CN114958840B - miR-206-3p海绵及其应用 - Google Patents

miR-206-3p海绵及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114958840B
CN114958840B CN202210216198.1A CN202210216198A CN114958840B CN 114958840 B CN114958840 B CN 114958840B CN 202210216198 A CN202210216198 A CN 202210216198A CN 114958840 B CN114958840 B CN 114958840B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mir
sponge
aortic aneurysm
abdominal aortic
abdominal
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210216198.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114958840A (zh
Inventor
曹根茂
轩学振
李亚玲
董红霖
张瑞婧
胡杰
王新阳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Second Hospital of Shanxi Medical University
Original Assignee
Second Hospital of Shanxi Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Second Hospital of Shanxi Medical University filed Critical Second Hospital of Shanxi Medical University
Priority to CN202210216198.1A priority Critical patent/CN114958840B/zh
Publication of CN114958840A publication Critical patent/CN114958840A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114958840B publication Critical patent/CN114958840B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开miR‑206‑3p海绵及其应用，其将miR‑206‑3p海绵应用于对腹主动脉瘤(AAA)的破裂的预防或治疗中，可为腹主动脉瘤(AAA)的破裂的预防和治疗提供新的思路。本发明的的miR‑206‑3p海绵可通过功能性敲低miR‑206‑3p，增强VSMC的增殖能力而增加主动脉中膜厚度，限制腹主动脉瘤的进一步扩张，来实现对腹主动脉瘤破裂的预防或治疗。

Description

miR-206-3p海绵及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及miR-206-3p海绵及其应用。
背景技术
腹主动脉瘤（AAA）是主动脉的横膈膜至髂总动脉分支段直径超过正常直径50%或大于3cm 的永久性局限性扩张。AAA 致死率极高，一旦破裂仅有50%的患者有机会进入医院接受紧急治疗。目前普遍认为AAA的发病机制是多因素的，与环境、遗传和生化因素有关。主要病理表现为平滑肌细胞凋亡、细胞外基质(ECM)降解、免疫细胞浸润和动脉粥样硬化血栓形成。
主动脉中层主要由弹性膜和环形排列的血管平滑肌细胞（VSMC）构成，VSMC数量将直接影响动脉收缩能力及动脉顺应性，VSMC数量减少、增殖能力减弱使得动脉易于扩张形成AAA。相关研究表明，主动脉壁中膜VSMC增殖有利于减少动脉瘤的进一步扩张，降低动脉瘤破裂风险。miR-206-3p是一种长度为22nt的小RNA，其在细胞内具有调节基因表达的作用。之前有研究发现miR-206-3p在骨骼肌细胞中高表达，并具有抑制细胞增殖，促进骨骼肌细胞表型转化的作用，但在VSMC中的作用目前还未见研究。
发明内容
因此，基于以上背景，本发明提供miR-206-3p海绵及其应用，其将miR-206-3p海绵应用于对腹主动脉瘤（AAA）的破裂的预防或治疗中，可为腹主动脉瘤（AAA）的破裂的预防和治疗提供新的思路。
本发明的目的之一，是提供一种miR-206-3p海绵，所述miR-206-3p海绵的核苷酸序列如SEQ NO.1所示。
