CN114957348A - 一种合成On-DNA芳并三氮唑化合物及其衍生物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种合成On‑DNA芳并三氮唑化合物及其衍生物的方法，该方法以On‑DNA芳基邻位二氨基化合物为原料，在亚硝酸试剂的存在下，反应得到On‑DNA芳并三氮唑化合物及其衍生物。本反应方法不需要金属催化剂参与、反应温和、原料易得、操作简单、应用试剂范围广，能够在DNA编码化合物库构建中引入芳并三氮唑及其衍生物结构，且适合多孔板进行的DNA编码化合物库的合成操作。
Description
技术领域
本发明属于编码化合物库技术领域，具体涉及一种由On-DNA芳基邻位二氨基化合物在亚硝酸试剂存在下，得到On-DNA芳并三氮唑化合物及其衍生物的方法。
背景技术
在药物研发，尤其是新药研发中，针对生物靶标的高通量筛选是快速获得先导化合物的主要手段之一。然而，基于单个分子的传统高通量筛选所需时间长、设备投入巨大、库化合物数量有限(数百万)，且化合物库的建成需要数十年的积累，限制了先导化合物的发现效率与可能性。近年来出现的DNA编码化合物库技术(WO2005058479、WO2018166532、CN103882532)，结合了组合化学和分子生物学技术，在分子水平上将每个化合物加上一个DNA标签，并能在极短的时间内合成高达亿级的化合物库，成为下一代化合物库筛选技术的趋势，并开始在制药行业广泛应用，产生了诸多积极的效果(Accounts of ChemicalResearch,2014,47,1247-1255)。
DNA编码化合物库通过组合化学快速产生巨型化合物库，并且能高通量地筛选出先导化合物，使得先导化合物的筛选变得前所未有的快捷和高效。构建DNA编码化合物库的挑战之一就是需要在DNA上高收率地合成具有化学多样性的小分子。由于DNA需要在一定的条件下(溶剂、pH、温度、离子浓度)才能维持稳定，同时应用于DNA编码化合物库构建的On-DNA反应还需要有较高的产率。因此DNA上进行的化学反应(简称On-DNA反应)的试剂种类、反应种类、反应条件直接影响到DNA编码化合物库的丰富度和可选择性。从而开发能够与DNA兼容的化学反应也成为目前DNA编码化合物库技术的长期探索和研究方向，也直接影响了DNA编码化合物库的应用及商业价值。
芳并三氮唑化合物及其衍生物是一类重要的化学结构，其在药物化学、有机化学以及材料化学领域都有很高的应用价值。因此在DEL中合成芳并三氮唑化合物及其衍生物有着重要意义。目前没有DNA编码化合物库构建中构建芳并三氮唑的相关方法，因此，需要开发构建芳并三氮唑及其衍生物的方法，并适用于构建DNA编码化合物库的大批量多孔板操作。
发明内容
本发明提供了一种原料稳定存储、反应条件温和、底物普适性好、对DNA损伤小、适合于使用多孔板进行批量操作的DNA编码化合物库的合成方法，可以快速将On-DNA芳基邻位二氨基化合物通过一步反应转化为On-DNA芳并三氮唑化合物及其衍生物。
本发明提供了一种合成On-DNA芳并三氮唑化合物及其衍生物的方法，所述方法是以On-DNA芳基邻位二氨基化合物为原料，在亚硝酸试剂的存在下，在反应溶剂中经一步反应得到On-DNA芳并三氮唑化合物及其衍生物；所述On-DNA芳基邻位二氨基化合物结构式为
所述On-DNA芳并三氮唑化合物及其衍生物的结构式为
其中，结构式中DNA包含由人工修饰的和/或未修饰的核苷酸单体聚合得到的单链或双链的核苷酸链，该核苷酸链通过一个或多个化学键或基团与化合物中剩余部分相连，所述DNA的长度为10～200bp。
其中，结构式中的DNA与Ar或R1通过一个化学键或多个化学键连接。一个化学键时，是指结构式中的DNA与Ar或R1直接相连；多个化学键时，指结构式中的DNA与Ar或R1之间间隔多个化学键相连，比如，DNA与Ar或R1之间通过一个亚甲基(-CH2-)相连，即通过两个化学键连接；或DNA与Ar或R1之间通过一个羰基(-CO-)连接DNA的氨基，也是通过两个化学键连接；或DNA与Ar或R1通过一个亚甲基羰基(-CH2CO-)连接DNA的氨基，也是通过三个连续的化学键连接。
其中，结构中Ar为任选取代的单环或者多环的芳香环；
R1选自分子量1000以下与DNA和氨基氮原子直接相连的基团或者不存在；
R2选自氢或分子量1000以下与氨基氮原子直接相连的基团。
其中所述的Ar可以选自如下基团：
所述的Ar上可以有0～3个其他取代基团，所述取代基团选自氢、羧基、卤素、烷基、取代烷基、5～10元芳基、取代5～10元芳基、5-10元芳杂环基、取代5-10元芳杂环基；其中，所述烷基为C1～C20烷基或C3～C8环烷基；取代烷基的取代基的数量为一个或多个；取代烷基的取代基是相互独立的选自卤素、羧基、硝基、烷氧基、卤代苯基、苯基、烷基苯基中的一种或多种；取代5～10元芳基的取代基的数量为一个或多个，取代5～10元芳基的取代基是相互独立的选自卤素、氰基、硝基、羧基、烷氧基、C1～C20烷基、三氟甲基中的一种或多种；取代5-10元芳杂环基的取代基的数量为一个或多个，取代5-10元芳杂环基的取代基是相互独立的选自卤素、氰基、硝基、羧基、烷氧基、C1～C20烷基、三氟甲基中的一种或多种；；
