CN114958898A - Peg介导的菜豆壳球孢遗传转化体系的建立方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物领域，涉及菜豆壳球孢的遗传转化，特别是指PEG介导的菜豆壳球孢遗传转化体系的建立方法及其应用。将活化好的菜豆壳球孢菌丝，经研磨再振荡培养后，用三层滤纸过滤收集沉淀，沉淀经KCl溶液洗涤后，转移至裂解液中经摇床培养获得原生质体；向原生质体悬浮液中加入目的质粒，再逐滴加入40%SPTC溶液，再加入TB3培养液，制备恢复好的菌丝；将菌丝转入含有筛选抗生素的PDA培养基中，进行平板筛选培养，获得转化子；利用PEG介导将gfp基因转化至菜豆壳球孢中，转化子经5代转接后，仍能检测到目的gfp基因。转化后的菌株接种甜瓜后表现出与原始菌株一致的致病性，表明成功构建了菜豆壳球孢的遗传转化体系。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，涉及菜豆壳球孢的遗传转化，特别是指PEG介导的菜豆壳球孢遗传转化体系的建立方法及其应用。
背景技术
甜瓜（Cucumis melo）是我国重要的葫芦科经济作物，近年来随着设施甜瓜的大面积推广，土传病害的炭腐病已成为制约甜瓜生产的重要因子。该病是由菜豆壳球孢（Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid，M.phaseolina）引起的土传真菌病害。寄主范围广，可侵染750多种植物。我国早在1981年报道该病菌侵染哈密瓜，成熟前15d-20d左右植株表现症状，初期萎蔫，随后甜瓜茎基部坏死、腐烂，病株呈渐进性枯死或急性萎蔫枯死，造成果实不能正常成熟，严重影响甜瓜的产量和品质，严重的田块发病率可达80%~90%。
M.phaseolina菌核呈球形至椭圆形，外面黑色、光滑，内部褐色或暗褐色，菌核大小为50微米~150微米，分生孢子阶段很少发现。目前对该病的研究主要集中在寄主的抗性及化学防治方面，缺乏对该病的侵染和致病机制的研究，目前进行机理研究的主要利用GFP基因插入进行可视化观测；而GFP插入的方法最常用到的是利用农杆菌介导的转化和利用原生质体介导的转化。但是菜豆壳球孢M.phaseolina在人工培养基上无法产生孢子，因而无法利用农杆菌介导的孢子转化。通过原生质体介导也是微生物遗传转化的一个方法，专利CN 112011465 A公开了一种深海真菌白色侧齿霉菌原生质体的制备及遗传转化方法，但是本申请发明人采用该方法进行遗传转化时发现并不能制备出大量的菜豆壳球孢的转化子，一方面原因是菜豆壳球孢在人工培养基上难以形成分生孢子，且极易产生微菌核，而微菌核是度过不良环境的休眠体，培养20h就能观察到大量的微菌核，使得制备原生质体的难度增加，另一方面原因是原生质体在转化过程中仅能产生少量的转化子；以至于，本领域的科研人员一直没能大量制备出菜豆壳球孢的转化子。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提出一种PEG介导的菜豆壳球孢遗传转化体系的建立方法及其应用。
本发明的技术方案是这样实现的：
PEG介导的菜豆壳球孢遗传转化体系的建立方法，步骤为：
（1）将活化好的菜豆壳球孢菌丝进行培养，收集新鲜菌丝，经研磨后振荡培养再经三层滤纸过滤收集沉淀，沉淀经KCl溶液洗涤后，将菌丝沉淀转移至裂解液中经摇床培养获得原生质体；
（2）向步骤（1）原生质体的悬浮液中加入目的质粒，混匀后冰上静置，逐滴加入40%SPTC溶液，混匀后继续冰上静置，再加入TB3培养液，室温静置、振荡培养过夜得恢复好的菌丝；
（3）将步骤（2）的菌丝转入含有抗生素的PDA筛选培养基中，进行平板筛选培养，获得转化子；
（4）将步骤（3）的转化子转接至PDA培养基上，待菌长满培养皿时，用打孔器打成5mm直径的菌饼，离体接种于实验植物的茎部。
进一步，所述步骤（1）中新鲜菌丝的菌龄为12-24 h。
