CN114480296A

CN114480296A - 一种杂交瘤细胞株、单克隆抗体、检测试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN114480296A
Application number: CN202210109950.2A
Authority: CN
Inventors: 曹振; 王静; 潘凌屹; 盈盈; 罗婷; 于春生; 金茂俊; 郑鹭飞
Original assignee: Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology for Agro Products of CAAS
Current assignee: Beijing Yishizhijian Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-01-28
Filing date: 2022-01-28
Publication date: 2022-05-13
Anticipated expiration: 2042-01-28
Also published as: CN114480296B

Abstract

本发明公开了一种杂交瘤细胞株、单克隆抗体、检测试剂盒及检测方法，涉及食品安全检测技术领域。杂交瘤细胞株SZC1H3保藏编号为CGMCC No.45002。分泌的单克隆抗体可以同时识别三唑酮、三唑醇和多效唑，且均具有较高的检测灵敏度，与其他的三氮唑农药类似物的交叉反应率很小，也即杂交瘤细胞SZC1H3产生的抗体对三唑酮、三唑醇和多效唑有很好的特异性。该单克隆抗体为建立同时检测多效唑、三唑酮与三唑醇的免疫学检测方法提供了良好的抗体支持。获得的单克隆抗体可以用于三唑酮、三唑醇、多效唑的检测。

Description

一种杂交瘤细胞株、单克隆抗体、检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及食品安全检测技术领域，具体而言，涉及一种杂交瘤细胞株、单克隆抗体、检测试剂盒及检测方法。

背景技术

三唑类农药在农业生产中扮演着重要的作用，其中，多效唑、三唑酮、三唑醇是最为常用的三种三唑类农药。多效唑又名氯丁唑，是一种植物生长调节剂和广谱杀菌剂，可抑制植株中赤霉素和固醇的生物合成，在农业生产过程中常用于促进花芽分化，矮化植株，延缓营养生长、促果实生长与增产等。三唑酮是一种广谱三氮唑类杀菌剂，低毒内吸性强，用于防治植株被真菌病毒侵害。三唑醇为三唑酮的代谢产物，其杀菌活性强于母体。

已有研究表明，多效唑不易降解，易在食物上残留，在土壤中的残留也对于后茬作物产生较大影响；三唑酮与三唑醇具有神经、生殖和基因毒性，可致癌致畸。在农作物例如花生、小麦、油菜、水稻，以及中药材例如麦冬的种植生产中，存在多效唑与三唑酮同时施用并造成农药残留的情况，对生物体与环境都存在危害性，因此同时监测多效唑、三唑酮及其代谢物三唑醇具有重要的现实意义。

传统仪器检测方法虽然灵敏度高、准确性好，但是由于前处理步骤复杂繁琐，仪器体积大且昂贵，对操作人员专业性要求高等缺点，而免疫分析法具有操作简单，快速便捷，成本低可携带等优点，更加适用于三唑类农药残留的现场快速筛查。但目前免疫分析领域中目前并没有可以同时检测多效唑、三唑酮、三唑醇的抗体，若要实现同时检测这三种三唑类农药需要不同的两种甚至三种抗体，检测成本增加，且检测效率不高。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种杂交瘤细胞株、单克隆抗体、检测试剂盒及检测方法以解决上述技术问题。

本发明是这样实现的：

本发明提供了一种杂交瘤细胞株，其包括2021年12月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的杂交瘤细胞株SZC1H3，保藏编号为CGMCC No.45002。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

发明人提供了一株杂交瘤细胞株SZC1H3，由该细胞株制备的单克隆抗体可同时识别多效唑、三唑酮与三唑醇，且均具有较高的检测灵敏度，可以应用于建立同时检测多效唑、三唑酮与三唑醇的免疫学检测方法。

本发明还提供了一种单克隆抗体，由上述的杂交瘤细胞株分泌获得。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述单克隆抗体分别具有如SEQ ID NO.1所示的重链可变区核苷酸编码序列和如SEQ ID NO.2所示的轻链可变区核苷酸编码序列。

上述单克隆抗体分别具有如SEQ ID NO.3所示的重链可变区氨基酸序列和如SEQID NO.4所示的轻链可变区氨基酸序列。

SEQ ID NO.1所示的重链可变区核苷酸编码序列如下：

GAGTCTGGGGGAGGCGTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTAAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAGTTTCAGTAACTATGGCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAAAAGAGGCTGGAATGGGTCGCAAGTATTAGTGATGGTGGTAGTCTCACCTTCTATTCAGACAATATGCAGGGGCGATGCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACTCGGCCATTTATTACTGTGCAAGACACGGAAGGAGGGTCAACTATGATTACGAAGGCTGGTTTGGTAACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCTCTGTCTCTGCAGCCAAAACGACACCCCCATCAGTCTATCCACTGGCCCCT。

SEQ ID NO.2所示的轻链可变区核苷酸编码序列：

CAGACTACAGCCTCCCTATCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGTCGACCAAGTGAGAATATTTACGGTTATTTAGCATGGTATCAGCAGAAACAGGGAAGATCTCCTCAGCTCCTTATATATAATGCAAAAACCTTAGCAGAGGGTATGCCATCAAGGTTCGATGGCAGTGGATCAGACACACAGTTTTCTCTGAAGATCAATAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGGGACTTATTACTGTCAACATCATTATGGTCTTCCGTGGACGTTCGGTGGGGGCACCAAGCTGGATATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCC。

SEQ ID NO.3所示的重链可变区氨基酸序列：

ESGGGVVKPGGSLKLSCAASGFSFSNYGMSWVRQTPEKRLEWVASISDGGSLTFYSDNMQGRCTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDSAIYYCARHGRRVNYDYEGWFGNWGQGTLVSVSAAKTTPPSVYPLAP。

