所述电化学酶传感器包括工作电极、参比电极与对电极,所述工作电极为富氧酶电极,所述制备方法包括以下步骤:
(1)用基底材料设计三电极图形,进行激光碳化,得到工作电极、参比电极与对电极的基底,并对工作电极的基底进行疏水化处理;
(2)将步骤(1)中所得疏水化的工作电极的基底进行过氧化氢还原催化剂修饰;
(3)将含有氧化酶的混合溶液滴涂在步骤(2)所得电极表面干燥成膜,干燥即得到所述富氧酶电极;
(4)在步骤(1)中所得参比电极的基底表面涂Ag/AgCl浆料,获得所述参比电极。
在本发明的一个实施例中,步骤(1)中,所述基底材料选自高分子聚合物薄膜或高分子材料和碳的复合材料。
在本发明的一个实施例中,所述高分子聚合物薄膜中的高分子聚合物选自聚酰亚胺、聚醚酰亚胺、酚醛树脂、聚苯胺、聚吡啶、聚吡咯和聚苯乙烯中的一种或多种;所述碳的复合材料选自碳纤维纸、石墨碳、碳纳米管和3D石墨烯中的一种或多种。
在本发明的一个实施例中,所述高分子聚合物薄膜的厚度为5-1500μm。
在本发明的一个实施例中,步骤(1)中,所述激光的光源选自紫外光
(UV)、红外光、可见光;进一步的,优选红外光。
在本发明的一个实施例中,步骤(1)中,激光碳化仪器选用CO2激光器。
在本发明的一个实施例中,所述CO2激光器的参数:扫描速度为5-100mm/s,扫描间隔为0.1-0.4mm和激光功率为3-7W。
在本发明的一个实施例中,步骤(1)中,碳化后的工作电极、参比电极与对电极的基底形成多孔导电层,所述导电层厚度为5-500μm,所述多孔的孔径为微米级。所形成的多孔结构具有多个气道,这是构建电极的必要前提。
在本发明的一个实施例中,步骤(1)中,进行疏水化处理所用疏水物质选自聚二甲基硅氧烷、氟硅烷、氯硅烷、硅烷偶联剂、全氟辛烷磺酸、聚四氟乙烯和长链烷基化合物中的一种或多种。
在本发明的一个实施例中,步骤(2)中,所述过氧化氢还原催化剂选自金属、金属氧化物、金属盐、有机材料还原催化剂中的一种或多种。
在本发明的一个实施例中,所述金属选自铂、铑、金、镍、铜、钛和铝中的一种或多种。
在本发明的一个实施例中,所述有机材料还原催化剂选自生物材料和/或金属有机配合物,所述生物材料选自细胞色素C、过氧化氢酶或辣根过氧化物酶中的一种或多种。
在本发明的一个实施例中,步骤(2)中,所述基底进行过氧化氢还原催化剂修饰的方法选择电沉积法、溅射法、共沉淀法或水热合成法等。
在本发明的一个实施例中,所述电沉积法利用三电极体系,对电极为Pt丝,商用的Ag/AgCl作为参比电极,沉积电位为-0.1V至-0.5V,沉积时间为10s-50s。
在本发明的一个实施例中,步骤(3)中,所述氧化酶选自葡萄糖氧化酶、α-磷酸甘油氧化酶、胆固醇酯酶、胆固醇脱氢酶、胆固醇氧化酶、葡萄糖脱氢酶、乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、胆红素氧化酶、抗坏血酸氧化酶、过氧化物酶、尿酸酶、胶原酶、质酸酶、蛋白酶和蛋白水解酶中的一种或多种。
本发明的第二个目的在于提供所述的制备方法所得激光直写富氧电化学酶传感器。
本发明的第三个目的在于提供所述的激光直写富氧电化学酶传感器在检测葡萄糖、蔗糖、乳糖、尿酸、肌酐、尿素、乳酸、乙酰胆碱、甘油三酯或胆固醇中的应用。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点:
与传统的固/液两相界面生物传感器相比,本发明制备的电极是一种三相富氧酶生物电极,利用三相界面使得反应处的气体浓度充足且恒定,提高测试准确性的同时还可以测更高浓度的葡萄糖浓度。除此以外,与以往的三相界面电化学酶传感器相比较,该方法利用激光制备电极,将工作电极、对电极、参比电极集成在一起,用激光碳化出的多孔导电物质直接作为对电极,大大降低了成本,操作简单、便于批量化生产,并且碳作为对电极要比金属电极等成本低很多。利用该方法制备所得的酶传感器不仅可以检测高浓度葡萄糖,同时也可以检测足够低浓度的葡萄糖(最低检测限0.05mM,最高检测限60mM),可检测人体汗液中葡萄糖。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解,下面根据本发明的具体实施例并结合附图,对本发明作进一步详细的说明,其中
图1为本发明利用激光生产三电极阵列的实物图;
图2为本发明实施例1中所得多孔导电基底的SEM图片;