本发明的目的之二，是提供上述的miR-206-3p海绵的应用，所述miR-206-3p海绵可用于制备预防或治疗腹主动脉瘤破裂的药物。
进一步地，上述的miR-206-3p海绵是通过功能性敲低miR-206-3p，增强VSMC的增殖能力而增加主动脉中膜厚度，限制腹主动脉瘤的进一步扩张，来实现对腹主动脉瘤破裂的预防或治疗。
本发明的目的之三，是提供一种miR-206-3p海绵载体质粒，其包括表达载体和与所述表达载体有效连接的miR-206-3p海绵。
进一步地，所述表达载体为腺相关病毒表达载体pHBAAV-CMV-MCS-T2A-ZsGreen。
本发明的目的之四，是提供上述的miR-206-3p海绵载体质粒的应用，所述miR-206-3p海绵载体质粒可用于制备预防或治疗腹主动脉瘤破裂的药物。
本发明的目的之五，是提供一种腺相关病毒，制备所述腺相关病毒采用的穿梭质粒是上述的miR-206-3p海绵载体质粒。
进一步地，所述腺相关病毒的制备方法包含以下步骤：采用上述的miR-206-3p海绵载体质粒、pAAV-RC载体质粒、pHelper载体质粒共转染AAV-293细胞。
本发明的目的之六，是提供上述的腺相关病毒的应用，所述腺相关病毒可用于制备预防或治疗腹主动脉瘤破裂的药物。
采用上述技术方案，具有的有益效果如下：
通过动物实验验证，本发明的miR-206-3p海绵通过功能性敲低miR-206-3p，VSMC去分化，使得VSMC具有更强的增殖能力进而可增加主动脉中膜厚度，可进一步地限制腹主动脉瘤的进一步扩张，从而降低腹主动脉瘤破裂的风险，从而实现对腹主动脉瘤破裂的预防或治疗，可为腹主动脉瘤及其腹主动脉瘤破裂的防治提供新的思路，具有非常高的临床应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1基本表达载体pHBAAV-CMV-MCS-T2A-ZsGreen的图谱示意图；
图2为本发明实施例1构建的miR-206-3p海绵载体质粒的图谱示意图；
图3为本发明实施例2中小鼠AAA模型中的miR-206-3p表达水平示意图；
图4为本发明实施例3中的空转染组和miR-206-3p-sponge转染组的免疫荧光照片；
图5为本发明实施例3中的各组小鼠病理切片及免疫荧光照片；
图6为本发明实施例3中的各组小鼠动脉瘤中最大中膜厚度、最小中膜厚度、内膜周长的柱状示意图；
图7为本发明实施例3的各组小鼠收缩型平滑肌标志物CNN1、ACTA2的表达量柱状示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：腺相关病毒的制备
（1）miR-206-3p海绵载体质粒制备
1）目的基因序列信息：
mmu-miR-206-3p，
UGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGG ；
U变为T：TGGAATGTAAGGAAGTGTGTGG；
反向互补序列：CCACACACTTCCTTACATTCCA ；
突变后的反向互补序列：CCACACACTTAAGACATTCCA；
mmu-miR-206-3p-sponge： CCACACACTTAAGACATTCCATATACCCACACACTTAAGACATTCCAACATCCCACACACTTAAGACATTCCATCTTCACCACACACTTAAGACATTCCA（SEQ NO.1）
2）采用腺相关病毒表达载体pHBAAV-CMV-MCS-T2A-ZsGreen为基本载体（其质粒图谱见图1），对基本载体进行酶切。
配置载体酶切体系（见表1）后，置于37℃水浴锅中反应1-2h；酶切结束之后进行琼脂糖凝胶电泳，回收载体；
表1：载体酶切体系
试剂 体积(μL)
载体DNA(1ug/uL) 1
10*buffer 4
<![CDATA[DdH<sub>2</sub>O]]> 32
EcoRI 1.5
HindIII 1.5
total 40
3）目的片段的获取
①引物设计：
AAV-mmu-miR-206-3p-sponge-Eco-F：
ACAGAATTCCCACACACTTAAGACATTCCATATACCCACACACTTAAGACATTCCAACATCCCACACAC（SEQ NO.2）；
AAV-mmu-miR-206-3p-sponge-Hin-R：
ACAAAGCTTTGGAATGTCTTAAGTGTGTGGTGAAGATGGAATGTCTTAAGTGTGTGGGATGTTGGAATG（SEQ NO.3）。
②PCR扩增
配制PCR扩增体系（见表2），轻轻混匀，置于PCR仪中进行反应；
表2：PCR扩增体系
组分名称 体积（μL）
2X PCR Buffer 25
dNTPs mix（10mM each） 1