进一步，所述步骤（1）中KCl溶液的浓度为1.2 mol/L；每0.5 g菌丝体里添加5 mL裂解液，裂解时间为3-4 h；每mL裂解液中含有10 mg裂解酶和10 mg崩溃酶。
进一步，所述步骤（2）中原生质体的悬浮液中原生质体的浓度为7-8×108 个/mL；40%SPTC为40g PEG8000溶于100ml的STC溶液中；每1 μg目的质粒添加200 μL的悬浮液。
进一步，所述目的质粒为含有eGFP基因的环形表达载体。
进一步，所述目的质粒的制备方法为：将目的片段eGFP插入pCETNS-4载体上。
进一步，所述STC溶液为75 mM CaCl2、0.5 mol/L Tris-HCl (pH=8.0) 50 mL、蔗糖 100 g，补纯水至 500 mL。
进一步，所述步骤（3）中PDA培养基中抗生素的含量为潮霉素 50 mg/mL，氨苄 100mg/mL。
上述的方法在大量制备菜豆壳球孢转化子中的应用。
优选的，所述转化子的量高达8.6×103个/mg DNA。
本发明具有以下有益效果：
1、本申请以1.2 mol/L KCl 为稳渗剂，在菌龄生长12h时和16h时菜豆壳球孢菌丝经 10mg/ mL Driselase 和 10mg/mL Lysing enzymes 共同酶解3.5 h ，用 16 × 25 格血球计数板分别记录菌龄生长12h、16 h、20 h、24h的原生质体数量。12h时可获得 7×108个/mL 原生质体，16h产生的原生质体量为8×108个/mL，之后随着菌龄的增长原生质体的产量逐渐下降。
2、针对菜豆壳球孢的转化子产量低的问题，发明人做了大量的探索，按照常规的方法进行转化（STC的配方为50mM CaCl2，0.5 mol/L Tris-HCl (pH=8.0) 50 mL 蔗糖 100g, 补纯水至 500 mL）发现转化效率很低，当转化1μg的DNA时，在平板上只出现1-2个菌落，转化子很少。分析可能造成转化子少的可能原因：（1）改变培养基配方，增加生长培养基和复苏培养基的配方，有延长了复苏时间，但是转化子数量依旧没有变化。（2）增加了载体的转化起始量，改成每次转化5μg-10μg，但是转化子数量依旧增加很少。进行了很多次，转化子数量依旧很少，一直苦于没有办法提高转化效率。后来在制备大肠杆菌的感受态细胞时要添加CaCl2溶液，于是猜测STC的CaCl2浓度会不会是影响菜豆壳球孢转化子产率的关键呢；于是采用同一批原生质体和载体，进行实验，发现其它条件不变的情况下，只改变氯化钙浓度，转化子的产量会发生很大的变化。
3、本申请意外发现了影响菜豆壳球孢转化子产量的关键性物质—氯化钙的浓度，当氯化钙浓度为75mM时，转化子的效率最高可达8.6×103个以上/mg DNA；进一步分析机理猜测可能的原因是：氯化钙可使细胞膨胀，钙离子直接结合在细胞膜上，细胞膜磷脂分层形成液晶结构，使细胞的通透性变大，易于外源基因或载体进入。
4、本申请成功的利用PEG介导将gfp基因转化至菜豆壳球孢中，转化子经5代转接后，仍能检测到目的基因，表明成功构建了遗传转化体系。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为不同浓度的g418对菌丝的拮抗作用。
图2为原生质体产生与菌龄的关系图。
图3为不同浓度的氯化钙浓度对转化效率的影响。
图4为PCR检测转化菌株的gfp基因电泳图。
图5为心态特征不同的转化子形态及gfp荧光观察。
图6为接种72 h后的发病症状及绿色荧光的观察图，其中A为PDA阴性对照接种3d后症状；B为转化子接种茎部后的症状，白色箭头指向发病部位；C为接种茎后第3天在激光共聚焦下观察gfp荧光。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本申请采用的材料和试剂如下：
菜豆壳球孢菌为导致甜瓜炭腐病的病原菌。
PDA培养：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，去离子水马铃薯去皮切块，沸水煮烂，收集滤液，加入葡萄糖和琼脂，搅拌溶解分装，灭菌室温存放；
TB3：酵母粉3g，酸水解酪蛋白3g，蔗糖10g，去离子水搅拌均匀，灭菌室温存放；
Bottom Agar：琼脂10g，酵母粉3g，酸水解酪蛋白3 g，蔗糖 10g，去离子水搅拌均匀，灭菌室温存放；
Top Agar：琼脂15 g，酵母粉3 g，酸水解酪蛋白3g，蔗糖10g，去离子水搅拌均匀，灭菌室温存放；
裂解液：10mg/mL裂解酶和10 mg/mL崩溃酶，裂解酶和崩溃酶购自sigama公司；
目的质粒pCETNS4-eGFP是在互补载体pCETNS-4（核盘菌分泌蛋白SsCP1的功能研究，博士论文）的基础上构建的。以pcDNA3.1-eGFP（购自河南吉荧生物科技有限公司）为模板，用引物KpnI-eGFP-F：5´-GGG GTA CCA TGG TGA GCA AGG GCG AGG A-3´/SmaI-eGFP-R：5´-TCC CCC GGG CTT GTA CAG CTC GT-3´扩增eGFP片段，回收。与用KpnI-SmaI（内切酶购自fermentas）双酶切pCETNS-4载体回收的片段连接。连接产物转化TOP10，筛选eGFP的阳性克隆载体，经测序正确后，命名为pCETNS-eGFP。
3种浓度的STC溶液：
50mM CaCl2的STC：50mM CaCl2，0.5 mol/L Tris-HCl (pH=8.0) 50 mL 蔗糖 100g, 补纯水至 500 mL
75mMCaCl2的STC：75mM CaCl2，0.5 mol/L Tris-HCl (pH=8.0) 50 mL 蔗糖 100g, 补纯水至 500 mL
100mMCaCl2的STC： 100mM CaCl2，0.5 mol/L Tris-HCl (pH=8.0) 50 mL 蔗糖100g, 补纯水至 500 mL
分别配制含不同CaCl2的40%SPTC（PEG8000）：40gPEG8000溶于100ml的STC溶液中。
实施例
一、菜豆壳球孢菌对遗传霉素的敏感性测定
遗传霉素（G418）对菜豆壳球孢菌菌株抑制效果测定：取生长旺盛的菌饼5mm分别置于含不同遗传霉素浓度的 PDA 培养基上，浓度梯度为0、10、20、40和60、80、100、120µg/mL 8个梯度。接种的培养基在27℃条件下，培养5天后观察菌落生长情况。每处理设 3 次重复。
不同浓度的g418拮抗菌丝实验处理，发现在100µg/mL和120µg/mL浓度下均能抑制菌丝的生长（图1）。因此在后期转化子筛选时选用100µg/mL的g418的浓度。
二、原生质体的制备
将在PDA上活化好的新鲜菌丝再转接到新的PDA上培养，27℃培养天1d后在超净工作台上，取新鲜菌丝用45HZ，90s磨碎加入到PDB中28℃，振荡培养12-24h，经3层滤纸过滤收集菌丝沉淀。然后用1.2mol/L的KCL的洗涤过滤的菌丝。挑0.5g菌丝体至装有5 mL裂解液（50mg裂解酶和50mg崩溃酶）的50 mL离心管中（酶解液需提前配好），将离心管按照与水平面30度夹角放置于摇床中（30 ℃，90 rpm）培养3-4h左右。随时观察原生质体产生情况。菌龄是影响原生质体产生的重要因素之一。以1.2 mol/L KCl 为稳渗剂，分析在菌龄为12h、16h、20h和24h时原生质体产生情况。