图3为本发明实施例1中生物酶层干燥后的SEM图片;
图4为本发明使用实施例1中的电极与传统两相电极在不同氧浓度下的背景电流;
图5为本发明使用实施例1中的电极与传统两相电极检测葡萄糖的结果;
图6为本发明使用实施例1中的电极对0mM-1mM的葡萄糖的检测结果;
图7为本发明使用实施例1中的电极在人工汗液中对葡萄糖的检测结果;
图8为本发明使用实施例2中的电极对乳酸的检测结果;
图9为本发明使用实施例3中的电极对蔗糖的检测结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明,以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施,但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1
本实施例提供了激光直写富氧酶电极及基于其的电化学酶传感器的制备,步骤:
1)多孔导电基底制备:将125μm聚酰亚胺薄膜(PI膜)用乙醇清洗干净,以铝板作为衬底,将清洗后的PI膜固定在其上面,导入已画好的三电极图(工作电极检测面积为直径4mm的圆,如图1),用CO2激光器在其表面进行扫描,固定激光功率为1W,扫描速度70mm/s,扫描间隔为0.01mm,进而得到多孔且导电的基底,表征结果见图2,由图2可知由碳化得到的该导电基底具有疏松多孔材料,孔径大小呈现微米级。
2)疏水化处理:对该基底进行疏水化处理,先将聚二甲基硅氧烷(PDMS)用环己烷稀释30倍,随后将基底浸泡其中30min,随后将其取出并置于120℃固化30min。
3)电沉积催化剂:以疏水多孔导电基底作为工作电极,采用恒电位沉积法,采用三电极体系,以铂丝作为对电极、银/氯化银作为参比电极,以相对于Ag/AgCl电极的电压为-0.3V条件下进行电沉积,电沉积时间为10s,将Pt催化剂电沉积到工作电极表面。
4)酶层修饰:将葡萄糖氧化酶混合液滴在工作电极表面,并自然晾干,进而得到酶生物电极,表征结果见图3,由图3可知,酶均匀地覆盖在基底表面,并未渗入到基底内部,这就构成了酶生物电极。并且由图3可以看出酶层厚度大约在1微米左右。
5)参比电极的制备:在工作电极右侧的电极表面涂Ag/AgCl浆料,并置于100℃烘干,作为测试的参比电极,该三电极体系集成在一起形成一个电化学酶传感器。
6)将上述制好的电化学酶传感器进行葡萄糖的电化学测量。电化学测量是使用具有三电极系统的CHI 660E电化学工作站进行的。将中间的电极作为工作电极,左侧由激光碳化所得的多孔导电材料为对电极,右侧涂有Ag/AgCl浆料的电极作为参比电极。所有安培实验均在0V下进行,扫描速度为0.05Vs-1。
对照例1
以传统两相电极作为对比,其制备方法与实施例1中电极的制备过程类似,区别点在于,此处不进行疏水化处理,使其完全亲水。
性能测试例
1,将实施例1所得酶电极和对照例1中所得传统两相电极进行性能测试
检测在不同氧浓度下的背景电流的对比,结果见图4,图4为利用本发明所制备的电极与传统两相电极在不同氧浓度下的背景电流的对比。结果表明,本发明的酶电极在不同氧浓度下背景电流恒定,而亲水的固-液两相系统在氧浓度越高时,背景电流越大,不恒定。
2,检测实施例1所得电化学酶传感器与对照例1中所得生物传感器在检测葡萄糖中的情况
将实施例1中所得电化学酶传感器和对照例1中所得生物传感器在0V进行葡萄糖测试,葡萄糖浓度分别为0mM、5mM、10mM、20mM、30mM、40mM、60mM、100mM,实验结果见图5。图5a是本发明传感器检测葡萄糖的响应电流的图,图中自上而下的葡萄糖浓度分别为0mM、5mM、10mM、20mM、30mM、40mM、60mM、100mM,由图5a可知它可以用于检测葡萄糖,且随着葡萄糖浓度增大,响应电流也相对应增加。从图5b可知,本发明实施例1所制的电化学酶传感器的检测上限高达60mM,而对照例1所得生物传感器的检测上限是1mM,可见本发明所得生物传感器的检测限是对照例1所得传感器的检测限的60倍左右,同时可知,本发明实施例1所得电化学酶传感器在60mM浓度范围内呈现线性相关,其线性方程为y=-1.90x-17.5,R2=0.99。