SEQ ID NO.4所示的轻链可变区氨基酸序列：

QTTASLSASVGETVTITCRPSENIYGYLAWYQQKQGRSPQLLIYNAKTLAEGMPSRFDGSGSDTQFSLKINSLQPEDFGTYYCQHHYGLPWTFGGGTKLDIKRADAAPTVS。

经验证，本发明提供的杂交瘤细胞SZC1H3分泌的单克隆抗体与其他的三氮唑农药类似物的交叉反应率很小，也即杂交瘤细胞SZC1H3产生的抗体对三唑酮、三唑醇和多效唑有很好的特异性。该单克隆抗体可以同时识别三唑酮、三唑醇和多效唑，且均具有较高的检测灵敏度，为建立同时检测三唑酮、三唑醇和多效唑的免疫学检测方法提供了良好的抗体支持。获得的单克隆抗体可以用于包被固相载体，用于食品中残留三唑类农药的检测。

本发明还提供了一种三唑类农药的检测试剂、试剂盒或试纸条，其包括：

上述的单克隆抗体。

上述试剂的形态包括不限于：乳液、半乳液、溶液、固体、半固体。

在一种可选的实施方式中，上述检测试剂盒还包括固相载体和带有可被检测的标记物的抗抗体，固相载体上包被有包被原，包被原为三唑类农药半抗原与载体蛋白的偶联物。

一种检测试纸条，其包括包被有单克隆抗体的结合垫、包被有完全抗原作为检测T线的硝酸纤维素膜。

上述检测试剂盒中包被原设置在固相载体上，加入单克隆抗体和待测物后，待测物与包被原竞争性结合单克隆抗体。若待测物中不含三唑类农药，则单克隆抗体可以与包被原反应形成抗原抗体复合物，被固定在固相载体上，加入后续的带有可被检测的标记物的抗抗体后，经催化等条件进行显色反应，吸光度值较大。若待测物中含三唑类农药，即含有游离抗原，游离抗原与包被原竞争结合单克隆抗体，则仅有部分单克隆抗体可以与包被原反应形成抗原抗体复合物被固定在固相载体上，而其他的单克隆抗体与待测物中的三唑类农药结合，游离在待测液体中，在后续的洗板过程中被清洗下来。加入后续的带有可被检测的标记物的抗抗体后，经催化等条件进行显色反应，吸光度值远小于不含三唑类农药的样本。根据三唑类农药的标准品的浓度与吸光度值在一定范围内具有特定的线性关系，可以获得待测物中三唑类农药的含量。

上述检测试剂盒为间接竞争免疫检测试剂盒，在其他实施方式中，也可以是直接竞争免疫检测试剂盒，例如直接包被单克隆抗体至固相载体上的实施方式。无论何种实施方式，只要采用本发明中的单克隆抗体并在一定程度上实现三唑类农药的有效检测，均在本发明的检测试剂盒的保护范围之内。

本发明提供的检测试剂盒具有检测限低，检测成本低，检测效率高的技术优势。

在一种可选的实施方式中，上述的抗抗体可以是IgG-HRP二抗。

在本发明应用较佳的实施方式中，固相载体选自微孔板或微孔膜。

可被检测的标记物选自荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂或纳米颗粒类标记物。

可被检测的标记物是指具有能够被肉眼直接观察或被仪器检测或探测到的特性例如发光、显色、放射性等特性的一类物质，通过该特性可以实现对相应目标物的定性或定量检测。在本发明应用较佳的实施方式中，上述可被检测的标记物选自荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂或纳米颗粒类标记物。

在一种可选的实施方式中，荧光染料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物(例如包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)羟基光素(FAM)、四氯光素(TET)等或其类似物)、罗丹明类染料及其衍生物(例如包括但不限于红色罗丹明(RBITC)、四甲基罗丹明(TAMRA)、罗丹明B(TRITC)等或其类似物)、Cy系列染料及其衍生物(例如包括但不限于Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy3等或其类似物)、Alexa系列染料及其衍生物(例如包括但不限于AlexaFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物)和蛋白类染料及其衍生物(例如包括但不限于藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(PC)、别藻蓝蛋白(APC)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白(preCP)等)。

在一种可选的实施方式中，催化底物显色的酶包括不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶或6-磷酸葡萄糖脱氧酶。

在一种可选的实施方式中，放射性同位素包括不限于²¹²Bi、¹³¹I、¹¹¹In、⁹⁰Y、¹⁸⁶Re、²¹¹At、¹²⁵I、¹⁸⁸Re、¹⁵³Sm、²¹³Bi、³²P、⁹⁴mTc、⁹⁹mTc、²⁰³Pb、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁴³Sc、⁴⁷Sc、¹¹⁰mIn、⁹⁷Ru、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁶⁸Cu、⁸⁶Y、⁸⁸Y、¹²¹Sn、¹⁶¹Tb、¹⁶⁶Ho、¹⁰⁵Rh、¹⁷⁷Lu、¹⁷²Lu或¹⁸F。

在一种可选的实施方式中，化学发光试剂包括不限于鲁米诺及其衍生物、光泽精、甲壳动物荧光素及其衍生物、联吡啶钌及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、二氧环乙烷及其衍生物、洛粉碱及其衍生物或过氧草酸盐及其衍生物。

在一种可选的实施方式中，纳米颗粒类标记物包括不限于纳米颗粒或胶体。

在一种可选的实施方式中，纳米颗粒包括不限于有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒或稀土络合物纳米颗粒。

本发明应用较佳的实施方式中，试剂盒用于检测三唑酮、三唑醇和多效唑中的至少一种时，试剂盒包括单克隆抗体、标准品、包被有包被原的酶标板、酶结合物、底物显色液和终止液，包被原为三唑酮与载体蛋白的偶联物。

优选地，试剂盒还包括洗涤液、酶结合物稀释液；

载体蛋白选自甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白或血蓝蛋白；酶结合物为带有酶标记的抗抗体；标准品包括三唑酮、三唑醇和多效唑的标准品；

优选地，包被原为具有如下结构的抗原：

(即完全抗原C1)或

(即完全抗原C2)。

优选地，包被原的稀释度为1：8000-16000，单克隆抗体的稀释度为1：4000-8000。

发明人发现，包被原的稀释度为1：8000-16000，单克隆抗体的稀释度为1：4000-8000，此时标准品(或者待测样本所包含的)三唑酮可以较好地竞争性结合单克隆抗体，抑制单克隆抗体与包被原的结合，实现较好的抑制效果，使得对照孔和抑制孔的吸光度值差异较为明显，有利于更准确的实现待测物中定量检测。

当单克隆抗体在抗原稀释度为1：8000效价达到8×10³，当包被抗原稀释度为1：8000，抗体稀释度为1：4000时，对照孔和抑制孔的吸光度值差异最为明显，此时按照抑制率计算公式：抑制率＝(B₀-B_I)/B₀×100％)，B₀为对照孔OD值；B_I为抑制孔OD值，抑制率越高即此时对农药的检测效果最好，有利于更为准确的实现待测物中定量检测。

本发明应用较佳的实施方式中，试剂盒用于检测三唑酮、三唑醇和多效唑中的至少一种时，试剂盒包括单克隆抗体、多效唑标准品、包被有包被原的酶标板、酶结合物、底物显色液和终止液，包被原为多效唑与载体蛋白的偶联物。

优选地，试剂盒还包括洗涤液、酶结合物稀释液。

载体蛋白选自甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白或血蓝蛋白；酶结合物为带有酶标记的抗抗体；标准品包括三唑酮、三唑醇和多效唑的标准品。

优选地，包被原为具有如下结构的抗原：

由于三唑醇的半抗原、完全抗原都与三唑酮的结构一致，此处不再赘述三唑醇的检测试剂盒，同三唑酮。

本发明还提供了一种三唑类农药的直接竞争检测试剂盒，其包括：

固相载体和带有可被检测的标记物的抗原，固相载体上包被有上述的单克隆抗体；抗原为三唑类农药半抗原与载体蛋白的偶联物。

本发明还提供了一种检测三唑类农药的试纸条，其含有上述单克隆抗体。

一种可选的实施方式中，试纸条包括：包被有单克隆抗体的固相载体、包被有抗原作为检测T线以及二抗(抗抗体)作为C线的硝酸纤维素膜、样品垫、结合垫及吸水垫。

固相载体选自荧光微球、乳胶微球、树脂微球、磁性微球、胶体金颗粒、量子点。

在一种可选的实施方式中，胶体包括不限于胶体金属、分散型染料、染料标记的微球和乳胶。在一种可选的实施方式中，胶体金属包括不限于胶体金、胶体银、胶体碳或胶体硒。

在一种可选的实施方式中，上述量子点为核壳型量子点，如ZnS/CdSe或ZnS/CdTe形成的量子点。根据需要，上述量子点可以调整为单一化合物形成的量子点，如硒化镉(CdSe)、硫化锌(ZnS)、碲化镉(CdTe)、硫化镉(CdS)、硒化锌(ZnSe)、磷化铟(InP)或砷化铟(InAs)，或是CdSe核上包裹一层ZnS或CdS组成的纳米晶或半导体纳米晶等物质中的一种。

在一种可选的实施方式中，荧光微球选自时间分辨荧光微球，磁性微球选自磁珠。在一种可选的实施方式中，时间分辨荧光微球选自时间分辨荧光物质与乳胶或纳米颗粒的结合物，时间分辨荧光物质为镧系元素、镧系元素与乳胶的结合物、镧系元素的螯合物中的一种；镧系元素可以为铕，铽，钐或镝中的任意一种。

本发明还提供了一种检测三唑类农药的方法，其包括：使用上述单克隆抗体、试剂盒，或者上述试剂或试纸条进行检测。

本发明还提供了一种单克隆抗体、试剂盒，试剂或试纸条在农药残留检测中的应用。

上述单克隆抗体、试剂盒、试剂或试纸条具有低成本、快速且便携的技术优势，检测时对于样本的纯度要求不高，而且操作简便，可以用于大量样本的现场快速检测应用，在农药残留检测中具有良好的应用前景。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一株杂交瘤细胞株SZC1H3，由该细胞株制备的单克隆抗体可同时识别多效唑、三唑酮与三唑醇，且均具有较高的检测灵敏度，可以应用于建立同时检测多效唑、三唑酮与三唑醇的免疫学检测方法。基于此，发明人开发出相应的单克隆抗体、试剂盒、试剂或试纸条，具有低成本、快速且便携的技术优势，检测时对于样本的纯度要求不高，而且操作简便，可以用于大量样本的现场快速检测应用，在农药残留检测中具有良好的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为完全抗原C1的合成路线；

图2为完全抗原C2的合成路线；

图3为以完全抗原C1为包被原绘制的标准曲线图；

图4为以完全抗原D为包被原绘制的标准曲线图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

下述实验中所用的各种缓冲液如下：

(1)包被缓冲液(pH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液):Na₂CO₃ 1.5g；NaHCO₃ 2.94g，加纯水定容至1000mL；

(2)磷酸盐缓冲液PBS(0.01M pH7.4)：0.2g KH₂PO₄；8g NaCl；2.92g NaH₂PO₄·12H₂O，加纯水定容至1000mL；

(3)洗涤缓冲液(PBST)：在配好的1000mL PBS溶液中加入1mL Tween-20；

(4)样品稀释液(PBSTG)：配好的PBS中加入1mL Tween-20、1g明胶(微波炉加热融化)，加纯水定容至1000mL；

(5)底物缓冲液(pH5.5)：9.22g Na₂HPO₄·12H₂O；2.55g一水合柠檬酸；0.5mLTween-20，加纯水至1L；

(6)终止液(2M H₂SO₄)：取蒸馏水445.6mL，逐滴加入浓硫酸(98％)54.4mL并搅拌。

实施例1

本实施例分别合成了半抗原A、半抗原B，并以半抗原B合成了完全抗原C1和C2，在其他实施方式中，也可采用现有专利CN 111304174 A的方法进行合成。

半抗原A的结构如下：

HRMS calcd for C₁₆H₂₀ClN₃O₃:m/z＝353.1142,found m/z＝353.1126。

产品经¹H NMR和HRMS确证，为式A所示半抗原：2-((1-(4-氯苯氧基)-3,3-二甲基-1-(1H-1,2,4-三唑-1-基)丁-2-基)氧基)乙酸化合物。

(2)合成半抗原B：

称取半抗原A 2-((1-(4-氯苯氧基)-3,3-二甲基-1-(1H-1,2,4-三唑-1-基)丁-2-基)氧基)乙酸化合物(0.02mmol)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，0.04mmol)和DCC(0.040mmol)用1mL无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，在室温4℃搅拌反应4小时后，将反应液在5000转下离心5分钟，取上清液备用，得到含有半抗原B的反应物，该反应产物可直接用于后续载体蛋白的偶联。

(3)合成完全抗原C1，合成路线参照图1所示：

将含半抗原B的反应物的上清液缓慢滴加入载体蛋白OVA(卵清白蛋白)溶液(该载体蛋白溶液是由20mg OVA溶于2mL pH值为7.5的磷酸盐(PBS)缓冲液混匀而得)中，半抗原B化合物与载体蛋白的投料摩尔比为30:1，在4℃搅拌12h后，将所得反应液用pH值为7.5、浓度为0.1mol/L的PBS溶液透析三天，将透析完全的反应产物溶液稀释为2mg/mL的溶液，置于-20℃冻存待用。透析的作用在于去除未反应的原料或副产物，得到完全抗原C1的化合物，即2-((1-(4-氯苯氧基)-3,3-二甲基-1-(1H-1,2,4-三唑-1-基)丁-2-基)氧基)乙酸与OVA的偶联物。

(4)合成完全抗原C2，合成路线参照图2所示：

将含半抗原B的反应物的上清液缓慢滴加到载体蛋白液中(该载体蛋白溶液是由20mg BSA溶于2mL pH值为7.5的磷酸盐缓冲液(PBS))，式B化合物与载体蛋白的投料摩尔比为30：1，在4℃搅拌12h后，将所得反应液用pH值为7.5、浓度为0.1mol/L的PBS溶液透析三天，将透析完全的反应产物溶液稀释为2mg/mL的溶液，置于-20℃冻存待用。

得到完全抗原C2，即2-((1-(4-氯苯氧基)-3,3-二甲基-1-(1H-1,2,4-三唑-1-基)丁-2-基)氧基)乙酸与BSA的偶联物。

(5)完全抗原D结构如下：

此结构为以多效唑为起点设计的完全抗原，已发表在：[1]曹振.多效唑和热变性Bt Cry1Ac免疫检测技术及其应用研究[D].中国农业大学,2014。

实施例2

本实施例提供了杂交瘤细胞株SZC1H3的制备方法，其具体制备步骤为：

(1)选取8-10周龄的BALB/C小白鼠作为实验动物。

(2)基础免疫：用稀释好的完全抗原C2抗原溶液(浓度为1mg/mL)，经无菌过滤器过滤后加入等体积弗氏完全佐剂，用磁力搅拌器充分搅拌乳化，直到滴入水中不扩散。用乳化好的完全抗原采用腹腔及背部皮下多点注射Balb/C小白鼠，注射剂量为0.1mg抗原/只。

(3)加强免疫：基础免疫2周后，取1mL释好的完全抗原C2抗原溶液(浓度为1mg/mL)，加入1mL弗氏不完全佐剂，用磁力搅拌器充分搅拌乳化，直到滴入水中不扩散。将乳化好的抗原采用腹腔及背部皮下多点注射BALB/C小鼠，注射剂量为0.1mg抗原/只。加强免疫每隔15天免疫一次，从第三次加强免疫开始，每次免疫后第3-5天，从小鼠眼眶采血，使用间接竞争ELISA方法测定抗体效价，方法所用包被抗原为1mg/mL完全抗原C1稀释500倍用，待效价大于1:8000后(效价定义为零孔显色值为1时，血清的稀释倍数)，眼球摘除采血，血液室温静置1小时后，再于4℃冰箱中静置2小时，然后于离心机中8000rpm离心5分钟后，分离出抗血清。用于下述各实验。

动物免疫实验使用的是完全抗原C2，其偶联的载体蛋白为BSA，实验动物抗血清中会存在抗BSA的抗体，为了排除干扰，更好地筛选出可特异性识别目标农药的单克隆抗体，因此在筛选时选择完全抗原C1进行包被，而已筛选到杂交瘤细胞SZC1H3后，在其他实施方式中，两种完全抗原均可以作为包被原。

(4)细胞融合

选取融合用的小鼠，摘除眼球放血，收集血液置于室温0.5h后转移至4℃静置2h，离心，取血清作为阳性对照。小鼠处死后，浸泡于75％酒精中5min，转移到超净工作台，腹部朝上固定于石蜡托盘内。提前准备20mL DMEM培养液，用已灭菌镊子提起肚皮，先后剪开腹部外皮和内腹膜，摘取脾脏后迅速转移到干净的培养皿中。去除脾脏周围脂肪和结缔组织，处理干净后转移至DMEM培养液中。使用注射器针头在脾脏正反面戳孔，并将DMEM注入脾脏中吹脾脏细胞，脾脏细胞彻底吹出来，混匀后转移至50mL离心管。

同时准备骨髓瘤细胞，弃掉培养液，用DMEM培养液将状态良好的骨髓瘤细胞从6孔板上吹散，混匀后转移至50mL离心管内，脾细胞和瘤细胞悬浮液离心，弃上清，分别使用DMEM培养液将脾细胞和骨髓瘤重悬，显微镜下计数。根据SP2/0骨髓瘤细胞与脾脏细胞的比例为5～10:1的比例将重悬后的脾细胞加入到瘤细胞中，吹散混匀，离心，弃上清，留有1～2滴DMEM于细胞中。在超净工作台上剐蹭离心管底部，混匀细胞。

使用1mL灭菌移液管吸取PEG 1450，将其滴加到细胞混液中，滴加过程中离心管置于手心中并不断向同方向旋转，确保在加PEG融合的过程中细胞处于恒温环境和混匀状态。融合具体操作为1min内匀速滴加1mL PEG溶液，下一个30s内将离心管里的混合液体吸回1mL移液管中，下一个30s内静置液体于移液管中，下一个30s内:将液体匀速滴入离心管中。完成融合后，在细胞混液中加入DMEM培养液终止融合反应，具体终止流程如下所示:第一分钟:匀速加完1mL DMEM培养液，第二、三分钟:匀速加完4mL DMEM培养液，第四、五分钟:匀速加完20mL DMEM培养液。终止反应后，离心，弃上清。使用提前预热好的50mL 2％HAT完全培养液重悬融合细胞混液，重悬细胞后，加入到96孔培养板，每孔补充100μL 2％HAT完全培养液，放入37℃，5％CO₂的恒温细胞培养箱内培养(37℃)。

(5)杂交瘤细胞的筛选与亚克隆

融合完成7-10天后根据细胞生长状态，待杂交瘤细胞生长至一定大小后，使用icELISA方法对杂交瘤细胞的阳性与特异性检测。根据融合小鼠血清棋盘格icELISA结果，确定包被原的最佳稀释倍数。用阴性血清和阳性血清做对照，分两次检测杂交瘤细胞，先用间接ELSIA法检测的细胞阳性，选取OD值大于3.0的阳性孔，次日用间接竞争ELISA法，三唑酮抑制浓度为100ng/mL，检测筛选的阳性孔杂交瘤细胞抑制率。通过以上两步，筛选出效价高，对100ng/mL三唑酮抑制率大于90％的杂交瘤细胞株系。通过有限梯度稀释法稀释并克隆杂交瘤细胞株系，再用相同检测方法检测其阳性与抑制率，最终筛选得到单克隆细胞株SZC1H3。

抑制率计算公式：抑制率＝(B₀-B_I)/B₀×100％)，B₀为对照孔OD值；B_I为抑制孔OD值。

实施例3

本实施例进行单克隆抗体的制备与纯化。

选取8只6-8周龄BALB/C雌性小鼠，提前一周在腹腔内注射无菌石蜡油，每只0.3mL。单克隆细胞株SZC1H3培养好后，弃掉原有培养液，用DMEM吹打重悬，离心，弃上清后按照0.3mL/孔的DMEM添加量重悬细胞。每只石蜡油预处理的小鼠，腹腔注射0.3mL单克隆细胞株SZC1H3悬浮液，每只注射细胞数量大约为106个。待小鼠腹部肿胀，收集小鼠腹水置于室温0.5h，4℃静置过夜，4℃离心，用注射器吸取澄清液体。由于腹水中含有的杂质较多，需要对腹水进行纯化。本研究采用盐析法去除了腹水中的非特异性杂蛋白，纯化出抗体，该方法分两步纯化，步骤如下：腹水静置过夜后，4℃条件下离心，吸取V体积澄清腹水置于50mL圆底离心管中，加入V体积的PBS缓冲液，置于冰浴中。磁力搅拌器慢速搅拌腹水溶液，使用恒流泵缓慢滴加2V体积的饱和硫酸铵，4℃静置4h。静置后，4℃条件下离心，白色沉淀使用2V体积的PBS充分溶解后，加入V体积的饱和硫酸铵溶液，具体步骤同上，4℃静置4h后，4℃条件下离心。用V体积的PBS溶液充分溶解抗体蛋白，置于透析袋中，分别用4L的PBS和4L的PB各透析四次和两次，每次四个小时。透析完的抗体蛋白分装后-80℃过夜，真空冻干。至此，得到纯化好的由杂交瘤细胞株SZC1H3分泌的单克隆抗体。

实施例4

抗体效果检测：

(一)抗血清、抗体抑制实验

1、包被抗原C1溶液的配制

将制备的稀释后1mg/mL的包被抗原C1解冻后，用包被液按1:500、1:1000、1:2000、1:4000进行梯度稀释，得到不同浓度的包被抗原C1溶液。

2、标准品溶液的配制

(1)分别称取10mg三唑酮、三唑醇、多效唑标准品，充分溶解于10mL DMF中，即得到1mg/mL三唑酮、三唑醇、多效唑标准品溶液。

(2)用样品稀释液将上述(1)的1mg/mL三唑酮标准品溶液配制成终浓度1000ng/mL、100ng/mL的三唑酮标准品工作溶液。

3、抗血清稀释液的配制

将上述步骤制备的抗血清用样品稀释液按1:1000、1:2000、1:4000、1:8000进行梯度稀释，得到抗血清稀释液。

4、抗原-抗血清、抗原-抗体的棋盘格实验

包被：在96孔酶标板中每孔加入100μL步骤1制备得到的包被抗原C1溶液，置湿盒中37℃包板3h，用PBST洗涤3次；

竞争：对照孔加入50μL样品稀释液，抑制孔每孔加入50μL步骤2制备得到的三唑酮标准品溶液。将上述步骤3得到的抗血清稀释液加入酶标板中(50μL/孔)，置湿盒中37℃条件下30min，用PBST洗板3次。

加酶标二抗：使用样品稀释液将羊抗鼠酶标二抗(IgG-HRP，Jackson公司)稀释1000倍，每孔加100μL，置湿盒中37℃条件下30min，用PBST洗板3次。

显色：显色底物现用现配，每10mL底物缓冲液中加入20mg OPD，将称好的OPD溶于底物缓冲液后，每10mL加入4μL 30％的双氧水，每孔加入100μL，常温避光显色10min。

终止：每孔加入50μL 2M的终止缓冲液，用酶标仪492nm处测定各孔的OD值。

结果如表1，表2所示

表1小鼠抗血清效价检测结果统计表(OPD37℃显色15min，1000ng/mL三唑酮标样抑制)。

表1结果表明，随着抗原免疫次数的增加，小鼠抗血清效价与抑制率都有所提升。在第四次免疫时，当包被抗原稀释度为1：4000时，抗血清效价达到8×10³以上，效价较高(OD值＝1.5；效价8000)的情况下此时抗血清抑制率为46％。说明上述完全抗原C2可以作为免疫原制备出检测三唑酮的抗体。

表2单克隆抗体效价检测结果统计表(OPD 37℃显色10min，100ng/mL三唑酮标准品抑制)。

注：I表示酶标板中的抑制孔，C表示酶标板中的对照孔。

表2结果表明，由杂交瘤细胞SZC1H3分泌得到的单克隆抗体在抗原稀释度为1：8000效价达到8×10³以上。当包被抗原稀释度为1：8000，抗体稀释度为1：4000时，按照抑制率计算公式，此时抗体抑制率最好，抑制率为93.12％。说明上述杂交瘤细胞SZC1H3产生的抗体可以检测三唑酮。

(二)完全抗原C1包被下三唑酮、三唑醇、多效唑标准曲线的建立。

将上述制备的三唑酮/三唑醇/多效唑标准品溶液用样品稀释液分别稀释成如下不同的浓度：50ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0.25ng/mL。

(1)抗原的包被：将完全抗原C1按1:16000稀释后加入到酶标板中，每孔100μL，置湿盒中37℃包板3h；倒去酶标板中的溶液，用洗涤液洗板3次，甩干；

(2)在步骤(1)的酶标板中分别加入上述不同浓度的三唑酮/三唑醇/多效唑标准品溶液(抑制孔)，每孔50μL，对照孔中加入50μL样品稀释液；

(3)分别向上述实验孔和对照孔中加入稀释倍数为1:4000的抗体稀释液，每孔50μL，37℃温育30min；倒去酶标板中的溶液，用洗涤液洗板3次，甩干；

(4)在实验孔和对照孔中分别加入100μL稀释倍数为1:1000的IgG-HRP二抗(Jackson公司)，37℃温育30min；倒去酶标板中的溶液，用洗涤液洗板3次，甩干；

(5)向抑制孔和对照孔中分别加入100μL配制好的底物缓冲液，37℃温育10min后，再向每孔中加入50μL 2M的硫酸溶液终止反应；

(6)在492nm下测定吸光值；

(7)绘制标准曲线：以不同浓度(ng/mL)的三唑酮、三唑醇、多效唑标准品溶液作为X轴，以吸光度值的比值(B/B₀×100％，其中，B为三唑酮、三唑醇、多效唑标准品溶液的平均吸光度值，B₀为对照孔的平均吸光度值)作为Y轴，绘制标准曲线图。实验设3次重复，取三次实验结果的平均值，分别得到三唑酮、三唑醇和多效唑标准曲线如图3所示。

表3三唑酮、三唑醇和多效唑标准曲线拟合结果

农药	多效唑	三唑酮	三唑醇
				IC<sub>50</sub>	6.56	7.09	91.09
IC<sub>20</sub>	26.93	--	439.58
				IC<sub>80</sub>	1.70	1.46	30.04
R<sup>2</sup>	0.999	0.988	0.994

结果表明，杂交瘤细胞SZC1H3产生的抗体针对多效唑的检测灵敏度(IC₅₀)为6.56ng/mL，针对三唑酮的检测灵敏度(IC₅₀)为7.09ng/mL，针对三唑醇的检测灵敏度(IC₅₀)为91.09ng/mL。说明由杂交瘤细胞株SZC1H3制备的单克隆抗体对多效唑、三唑酮、三唑醇都具有很好的检测效果，检测限低。其中，对多效唑的检测灵敏度，较目前已发表的其他抗多效唑单克隆抗体都更好。

(三)抗体特异性检测

1、农药标准品溶液的配制

参照步骤(一)中标准品的配制方法，配制三氮唑农药类似物标准品：制备烯效唑、烯唑醇、戊唑醇的标准样品；配制可能同时施用的农药标准品：制备吡虫啉、多菌灵的标准样品。

用样品稀释液将上述5种类似物分别稀释成如下浓度：5000ng/mL，3000ng/mL，1000ng/mL，750ng/mL，500ng/mL，250ng/mL，100ng/mL，50ng/mL，10ng/mL。

建立标准曲线，测定其他农药中浓度IC₅₀(抑制率达到50％的标样浓度值)，标准曲线的建立方法与上述(二)中标准曲线的建立方法相同。

交叉反应率(％)＝(三唑酮IC₅₀)/(类似物IC₅₀)×100％。

实验设3次重复，取三次实验结果的平均值，结果如表3所示。

表4杂交瘤细胞SZC1H3产生的抗体特异性检测

表4结果表示，上述由杂交瘤细胞SZC1H3分泌的单克隆抗体与其类似物的交叉反应率很小，说明杂交瘤细胞SZC1H3产生的抗体对三唑酮、三唑醇和多效唑有很好的特异性。

(四)完全抗原D包被下三唑酮、三唑醇、多效唑标准曲线的建立。

(1)抗原的包被：将完全抗原D按1:8000稀释后加入到酶标板中，每孔100μL，置于湿盒中37℃包板3h；倒去酶标板中的溶液，用洗涤液洗板3次，甩干；

(2)在步骤(1)的酶标板中分别加入上述不同浓度的三唑酮/三唑醇.多效唑标准品溶液(抑制孔)，每孔50μL，对照孔中加入50μL样品稀释液；

(6)在492nm下测定吸光值；

(7)绘制标准曲线：以不同浓度(ng/mL)的三唑酮、三唑醇、多效唑标准品溶液作为X轴，以吸光度值的比值(B/B₀×100％，其中，B为三唑酮、三唑醇、多效唑标准品溶液的平均吸光度值，B0为对照孔的平均吸光度值)作为Y轴，绘制标准曲线图。实验设3次重复，取三次实验结果的平均值，分别得到三唑酮、三唑醇和多效唑标准曲线如图4所示。

农药	多效唑	三唑酮	三唑醇
				IC<sub>50</sub>	2.42	3.04	45.46
IC<sub>20</sub>	14.95	20.84	---
				IC<sub>80</sub>	0.38	0.67	11.67
R<sup>2</sup>	0.998	0.998	0.999

结果表明，杂交瘤细胞SZC1H3产生的抗体在完全抗原D包被下，也能够同时识别多效唑、三唑酮、三唑醇，且具有更好的检测效果，更低的检测限。针对多效唑的检测灵敏度(IC₅₀)为2.42ng/mL，针对三唑酮的检测灵敏度(IC₅₀)为3.04ng/mL，针对三唑醇的检测灵敏度(IC₅₀)为45.46ng/mL。

实施例5

基于PCR扩增的抗体测序

1.总RNA提取

(1)六孔板每孔细胞中加入1ml Trizol，冰上放置5min，枪头吹打。

(2)将各孔裂解液吸到1.5ml EP管中，加入氯仿0.2ml/管，用力振摇15s。15－30℃下孵育2-3min，离心(4℃，12000g，15min)。

(3)离心后液体分为三层(上层－无色水样层为RNA，中层白色为DNA和底层红色为蛋白质)，小心吸取上层无色液体移入一新的EP管中。

(4)加入等体积异丙醇，0.4－0.5ml，混匀，15-30℃下孵育10－30min，离心(4℃，12000g，10min)。其中如果加入等体积异丙醇后，置于试管架上用PE手套密封后，放于4℃冰箱中，沉淀30min效果更好。

(5)去上清，沉淀加入75％乙醇1ml，漩涡振荡30s，离心(4℃，7 500g，5min)。

(6)去上清，管内沉淀在超净台中鼓风静置干燥3-5min。

(7)加入20μl DEPC水溶解，分装5μl/管，-70℃冰箱保存。

2.mRNA反转录

(1)配制RNA/引物混合液：

组分	体积
		50μM oligo(dT)20primer	1μL
10mM dNTP mix(10mM each)	1μL
		Template RNA(10pg-5μg total RNA or 10pg-500ng mRNA)	up to 11μL
DEPC-treated or nuclease-free water	to 13μL

(2)在65℃下加热RNA/引物混合物5min，然后冰上冷却至少1min。

(3)配置反转录体系：

(4)向退火RNA中加入上述反转录混合液，5055℃下培养10min。

(5)80℃下培养10min。

所得产物贮存于-20℃备用。

3.PCR扩增。

以反转录的cDNA第一链为模板，分别用以下引物对重链可变区和轻链可变区基因进行扩增。用于扩增重链可变区基因的引物序列：

VH-1：5’-cttccggaattcSARGTNMAGCTGSAGSAGTC-3’

VH-2：5’-ggaagatctAGGGGCCAGTGGATAGACTGATGG-3’

用于扩增轻链可变区基因的引物序列：

VL-1：5’-gggagctcGAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA-3’

VL-2:5’-ggtgcatgcGGATACAGTTGGTGCAGCATC-3’

配置50μL反应体系：取1μL模板，依次加入24μL Mix，1μL Taq酶，上下游引物各1μL，用ddH2O补足至50μL。

设置PCR反应程序；上样，启动反应程序。

扩增产物的电泳检测。取1μL Marker，加入1μL Loading Buffer+4μL TAE混匀加入琼脂糖凝胶的孔中。然后分别取5μL样品DNA，加入1μL Loading Buffer混匀后依次加入孔中。接上电源，电压120V，电流50mA进行电泳。

4.PCR产物的回收

(1)在紫外灯下快速切割含目的条带的琼脂糖胶块于1.5mL离心管中，尽量避免切到目的条带旁边多余的胶块。

(2)加入胶块3倍重量的结合液DB。

(3)56℃恒温水浴至胶块完全溶解，期间可以上下颠倒促进溶解。

(4)将吸附柱AC放于收集管，然后将溶液转入AC中，12000rpm离心30s，弃废液。

(5)向AC中加入700μL漂洗液WB(加入一定量的乙醇)，12000rpm离心30s，弃废液。

(6)向AC中再次加入500μL WB，12,000rpm离心30s，弃废液。

(7)将AC放回空收集管，12,000rpm离心2min，以去除漂洗液。

将AC放入一个新的1.5mL EP中，在吸附膜中间悬空加入35μL预热(65-70℃水浴)的洗脱缓冲液EB，静置2min，12000rpm离心1min，即可得目的DNA产物。

5.T载体的构建。

(1)取1μL目的DNA产物，加入2μL 5×pClone007 Simple Vector Mix，用ddH2O补足至10μL，轻轻混匀，室温反应5min，然后将离心管置于冰上。

(2)加连接产物于100μL Trelief^TM5αChemically Competent Cell感受态细胞中(在感受态细胞刚刚解冻时加入连接产物)，轻弹混匀，冰浴5min。