所述的R1或R2为氢、烷基、取代烷基、5～10元芳基、取代5～10元芳基、5-10元芳杂环基、取代5-10元芳杂环基、3-10元杂环基、取代3-10元杂环基；其中，所述烷基为C1～C20烷基或C3～C8环烷基；取代烷基的取代基的数量为一个或多个；取代烷基的取代基是相互独立的选自卤素、氨基、羧基、硝基、烷氧基、卤代苯基、苯基、烷基苯基、烷氧基羰基氨基中的一种或多种；取代5～10元芳基的取代基的数量为一个或多个，取代5～10元芳基的取代基是相互独立的选自卤素、氰基、硝基、羧基、烷氧基、C1～C20烷基、三氟甲基中的一种或多种；取代5-10元芳杂环基的取代基的数量为一个或多个，取代5-10元芳杂环基的取代基是相互独立的选自卤素、氰基、硝基、羧基、烷氧基、C1～C20烷基、三氟甲基中的一种或多种；取代3-10元杂环基的取代基是相互独立的选自卤素、氰基、硝基、羧基、烷氧基、C1～C20烷基、C1～C20烷氧基羰基、三氟甲基中的一种或多种。
更具体地：
所述On-DNA芳基邻位二氨基化合物优先选自：
本发明还提供了一种合成On-DNA芳并三氮唑化合物及其衍生物的方法，所述反应的反应步骤为：向摩尔当量为1，摩尔浓度为0.5-5mM的On-DNA芳基邻位二氨基化合物溶液中，加入5-500倍摩尔当量亚硝酸试剂，在0℃～100℃下反应0.5-24小时。
进一步地，所述亚硝酸试剂为亚硝酸叔丁酯、亚硝酸钠、亚硝酸异戊酯中的一种或几种的混合物；优选地，所述亚硝酸试剂为是亚硝酸叔丁酯。
进一步地，所述反应溶剂为水、甲醇、乙醇、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、甲基吡咯烷酮、无机盐缓冲液、有机酸缓冲液、有机碱缓冲液中任意一种或几种的含水混合溶剂；优选地，所述反应溶剂含有磷酸钠缓冲液和二甲基甲酰胺；更优选地，所述磷酸钠缓冲液pH＝5.5。
进一步地，所述反应的反应温度为0℃～100℃；优选地，反应温度为10℃～60℃；更优选地，反应温度为25℃。
进一步地，所述反应的反应时间为0.5～24小时；优选地，反应时间为0.5小时～4小时；更优选地，反应时间为1小时。
进一步地，所述反应的加料顺序为先加入On-DNA芳基邻位二氨基化合物，再加入亚硝酸试剂。
进一步地，上述方法用于批量的多孔板操作。
进一步地，上述方法用于多孔板的DNA编码化合物库的合成。
本发明方法可以实现一步反应将On-DNA芳基邻位二氨基化合物转化为On-DNA芳并三氮唑化合物及衍生物。该方法不需要金属催化剂参与、反应温和、原料易得、操作简单、应用试剂范围广，能够在DNA编码化合物库构建中引入芳并三氮唑及其衍生物结构，且适合多孔板进行的DNA编码化合物库的合成操作。
关于本发明的使用术语的定义：除非另有说明，本文中基团或者术语提供的初始定义适用于整篇说明书的该基团或者术语；对于本文没有具体定义的术语，应该根据公开内容和上下文，给出本领域技术人员能够给予它们的含义。
“取代”是指分子中的氢原子被其它不同的原子或分子所替换。
“任选取代”是指取代或不取代。
碳氢基团中碳原子含量的最小值和最大值通过前缀表示，例如，前缀(Ca～Cb)烷基表明任何含“a”至“b”个碳原子的烷基。因此，例如，C1～C20烷基是指包含1～20个碳原子的直链或支链的烷基。
烷基是指烷烃分子中直链或支链的烃基，例如甲基-CH3、乙基-CH2CH3、亚甲基-CH2-；烷基基团也可以是其他基团的一部分，所述其他基团例如为C1～C6烷氧基，C1～C6烷基氨基。
环烷基是指具有多个碳原子且没有环杂原子且具有单个环或多个环(包括稠合、桥连和螺环体系)的饱和或部分饱和的环状基团。
所述卤素为氟、氯、溴或碘。
烷氧基是指烷基与氧原子连接形成取代基，例如甲氧基为-OCH3。
卤代苯基是指苯基上的H被卤素取代而形成的基团。
烷基苯基是指苯基上的H被烷基取代而形成的基团。
芳基是指不含杂原子，由C原子构成的芳香性单一环状或多个环状基团。
芳杂环基是指带有至少一个选自O、S、N的具有芳香性的单一环状或多个环状基团。
杂环基是带有至少一个选自O、S、N的多个原子的饱和或部分不饱和的单环或多环烃基。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明：
图1：实施例1中化合物1的LC-Ms谱图和Ms谱图。
具体实施方式
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
本发明中DNA-NH2是单链或双链DNA与接头基团形成的带有-NH2接头的DNA结构，例如WO2005058479中“compound1”的DNA-NH2结构。也例如下述的DNA结构：