图6为本发明实施例1所得电化学酶传感器对0mM-1mM的葡萄糖的检测结果。图6a中的曲线自上而下分别为0mM、0.05mM、0.1mM、0.3mM、0.5mM、0.7mM、1mM。由图6b可知本发明所制的电化学酶传感器的检测下限为0.05mM。因此可用于检测人体汗液中葡萄糖。
图7为本发明实施例1所获电化学酶传感器在人工汗液中对葡萄糖的检测结果。图7a曲线由上到下分别为0mM、0.1mM、0.3mM、0.5mM、0.7mM、1.2mM、1.4mM、1.6mM,由图7b可知,在该浓度范围内,葡萄糖浓度与电极电流呈现线性相关,其线性方程为y=-0.76x-5.53,因此本发明所获的电化学酶传感器在人工汗液中可以实现定量检测葡萄糖。
实施例2
本实施例电极制备与实施例1的制备相同,区别点在于,将葡萄糖氧化酶混合液换成乳酸氧化酶混合液。图8为本实施例所获的电化学酶传感器对乳酸的检测结果。图8a中曲线自上而下分别为0mM、1mM、3mM、5mM、7mM、10mM、15mM、20mM、40mM。由图8b可知,该方法所制的电化学酶传感器的乳酸的检测上限可达20mM。
实施例3
本实施例电极制备与实施例1的制备相同,区别点在于,将葡萄糖氧化酶混合液换成蔗糖酶混合液。图9为本实施例所获的电化学酶传感器对蔗糖的检测结果。图9a中曲线自上而下分别为0mM、10mM、30mM、40mM、60mM、90mM、110mM、140mM、180mM。由图9b可知,该方法所制的电化学酶传感器的蔗糖的检测上限高达100mM。
实施例4
本实施例提供了激光直写富氧酶电极及基于其的电化学酶传感器的制备,步骤:
1)多孔导电基底制备:将125μm聚酰亚胺薄膜(PI膜)用乙醇清洗干净,以铝板作为衬底,将清洗后的PI膜固定在其上面,导入已画好的三电极图(工作电极检测面积为直径4mm的圆),用CO2激光器在其表面进行扫描,固定激光功率为10W,扫描速度80mm/s,扫描间隔为0.01mm,进而得到多孔且导电的基底。
2)疏水化处理:对该基底进行疏水化处理,先将聚二甲基硅氧烷(PDMS)用环己烷稀释100倍,随后将基底浸泡其中30min,随后将其取出并置于120℃固化90min。
3)电沉积催化剂:以疏水多孔导电基底作为工作电极,采用恒电位沉积法,采用三电极体系,以铂丝作为对电极、银/氯化银作为参比电极,以相对于Ag/AgCl电极的电压为-0.3V条件下进行电沉积,电沉积时间为10s,将Pt催化剂电沉积到工作电极表面。
4)酶层修饰:将乳酸脱氢酶混合液滴在工作电极表面,并自然晾干,进而得到酶生物电极,酶均匀地覆盖在基底表面,并未渗入到基底内部,这就构成了酶生物电极。
5)参比电极的制备:在工作电极右侧的电极表面涂Ag/AgCl浆料,并置于120℃烘干,作为测试的参比电极,该三电极体系集成在一起形成一个电化学酶传感器。
6)将上述制好的电化学酶传感器进行葡萄糖的电化学测量。电化学测量是使用具有三电极系统的CHI 660E电化学工作站进行的。将中间的电极作为工作电极,左侧由激光碳化所得的多孔导电材料为对电极,右侧涂有Ag/AgCl浆料的电极作为参比电极。所有安培实验均在0V下进行,扫描速度为0.05Vs-1。
实施例5
本实施例提供了激光直写富氧酶电极及基于其的电化学酶传感器的制备,步骤:
1)多孔导电基底制备:将125μm酚醛树脂薄膜用乙醇清洗干净,以铝板作为衬底,将清洗后的酚醛树脂薄膜固定在其上面,导入已画好的三电极图(工作电极检测面积为直径5mm的圆),用CO2激光器在其表面进行扫描,固定激光功率为1W,扫描速度70mm/s,扫描间隔为0.01mm,进而得到多孔且导电的基底,所得该导电基底具有疏松多孔材料,孔径大小呈现微米级。
2)疏水化处理:对该基底进行疏水化处理,先将聚四氟乙烯用环己烷稀释20倍,随后将基底浸泡其中60min,随后将其取出并置于120℃固化60min。
3)电沉积催化剂:以疏水多孔导电基底作为工作电极,采用恒电位沉积法,采用三电极体系,以铂丝作为对电极、银/氯化银作为参比电极,以相对于Ag/AgCl电极的电压为-0.3V条件下进行电沉积,电沉积时间为10s,将Pt催化剂电沉积到工作电极表面。
4)酶层修饰:将葡萄糖氧化酶混合液滴在工作电极表面,并自然晾干,进而得到酶生物电极,酶均匀地覆盖在基底表面,并未渗入到基底内部,得到了酶生物电极。
5)参比电极的制备:在工作电极右侧的电极表面涂Ag/AgCl浆料,并置于60℃烘干,作为测试的参比电极,该三电极体系集成在一起形成一个电化学酶传感器。
6)将上述制好的电化学酶传感器进行葡萄糖的电化学测量。电化学测量是使用具有三电极系统的CHI 660E电化学工作站进行的。将中间的电极作为工作电极,左侧由激光碳化所得的多孔导电材料为对电极,右侧涂有Ag/AgCl浆料的电极作为参比电极。所有安培实验均在0V下进行,扫描速度为0.05Vs-1。
实施例6
本实施例电极制备与实施例3的制备相同,区别点在于,将聚酰亚胺薄膜替换成聚苯乙烯薄膜。
实施例7
本实施例电极制备与实施例4的制备相同,区别点在于,将聚酰亚胺薄膜替换成石墨碳。
实施例8
本实施例电极制备与实施例1的制备相同,区别点在于,将聚酰亚胺薄膜替换成3D石墨烯。
实施例9
本实施例电极制备与实施例1的制备相同,区别点在于,将Pt催化剂替换成钛。
实施例10
本实施例电极制备与实施例1的制备相同,区别点在于,将Pt催化剂替换成镍。
实施例11
本实施例电极制备与实施例1的制备相同,区别点在于,将Pt催化剂替换成铑。
实施例12
本实施例电极制备与实施例1的制备相同,区别点在于,将Pt催化剂替换成金。
显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例,并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种激光直写富氧电化学酶传感器的制备方法,所述电化学酶传感器包括工作电极、参比电极与对电极,所述工作电极为富氧酶电极,其特征在于,所述制备方法包括以下步骤:
(1)用基底材料设计三电极图形,进行激光碳化,得到工作电极、参比电极与对电极的基底,并对工作电极的基底进行疏水化处理;
(2)将步骤(1)中所得疏水化的工作电极的基底进行过氧化氢还原催化剂修饰;
(3)将含有氧化酶的混合溶液滴涂在步骤(2)所得电极表面干燥成膜,干燥即得到所述富氧酶电极;
(4)在步骤(1)中所得参比电极的基底表面涂Ag/AgCl浆料,获得所述参比电极。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,所述基底材料选自高分子聚合物或高分子聚合物和碳的复合材料。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述高分子聚合物选自聚酰亚胺、聚醚酰亚胺、酚醛树脂、聚苯胺、聚吡啶、聚吡咯和聚苯乙烯中的一种或多种;所述碳的复合材料选自碳纤维、石墨碳、碳纳米管构建物、膨胀石墨、光刻石墨、碳纳米管和3D石墨烯中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,碳化后的工作电极基底形成多孔导电层,所述导电层厚度为5-500μm。
5.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,进行疏水化处理所用疏水物质选自聚二甲基硅氧烷、氟硅烷、氯硅烷、硅烷偶联剂、全氟辛烷磺酸、聚四氟乙烯和长链烷基化合物中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,所述过氧化氢还原催化剂选自碳、金属、金属氧化物、金属盐和有机材料还原催化剂中的一种或多种。
7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述金属选自铂、铑、金、镍、铜、钛和铝中的一种或多种。
8.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述有机材料还原催化剂选自生物材料和/或金属有机配合物,所述生物材料选自细胞色素C、过氧化氢酶或辣根过氧化物酶中的一种或多种。
9.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(3)中,所述氧化酶选自葡萄糖氧化酶、α-磷酸甘油氧化酶、胆固醇酯酶、胆固醇脱氢酶、胆固醇氧化酶、葡萄糖脱氢酶、乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、胆红素氧化酶、抗坏血酸氧化酶、过氧化物酶、尿酸酶、胶原酶、质酸酶、蛋白酶和蛋白水解酶中的一种或多种。
10.权利要求1-9任一项所述的制备方法所得激光直写富氧电化学酶传感器。
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