F引物 （10 μM） 2
R引物（10 μM） 2
模板DNA(200ng/uL) 1
<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]> 18
phanta Super-Fidelity DNA Polymerase 1
总体积 50
4）目的片段与载体连接
HB infusionTM一步克隆连接体系：
于冰水浴中配制表3所示反应体系，接反应液在50℃反应30min后，置于冰上5min，立即转化。
表3：反应体系
组分名称 体积（μL）
目的基因片段 X(≥100ng)
线性化载体 Y(≥50ng)
2×HB infusionTM Mastermix 10
<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]> Z（=10-X-Y）
总体积 20
5）转化
①DH5α感受态细胞从-80℃冰箱拿出来之后，要立刻放到冰上融化，感受态分装过程操作轻柔，减轻对其机械破坏；
②待感受态融化后，以每管50 μL的体积分装（对于质粒转化，20 μL就足够了），分装之后以不超过感受态体积1/10的量加入连接产物（目前加5 μL连接产物），冰上放置20-30min；
③42℃热激90 s（这个时间要非常严格），热激完之后立刻插入冰上冰育2-3 min；
在超净台中，加入500μL LB培养基（注意一定是无抗的LB培养基），轻柔的上下颠倒3-5次；
④37℃、230rpm震荡培养45-60 min；
⑤将菌液涂到相应抗性的固体平板上，涂布均匀，然后将板子倒放37℃恒温箱培养12-16h。
6）菌液PCR鉴定
7）测序
将筛选出来的阳性克隆，选择两个克隆进行测序，测序结果显示其具有SEQ NO.1所示序列，则说明miR-206-3p海绵载体质粒构建成功，其图谱如图2所示。
（2）将miR-206-3p海绵载体质粒、pAAV-RC载体质粒、pHelper载体质粒进行高纯无内毒素抽提后，采用汉恒的LipofiterTM转染试剂将三质粒共转染AAV-293T细胞，转染后72h收集细胞沉淀，采用柱纯化方式得到高滴度的腺相关病毒保存液（即AAV-miR206 sponge-zsGreen病毒溶液）。
实施例2：
本实施例主要构建小鼠AAA模型并且qPCR检测小鼠AAA模型AAA中miR-206-3p的表达水平。
材料：
C57/BL6小黑鼠（雄性，8-10周，30-40g）：购自山西医科大学实验动物中心(合格证号scxk(晋)2019-0004)。
小鼠饲养环境为18～22℃，湿度50～60％。每笼饲养两只小鼠，食物为大小鼠维持饲料：购自山西医科大学实验动物中心，每次每笼供应30g，每2天供应一次；带金属饮水管的塑料瓶（250ml/500ml）装满清水供小鼠饮用，每2天更换一次。
实验所需材料为小鼠手术器械，可吸收明胶海绵，弹性蛋白酶溶液(0.5%)，8-0可吸收缝合线。
取小鼠吸入乙醚麻妥后，碘伏棉球消毒小鼠腹部皮肤3遍，沿C57小鼠腹中线分别切开腹部皮肤及腹部肌层，打开腹腔，将肠管移动至两侧以暴露腹主动筋膜。找到包裹下腔静脉和腹主动脉的筋膜，小心将之剥离。随后将浸润弹性蛋白酶溶液（100mg/ml）的明胶海绵（1mm * 1mm * 5mm）放置于肾下腹主动脉上15min，取出海绵，随后使用37℃生理盐水灌洗小鼠腹腔3次。对照组则使用生理盐水浸润的明胶海绵，其余同上。还纳腹腔器官后使用6-0尼龙线缝合腹肌层及皮肤，随后使用碘伏棉球再次消毒。术后将小鼠放置于加热垫上苏醒，21d后开腹观察AAA形成情况，若直径扩大超过50%则视为造模成功。
小鼠AAA模型造模21d后处死，心脏灌注大量生理盐水后分离腹主动脉，用于总RNA提取。RNA提取使用M5 HiPer纤维类组织RNA快速提取试剂盒（MF168-01，聚合美，北京）。来源于AAA和正常腹主动脉的总RNA（1ug）使用Bulge-Loop miRNAqRT-PCR Starter Kit（锐博生物，广州）进行逆转录及qPCR。内参基因为U6。引物如下：
-206-3p RT Primer
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCACAC
-206-3p Forward GCGCGTGGAATGTAAGGAAGT
-206-3p Reverse AGTGCAGGGTCCGAGGTATT
结果见附图3，显示小鼠AAA模型的miR-206-3p表达水平显著升高约5倍（p<0.05）。
实施例3：对比实验验证
C57/BL6小黑鼠（雄性，8-10周，30-40g）：购自山西医科大学实验动物中心(合格证号scxk(晋)2019-0004)。