其中，A为腺嘌呤，T为胸腺嘧啶，C为胞嘧啶，G为鸟嘌呤。
实施例1、On-DNA苯并三氮唑化合物的合成
将DNA二氨基化合物溶解到磷酸钠缓冲液中(磷酸钠250mM，pH＝5.5)中，配置成1mM的溶液(10ul，10nmol)，向溶液中加入亚硝酸叔丁酯(2000nmol，200当量，500mM二甲基甲酰胺溶液)，混合均匀，然后将反应液置于25度反应1小时。
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物1，LCMS确认反应转化率为98％。理论分子量为5433.2，观察到的分子量为5434.5。
实施例2、On-DNA苯并三氮唑化合物的合成
将DNA二氨基化合物溶解到磷酸钠缓冲液中(磷酸钠250mM，pH＝5.5)中，配置成1mM的溶液(10ul，10nmol)，向溶液中加入亚硝酸钠(2000nmol，200当量，500mM二甲基甲酰胺溶液)，混合均匀，然后将反应液置于25度反应1小时。
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物1，LCMS确认反应转化率为95％。理论分子量为5433.2，观察到的分子量为5434.5。
实施例3、On-DNA苯并三氮唑化合物的合成
将DNA二氨基化合物溶解到磷酸钠缓冲液中(磷酸钠250mM，pH＝5.5)中，配置成1mM的溶液(10ul，10nmol)，向溶液中加入亚硝酸异戊酯(2000nmol，200当量，500mM二甲基甲酰胺溶液)，混合均匀，然后将反应液置于25度反应1小时。
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物1，LCMS确认反应转化率为90％。理论分子量为5433.2，观察到的分子量为5434.5。
实施例4、On-DNA苯并三氮唑化合物的合成
将DNA二氨基化合物溶解到吗啉乙磺酸钠缓冲液中(吗啉乙磺酸钠500mM，pH＝6.0)中，配置成1mM的溶液(10ul，10nmol)，向溶液中加入亚硝酸叔丁酯(2000nmol，200当量，500mM二甲基甲酰胺溶液)，混合均匀，然后将反应液置于25度反应1小时。
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物1，LCMS确认反应转化率为87％。理论分子量为5433.2，观察到的分子量为5434.5。
实施例5、On-DNA苯并三氮唑化合物的合成
将DNA二氨基化合物溶解到磷酸钠缓冲液中(磷酸钠250mM，pH＝7.1)中，配置成1mM的溶液(10ul，10nmol)，向溶液中加入亚硝酸叔丁酯(2000nmol，200当量，500mM二甲基甲酰胺溶液)，混合均匀，然后将反应液置于25度反应1小时。
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物1，LCMS确认反应转化率为91％。理论分子量为5433.2，观察到的分子量为5434.5。
实施例6、On-DNA苯并三氮唑化合物的合成
将DNA二氨基化合物溶解到硼酸钠缓冲液中(硼酸钠250mM，pH＝5.5)中，配置成1mM的溶液(10ul，10nmol)，向溶液中加入亚硝酸叔丁酯(2000nmol，200当量，500mM二甲基甲酰胺溶液)，混合均匀，然后将反应液置于25度反应1小时。
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物1，LCMS确认反应转化率为83％。理论分子量为5433.2，观察到的分子量为5434.5。
实施例7、On-DNA苯并三氮唑化合物的合成
将DNA二氨基化合物溶解到磷酸钠缓冲液中(磷酸钠250mM，pH＝5.5)中，配置成1mM的溶液(10ul，10nmol)，向溶液中加入亚硝酸叔丁酯(2000nmol，200当量，500mM二甲基甲酰胺溶液)，混合均匀，然后将反应液置于45度反应1小时。
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物1，LCMS确认反应转化率为76％。理论分子量为5433.2，观察到的分子量为5434.5。
实施例8、On-DNA苯并三氮唑化合物的合成
将DNA二氨基化合物溶解到磷酸钠缓冲液中(磷酸钠250mM，pH＝5.5)中，配置成1mM的溶液(10ul，10nmol)，向溶液中加入亚硝酸叔丁酯(2000nmol，200当量，500mM二甲基甲酰胺溶液)，混合均匀，然后将反应液置于60度反应1小时。
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物1，LCMS确认反应转化率为27％。理论分子量为5433.2，观察到的分子量为5434.5。
实施例9、On-DNA苯并三氮唑化合物的合成
将DNA二氨基化合物溶解到磷酸钠缓冲液中(磷酸钠250mM，pH＝5.5)中，配置成1mM的溶液(10ul，10nmol)，向溶液中加入亚硝酸叔丁酯(2000nmol，200当量，500mM二甲基甲酰胺溶液)，混合均匀，然后将反应液置于25度反应0.5小时。
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物1，LCMS确认反应转化率为96％。理论分子量为5433.2，观察到的分子量为5434.5。
实施例10、On-DNA苯并三氮唑化合物的合成
将DNA二氨基化合物溶解到磷酸钠缓冲液中(磷酸钠250mM，pH＝5.5)中，配置成1mM的溶液(10ul，10nmol)，向溶液中加入亚硝酸叔丁酯(2000nmol，200当量，500mM二甲基甲酰胺溶液)，混合均匀，然后将反应液置于25度反应2小时。
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物1，LCMS确认反应转化率为98％。理论分子量为5433.2，观察到的分子量为5434.5。
实施例11、On-DNA苯并三氮唑化合物的合成
将DNA二氨基化合物溶解到磷酸钠缓冲液中(磷酸钠250mM，pH＝5.5)中，配置成1mM的溶液(10ul，10nmol)，向溶液中加入亚硝酸叔丁酯(2000nmol，200当量，500mM二甲基甲酰胺溶液)，混合均匀，然后将反应液置于25度反应4小时。
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物1，LCMS确认反应转化率为97％。理论分子量为5433.2，观察到的分子量为5434.5。
实施例12、On-DNA苯并三氮唑化合物的合成
将DNA二氨基化合物溶解到磷酸钠缓冲液中(磷酸钠250mM，pH＝5.5)中，配置成1mM的溶液(10ul，10nmol)，向溶液中加入亚硝酸叔丁酯(2000nmol，200当量，500mM二甲基乙酰胺溶液)，混合均匀，然后将反应液置于25度反应1小时。
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物1，LCMS确认反应转化率为96％。理论分子量为5433.2，观察到的分子量为5434.5。
实施例13、On-DNA苯并三氮唑化合物的合成
将DNA二氨基化合物溶解到磷酸钠缓冲液中(磷酸钠250mM，pH＝5.5)中，配置成1mM的溶液(10ul，10nmol)，向溶液中加入亚硝酸叔丁酯(2000nmol，200当量，500mM乙腈溶液)，混合均匀，然后将反应液置于25度反应1小时。
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物1，LCMS确认反应转化率为90％。理论分子量为5433.2，观察到的分子量为5434.5。
实施例14、On-DNA苯并三氮唑化合物的合成
将DNA二氨基化合物溶解到磷酸钠缓冲液中(磷酸钠250mM，pH＝5.5)中，配置成1mM的溶液(10ul，10nmol)，向溶液中加入亚硝酸叔丁酯(2000nmol，200当量，500mM甲基吡咯烷酮溶液)，混合均匀，然后将反应液置于25度反应1小时。
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物1，LCMS确认反应转化率为95％。理论分子量为5433.2，观察到的分子量为5434.5。
实施例15、On-DNA芳并三氮唑化合物的合成
将DNA二氨基化合物溶解到磷酸钠缓冲液中(磷酸钠250mM，pH＝5.5)中，配置成1mM的溶液(10ul，10nmol)，向溶液中加入亚硝酸叔丁酯(2000nmol，200当量，500mM二甲基甲酰胺溶液)，混合均匀，然后将反应液置于25度反应1小时。
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物1，LCMS确认反应转化率为89％。理论分子量为5434.1，观察到的分子量为5433.9。
实施例16、On-DNA苯并三氮唑化合物的合成
将DNA二氨基化合物溶解到磷酸钠缓冲液中(磷酸钠250mM，pH＝5.5)中，配置成1mM的溶液(10ul，10nmol)，向溶液中加入亚硝酸叔丁酯(2000nmol，200当量，500mM二甲基甲酰胺溶液)，混合均匀，然后将反应液置于25度反应1小时。
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物1，LCMS确认反应转化率为29％。理论分子量为5433.2，观察到的分子量为5461.9。
实施例17、On-DNA苯并三氮唑化合物的合成
将DNA二氨基化合物溶解到磷酸钠缓冲液中(磷酸钠250mM，pH＝5.5)中，配置成1mM的溶液(10ul，10nmol)，向溶液中加入亚硝酸叔丁酯(2000nmol，200当量，500mM二甲基甲酰胺溶液)，混合均匀，然后将反应液置于25度反应1小时。
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物1，LCMS确认反应转化率为98％。理论分子量为5433.2，观察到的分子量为5433.9。
实施例18、On-DNA苯并三氮唑化合物的合成
将DNA二氨基化合物溶解到磷酸钠缓冲液中(磷酸钠250mM，pH＝5.5)中，配置成1mM的溶液(10ul，10nmol)，向溶液中加入亚硝酸叔丁酯(2000nmol，200当量，500mM二甲基甲酰胺溶液)，混合均匀，然后将反应液置于25度反应1小时。
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物1，LCMS确认反应转化率为87％。理论分子量为5433.2，观察到的分子量为5432.5。
实施例19、On-DNA芳并三氮唑化合物的合成
将DNA二氨基化合物溶解到磷酸钠缓冲液中(磷酸钠250mM，pH＝5.5)中，配置成1mM的溶液(10ul，10nmol)，向溶液中加入亚硝酸叔丁酯(2000nmol，200当量，500mM二甲基甲酰胺溶液)，混合均匀，然后将反应液置于25度反应1小时。
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物1，LCMS确认反应转化率为77％。理论分子量为5434.1，观察到的分子量为5433.9。
实施例20、On-DNA苯并三氮唑化合物的合成
将DNA二氨基化合物溶解到磷酸钠缓冲液中(磷酸钠250mM，pH＝5.5)中，配置成1mM的溶液(10ul，10nmol)，向溶液中加入亚硝酸叔丁酯(2000nmol，200当量，500mM二甲基甲酰胺溶液)，混合均匀，然后将反应液置于25度反应1小时。
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物1，LCMS确认反应转化率为77％。理论分子量为5447.2，观察到的分子量为5447.6。
实施例21、On-DNA苯并三氮唑化合物的合成
将DNA二氨基化合物溶解到磷酸钠缓冲液中(磷酸钠250mM，pH＝5.5)中，配置成1mM的溶液(10ul，10nmol)，向溶液中加入亚硝酸叔丁酯(2000nmol，200当量，500mM二甲基甲酰胺溶液)，混合均匀，然后将反应液置于25度反应1小时。
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物1，LCMS确认反应转化率为69％。理论分子量为5447.2，观察到的分子量为5447.2。
实施例22、On-DNA苯并三氮唑化合物的合成
将DNA二氨基化合物溶解到磷酸钠缓冲液中(磷酸钠250mM，pH＝5.5)中，配置成1mM的溶液(10ul，10nmol)，向溶液中加入亚硝酸叔丁酯(2000nmol，200当量，500mM二甲基甲酰胺溶液)，混合均匀，然后将反应液置于25度反应1小时。
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物1，LCMS确认反应转化率为75％。理论分子量为5447.2，观察到的分子量为5446.8。
实施例23、On-DNA苯并三氮唑化合物的合成
将DNA二氨基化合物溶解到磷酸钠缓冲液中(磷酸钠250mM，pH＝5.5)中，配置成1mM的溶液(10ul，10nmol)，向溶液中加入亚硝酸叔丁酯(2000nmol，200当量，500mM二甲基甲酰胺溶液)，混合均匀，然后将反应液置于25度反应1小时。
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物1，LCMS确认反应转化率为99％。理论分子量为5387.1，观察到的分子量为5386.7。
实施例24、On-DNA苯并三氮唑化合物的合成
将DNA二氨基化合物溶解到磷酸钠缓冲液中(磷酸钠250mM，pH＝5.5)中，配置成1mM的溶液(10ul，10nmol)，向溶液中加入亚硝酸叔丁酯(2000nmol，200当量，500mM二甲基甲酰胺溶液)，混合均匀，然后将反应液置于25度反应1小时。
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物1，LCMS确认反应转化率为99％。理论分子量为5411.2，观察到的分子量为5410.1。
实施例25、On-DNA苯并三氮唑化合物的合成
将DNA二氨基化合物溶解到磷酸钠缓冲液中(磷酸钠250mM，pH＝5.5)中，配置成1mM的溶液(10ul，10nmol)，向溶液中加入亚硝酸叔丁酯(2000nmol，200当量，500mM二甲基甲酰胺溶液)，混合均匀，然后将反应液置于25度反应1小时。
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物1，LCMS确认反应转化率为94％。理论分子量为5419.1，观察到的分子量为5418.5。