(3)42℃水浴热激45s，立即置于冰上2min。

加500μL平衡至室温的LB培养液，无需复苏，取200μL均匀地涂在准备好的含Amp抗生素的LB平板上，37℃培养箱中倒置过夜培养。

6.测序。

(1)挑选由杂交瘤细胞SZC1H3分泌的单克隆，加入到500μL LB培养基中，37℃，250rpm摇菌，提取质粒。

(2)用M13 Forward Primer引物

(M13F-5’-ACTGGCCGTCGTTTTAC-3’)进行测序。

经测序，单克隆抗体分别具有如SEQ ID NO.1所示的重链可变区核苷酸编码序列和如SEQ ID NO.2所示的轻链可变区核苷酸编码序列。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所

<120> 一种杂交瘤细胞株、单克隆抗体、检测试剂盒及检测方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 396

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gagtctgggg gaggcgtagt gaagcctgga gggtccctaa aactctcctg tgcagcctct 60

ggattcagtt tcagtaacta tggcatgtct tgggttcgcc agactccgga aaagaggctg 120

gaatgggtcg caagtattag tgatggtggt agtctcacct tctattcaga caatatgcag 180

gggcgatgca ccatctccag agacaatgcc aagaacaccc tgtacctgca aatgagcagt 240

ctgaggtctg aggactcggc catttattac tgtgcaagac acggaaggag ggtcaactat 300

gattacgaag gctggtttgg taactggggc caagggactc tggtctctgt ctctgcagcc 360

aaaacgacac ccccatcagt ctatccactg gcccct 396

<210> 2

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cagactacag cctccctatc tgcatctgtg ggagaaactg tcaccatcac atgtcgacca 60

agtgagaata tttacggtta tttagcatgg tatcagcaga aacagggaag atctcctcag 120

ctccttatat ataatgcaaa aaccttagca gagggtatgc catcaaggtt cgatggcagt 180

ggatcagaca cacagttttc tctgaagatc aatagcctgc agcctgaaga ttttgggact 240

tattactgtc aacatcatta tggtcttccg tggacgttcg gtgggggcac caagctggat 300

atcaaacggg ctgatgctgc accaactgta tcc 333

<210> 3

<211> 132

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser

1 5 10 15

Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr Gly Met Ser Trp Val

20 25 30

Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Asp

35 40 45

Gly Gly Ser Leu Thr Phe Tyr Ser Asp Asn Met Gln Gly Arg Cys Thr

50 55 60

Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser

65 70 75 80

Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg His Gly Arg

85 90 95

Arg Val Asn Tyr Asp Tyr Glu Gly Trp Phe Gly Asn Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Ser Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr

115 120 125

Pro Leu Ala Pro

130

<210> 4

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Gln Thr Thr Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile

1 5 10 15

Thr Cys Arg Pro Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln

20 25 30

Gln Lys Gln Gly Arg Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Asn Ala Lys Thr

35 40 45

Leu Ala Glu Gly Met Pro Ser Arg Phe Asp Gly Ser Gly Ser Asp Thr

50 55 60

Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Thr

65 70 75 80

Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly

85 90 95

Thr Lys Leu Asp Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser

100 105 110

Claims

1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，其包括2021年12月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的杂交瘤细胞株SZC1H3，保藏编号为CGMCC No.45002。

2.一种单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌获得。

3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体分别具有如SEQ IDNO.3所示的重链可变区氨基酸序列和如SEQ ID NO.4所示的轻链可变区氨基酸序列。

4.一种三唑类农药的检测试剂、试剂盒或试纸条，其特征在于，其包括：

权利要求2-3任一项所述的单克隆抗体；

优选地，所述检测试剂盒还包括固相载体和带有可被检测的标记物的抗抗体，所述固相载体上包被有包被原，所述包被原为三唑类农药半抗原与载体蛋白的偶联物。

5.根据权利要求4所述的检测试剂、试剂盒或试纸条，其特征在于，所述可被检测的标记物选自荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂或纳米颗粒类标记物。

6.根据权利要求5所述的检测试剂、试剂盒或试纸条，其特征在于，所述试剂盒用于检测三唑酮、三唑醇和多效唑中的至少一种时，所述试剂盒包括单克隆抗体、标准品、包被有包被原的酶标板、酶结合物、底物显色液和终止液，所述包被原为三唑酮与载体蛋白的偶联物；

优选地，所述试剂盒还包括洗涤液、酶结合物稀释液；

所述载体蛋白选自甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白或血蓝蛋白；所述酶结合物为带有酶标记的抗抗体；所述标准品包括三唑酮、三唑醇和多效唑的标准品；

优选地，所述包被原为具有如下结构的抗原：

优选地，所述包被原的稀释度为1：8000-16000，所述单克隆抗体的稀释度为1：4000-8000。

7.根据权利要求5所述的检测试剂、试剂盒或试纸条，其特征在于，所述试剂盒用于检测三唑酮、三唑醇和多效唑中的至少一种时，所述试剂盒包括单克隆抗体、标准品、包被有包被原的酶标板、酶结合物、底物显色液和终止液，所述包被原为多效唑半抗原与载体蛋白的偶联物；

优选地，所述试剂盒还包括洗涤液、酶结合物稀释液；

优选地，所述包被原为具有如下结构的抗原：

8.一种三唑类农药的检测试剂盒，其特征在于，其包括：

固相载体和带有可被检测的标记物的抗原，所述固相载体上包被有所述权利要求2-3任一项所述的单克隆抗体；所述抗原为三唑类农药半抗原与载体蛋白的偶联物。

9.一种检测三唑类农药的方法，其特征在于，其包括：使用权利要求2-3任一项所述的单克隆抗体、权利要求4-7任一项所述的检测试剂、试剂盒或试纸条、或者权利要求8所述的检测试剂盒。

10.一种如使用权利要求2-3任一项所述的单克隆抗体、权利要求4-7任一项所述的检测试剂、试剂盒或试纸条，或者权利要求8所述的检测试剂盒在农药残留检测中的应用。