菌龄与产生原生质体产生量的关系：以1.2 mol/L KCl 为稳渗剂，在菌龄生长12h时和16h时菜豆壳球孢菌丝经 10mg/ mL Driselase 和 10mg/mL Lysing enzymes 共同酶解3.5 h ，用 16 × 25 格血球计数板分别记录菌龄生长12h、16 h、20 h、24h的原生质体数量。12h时可获得 7×108个/mL 原生质体，16h产生的原生质体量为8×108个/mL，菌龄为20h时原生质体数量下降为0.1×108，24时原生质体的数量很少0.002×108个（图2A）。结果表明原生质体随着菌龄的增长而减少，分析原因，可能是因为菜豆壳球孢菌的菌丝随着培养时间的延长会产生菌丝集结的微菌核，而微菌核是该菌度过不良环境的结构，该结构可耐酸碱，在土壤里面最长可以持续存活2-10年。因此，当菌丝培养20h时，如图2B所示在显微镜下可以看到菌丝集结成零星的微菌核，酶解较难，产生的原生质体数量少；当菌丝培养至24h时，肉眼可见的黑色微菌核已经形成，菌丝细胞壁老化、成分改变，酶系统对其作用不显著，造成酶切困难，原生质体得率较低。当菌龄在12h时，虽然原生质体的产生与16h时的数量多少差别不大，但菌龄12h时，一方面产生的菌丝相对比较幼嫩，在原生质体释放后容易受到酶的作用而破裂，造成原生质体数量低，另外一个方面是培养时间短产生的菌体量少，需要收集足够的菌丝需要加大菌体的摇菌量；而菌丝16h时随着菌丝的生长，易于收集菌丝，且原生质体数量高，因此选择16h作为培养该菌丝的最佳时间。
三、原生质体的转化子的摸索
将200μl的原生质体悬浮液、1μg的目质粒加入50 ml无菌离心管中，轻轻混匀，冰上静置30 min；逐滴加入1 ml的40%SPTC溶液，轻轻混匀，在室温静置30 min；加入5 ml的TB3培养液，室温静置2 h（可延长）后28℃，100 rpm过夜培养（12h左右）。次日将恢复好的菌丝混入温度适中的PDA培养基中，加入筛选抗生素（潮霉素 50mg/ml，氨苄 100mg/ml），铺平板，27°C培养2~3 d后挑转化子。
转化过程中，按照大家常用的方法进行转化（STC的配方为50mM CaCl2，0.5 mol/LTris-HCl (pH=8.0) 50 mL 蔗糖 100 g, 补纯水至 500 mL）发现转化效率很低，当转化1μg的DNA时，在平板上只出现1-2个菌落，转化子很少。分析可能造成转化子少的原因：（1）改变培养基配方，增加生长培养基和复苏培养基的配方，有延长了复苏时间，但是转化子数量依旧没有变化。（2）增加了载体的转化起始量，改成每次转化5μg-10μg，但是转化子数量依旧增加很少。进行了很多次，转化子数量依旧很少，一直苦于没有办法提高转化效率。后来在我们进行其他的实验中，需要制备大肠杆菌的感受态细胞，期间需要应用CaCl2，我们突发奇想的怀疑STC的CaCl2浓度会不会影响转化效率呢；于是，运用了同一批的原生质体和载体，采用了不同浓度的STC溶液：
50mM（STC的配方为50mM CaCl2，0.5 mol/L Tris-HCl (pH=8.0) 50 mL 蔗糖 100g, 补纯水至 500 mL）；
75mM（STC的配方为75mM CaCl2，0.5 mol/L Tris-HCl (pH=8.0) 50 mL 蔗糖 100g, 补纯水至 500 mL）；
100mM（STC的配方为100mM CaCl2，0.5 mol/L Tris-HCl (pH=8.0) 50 mL 蔗糖100 g, 补纯水至 500 mL）的CaCl2，
其他方法都相同的时候，进行了转化，结果表明：当氯化钙浓度为50mM时，转化子达0.2×103个/mg DNA，当氯化钙浓度为75mM时，转化子可达8.6×103个以上/mg DNA；当氯化钙浓度为100 mM时，转化子数量为达3.3×103个/mg DNA（图3）。因此，发现STC中的CaCl2浓度影响转化效率，而当氯化钙浓度为75mM时的转化效率最高。
四、菜豆壳球孢转化子PCR检测
转化子经5代转接后，提取总的DNA，经PCR检测gfp基因，1%的琼脂糖电泳检测后发现，泳道1为阳性对照，泳道2-3为阴性对照，泳道4-11为显示转化菌株（图4），该结果表明绿色荧光的菌株均能检测gfp基因的存在，gfp已成功转入到该菌中，表明遗传转化体系构建成功。
五、转化菌株遗传稳定性分析及荧光观察