实施例26、On-DNA苯并三氮唑化合物的合成
将DNA二氨基化合物溶解到磷酸钠缓冲液中(磷酸钠250mM，pH＝5.5)中，配置成1mM的溶液(10ul，10nmol)，向溶液中加入亚硝酸叔丁酯(2000nmol，200当量，500mM二甲基甲酰胺溶液)，混合均匀，然后将反应液置于25度反应1小时。
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物1，LCMS确认反应转化率为99％。理论分子量为5405.1，观察到的分子量为5404.6。
实施例27、On-DNA苯并三氮唑化合物的合成
将DNA二氨基化合物溶解到磷酸钠缓冲液中(磷酸钠250mM，pH＝5.5)中，配置成1mM的溶液(10ul，10nmol)，向溶液中加入亚硝酸叔丁酯(2000nmol，200当量，500mM二甲基甲酰胺溶液)，混合均匀，然后将反应液置于25度反应1小时。
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物1，LCMS确认反应转化率为99％。理论分子量为5435.1，观察到的分子量为5434.9。
实施例28、On-DNA苯并三氮唑化合物的合成
将DNA二氨基化合物溶解到磷酸钠缓冲液中(磷酸钠250mM，pH＝5.5)中，配置成1mM的溶液(10ul，10nmol)，向溶液中加入亚硝酸叔丁酯(2000nmol，200当量，500mM二甲基甲酰胺溶液)，混合均匀，然后将反应液置于25度反应1小时。
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物1，LCMS确认反应转化率为60％。理论分子量为5443.2，观察到的分子量为5442.0。
实施例29、On-DNA苯并三氮唑化合物的合成
将DNA二氨基化合物溶解到磷酸钠缓冲液中(磷酸钠250mM，pH＝5.5)中，配置成1mM的溶液(10ul，10nmol)，向溶液中加入亚硝酸叔丁酯(2000nmol，200当量，500mM二甲基甲酰胺溶液)，混合均匀，然后将反应液置于25度反应1小时。
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物1，LCMS确认反应转化率为51％。理论分子量为5477.1，观察到的分子量为5477.6。
实施例30、On-DNA苯并三氮唑化合物的合成
将DNA二氨基化合物溶解到磷酸钠缓冲液中(磷酸钠250mM，pH＝5.5)中，配置成1mM的溶液(10ul，10nmol)，向溶液中加入亚硝酸叔丁酯(2000nmol，200当量，500mM二甲基甲酰胺溶液)，混合均匀，然后将反应液置于25度反应1小时。
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物1，LCMS确认反应转化率为99％。理论分子量为5495.1，观察到的分子量为5494.6。
实施例31、On-DNA苯并三氮唑化合物的合成
将DNA二氨基化合物溶解到磷酸钠缓冲液中(磷酸钠250mM，pH＝5.5)中，配置成1mM的溶液(10ul，10nmol)，向溶液中加入亚硝酸叔丁酯(2000nmol，200当量，500mM二甲基甲酰胺溶液)，混合均匀，然后将反应液置于25度反应1小时。
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物1，LCMS确认反应转化率为77％。理论分子量为5443.2，观察到的分子量为5443.0。
实施例32、On-DNA苯并三氮唑化合物的合成
将DNA二氨基化合物溶解到磷酸钠缓冲液中(磷酸钠250mM，pH＝5.5)中，配置成1mM的溶液(10ul，10nmol)，向溶液中加入亚硝酸叔丁酯(2000nmol，200当量，500mM二甲基甲酰胺溶液)，混合均匀，然后将反应液置于25度反应1小时。
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物1，LCMS确认反应转化率为92％。理论分子量为5449.1，观察到的分子量为5449.3。
实施例33、On-DNA苯并三氮唑化合物的合成
将DNA二氨基化合物溶解到磷酸钠缓冲液中(磷酸钠250mM，pH＝5.5)中，配置成1mM的溶液(10ul，10nmol)，向溶液中加入亚硝酸叔丁酯(2000nmol，200当量，500mM二甲基甲酰胺溶液)，混合均匀，然后将反应液置于25度反应1小时。
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物1，LCMS确认反应转化率为70％。理论分子量为5560.2，观察到的分子量为5559.7。
实施例34、On-DNA苯并三氮唑化合物的合成
