CN114957141A - 三唑醇含量检测用半抗原及其应用 - Google Patents

三唑醇含量检测用半抗原及其应用 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种三唑醇含量检测用半抗原及其应用，三唑醇含量检测用半抗原的化学式为：C18H24ClN3O6；分子式为：

Description

三唑醇含量检测用半抗原及其应用
技术领域
本申请涉及农药残留检测技术领域，特别是一种三唑醇含量检测用半 抗原及其应用。
背景技术
三唑醇是一种高效、广谱的唑类杀菌剂，具有针对各类微生物病害的 预防、治疗和铲除作用，可抑制麦角甾醇的生物合成。主要用于麦类、果 树、蔬菜、瓜类、花卉等作物。对小麦叶枯病、麦类云纹病、凤梨黑腐病、 玉米黑穗病等均有很好的效果。GB 2763-2021《食品安全国家标准食品 中农药最大残留限量》对不同食品中三唑醇的最大残留限量为0.01～10 mg/kg。
检测三唑醇的方法有气相色谱法、气相色谱法-质谱法、超高效液相色 谱-质谱/质谱法、液相色谱-质谱/质谱法等，与上述方法相比，免疫化学检 测法对药物检测具有快速、特异、灵敏、准确、可以批量监测、样品处理 简单、能实现自动化操作等优点。
而免疫化学法检测三唑醇的前提是需要具备针对三唑醇的抗体。而现 有技术中CN201510973025.4检测三唑醇的酶联免疫试剂盒及其应用，公 开了一种采用酶联免疫试剂盒的三唑醇检测抗原。但该结构抗原用于检测 烟草中残留三唑醇时，回收率偏低，当样本中三唑醇添加量为2000μg/kg 时，回收率低于80％仅为76.8％，最优的检测结果中回收率也仅为102.5％。 且该抗原的特异性较差，检测结果易受与三唑醇搭配施用的多菌灵、甲霜 灵、异菌脲等农药影响，导致对三唑醇的交叉准确检出率低。
CN201510973025.4中公开的半抗原结构导致所得三唑醇酶联免疫试 剂盒对于烟叶样本的检测限仅为1000μg/kg，当样本中三唑醇的含量超过 该值后，无法进行正常检测，会导致检测误差的出现。同时现有三唑醇半 抗原用于三唑醇含量偏高的烤烟样本时，检测结果回收率偏低，准确度降 低，说明现有半抗原受样本中三唑醇含量对检测结果的影响较大。
由于经过烘烤后，烤烟内部结构改变，含水量降低，采用该现有抗原 难以准确检测烤烟中三唑醇含量。
发明内容
本申请提供了一种三唑醇含量检测用半抗原及其应用，用于解决现有 技术中存在的免疫化学法检测三唑醇所用抗原准确率低、检测结果无法避 免与三唑醇搭配施用的多菌灵、甲霜灵、异菌脲对检测结果的干扰的技术 问题。
本申请提供了一种三唑醇含量检测用半抗原，化学式为： C18H24ClN3O6；分子式为：
Figure BDA0003703050180000021
所述三唑醇含量检测用半抗原的制备方法，包括以下步骤：
1)将叔丁基羟基三唑醇溶解后与(S)-2-噁丙环乙酸乙酯、三乙胺、NaH 搅拌混合，在油浴条件下加热至100℃进行亲核加成反应6小时后，停止 反应；
2)所得反应物经过萃取，合并所得有机相，旋蒸蒸干得到黄色油状物；
3)添加乙醇溶解所得油状物后，加入KOH后室温条件搅拌进行水解 反应3小时停止反应，经过提纯处理后得到半抗原。
优选地，所述步骤3)中所述提纯处理包括：对所得反应物依序进行 旋蒸、除乙醇、萃取，将所得有机相蒸干后上硅胶柱，采用乙酸乙酯/石油 醚进行洗脱分离，得到所述半抗原。
优选地，所述叔丁基羟基三唑醇、(S)-2-噁丙环乙酸乙酯、三乙胺、NaH 按摩尔比为1：3：5：2混合；
优选地，叔丁基羟基三唑醇溶液浓度为0.1037g/ml。
优选地，所述萃取步骤中所用萃取剂为水、乙酸乙酯，水：乙酸乙酯 按体积比为1：0.5～0.8添加；萃取操作重复进行三次；
优选地，步骤3)中KOH的添加量为叔丁基羟基三唑醇摩尔数的2.3 倍；
优选地，洗脱操作中所用乙酸乙酯与石油醚按体积比为1：5混合后 使用。
本申请的另一方面还提供了一种三唑醇含量检测用抗原，为由如上述 半抗原与载体蛋白偶联得到的偶联物。
优选地，所述载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白；
所述抗原的制备方法包括：免疫原制备和包被原制备；