连续继代培养 5 代后，将转化子MP-gfp转接于含有100μg/mL的遗传霉素PDA培养基中。插入GFP的菌株后该菌丝的形态发生变化，经过5代活化后可分为6类，第 Ⅰ类是菌丝完全变成白色，不形成黑色微菌核（图5-Ⅰ）；第Ⅱ类是菌丝大多数呈白色，出现了少数的黑色微菌核（图5-Ⅱ）；第Ⅲ类是部分菌丝呈白色，黑色微菌核的数量增加（图5-Ⅲ）；第Ⅳ类是几乎观察不到菌丝，但在培养皿的培养基里出现了大量的黑色微菌核（图5-Ⅳ）；第Ⅴ类是菌丝生长旺盛，且有大量的黑色微菌核（图5-Ⅴ），和原始菌株的生长状态一致（图-Ⅵ）。激光共聚焦观察发现菌丝菌出现明显的绿色荧光，且出现明显的菌丝聚集，形成微菌核（图5B-1），而原始菌株却未有荧光（图5B-2）。
六、转化菌株致病力测定及荧光检测
接种甜瓜茎部恒温保湿72h后，观察发现接种空白PDA的茎部没有任何症状（图6-A），而接种插入GFP的菌株甜瓜茎部表现为茎部颜色变成褐色，随着时间的培养时间的延长，茎部的褐色部分会腐坏（图6-B）。在激发光波长为 488 nm的条件下明显观察到绿色荧光（图6-C）。
结论：GFP插入菌丝后的荧光观察和PCR检测GFP基因发现GFP已成功插入到菌丝中；通过致病力分析发现插入GFP的突变株的致病力很强，接种72h后能引起甜瓜茎部表现褐变，而空白对照却不表现任何症状，说明该GFP突变株的致病力没有改变。建立了菜豆壳球孢的遗传转化体系。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1. PEG介导的菜豆壳球孢遗传转化体系的建立方法，其特征在于，步骤为：
（1）将活化好的菜豆壳球孢菌丝进行培养，收集新鲜菌丝，经研磨后振荡培养再经三层滤纸过滤收集菌丝，菌丝经KCl溶液洗涤后，将菌丝转移至裂解液中经摇床培养获得原生质体；
（2）向步骤（1）原生质体的悬浮液中加入目的质粒，混匀后冰上静置，逐滴加入40%SPTC溶液，混匀后继续冰上静置，再加入TB3培养液，室温静置、振荡培养过夜得恢复好的菌丝；
（3）将步骤（2）的菌丝转入含有抗生素的PDA筛选培养基中，进行平板筛选培养，获得转化子；
（4）将步骤（3）的转化子转接至PDA培养基上，转接5代后，待菌长满培养皿时，用打孔器打成5mm直径的菌饼，离体接种于实验植物的茎部。
2. 根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于：所述步骤（1）中新鲜菌丝的菌龄为12-24 h。
3. 根据权利要求2所述的建立方法，其特征在于：所述步骤（1）中KCl溶液的浓度为1.2mol/L；每0.5 g菌丝体里添加5 mL裂解液，裂解时间为3-4 h；每mL裂解液中含有10 mg裂解酶和10 mg崩溃酶。
4. 根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于：所述步骤（2）中原生质体的悬浮液中原生质体的浓度为7-8×108 个/mL；40%SPTC为40g PEG8000溶于100ml的STC溶液中；每1 μg目的质粒添加200 μL的悬浮液。
5.根据权利要求4所述的建立方法，其特征在于：所述目的质粒为含有eGFP基因的环形表达载体。
6.根据权利要求4所述的建立方法，其特征在于，所述目的质粒的制备方法为：将目的片段eGFP插入pCETNS-4载体上。
7. 根据权利要求4所述的建立方法，其特征在于：所述STC溶液为75 mM CaCl2、0.5mol/L Tris-HCl (pH=8.0) 50 mL、蔗糖 100 g，补纯水至 500 mL。
8. 根据权利要求7所述的建立方法，其特征在于：所述步骤（3）中PDA培养基中抗生素的含量为潮霉素 50 mg/mL，氨苄 100 mg/mL。
9.权利要求1-8任一项所述的方法在大量制备菜豆壳球孢转化子中的应用。
10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述转化子的量高达8.6×103个/mgDNA。
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