将DNA二氨基化合物溶解到磷酸钠缓冲液中(磷酸钠250mM，pH＝5.5)中，配置成1mM的溶液(10ul，10nmol)，向溶液中加入亚硝酸叔丁酯(2000nmol，200当量，500mM二甲基甲酰胺溶液)，混合均匀，然后将反应液置于25度反应1小时。
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物1，LCMS确认反应转化率为95％。理论分子量为5486.2，观察到的分子量为5485.8。
实施例35、On-DNA苯并三氮唑化合物的合成
将DNA二氨基化合物溶解到磷酸钠缓冲液中(磷酸钠250mM，pH＝5.5)中，配置成1mM的溶液(10ul，10nmol)，向溶液中加入亚硝酸叔丁酯(2000nmol，200当量，500mM二甲基甲酰胺溶液)，混合均匀，然后将反应液置于25度反应1小时。
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物1，LCMS确认反应转化率为46％。理论分子量为5458.2，观察到的分子量为5456.9。
实施例36、On-DNA苯并三氮唑化合物的合成
将DNA二氨基化合物溶解到磷酸钠缓冲液中(磷酸钠250mM，pH＝5.5)中，配置成1mM的溶液(10ul，10nmol)，向溶液中加入亚硝酸叔丁酯(2000nmol，200当量，500mM二甲基甲酰胺溶液)，混合均匀，然后将反应液置于25度反应1小时。
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物1，LCMS确认反应转化率为99％。理论分子量为5512.2，观察到的分子量为5512.2。
实施例37、On-DNA苯并三氮唑化合物的合成
将DNA二氨基化合物溶解到磷酸钠缓冲液中(磷酸钠250mM，pH＝5.5)中，配置成1mM的溶液(10ul，10nmol)，向溶液中加入亚硝酸叔丁酯(2000nmol，200当量，500mM二甲基甲酰胺溶液)，混合均匀，然后将反应液置于25度反应1小时。
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物1，LCMS确认反应转化率为99％。理论分子量为5330.1，观察到的分子量为5329.9。
实施例38、On-DNA苯并三氮唑化合物的合成
将DNA二氨基化合物溶解到磷酸钠缓冲液中(磷酸钠250mM，pH＝5.5)中，配置成1mM的溶液(10ul，10nmol)，向溶液中加入亚硝酸叔丁酯(2000nmol，200当量，500mM二甲基甲酰胺溶液)，混合均匀，然后将反应液置于25度反应1小时。
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物1，LCMS确认反应转化率为32％。理论分子量为5286.1，观察到的分子量为5286.6。
实施例39、On-DNA苯并三氮唑化合物的合成
将DNA二氨基化合物溶解到磷酸钠缓冲液中(磷酸钠250mM，pH＝5.5)中，配置成1mM的溶液(10ul，10nmol)，向溶液中加入亚硝酸叔丁酯(2000nmol，200当量，500mM二甲基甲酰胺溶液)，混合均匀，然后将反应液置于25度反应1小时。
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物1，LCMS确认反应转化率为46％。理论分子量为5364.0，观察到的分子量为5365.6。
实施例40、On-DNA苯并三氮唑化合物的合成
将DNA二氨基化合物溶解到磷酸钠缓冲液中(磷酸钠250mM，pH＝5.5)中，配置成1mM的溶液(10ul，10nmol)，向溶液中加入亚硝酸叔丁酯(2000nmol，200当量，500mM二甲基甲酰胺溶液)，混合均匀，然后将反应液置于25度反应1小时。
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物1，LCMS确认反应转化率为95％。理论分子量为5287.1，观察到的分子量为5287.5。
实施例41、On-DNA芳并三氮唑化合物的合成
将DNA二氨基化合物溶解到磷酸钠缓冲液中(磷酸钠250mM，pH＝5.5)中，配置成1mM的溶液(10ul，10nmol)，向溶液中加入亚硝酸叔丁酯(2000nmol，200当量，500mM二甲基甲酰胺溶液)，混合均匀，然后将反应液置于25度反应1小时。
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀用去离子水溶解，得到化合物1，LCMS确认反应转化率为79％。理论分子量为5337.1，观察到的分子量为5338.3。
综上所述，本发明方法通过控制反应的试剂溶剂、温度、时间等条件，由On-DNA芳基邻位二氨基化合物在亚硝酸试剂的存在下，高收率得到On-DNA芳并三氮唑化合物及其衍生物。本方法不需要金属催化剂参与、反应温和、原料易得、操作简单、应用试剂范围广，能够在DNA编码化合物库构建中引入芳并三氮唑及其衍生物结构，且适合多孔板进行的DNA编码化合物库的合成操作。