优选地，所述免疫原制备为三唑醇半抗原与牛血清白蛋白偶联得到免 疫原。
优选地，所述包被原制备为取所述半抗原9.17mg，加1mlDMF溶解 澄清，加NHS5.3mg，EDC11.4mg，充分溶解混匀，室温反应2h，得到半 抗原活化液A液；取卵清白蛋白50mg，加0.1M CB9.14ml溶解，得到B 液，将A液逐滴滴加到B液中，室温反应6h，停止反应，0.02M PBS透 析纯化3天，每天换液3次，离心分装，得到三唑醇-OVA偶联物，即为 包被原。
本申请的另一方面还提供了一种三唑醇含量检测用单克隆抗体，为由 如上述的抗原经动物免疫、细胞融合和克隆化、细胞冻存和复苏、单克隆 抗体的生产与纯化后得到的单克隆抗体；
所述单克隆抗体能与三唑醇发生特异性免疫反应。
本申请的另一方面还提供了一种三唑醇酶联免疫检测试剂盒，由：
(1)包被如上述三唑醇含量检测用抗原的酶标板；
(2)浓度分别为0μg/L、1μg/L、3μg/L、9μg/L、27μg/L的三唑醇标 准品溶液；
(3)如上述三唑醇含量检测用单克隆抗体工作液；
(4)底物显色液：A液为过氧化脲，B液为四甲基联苯胺；
(5)2mol/L硫酸终止液；
(6)洗涤液：pH值为7.4，含有0.5％～1.0％吐温-20、0.01‰～0.03‰叠 氮化钠防腐剂、0.1～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百 分比组成。
优选地，所述三唑醇酶联免疫试剂盒检测样本为经过预处理的烟草样 本。
本申请能产生的有益效果包括：
1)本申请所提供的三唑醇含量检测用半抗原，本申请提供半抗原制 成的试剂盒对三唑醇的检测浓度得到提高，达到2mg/kg，有效避免当三唑 醇浓度升高后，无法检测的情况，降低检测结果误差值。本申请的半抗原 对初烤烟叶回收率较高，最高可达105.9％，且批间相对标准偏差均小于 10％，说明采用该半抗原检测准确性得到提高，且可用于对初烤烟叶的准 确检测中。采用该半抗原对含4mg/kg三唑醇的待烤烟叶进行检测，平均回 收率高达87.2％，说明在检测上限得到提高的情况下，本申请提供半抗原 对高浓度三唑醇样本的检出准确率得到提高。本申请提供半抗原制成抗体 后，抗体的效价比1：(1000000-3000000)，在相同的检测效果下，能降 低抗体用量，节省检测成本。
2)本申请所提供的三唑醇含量检测用半抗原，本申请发明了三唑醇 人工抗原制备方法，并将其应用于酶联免疫试剂盒中，用时短，操作简单， 成本较低，适用于基层单位大批量地检测样品。采用ELISA方法定性或定 量检测样品中三唑醇的含量；样品前处理过程简单，能同时快速检测大批 量样品；主要试剂以工作液的形式提供，检验方法方便易行，具有特异性 高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。本发明的酶联免疫试剂盒， 结构简单、使用方便、价格便宜、携带便利、检测方法高效、准确、简便、 适于大批量样品筛选的定性、定量。
附图说明
图1为本申请提供的三唑醇标准品浓度---吸光率标准曲线示意图；
图2为本申请实施例1中所得半抗原样品照片；
图3为本申请实施例1中所得半抗原核磁共振检测结果示意图；
具体实施方式
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合 本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完 整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全 部的实施方式。
参见图1～3，本申请提供的三唑醇含量检测用半抗原，化学式为： C18H24ClN3O6；分子式为：
Figure BDA0003703050180000051
所述三唑醇含量检测用半抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步 骤：
1)将叔丁基羟基三唑醇溶解后与(S)-2-噁丙环乙酸乙酯、三乙胺、NaH 搅拌混合，在油浴条件下加热至100℃进行亲核加成反应6小时反应，停 止反应；
2)所得反应物经过萃取，合并所得有机相，旋蒸蒸干得到黄色油状物；
3)添加乙醇溶解所得油状物后，加入KOH后室温条件搅拌进行水解 反应3小时停止反应，经过提纯处理后得到半抗原。
本申请通过采用缩合、水解(乙酯水解成羧酸)反应，制得具有上述 分子式结构的三唑醇含量检测用半抗原，采用该抗原制得试剂盒后，该试 剂盒对烟草植株中所含三唑醇含量的检测上限可达2mg/kg，远高于现有技 术中公开的三唑醇抗原检测上限值，能对各类三唑醇含量样本进行准确检 测，且本申请提供半抗原用于对三唑醇含量为4mg./kg的待烤烟叶样本检 测时，回收率可达87.4％，远高于现有技术中该浓度下的检测回收率。
该半抗原尤其适用于待烤烟叶中三唑醇的检测，对采后待烤烟叶中三 唑醇含量检测的回收率可高达105.9％。该半抗原尤其适用于初烤烟叶中三 唑醇含量的检测。
该半抗原制成试剂盒后对三唑醇具有显著特异性，且不会受到与三唑 醇搭配施用的多菌灵、甲霜灵、异菌脲的干扰，从而准确获取三唑醇的含 量。
本申请中初烤烟叶是指：将摘下的青烟叶，经烤房使烟叶干燥成熟， 称为初烤烟。
采后待烤烟叶是指：未经烤房烘烤的摘下的青烟叶。
该半抗原按现有技术中常用方法制成试剂盒后，用于烤烟或未烘烤青 叶中所含三唑醇检测时，检测结果的回收率得到提高；样本中三唑醇添加 浓度为4mg/kg时，检测结果回收率得到的提高；尤其用于对初烤烟叶样 本进行检测时，回收率最高；采用该半抗原制成的试剂盒，分别对多批次 样本进行检测，批内、批间RSD不降低。
本申请提供的半抗原按以下反应方程式发生反应后制得：
Figure BDA0003703050180000061
以三唑醇的类似物叔丁基羟基三唑醇为起始原料，在叔丁基羟基上与 环氧化物在碱性条件亲核加成反应，再经水解，得到羧基三唑醇半抗原产 物，与载体蛋白偶联，得到全抗原免疫动物制备单克隆抗体。
优选地，所述步骤3)中所述提纯处理包括：对所得反应物依序进行 旋蒸、除乙醇、萃取，将所得有机相蒸干后上硅胶柱，采用乙酸乙酯/石油 醚进行洗脱分离，得到所述半抗原。
优选地，所述叔丁基羟基三唑醇、(S)-2-噁丙环乙酸乙酯、三乙胺、NaH 按摩尔比为1：3：5：2混合；
优选地，叔丁基羟基三唑醇溶液浓度为0.1037g/ml。
优选地，所述萃取步骤中所用萃取剂为水、乙酸乙酯，水：乙酸乙酯 按体积比为1：0.5～0.8添加；萃取操作重复进行三次；
优选地，步骤3)中KOH的添加量为叔丁基羟基三唑醇摩尔数的2.3 倍。
优选地，洗脱操作中所用乙酸乙酯与石油醚按体积比为1：5混合后 使用。
本申请的另一方面还提供了一种三唑醇含量检测用抗原，为由如上述 半抗原与载体蛋白偶联得到的偶联物。
优选地，所述载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白；
所述抗原的制备方法包括：免疫原制备和包被原制备；
优选地，所述免疫原制备为三唑醇半抗原与牛血清白蛋白偶联得到免 疫原；
优选地，所述包被原制备为取所述半抗原9.17mg，加1mlDMF溶解 澄清，加NHS5.3mg，EDC11.4mg，充分溶解混匀，室温反应2h，得到半 抗原活化液A液；取卵清白蛋白50mg，加0.1M CB9.14ml溶解，得到B 液，将A液逐滴滴加到B液中，室温反应6h，停止反应，0.02M PBS透 析纯化3天，每天换液3次，离心分装，得到三唑醇-OVA偶联物，即为 包被原。
本申请的另一方面还提供了一种三唑醇含量检测用单克隆抗体，为由 如上述的抗原经动物免疫、细胞融合和克隆化、细胞冻存和复苏、单克隆 抗体的生产与纯化后得到的单克隆抗体；
所述单克隆抗体能与三唑醇发生特异性免疫反应。
本申请的另一方面还提供了一种三唑醇酶联免疫检测试剂盒，由：
(1)包被如上述三唑醇含量检测用抗原的酶标板；
(2)浓度分别为0μg/L、1μg/L、3μg/L、9μg/L、27μg/L的三唑醇标 准品溶液；
(3)如权利要求7中所述三唑醇含量检测用单克隆抗体工作液；
(4)底物显色液：A液为过氧化脲，B液为四甲基联苯胺；
(5)2mol/L硫酸终止液；
(6)洗涤液：pH值为7.4，含有0.5％～1.0％吐温-20、0.01‰～0.03‰叠 氮化钠防腐剂、0.1～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百 分比组成。
优选地，所述三唑醇酶联免疫试剂盒检测样本为经过预处理的烟草样 本。