小鼠饲养环境为18～22℃,湿度50～60％。每笼饲养两只小鼠，食物为大小鼠维持饲料：购自山西医科大学实验动物中心，每次每笼供应30g，每2天供应一次；带金属饮水管的塑料瓶（250ml/500ml）装满清水供小鼠饮用，每2天更换一次。
实验所需材料为小鼠手术器械，可吸收明胶海绵，弹性蛋白酶溶液(0.5%)，8-0可吸收缝合线；
AAV-zsGreen空载病毒溶液20ul，AAV-miR206-3p-sponge-zsGreen病毒溶液20ul。
①弹性蛋白酶处理+AAV-miR-206-3p-sponge转染组（转染组）
转染组小鼠吸入乙醚麻妥后，碘伏棉球消毒小鼠腹部皮肤3遍，沿C57小鼠腹中线分别切开腹部皮肤及腹部肌层，打开腹腔，将肠管移动至两侧以暴露腹主动筋膜。随后从左侧钝性分离腹主动脉筋膜，暴露腹主动脉，此过程注意不要损伤腹主动脉筋膜完整性。将浸润0.5%弹性蛋白酶的明胶海绵（5mm*2mm*2mm）敷在肾下腹主动脉上15分钟（破坏弹性蛋白层，使腹主动脉在血压下扩张形成动脉瘤）。生理盐水冲洗3次，随后将浸润20uL AAV-miR206-3p-sponge-zsGreen溶液的可吸收明胶海绵（5mm*2mm*2mm，大小可视AAV溶液体积而定）放置于腹主动脉旁，使用主动脉鞘膜包裹可吸收明胶海绵，并使用8-0可吸收缝合线缝合3-5针，还纳腹腔器官后使用6-0尼龙线缝合腹肌层及皮肤，随后使用碘伏棉球再次消毒。术后将小鼠放置于加热垫上苏醒。
②弹性蛋白酶处理+AAV-空转染组（空转染组）
空转染组小鼠在进行腹主动脉暴露后，使用浸润0.5%弹性蛋白酶的明胶海绵敷在腹主动脉上15分钟，生理盐水冲洗3次（此步骤之前均同上）。随后将浸润 20uL AAV-zsGreen空载病毒溶液的可吸收明胶海绵（5mm*2mm*2mm）放置于腹主动脉旁，使用主动脉鞘膜包裹可吸收明胶海绵，并使用8-0可吸收缝合线缝合3-5针，还纳腹腔器官后使用6-0尼龙线缝合腹肌层及皮肤，随后使用碘伏棉球再次消毒。术后将小鼠放置于加热垫上苏醒。
③弹性蛋白处理组
小鼠在进行腹主动脉暴露后，使用浸润0.5%弹性蛋白酶的明胶海绵敷在腹主动脉上15分钟，生理盐水冲洗3次（此步骤之前均同上），还纳腹腔器官后使用6-0尼龙线缝合腹肌层及皮肤，随后使用碘伏棉球再次消毒。术后将小鼠放置于加热垫上苏醒。
上述三组加假手术组的小鼠在造模21d后处死，进行相关指标检测。免疫荧光所需试剂及抗体均由赛维尔生物科技有限公司（武汉）提供。使用GraphPad Prism 8进行统计分析。Kolmogorov-Smirnov检验数据正态性（所有数据均服从正态分布），使用单因素方差分析（One-way Anova）鉴别各组间中膜厚度，内膜周长，收缩型标记物相对表达量是否有组间差异，以P<0.05为差异有统计学意义。中膜厚度，内膜周长通过CaseViewer2.4.0 于免疫荧光切片上采集。
结果如图4所示，图4的左图为空转染组免疫荧光图片，右图为转染组免疫荧光图片，从图中可以看出转染组的小鼠在转染AAV-miR-206-3p-sponge后，腹主动脉直径增粗，每组样本数（n=4）；
图5的左图为各组小鼠的病理切片图片，右图为各组小鼠的免疫荧光结果，显示AAV-miR-206-3p sponge转染后，α-SMA阳性的VSMC显著增殖，动脉中膜增厚（箭头处），每组样本数（n=3），本组样本显示敲除miR-206-3p会使动脉瘤中最大中膜厚度与最小中膜厚度均显著增加，而内膜周长无显著差异，总直径增加。
图6为收缩型平滑肌标志物CNN1、ACTA2的检测结果，从图中可以明显看出AAV-miR-206-3p sponge转染后，VSMC收缩型标记calponin1(CNN1)和αSMA（ACTA2）转录水平表达量进一步降低，表明VSMC发生了去分化。每组样本数（n=6）。
腹主动脉瘤的药物治疗一直是难点和热点，目前尚无有效的药物治疗可防止腹主动脉瘤进一步扩张。而本发明通过实验验证了miR-206-3p海绵功能性敲低miR-206-3p，可通过去分化VSMC来增加VSMC的增殖能力，进而增加主动脉中膜厚度，限制腹主动脉瘤的进一步扩张，从而降低主动脉瘤破裂的风险。miR-206-3p具有促进VSMC分化，降低其增殖能力的作用。腹主动脉瘤中miR-206-3p为高表达，将其敲低，收缩性标记物（CNN1，ACTA2）表达降低，α-SMA（+）细胞数量增多。说明敲除miR-206-3p后VSMC由分化程度高、增殖能力弱的收缩型转换为分化程度低、增殖能力强的表型，中止了VSMC数量减少导致的主动脉瘤形成，可降低了主动脉破裂的风险，可对主动脉瘤破裂起到防治的效果。本发明以miR-206-3p可作为治疗腹主动脉瘤的靶点，并在小鼠腹主动脉瘤模型上进行了实验验证，为进一步的临床治疗腹主动脉瘤提供了新思路及新靶点。