Claims (10)
1.一种合成On-DNA芳并三氮唑化合物及其衍生物的方法，其特征在于：所述方法是以On-DNA芳基邻位二氨基化合物为原料，在亚硝酸试剂的存在下，在反应溶剂中经一步反应得到On-DNA芳并三氮唑化合物及其衍生物；所述On-DNA芳基邻位二氨基化合物结构式为
所述On-DNA芳并三氮唑化合物及其衍生物的结构式为
其中，结构式中DNA包含由人工修饰的和/或未修饰的核苷酸单体聚合得到的单链或双链的核苷酸链，该核苷酸链通过一个或多个化学键或基团与化合物中剩余部分相连；
其中，结构中Ar为任选取代的单环或者多环的芳香环；
R1选自分子量1000以下与DNA和氨基氮原子直接相连的基团或者不存在；
R2选自氢或分子量1000以下与氨基氮原子直接相连的基团。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的Ar选自如下基团：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述Ar上有0～3个取代基团，所述取代基团选自氢、羧基、卤素、烷基、取代烷基、5～10元芳基、取代5～10元芳基、5-10元芳杂环基、取代5-10元芳杂环基；其中，所述烷基为C1～C20烷基或C3～C8环烷基；取代烷基的取代基的数量为一个或多个；取代烷基的取代基是相互独立的选自卤素、羧基、硝基、烷氧基、卤代苯基、苯基、烷基苯基中的一种或多种；取代5～10元芳基的取代基的数量为一个或多个，取代5～10元芳基的取代基是相互独立的选自卤素、氰基、硝基、羧基、烷氧基、C1～C20烷基、三氟甲基中的一种或多种；取代5-10元芳杂环基的取代基的数量为一个或多个，取代5-10元芳杂环基的取代基是相互独立的选自卤素、氰基、硝基、羧基、烷氧基、C1～C20烷基、三氟甲基中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的R1或R2为氢、烷基、取代烷基、5～10元芳基、取代5～10元芳基、5-10元芳杂环基、取代5-10元芳杂环基、3-10元杂环基、取代3-10元杂环基；其中，所述烷基为C1～C20烷基或C3～C8环烷基；取代烷基的取代基的数量为一个或多个；取代烷基的取代基是相互独立的选自卤素、氨基、羧基、硝基、烷氧基、卤代苯基、苯基、烷基苯基、烷氧基羰基氨基中的一种或多种；取代5～10元芳基的取代基的数量为一个或多个，取代5～10元芳基的取代基是相互独立的选自卤素、氰基、硝基、羧基、烷氧基、C1～C20烷基、三氟甲基中的一种或多种；取代5-10元芳杂环基的取代基的数量为一个或多个，取代5-10元芳杂环基的取代基是相互独立的选自卤素、氰基、硝基、羧基、烷氧基、C1～C20烷基、三氟甲基中的一种或多种；取代3-10元杂环基的取代基是相互独立的选自卤素、氰基、硝基、羧基、烷氧基、C1～C20烷基、C1～C20烷氧基羰基、三氟甲基中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述反应的反应步骤为：向摩尔当量为1，摩尔浓度为0.5-5mM的On-DNA芳基邻位二氨基化合物溶液中，加入5-500倍摩尔当量的亚硝酸试剂，在0℃～100℃下反应0.5-24小时。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述亚硝酸试剂为亚硝酸叔丁酯、亚硝酸钠、亚硝酸异戊酯的一种或几种的混合物。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述反应溶剂为水、甲醇、乙醇、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、甲基吡咯烷酮、无机盐缓冲液、有机酸缓冲液、有机碱缓冲液中任意一种或几种的含水混合溶剂。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述反应的反应时间为0.5-4小时。
9.根据权利要求1-8任一所述的方法，其特征在于，所述方法用于批量的多孔板操作。
10.根据权利要求1-8任一所述的方法，其特征在于，所述方法用于多孔板的DNA编码化合物库的合成。
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| PRIYANKA CHAUDHARY等: "Regioselective Nitration of N‑Alkyl Anilines using tert-Butyl Nitrite under Mild Condition", JOC, vol. 84, pages 104 * |
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