具体地，本申请中试剂盒检测样本的预处理操作，以烟叶为例：
1)用均质器均质烟叶样本；
2)称取1.0±0.05g均质后的烟叶样本至50mL聚苯乙烯离心管中；
3)加入10mL 50％乙醇溶液，用振荡器振荡5min，混匀，3000g室温 (20-25℃)离心10min；
4)移取10μL上层清液至2mL聚苯乙烯离心管中，加入990μL复溶工 作液，用涡旋仪涡动30s，混匀；
5)取50μL用于分析。
实施例
以下实施例中所用仪器、试剂、实验动物如无特殊说明均为商业渠道 获得。
实施例1试剂盒组分的制备
1、三唑醇半抗原的制备
取叔丁基羟基三唑醇3.11g，加N,N-二甲基甲酰胺30ml溶解，加(S)-2- 噁丙环乙酸乙酯3.9g，加三乙胺0.7ml，NaH 0.48g，充分搅拌，油浴加热 100℃反应6h，停止反应，冷却到室温，加水200ml，乙酸乙酯100ml×3萃 取三次，合并有机相，旋蒸蒸干，得到黄色油状物，直接进行下一步，将 全部的油状物加80ml乙醇溶解，加KOH 1.28g，室温搅拌3h，停止反应， 旋蒸，除去乙醇，加水100ml，加乙酸乙酯80ml萃取，分去水相，有机相 蒸干，上硅胶柱，乙酸乙酯/石油醚(v/v,1/5)洗脱分离，得到羧基三唑醇 半抗原0.24g，收率5.8％。
按现有核磁共振测试方法对所得物质进行检测，所得结果为 12.0(s,1H,-COOH),8.77(s,1H,＝CH-),8.06(s,1H,- ＝CH-),7.32(s,2H,ArH),7.03(s,2H,ArH),5.67-5.92(d,2H,- CH2-),5.37(s,1H,-OH),4.12(m,1H,-CH-),3.8(d,1H,-CH-OH),3.38- 3.62(m,2H,-CH2-),2.39-2.59(m,2H,-CH2-),0.92(s,6H,-CH3)。核磁共 振谱图如图3所示。
2、抗原的制备
免疫原制备——三唑醇半抗原与牛血清白蛋白(BSA)偶联得到免疫 原。
取羧基三唑醇半抗原产物15.4mg，加1ml四氢呋喃溶解澄清，加 NHS9.1mg，加EDC16.1mg，充分溶解混匀，室温反应2h，得到半抗原活 化液A液；取牛血清白蛋白(BSA)50mg，加0.1M碳酸氢钠溶液4ml溶解， 得到B液，将A液逐滴滴加到B液中，室温反应6h，停止反应，0.02M PBS 透析纯化3天，每天换液3次，离心分装，得到三唑醇-BSA偶联物，即为免疫原。
包被原制备——三唑醇半抗原与卵清蛋白(OVA)偶联得到包被原。
取羧基-类克伦特罗半抗原产物9.17mg，加1mlDMF溶解澄清，加 NHS5.3mg，EDC11.4mg，充分溶解混匀，室温反应2h，得到半抗原活化 液A液；取卵清白蛋白(OVA)50mg，加0.1M CB9.14ml溶解，得到B液， 将A液逐滴滴加到B液中，室温反应6h，停止反应，0.02MPBS透析纯化3天， 每天换液3次，离心分装，得到三唑醇-OVA偶联物，即为包被原。
以三唑醇的类似物叔丁基羟基三唑醇为起始原料，在叔丁基羟基上与 环氧化物在碱性条件测缩合，再经水解，得到羧基三唑醇半抗原产物，与 载体蛋白偶联，得到全抗原免疫动物制备单克隆抗体。
3、三唑醇单克隆抗体的制备
动物免疫：将上述步骤得到的免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂 量为150μg/只，使其产生抗血清。
细胞融合和克隆化：小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按8:1(数 量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清 液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌三 唑醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
细胞冻存和复苏：将单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成1×106个/mL的 细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中 速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
单克隆抗体的生产与纯化：将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5mL/ 只，7天后腹腔注射稳定的单克隆杂交瘤细胞株5×105个/只，7天后采集腹 水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，-20℃保存。
4、酶结合物的制备
以山羊作为免疫动物，以三唑醇单克隆抗体为免疫原对无病原体山羊 进行免疫，得到三唑醇抗体。将三唑醇抗体与辣根过氧化物酶(HRP)进 行偶联得到酶结合物。
5、酶标板的制备
用包被缓冲液将包被原稀释成20μg/mL，每孔加入100μl，25℃避光孵 育2h，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中 加入200μl封闭液，25℃避光孵育2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真 空密封保存。
实施例2三唑醇单克隆抗体性能检测
对所得抗体设置梯度浓度后，按棋盘法测定，具体操作和未详述内容 参见CN201510973025.4中测定的方法一样。
检测而结果：三唑醇单克隆抗体的效价比1：(1000000-3000000)
本申请提供抗体的效价高于现有技术中公开的三唑醇检测抗体，说明 采用本申请提供半抗原能够节省抗体用量，降低成本。
实施例3检测三唑醇的酶联免疫试剂盒的组建
组建检测三唑醇的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分：
(1)包被三唑醇偶联抗原的酶标板；
(2)三唑醇标准品溶液5瓶，浓度分别为0μg/L，1μg/L，3μg/L，9μg/L， 27μg/L；
(3)用辣根过氧化物酶标记的三唑醇抗体；
(4)底物显色液由A液和B液组成，A液为过氧化脲，B液为四甲基联 苯胺；
(5)终止液为2mol/L硫酸；
(6)洗涤液为pH值为7.4，含有0.5％～1.0％吐温-20、0.01‰～0.03‰叠 氮化钠防腐剂、0.1～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百 分比。
实施例4试剂盒烟叶(采后待烤烟叶、初烤烟叶)中三唑醇的检测
1、将实施例3中所得试剂盒用于烟草的检测
将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行， 并记录标准孔和样本孔所在的位置。加入标准品/样本50μl到对应的微孔 中，然后加入酶结合物工作液50μl/孔，25℃避光环境中反应30min。将孔 内液体甩干，洗涤4-5次，拍干。加入底物液A液50μl/孔，再加入底物液B 液50μl/孔，混匀，25℃避光环境中反应15min。加入终止液50μl/孔，混匀， 设定酶标仪于450nm处，测定每孔OD值。
2、检测结果分析
标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值 (双孔)除以第一个标准品(0标准)的吸光度值的平均值，再乘以100％， 得到标准品或样本的百分吸光度值。
以标准品吸光率为纵坐标，以三唑醇标准品浓度(μg/L)的对数为横 坐标，绘制标准曲线图参见图1。将样本的百分吸光率代入标准曲线中， 从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中 三唑醇的实际浓度。
实施例5三唑醇含量检测试剂盒技术参数的确定试验
1、试剂盒灵敏度和检测限
按照常规方法测定试剂盒灵敏度，标准曲线的范围为1～27μg/L，IC50 (50％抑制浓度)浮动范围为4.2～7.5μg/L；对20份样品进行检测，从标准 曲线上查出对应于各百分吸光度值的浓度，以20份样本浓度的平均值加上3 倍标准差表示检测限。
结果显示，该方法对烟叶(采后待烤烟叶、初烤烟叶)中三唑醇的检 测限为2mg/kg(样本稀释倍数为1000倍)。
由上可知，本申请提供半抗原制成的试剂盒对三唑醇的检测浓度得到 提高，有效避免当三唑醇浓度升高后，无法检测的情况，降低检测结果误 差值。
2、样本精密度和准确度试验
以回收率作为准确度评价指标，重复测定某一浓度样品的检测结果相 对标准偏差(RSD％)作为精密度评价指标。计算公式为：回收率(％)＝ 实际测定值/理论值×100％，其中理论值为样品的添加浓度；相对标准偏 差RSD％＝SD/X×100％，其中SD为标准偏差，X为测定数据的平均值。
按2mg/kg、4mg/kg两个浓度的三唑醇对烟叶(采后待烤烟叶、初烤烟 叶)样品进行添加回收测定，每个样品做4个平行，用三批不同试剂进行 测定。计算样品的平均回收率及精密度结果见下表。
试剂盒的样本处理采后待烤烟叶和初烤烟叶的前处理方法相同，不作 区分。烟叶样本前处理方法：
1)用均质器均质烟叶样本；
2)称取1.0±0.05g均质后的烟叶样本至50mL聚苯乙烯离心管中；
3)加入10mL 50％乙醇溶液，用振荡器振荡5min，混匀，3000g室温 (20-25℃)离心10min；
4)移取10μL上层清液至2mL聚苯乙烯离心管中，加入990μL复溶工 作液，用涡旋仪涡动30s，混匀；
5)取50μL用于分析。
表1烟叶样本精密度及准确度试验
Figure BDA0003703050180000121
按2mg/kg、4mg/kg两个浓度的三唑醇对烟叶(采后待烤烟叶、初烤烟 叶)样品进行添加回收测定，平均回收率为87.2％～105.9％；批内、批间相 对标准偏差均小于10％。由上表1可见，平均回收率、批内、批间相对标准 偏差均优于现有三唑醇含量检测用试剂盒。
说明采用本申请的半抗原对初烤烟叶回收率较高，最高可达105.9％， 且批间相对标准偏差均小于10％，说明采用该半抗原检测准确性得到提高。
采用该半抗原对含4mg/kg三唑醇的待烤烟叶进行检测，平均回收率得 到提高，说明在检测上限得到提高的情况下，本申请提供半抗原对高浓度 三唑醇的检出准确性得到提高。
3、试剂盒稳定性试验
试剂盒保存条件为2～8℃，经过12个月的测定，试剂盒的最大吸光度 值(零标准)、50％抑制浓度、三唑醇添加实际测定值均在正常范围之内。 考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保 存条件下放置7天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒各项指标完全 符合要求。
考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻7天，测定 结果也表明试剂盒各项指标完全正常。
从以上结果可得出本申请提供试剂盒可以在2～8℃至少保存12个月以 上，半抗原稳定性较高，满足使用要求。
4、试剂盒特异性试验
1)用实施例4中所得三唑醇试剂盒测定三唑醇与多菌灵、甲霜灵、异 菌脲的交叉反应率，结果见表2。
Figure BDA0003703050180000131
表2第一特异性试验
药物名称 交叉反应率
三唑醇 100％
多菌灵 ＜1％
甲霜灵 ＜1％
异菌脲 ＜1％
2)用实施例4中所得三唑醇试剂盒测定三唑醇与三唑醇类杀菌剂 (三唑醇、环唑醇、粉唑醇、戊唑醇、己唑醇、烯唑醇、联苯三唑醇) 的交叉率，所得结果如表3所示：
Figure BDA0003703050180000132
表3第二特异性试验
药物名称 交叉反应率
三唑醇 100％
环唑醇 ＜1％
粉唑醇 ＜1％
戊唑醇 ＜1％
己唑醇 ＜1％
烯唑醇 ＜1％
联苯三唑醇 ＜1％
由上表可知，本申请提供半抗原，无论是与具有类似结构的农药还是 搭配施用的农药，均具有较好的特异性，该半抗原对三唑醇的检测结果准 确性较高。
对比例1
采用如CN201510973025.4中实施例1公开的方法制备该半抗原，并 按本申请上述实施例中方法制得试剂盒后，按照本申请实施例4中“2、 样本精密度和准确度试验”进行检测，所得结果列于表4中。
表4烟叶样本精密度及准确度试验
Figure BDA0003703050180000141
由上可知，现有对比例中所用三唑醇半抗原，受制于其检测上限值， 用于待烤烟和初烤烟叶时，无法得到如本申请表1所列的回收率，说明采 用本申请提供半抗原，检测效果准确性得到有效提高，尤其是针对三唑醇 含量较高的情况。
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术 人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者 对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的 任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种三唑醇含量检测用半抗原，其特征在于，化学式为：C18H24ClN3O6；分子式为：
Figure FDA0003703050170000011
所述三唑醇含量检测用半抗原的制备方法，包括以下步骤：
1)将叔丁基羟基三唑醇溶解后与(S)-2-噁丙环乙酸乙酯、三乙胺、NaH搅拌混合，在油浴条件下加热至100℃进行亲核加成反应6小时后，停止反应；
2)所得反应物经过萃取，合并所得有机相，旋蒸蒸干得到黄色油状物；
3)添加乙醇溶解所得油状物后，加入KOH后室温条件搅拌进行水解反应3小时停止反应，经过提纯处理后得到半抗原。
2.根据权利要求1所述的三唑醇含量检测用半抗原，其特征在于，所述步骤3)中所述提纯处理包括：对所得反应物依序进行旋蒸、除乙醇、萃取，将所得有机相蒸干后上硅胶柱，采用乙酸乙酯/石油醚进行洗脱分离，得到所述半抗原。
3.根据权利要求2所述的三唑醇含量检测用半抗原，其特征在于，所述叔丁基羟基三唑醇、(S)-2-噁丙环乙酸乙酯、三乙胺、NaH按摩尔比为1：3：5：2混合；
优选地，叔丁基羟基三唑醇溶液浓度为0.1037g/ml。
4.根据权利要求2所述的三唑醇含量检测用半抗原，其特征在于，所述萃取步骤中所用萃取剂为水、乙酸乙酯，水：乙酸乙酯按体积比为1：0.5～0.8添加；萃取操作重复进行三次；
优选地，步骤3)中KOH的添加量为叔丁基羟基三唑醇摩尔数的2.3倍；
优选地，洗脱操作中所用乙酸乙酯与石油醚按体积比为1：5混合后使用。
5.一种三唑醇含量检测用抗原，其特征在于，为由如权利要求1～4中任一项所述半抗原与载体蛋白偶联得到的偶联物。
6.根据权利要求5所述的三唑醇含量检测用抗原，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白；
所述抗原的制备方法包括：免疫原制备和包被原制备；
优选地，所述免疫原制备为三唑醇半抗原与牛血清白蛋白偶联得到免疫原。
7.根据权利要求5所述的三唑醇含量检测用抗原，其特征在于，所述包被原制备为取所述半抗原9.17mg，加1mlDMF溶解澄清，加NHS5.3mg，EDC11.4mg，充分溶解混匀，室温反应2h，得到半抗原活化液A液；取卵清白蛋白50mg，加0.1M CB9.14ml溶解，得到B液，将A液逐滴滴加到B液中，室温反应6h，停止反应，0.02M PBS透析纯化3天，每天换液3次，离心分装，得到三唑醇-OVA偶联物，即为包被原。
8.一种三唑醇含量检测用单克隆抗体，其特征在于，为由如权利要求5～7中任一项所述的抗原经动物免疫、细胞融合和克隆化、细胞冻存和复苏、单克隆抗体的生产与纯化后得到的单克隆抗体；
所述单克隆抗体能与三唑醇发生特异性免疫反应。
9.一种三唑醇酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，由：
(1)包被如权利要求5～7中任一项所述三唑醇含量检测用抗原的酶标板；
(2)浓度分别为0μg/L、1μg/L、3μg/L、9μg/L、27μg/L的三唑醇标准品溶液；
(3)如权利要求7中所述三唑醇含量检测用单克隆抗体工作液；
(4)底物显色液：A液为过氧化脲，B液为四甲基联苯胺；
(5)2mol/L硫酸终止液；
(6)洗涤液：pH值为7.4，含有0.5％～1.0％吐温-20、0.01‰～0.03‰叠氮化钠防腐剂、0.1～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比组成。
10.根据权利要求9所述的三唑醇酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述三唑醇酶联免疫试剂盒检测样本为经过预处理的烟草样本。
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