以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，实施例中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 山西医科大学第二医院
<120> miR-206-3p海绵及其应用
<130> 2022
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ccacacactt aagacattcc atatacccac acacttaaga cattccaaca tcccacacac 60
ttaagacatt ccatcttcac cacacactta agacattcca 100
<210> 2
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
acagaattcc cacacactta agacattcca tatacccaca cacttaagac attccaacat 60
cccacacac 69
<210> 3
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
acaaagcttt ggaatgtctt aagtgtgtgg tgaagatgga atgtcttaag tgtgtgggat 60
gttggaatg 69

Claims (6)

1.miR-206-3p海绵在制备预防或治疗腹主动脉瘤破裂的药物中的应用，其特征在于，所述miR-206-3p海绵的核苷酸序列如SEQ NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述miR-206-3p海绵通过功能性敲低miR-206-3p，增强VSMC的增殖能力而增加主动脉中膜厚度，限制腹主动脉瘤的进一步扩张，来实现对腹主动脉瘤破裂的预防或治疗。
3.一种miR-206-3p海绵载体质粒在制备预防或治疗腹主动脉瘤破裂的药物中的应用，其特征在于，所述miR-206-3p海绵载体质粒包括表达载体和与所述表达载体有效连接的miR-206-3p海绵，所述miR-206-3p海绵的核苷酸序列如SEQ NO.1所示。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述表达载体为腺相关病毒表达载体pHBAAV-CMV-MCS-T2A-ZsGreen。
5.一种腺相关病毒在制备预防或治疗腹主动脉瘤破裂的药物中的应用，其特征在于，制备所述腺相关病毒采用的穿梭质粒是权利要求3或4所述的miR-206-3p海绵载体质粒。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述腺相关病毒的制备方法包含以下步骤：采用权利要求3或4所述的miR-206-3p海绵载体质粒、pAAV-RC载体质粒、pHelper载体质粒共转染AAV-293细胞。
CN202210216198.1A 2022-03-07 2022-03-07 miR-206-3p海绵及其应用 Active CN114958840B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210216198.1A CN114958840B (zh) 2022-03-07 2022-03-07 miR-206-3p海绵及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210216198.1A CN114958840B (zh) 2022-03-07 2022-03-07 miR-206-3p海绵及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114958840A CN114958840A (zh) 2022-08-30
CN114958840B true CN114958840B (zh) 2023-05-05

Family

ID=82975429

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210216198.1A Active CN114958840B (zh) 2022-03-07 2022-03-07 miR-206-3p海绵及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114958840B (zh)

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090023670A1 (en) * 2006-05-19 2009-01-22 Sebestyen Magdolna G Regulation of Transgene Expression by RNA Interference
