CN114965634A - 一种丝印生物电化学传感器的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种丝印生物电化学传感器的制备方法，通过电聚合的方式将导电聚合物聚苯胺沉积在丝印碳电极表面，该导电聚合物的具有较强吸附特性，以用于葡萄糖氧化酶的固定，增加葡萄糖氧化酶在碳电极的长期稳定性，同时采用聚乙二醇缩水甘油醚交联聚合物二茂铁和葡萄糖氧化酶，对葡萄糖氧化酶进一步强化固定，外加具有交联作用的水凝胶外膜，进一步的增加产品电极的稳定性，并维持较好的线性。

Description

一种丝印生物电化学传感器的制备方法
技术领域
本发明涉及生物电化学传感器技术领域，更具体地说，是涉及一种丝印生物电化学传 感器的制备方法。
背景技术
糖尿病是由遗传、免疫等各种致病因子作用于机体导致胰岛功能减退、胰岛素抵抗等 而引发的代谢紊乱综合征，在对糖尿病人的治疗过程中，检测患者血糖是十分必要的。生 物电化学传感器具有简单便捷、价格便宜、灵敏度高等优点，因此广泛用于医疗健康的治 疗中，其中在糖尿病的血糖检测中起到主要的作用。通过生物电化学传感器对血糖进行监 控，通常是使用葡萄糖生物电化学传感器，葡萄糖生物电化学传感器的测试原理具有多种 方法，包括氧化酶法、光谱分析法、荧光检测法等。目前技术最成熟、检测精度最高的技 术是葡萄糖氧化酶法，该方法通过利用电化学的方法检测葡萄糖氧化酶催化葡萄糖反应过 程中的电流变化来测量血糖浓度。第一个葡萄糖酶电极是基于在氧电极上通过半透膜嵌入 一层很薄的葡萄糖氧化酶制成的，可测量酶催化过程的氧气消耗量。自此以后，许多研究 人员致力于电化学葡萄糖传感器的研发，并取得了很大的进展。
葡萄糖生物电化学传感器的发展，按照葡萄糖氧化酶催化的性质，可以分为三个阶段： 以氧气为电子受体的第一代传感器、以非生理介体为电子受体的第二代传感器及直接电子 传递的第三代传感器。第一代葡萄糖生物电化学传感器存在测试电压高的缺点，同时在高 葡萄糖浓度情况下存在对氧气过度依赖问题，从而使传感器的线性度受到影响。第二代葡 萄糖生物电化学传感器为了降低传感器的工作电位，减小干扰物质对传感器电流的影响， 同时解决氧气不足对传感器线性度的影响，采用人造的电子介体代替氧气充当电子媒介的 作用，为了起到电子介体的功能，人造的电子介体与葡萄糖氧化酶的反应速度必须比氧气 与葡萄糖氧化酶反应的速度快很多，这样，氧气的作用才会被最小化。此类人造电子介体 有二茂铁、铁氰化物、导电性有机盐、过渡金属配合物等。这些物质具有较低的氧化还原 电压，因此传感器的工作电压可以降低，传感器在低电压下状态下，干扰物的影响就可以 被排除。
由于葡萄糖生物电化学传感器在植入皮下后，灵敏度会逐渐下降，这一现象一方面由 异体反应导致，另一方面是由葡萄糖氧化酶的活性不断下降引起的，这涉及到了制备生物 电化学传感器的酶固定技术。现有技术中固定葡萄糖氧化酶采用戊二醛、京尼平等物质， 这些物质不仅毒性高、污染严重，且在固化葡萄糖氧化酶的过程中，对葡萄糖氧化酶的活 性存在一定影响，故当葡萄糖生物电化学传感器植入皮下时，其灵敏度在异体反应的促动 下下降程度明显，最终影响葡萄糖生物电化学传感器的检测结果。
发明内容
现有的葡萄糖生物传感器上葡萄糖氧化酶的负载量少，稳定性差，在植入人体皮下时， 感应电极上附着的葡萄糖氧化酶的活性由于异体反应不断下降，严重影响葡萄糖生物电化 学传感器的检测结果。为了克服该现有技术的不足，本发明提供一种丝印生物电化学传感 器的制备方法。
本发明技术方案如下所述：
一种丝印生物电化学传感器的制备方法，过程步骤包括：
步骤S1.准备丝网印刷碳电极，清洗丝网印刷碳电极表面；
步骤S2.制备苯胺溶液，将丝网印刷碳电极置于苯胺溶液内并使用恒电流法进行电聚合 反应；
步骤S3.制备混合酶溶液，将丝网印刷碳电极置于混合酶溶液中静置；
步骤S4.将丝网印刷碳电极置于去离子水中浸泡；
步骤S5.制备外膜材料溶液，将丝网印刷碳电极浸泡在外膜材料溶液中。
上述的一种丝印生物电化学传感器的制备方法，在步骤S1中，清洗过程包括：
步骤A1.使用超声清洗机将丝网印刷碳电极清洗3分钟；
步骤A2.将清洗后的丝网印刷碳电极置于30摄氏度环境中干燥；
步骤A3.使用等离子清洗机将丝网印刷碳电极清洗180秒；
步骤A4.使用化学工作站以计时电流法对丝网印刷碳电极表面清洗30分钟。
上述的一种丝印生物电化学传感器的制备方法，在步骤S2中，将苯胺置于0.2mmol/l 的HCl溶液中，形成0.4mmol/l的苯胺溶液。
上述的一种丝印生物电化学传感器的制备方法，在步骤S2中，采用的恒定电流大小为 0.1毫安，电聚合时间为10分钟。
上述的一种丝印生物电化学传感器的制备方法，在步骤S3中，制备混合酶溶液的过程 包括：
步骤B1.在反应容器中加入PH5.5的二茂铁聚合物饱和溶液；
步骤B2.在反应容器中加入20mg/L葡萄糖氧化酶；
步骤B3.在反应容器中加入40％聚乙二醇缩水甘油醚；
步骤B4.静置24小时。
进一步的，加入反应容器的二茂铁聚合物饱和溶液、葡萄糖氧化酶及聚乙二醇缩水甘 油醚的质量比为＝140：60：75。
上述的一种丝印生物电化学传感器的制备方法，在步骤S3中，丝网印刷碳电极浸泡于 混合酶溶液中静置2小时。
上述的一种丝印生物电化学传感器的制备方法，在步骤S4中，丝网印刷碳电极浸泡在 去离子水中2小时后放置在25摄氏度的烘箱内放干。
上述的一种丝印生物电化学传感器的制备方法，在步骤S5中，外膜材料溶液为PSS溶 液，其溶剂为98％的去离子水和2％的二甲基甲酰胺配制成质量百分比为3％的溶液。
根据上述方案的本发明，其有益效果在于：本发明通过电聚合的方式将导电聚合物聚 苯胺沉积在丝印碳电极表面，该导电聚合物的具有较强吸附特性，以用于葡萄糖氧化酶的 固定，增加葡萄糖氧化酶在碳电极的长期稳定性，同时采用聚乙二醇缩水甘油醚交联聚合 物二茂铁和葡萄糖氧化酶，对葡萄糖氧化酶进一步强化固定，外加具有交联作用的水凝胶 外膜，进一步的增加产品电极的稳定性，并维持较好的线性。
1.与现有技术采用戊二醛溶液、京尼平交联方法，亦或是其它如包埋、溶胶凝胶等制 备方法，本发明中的制备方法固定酶效果更加良好，现有技术利用戊二醛等有机物进行交 联的方式对酶的活性有较大的影响，而本发明中将酶与电子介体固定在一起，保证了电子 的高效传输，令电化学传感器的电流密度可达118nA/mm2，且稳定性也优于现有技术制备产 生的电极，根据实验测试结构，以本发明的制备方法制成的电极在1年后均可达到60000U 的活性。
2.本发明通过电聚合的方式将聚苯胺沉积在电极表面，不仅可以强化酶的吸附能力， 提高酶固定在电极表面的稳定性，同时还可以起到提高电子传输速度的作用。
3.本发明采用聚乙二醇缩水甘油醚作为酶的交联剂，相比其它交联剂具有更好的交联 效果。
4.本发明制备的通过电聚合方式固定聚苯胺的丝印碳基底的葡萄糖生物电化学传感器 在置信区间为95％的范围内线性系数0.98以上，线性范围为1.7～28mmol/l，具备强稳定性， 能够持续保持其稳定性超过40天，电流信号衰减于60％左右，测试过程该电化学传感器至 第四天后产生的信号基本保持不变，稳定性较现有技术制备的电化学传感器存在大幅度提 升。
具体实施方式
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施 例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明， 并不用于限定本发明。
一种丝印生物电化学传感器的制备方法，过程步骤包括：
步骤S1.准备丝网印刷碳电极，清洗丝网印刷碳电极表面。在该过程中，因要在丝网印 刷碳电极表面需固定氧化酶，故需要对丝网印刷碳电极的表面进行清洗，除去表面其他杂 物与污垢等，防止污染或干扰后续聚合物的沉积与氧化酶的附着。在本发明中，生物电化 学传感器的电极采用丝网印刷碳电极，其工作电极、对电极、参比电极均采用生物碳材质， 电极之间有绝缘层间隔，防止电极短路，且丝网印刷电极更精致小巧，材料成本更低廉。
在本实施例中，步骤S1，清洗过程包括：
步骤A1.使用超声清洗机将丝网印刷碳电极清洗3分钟。
步骤A2.将清洗后的丝网印刷碳电极置于30摄氏度环境中干燥。
步骤A3.使用等离子清洗机将丝网印刷碳电极清洗180秒。
步骤A4.使用化学工作站以计时电流法对丝网印刷碳电极表面清洗30分钟。
在经过步骤A1-步骤A3，将丝网印刷碳电极表面的交联剂颗粒与油污，然后利用化学 工作站，通过计时电流法清洗丝网印刷碳电极，达到激活丝网印刷碳电极表面的效果。
步骤S2.制备苯胺溶液，将丝网印刷碳电极置于苯胺溶液内并使用恒电流法进行电聚合 反应，聚合电流的大小与采用的时间由电聚合的均匀性与分子的颗粒大小决定。在电聚合 反应过程中，恒电流法的电流与电压稳定，能够令处于苯胺溶液中的丝网印刷碳电极表面 表面形成稳定的、均匀的、致密的聚苯胺。
由于酶是非电解质的缘故，电解效率低，酶的负载量少，仅仅依靠葡萄糖氧化酶与聚 苯胺的氨基进行交联，葡萄糖氧化酶的稳定性差，且电子传输慢，同时因葡萄糖氧化酶催 化葡萄糖产生的副产物过氧化氢对酶活性也有一定的影响，故而在本申请中，使用恒流法 在丝网印刷碳电极的表面对苯胺进行电聚合，令其在丝网印刷碳电极的表面形成可以与葡 萄糖氧化酶、电子介体与交联剂结合的基团，进一步增加了丝网印刷碳电极上葡萄糖氧化 酶的稳定性，且不影响感应过程中电子的传输。
在步骤S2中，将苯胺置于0.2mmol/l的HCl溶液中，形成0.4mmol/ml的苯胺溶液。
在一种实施例中，将3.72g的苯胺单体溶于100ml的0.2mmol/l溶液中，形成0.4mmol/ml 的苯胺溶液。
将丝网印刷碳电极置于苯胺溶液中，通过恒电流法通电，使用0.1毫安的电流下，令 丝网印刷碳电极实现电聚合，使用去离子水清洗后，能够发现丝网印刷碳电极的表面呈墨 绿色，这是由于聚苯胺在丝网印刷碳电极的表面生长，至此，丝网印刷碳电极的表面附着 有聚苯胺网络。
步骤S3.制备混合酶溶液，将丝网印刷碳电极置于混合酶溶液中静置。
在本申请中，葡萄糖氧化酶是通过静电作用吸附在丝网印刷碳电极表面的聚苯胺网络 中的，由于静电力较弱，葡萄糖氧化酶容易泄漏溢出，影响电极与检测液之间的反应，因 袭，需要通过交联剂交联。
在本实施例中，步骤S3，制备混合酶溶液的过程包括：
步骤B1.在反应容器中加入PH5.5的二茂铁聚合物饱和溶液。
步骤B2.在反应容器中加入20mg/L葡萄糖氧化酶。
步骤B3.在反应容器中加入40％聚乙二醇缩水甘油醚。
步骤B4.静置24小时。
在本实施例中，加入反应容器的二茂铁聚合物饱和溶液、葡萄糖氧化酶及聚乙二醇缩 水甘油醚的质量比为＝140：60：75。
在本实施例中，步骤S3，丝网印刷碳电极浸泡于混合酶溶液中静置2小时，
根据上述步骤依次在反应容器中加入二茂铁聚合物饱和溶液、葡萄糖氧化酶及聚乙二 醇缩水甘油醚，令葡萄糖氧化酶进行交联反应，24小时之后，再令丝网印刷电极浸泡于混 合酶溶液中，于室温下静置2小时，让混合酶溶液中的发生交联后的葡萄糖氧化酶充分地 进入丝网印刷电极表面的聚苯胺纳米纤维网络中。通过静电作用，葡萄糖氧化酶吸附在聚 苯胺网络中。经过两小时之后，将丝网印刷电极取出放在25摄氏度的烘箱中放干。
在本申请中，聚乙二醇缩水甘油醚作为交联剂，作为醇类聚合物，聚乙二醇缩水甘油 醚对于葡萄糖氧化酶的活性影响小，即使长时间的溶液聚合反应也不会影响到酶的活性。 同时该交联剂利用端基-羟基来实现对聚合物二茂铁与氧化酶的交联，三者的交联反应为竞 争反应，过多的葡萄糖氧化酶则可能导致交联剂与葡萄糖氧化酶反应过度，电子介体参与 反应的少，从而无法实现电子的快速转移，而葡萄糖氧化酶含量过少则可能导致催化葡萄 糖强度不够，电流信号低。由于三种物质均为聚合物，分子链较长，故所需反应时间较长， 反应时间不够可能导致葡萄糖氧化酶的固定不稳定，电信号响应时间较短；若反应时间过 长则会导致交联过度，葡萄糖氧化酶活性位点被交联剂大量占据从而酶活性降低。
步骤S4.将丝网印刷碳电极置于去离子水中浸泡。在葡萄糖氧化酶附着在聚苯胺网络的 过程中，存在附着力度较低的部分，将丝网印刷碳电极置于去离子水中浸泡若干时间，令 这些未被固定葡萄糖氧化酶与其他电子介体扩散到水中，以确保丝网印刷电极表面的均为 固定牢固的葡萄糖氧化酶，保证电化学传感器的稳定性。
在本实施例中，步骤S4，丝网印刷碳电极浸泡在去离子水中2小时后放置在25摄氏度 的烘箱内放干。
步骤S5.制备外膜材料溶液，将丝网印刷碳电极浸泡在外膜材料溶液中。为了提高传感 器的线性度与稳定性，对已牢固附着在丝网印刷电极表面的葡萄糖氧化酶进一步固定，在 丝网印刷碳电极的最外层附着一层PSS外膜。该PSS外膜将葡萄糖氧化酶包覆，起到保护 与固定作用，在不影响电流感应效果的情况下，提高生物电化学传感器的稳定性。令丝网 印刷碳电极浸泡在外膜材料溶液中3分钟，然后取出，于室温状态下自然放干备用，即可 对丝网印刷碳电极进行测试。
在本实施例中，步骤S5，外膜材料溶液为PSS溶液，其溶剂为98％的去离子水和2％的 二甲基甲酰胺配制成质量百分比为3％的溶液。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和 原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种丝印生物电化学传感器的制备方法，其特征在于，过程步骤包括：
步骤S1.准备丝网印刷碳电极，清洗丝网印刷碳电极表面；
步骤S2.制备苯胺溶液，将丝网印刷碳电极置于苯胺溶液内并使用恒电流法进行电聚合反应；
步骤S3.制备混合酶溶液，将丝网印刷碳电极置于混合酶溶液中静置；
步骤S4.将丝网印刷碳电极置于去离子水中浸泡；
步骤S5.制备外膜材料溶液，将丝网印刷碳电极浸泡在外膜材料溶液中。
2.根据权利要求1中所述的一种丝印生物电化学传感器的制备方法，其特征在于，在步骤S1中，清洗过程包括：
步骤A1.使用超声清洗机将丝网印刷碳电极清洗3分钟；
步骤A2.将清洗后的丝网印刷碳电极置于30摄氏度环境中干燥；
步骤A3.使用等离子清洗机将丝网印刷碳电极清洗180秒；
步骤A4.使用化学工作站以计时电流法对丝网印刷碳电极表面清洗30分钟。
3.根据权利要求1中所述的一种丝印生物电化学传感器的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，将苯胺置于0.2mmol/l的HCl溶液中，形成0.4mmol/l的苯胺溶液。
4.根据权利要求1中所述的一种丝印生物电化学传感器的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，采用的恒定电流大小为0.1毫安，电聚合时间为10分钟。
5.根据权利要求1中所述的一种丝印生物电化学传感器的制备方法，其特征在于，在步骤S3中，制备混合酶溶液的过程包括：
步骤B1.在反应容器中加入PH5.5的二茂铁聚合物饱和溶液；
步骤B2.在反应容器中加入20mg/L葡萄糖氧化酶；
步骤B3.在反应容器中加入40％聚乙二醇缩水甘油醚；
步骤B4.静置24小时。
6.根据权利要求5中所述的一种丝印生物电化学传感器的制备方法，其特征在于，加入反应容器的二茂铁聚合物饱和溶液、葡萄糖氧化酶及聚乙二醇缩水甘油醚的质量比为＝140：60：75。
7.根据权利要求1中所述的一种丝印生物电化学传感器的制备方法，其特征在于，在步骤S3中，丝网印刷碳电极浸泡于混合酶溶液中静置2小时。
8.根据权利要求1中所述的一种丝印生物电化学传感器的制备方法，其特征在于，在步骤S4中，丝网印刷碳电极浸泡在去离子水中2小时后放置在25摄氏度的烘箱内放干。
9.根据权利要求1中所述的一种丝印生物电化学传感器的制备方法，其特征在于，在步骤S5中，外膜材料溶液为PSS溶液，其溶剂为98％的去离子水和2％的二甲基甲酰胺配制成质量百分比为3％的溶液。
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