EP3598978B1 (en) * 2018-07-26 2024-05-29 EXOFIX S.r.l. Fibroadipogenic progenitor-derived exosomes for regeneration of dystrophic muscles
CN111471716B (zh) * 2020-05-20 2021-10-15 上海市同济医院 一种基于重组腺相关病毒8型的microRNA-212-3P海绵的构建及其应用
CN112251421B (zh) * 2020-10-29 2022-05-24 武汉大学 一种ezh2可变剪切体及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Myocardin/miR-206/Connexin43信号通路在血管平滑肌细胞增殖及动脉粥样硬化中的作用;李慧;《中国优秀博士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》(第05期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114958840A (zh) 2022-08-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Mann et al. Ex-vivo gene therapy of human vascular bypass grafts with E2F decoy: the PREVENT single-centre, randomised, controlled trial
JP7515658B2 (ja) 瘻孔を治療する方法及び材料
Ding et al. Galectin-1-induced skeletal muscle cell differentiation of mesenchymal stem cells seeded on an acellular dermal matrix improves injured anal sphincter
CN114958840B (zh) miR-206-3p海绵及其应用
CN116898871B (zh) 慢病毒载体在制备治疗糖尿病血管内膜增生的药物的应用
CN107252491A (zh) 用于治疗心力衰竭的药物及其筛选方法和制备方法
CN113768947B (zh) 一种基因抑制剂在制备缺血性心脏病治疗药物中的应用
CN109097358B (zh) 一种lncRNA在预防或治疗高血压中的应用
CN114177298B (zh) Adar1作为治疗肺动脉高压疾病药物的应用
CN110327363A (zh) 基于hsa-miR-320a的防治糖尿病的药物及其筛选方法和制备方法
CN107022635A (zh) Acadl基因及其表达产物在制备腹主动脉瘤诊治产品中的应用
CN112391385A (zh) 靶向抑制NCEH1基因表达的siRNA、siRNA质粒、慢病毒及其构建方法和应用
CN111647656A (zh) mir-29a基因在检测肝癌及肝纤维化中的应用及所述基因条件敲入小鼠的构建方法
Kim et al. Body-shaping membrane to regenerate breast fat by elastic structural holding
CN115094090B (zh) 特定硫酸肝素修饰酶基因修饰的细胞及其构建方法和应用
CN105603116B (zh) 一种诊治子宫肌瘤的分子标志物
CN111840327B (zh) 治疗糖尿病足的间质干细胞制剂及其应用
CN105543401B (zh) 与子宫肌瘤相关的基因标志物
CN117398464B (zh) circRERE的抑制剂在制备缺血性心脏病治疗药物中的应用
CN117568466B (zh) 动脉重塑标志物及其应用
CN114480626B (zh) 一种子痫前期相关的基因及其应用
CN111097039B (zh) Ras相关蛋白2的制药用途
CN110433170B (zh) 心脏抽吸液miR-28-5p在心脏疾病中的应用
US20220409769A1 (en) Methods and materials for treating fistulas
CN116004814A (zh) miR-3154及其下游靶基因Pax7在VSMCs表型转化相关疾病中的医药用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant