CN114949252A - 用于肿瘤光热/化疗协同治疗的智能酸响应性自组装复合纳米载药体系及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于肿瘤光热/化疗协同治疗的智能酸响应性自组装复合纳米载药体系及其制备方法和应用。复合纳米载药体系的普鲁士蓝纳米粒子PB NPs可以同时作为药物载体及光热治疗的光热剂，利用静电相互作用将PEI修饰在PB NPs表面得到PB@PEI NPs，之后将可以智能响应酸性条件而通过分子间氢键自组装的多金属氧酸盐量子点POM NPs和PB@PEINPs通过静电吸附作用制备复合纳米材料PB@PEI‑POM NPs，最后负载化疗药物盐酸阿霉素DOX得到复合纳米载药体系PB@PEI‑POM‑DOX NPs。本发明具有良好的光热/化疗协同治疗肿瘤的效果，并能在肿瘤组织中实现“由小变大”从而延长纳米体系在肿瘤部位停留时间，达到更好的治疗效果，有望成为一种新型的高效协同抗癌药物递送系统，因而具有实用性及广阔的应用前景。

Description

用于肿瘤光热/化疗协同治疗的智能酸响应性自组装复合纳 米载药体系及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于药物制剂技术领域，具体涉及药物纳米载体技术。
背景技术
光热疗法(PTT)是指通过近红外激光(NIR)照射光热剂，光热剂吸收NIR，并将光转化为热，从而杀死肿瘤细胞。然而，由于NIR激光穿透深度的限制，单独利用PTT难以杀死深层肿瘤细胞，且仍受到NIR穿透深度低以及对肿瘤复发缺乏长期疗效的限制。为了提高治疗效果，目前将光热疗法和化疗联合治疗肿瘤的方法受到关注。然而，由于增强通透性和保留(EPR)效应差以及单核吞噬细胞系统(例如肝脏/脾脏)会非特异性地摄取纳米粒子，导致纳米粒子在肿瘤组织中的积累较低等原因，光热联合化疗的方法目前临床疗效并不理想。因此，还有必要对其进一步改进。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了用于肿瘤光热/化疗协同治疗的智能酸响应性自组装复合纳米载药体系及其制备方法和应用。
为实现本发明的目的，本发明的技术方案是：采用水热溶剂法制备PB NPs，在此基础上，利用静电相互作用将高分子聚合物PEI修饰到PB NPs，得到PB@PEI NPs，实现电位由负到正的翻转；采用不良溶剂沉淀法制备量子点POM NPs，通过静电吸附作用将POM NPs和PB@PEI NPs制备得到复合纳米材料PB@PEI-POM NPs，最后将化疗药物DOX负载到上述复合纳米材料上，得到复合纳米载药体系PB@PEI-POM-DOX NPs，考察该复合纳米载药体系的生物相容性及抗肿瘤效果。
具体地：
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：
一种用于肿瘤光热/化疗协同治疗的智能酸响应性自组装复合纳米载药体系，所述复合纳米载药体系(PB@PEI-POM-DOX NPs)包括普鲁士蓝纳米粒(PB NPs)，所述普鲁士蓝纳米粒(PB NPs)上通过聚乙烯亚胺(PEI)连接有多金属氧酸盐量子点(POM NPs)，并负载有盐酸阿霉素(DOX)。
进一步地，所述复合纳米载药体系的粒径为80～120nm，例如约为90nm。
本发明的纳米体系是根据普鲁士蓝纳米粒子(PB NPs)可以作为药物载体及光热治疗的光热剂，以及多金属氧酸盐(POM NPs)可以智能响应酸性条件而自组装成尺寸较大的纳米结构，而将POM NPs和PB NPs通过聚乙烯亚胺(PEI)制备成复合纳米材料，最后将化疗药物盐酸阿霉素(DOX)负载到上述复合纳米材料上，构建复合纳米载药体系，达到更好的抗肿瘤效果。
所述复合纳米载药体系，能够实现化疗/光热协同治疗肿瘤，并能在肿瘤组织中实现“由小变大”从而延长纳米体系在肿瘤部位停留时间，达到更好的治疗效果。本发明提出“由小变大”的策略，指的是复合纳米载药体系被设计成其在血液循环过程中保持较小尺寸的纳米粒子，然后在肿瘤组织中由肿瘤微环境(TME)的酸性条件触发，从而使得纳米粒子之间通过形成分子间氢键自组装成更大的纳米结构，这一特性有助于减少不可避免的捕获。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：
一种用于肿瘤光热/化疗协同治疗的智能酸响应性自组装复合纳米载药体系的制备方法，包括：
1)普鲁士蓝纳米粒(PB NPs)的制备：合成普鲁士蓝纳米粒(PB NPs)，作为载体及光热剂；
2)聚乙烯亚胺修饰的普鲁士蓝纳米粒(PB@PEI NPs)的制备：将聚乙烯亚胺(PEI)通过静电吸附作用修饰于普鲁士蓝纳米粒(PB NPs)，得到聚乙烯亚胺修饰的普鲁士蓝纳米粒(PB@PEI NPs)；
3)多金属氧酸盐量子点(POM NPs)的制备：制备多金属氧酸盐量子点(POM NPs)；
4)复合纳米材料(PB@PEI-POM NPs)的制备：将多金属氧酸盐量子点(POM NPs)与聚乙烯亚胺修饰的普鲁士蓝纳米粒(PB@PEI NPs)通过静电相互作用制备得到复合纳米材料(PB@PEI-POM NPs)；
5)复合纳米载药体系(PB@PEI-POM-DOX NPs)的制备：将化疗药物盐酸阿霉素(DOX)通过静电吸附作用负载到复合纳米材料(PB@PEI-POM NPs)，得到复合纳米载药体系(PB@PEI-POM-DOX NPs)。
进一步地，所述步骤1)中，以聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和铁氰化钾(K3[Fe(CN)6])通过水热反应制备普鲁士蓝纳米粒(PB NPs)，水热反应时间为20～24h，温度为75～85℃。
进一步地，所述步骤1)中，普鲁士蓝纳米粒(PB NPs)的制备过程中，离心速度为10000～12000rpm，离心时间为8～12min。
进一步地，所述步骤1)中，普鲁士蓝纳米粒(PB NPs)的电位为负。
进一步地，所述步骤1)中，普鲁士蓝纳米粒(PB NPs)的粒径为60～80nm，例如约为70nm。
进一步地，所述步骤2)中，将pH 4.8～5.2的聚乙烯亚胺(PEI)水溶液滴加于普鲁士蓝纳米粒(PB NPs)的水分散液中，搅拌，离心，洗涤，得到聚乙烯亚胺修饰的普鲁士蓝纳米粒(PB@PEI NPs)
进一步地，所述步骤2)中，所用聚乙烯亚胺(PEI)水溶液的浓度为11～13mg/mL。
进一步地，所述步骤2)中，得到的聚乙烯亚胺修饰的普鲁士蓝纳米粒(PB@PEINPs)的电位为正。
进一步地，所述步骤3)中，钼酸铵、磷酸二氢钠和L-抗坏血酸在水中反应后，加入乙醇沉淀，离心，洗涤，得到多金属氧酸盐量子点(POM NPs)。
进一步地，所述步骤3)中，多金属氧酸盐量子点(POM NPs)的粒径为2～4nm，例如约为3nm。
进一步地，所述步骤3)中，多金属氧酸盐量子点(POM NPs)的电位为负。
进一步地，所述步骤4)中，聚乙烯亚胺修饰的普鲁士蓝纳米粒(PB@PEI NPs)的水分散液与多金属氧酸盐量子点(POM NPs)的水分散液混合均匀，离心，洗涤，得到复合纳米材料(PB@PEI-POM NPs)。
进一步地，所述步骤5)中，在复合纳米材料(PB@PEI-POM NPs)的水分散液中加入盐酸阿霉素(DOX)，得到复合纳米载药体系(PB@PEI-POM-DOX NPs)
进一步地，所述步骤5)中，盐酸阿霉素(DOX)与复合纳米材料(PB@PEI-POM NPs)的投药比例(质量比)为1：1～3。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之三是：
一种用于肿瘤光热/化疗协同治疗的智能酸响应性自组装复合纳米载药体系在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明制备的新型肿瘤光热/化疗协同治疗的智能酸响应性自组装复合纳米载药体系的特点在于，该体系利用本身具有光热转换效果的普鲁士蓝为纳米载体，具有良好的生物安全性；多金属氧酸盐是由过渡金属和氧组成的聚阴离子簇合物，是量子点尺寸，可以在酸性条件中形成分子间氢键，自组装成较大尺寸的纳米结构；聚乙烯亚胺是阳离子型高分子聚合物，用来修饰普鲁士蓝，达到电位由负变正的翻转；盐酸阿霉素是广谱的化疗药物，对多种肿瘤均有作用，可以抑制DNA和RNA的合成。因此，该复合纳米载药体系可以用于制备抗肿瘤药物，尤其是光热/化疗协同治疗药物。
本发明所涉及的设备、试剂、工艺、参数等，除有特别说明外，均为常规设备、试剂、工艺、参数等，不再作实施例。
本发明所列举的所有范围包括该范围内的所有点值。
本发明中，所述“室温”即常规环境温度，可以为10～30℃。
本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：
1.本发明提供了一种新型的用于肿瘤光热/化疗协同治疗的智能酸响应性自组装复合纳米载药体系及其制备方法和应用，所述复合纳米载药体系中，普鲁士蓝纳米粒子(PBNPs)通过水热溶剂法制备得到，可以同时作为药物载体及光热治疗的光热剂，利用聚乙烯亚胺(PEI)和PB NPs的静电相互作用，将PEI修饰在PB NPs表面，得到带正电荷的PB@PEINPs，之后制备粒径约为3nm的多金属氧酸盐量子点(POM NPs)，该量子点可以智能响应酸性条件而通过分子间氢键自组装，将POM NPs和PB@PEI NPs通过静电吸附作用制备复合纳米材料，得到PB@PEI-POM NPs，最后将化疗药物盐酸阿霉素(DOX)负载到上述复合纳米材料上，得到复合纳米载药体系(PB@PEI-POM-DOX NPs)。
2.本发明的复合纳米载药体系(PB@PEI-POM-DOX NPs)的粒径约为90nm，粒径均一，分散性良好，具有显著的响应酸性pH自组装成较大纳米尺寸的效果，可在肿瘤组织中实现“由小变大”，解决了增强通透性和保留(EPR)效应差以及单核吞噬细胞系统非特异性地摄取纳米粒子导致纳米粒子在肿瘤组织中的积累较低等问题，可以使得纳米粒子在肿瘤细胞中停留较长时间，且光热转换效果良好，材料的生物安全性良好，载药体系的协同抗肿瘤作用显著，具有良好的光热/化疗协同治疗肿瘤的效果，解决了单独的光热治疗或者化疗的治疗效果不好等问题，有望成为一种新型的高效协同抗癌药物递送系统，因而具有实用性及广阔的应用前景。
3.本发明的制备方法结合了水热溶剂法、静电相互作用和不良溶剂沉淀法，工艺简单，操作方便，不涉及有毒有机溶剂。
附图说明
图1为本发明实施例1制得的肿瘤光热/化疗协同治疗的智能酸响应性自组装复合纳米载药体系(PB@PEI-POM-DOX NPs)的透射电镜图。
图2为不同pH值(pH＝7.4、6.5和5.5)溶液中PB@PEI-POM NPs的TEM图(a,b,c)和扫描电镜图像(d,e,f)，SEM的标尺为1μm。
图3为PB@PEI-POM NPs在不同pH值(pH＝7.4、6.5和5.5)溶液以及不同时间的水合粒径，各组中左侧为2h，右侧为24h。
图4为PB@PEI-POM-DOX NPs的体外光热转换性能，其中：a为在波长808nm激光辐射下，不同功率密度(0.5、1.0、1.5、2W/cm2)的100ppm PPPD NPs水溶液的温度变化曲线；b为在功率密度为1.5W/cm2、波长808nm激光辐射下，不同浓度(0、12.5、25、50、100、200ppm)的PPPD NPs水溶液的温度变化曲线；c为PPPD NPs水溶液在功率密度为1.5W/cm2、浓度100ppm、波长808nm激光辐射下，辐照3个循环的温度变化；d为不同功率密度下PPPD NPs纳米粒子的红外热成像图；e为不同浓度PPPD NPs纳米粒子的红外热成像图。
图5为不同浓度的各种纳米粒子与4T1细胞共培养24h和48h的相对存活率，其中：a为PB NPs、b为POM NPs、c为PB@PEI NPs、d为PB@PEI-POM NPs，各组中左侧为24h，右侧为48h。
图6为不同浓度的各种纳米粒子与MC3T3-E1细胞共培养24h和48h的相对存活率，其中：a为PB NPs、b为POM NPs、c为PB@PEI NPs、d为PB@PEI-POM NPs，各组中左侧为24h，右侧为48h。
图7为PB@PEI-POM-DOX NPs与4T1细胞共培养24h后的细胞毒性，其中：a为4T1细胞与PB NPs+NIR、PB@PEI-POM-DOX NPs、DOX+NIR、PB@PEI-POM-DOX NPs+NIR共培养24h的细胞增殖情况(808nm近红外激光照射条件为：1.5W/cm2，5min)，各组中从左至右依次为PB NPs+NIR、PB@PEI-POM-DOX NPs、DOX+NIR、PB@PEI-POM-DOX NPs+NIR；b为PB NPs+NIR、DOX、PB@PEI-POM-DOX NPs、PB@PEI-POM-DOX NPs+NIR在75μg/mL下与4T1细胞共培养的AM/PI荧光染色图像。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一、普鲁士蓝纳米粒(PB NPs)的制备
称取聚乙烯吡咯烷酮(PVP)5.0g和铁氰化钾(K3[Fe(CN)6])396mg于烧杯中，加入40mL盐酸(1M)，将烧杯置于磁力搅拌器搅拌30分钟成澄清透明淡黄色溶液后，转至200mL反应釜中，将反应釜放置在80℃的烘箱中恒温反应20h。取出反应釜，自然冷却至室温后离心(12000rpm，10min)，将得到的沉淀用超纯水洗涤三次，得到PB NPs，将制得的PB NPs冷冻干燥保存。
二、聚乙烯亚胺修饰的普鲁士蓝纳米粒(PB@PEI NPs)的制备
首先，称取40mg、80mg、120mg、160mg的聚乙烯亚胺(PEI)至烧杯中，加入10mL超纯水使之溶解，得到4mg/mL、8mg/mL、12mg/mL和16mg/mL的PEI。配制1M盐酸，通过pH计将盐酸滴加至PEI水溶液中使其pH由碱性调至pH为5.0。之后称取4组20mg的PB NPs分散于20mL的超纯水中，将不同浓度的PEI溶液分别滴加于PB NPs分散液中，磁力搅拌4h，之后离心并洗涤3次，得到PEI修饰的PB@PEI NPs，并比较各组的zeta电位变化，选择最优的PEI浓度(12mg/mL)确定合成方案，将制得的PB@PEI NPs(可记为PB-PEI NPs)冷冻干燥保存。
三、多金属氧酸盐量子点(POM NPs)的制备
称取4mmoL(即4.9434g)的(NH4)6Mo7O24·4H2O于烧杯中，加入20mL的超纯水，于室温搅拌1h。配制10mL超纯水溶解的2.34mmoL(即0.2808g)磷酸二氢钠溶液快速加入上述体系，搅拌15min后加入300mg/mL的L-抗坏血酸2mL，搅拌15分钟后加入80mL乙醇使其沉淀，后离心收集，用水和乙醇洗3遍，冷冻干燥成粉末进行保存。
四、复合纳米材料(PB@PEI-POM NPs)的制备
称取20mg的PB@PEI NPs加20mL超纯水配制成1mg/mL的分散液，同时称取120mg的POM NPs加20mL超纯水配制成6mg/mL的分散液，将上述两个分散液加到同一个烧杯中，搅拌4h，离心收集，用超纯水洗3遍，得到PB@PEI-POM NPs(可记为PB@POM或PB-POM NPs)，冷冻干燥成粉末保存。
五、复合纳米载药体系(PB@PEI-POM-DOX NPs)的制备
为了考察最佳投药比，设置三组不同的投药比，载体和DOX的比例分别为2：1、1：1和1：2。将载体PB@PEI-POM NPs称取20mg分散在20mL超纯水中，用20mL的PBS(pH为7.4)分别溶解10mg、20mg和40mg的DOX，将DOX体系滴加至PB@PEI-POM NPs分散液中，避光搅拌12h，得到载药纳米粒PB@PEI-POM-DOX NPs(可记为PPPD NPs或PPPD)，冷冻干燥成粉末保存。
实施例2
考察复合纳米载药体系(PB@PEI-POM-DOX NPs)的结构。利用TEM观察PB@PEI-POM-DOX NPs的形貌，拍摄TEM图像。取冷冻干燥得到的固体粉末重新分散于超纯水中，稀释浓度至0.1mg/mL，用移液枪取7μL均匀分散的样品溶液滴加至300目铜网，待自然晾干后，将将碳支持膜装载上TEM后，抽真空，启动电压，电压设置为100kV，调节不同倍数下选择合适的视野观察PB@PEI-POM-DOX NPs的形貌，观察到该复合载药纳米粒。具有规则的球形，表面粗糙，分散性好，粒径均一，平均粒径为90nm。如图1。
实施例3
通过定性和定量两个角度考察PB@PEI-POM NPs的酸响应自组装效果。
定性考察为：(1)利用TEM对PB@PEI-POM NPs的酸响应自组装进行考察。称取一定量的PB@PEI-POM NPs粉末，重新分散至pH值分别为7.4、6.4、5.5的PBS缓冲液中，将溶液稀释浓度至0.1mg/mL，再用移液枪取7μL均匀分散的样品溶液，随即滴加至300目铜网，待自然晾干后，将碳支持膜装载上TEM后，依次抽最大真空度，调整启动电压，在电脑中设定电压为100kV，再调节不同倍率下选择合适的视野观察PB@PEI-POM NPs的形貌，然后拍摄并留存照片。(2)利用SEM对PB@PEI-POM NPs的酸响应自组装进行考察。称取一定量的PB@PEI-POMNPs粉末重新分散于pH分别为7.4、6.4、5.5的PBS缓冲液中，稀释浓度至0.1mg/mL，将样品用移液枪吸取10μL，滴加于提前切割好的10mm2硅片上。剪一小段导电胶，撕掉一边的外层纸，贴到样品台上，再用镊子小心把另一边外层的纸揭开，暴露出带有粘性的导电胶，此时用镊子将滴有样品的硅片粘到导电胶上，并用高压气体吹3次硅片，确保硅片上无杂质以及黏附稳定。之后把样品台拿去喷金30s后再装载到样品室，并依次抽最大的真空度，接着调整使得电压升起来。选取不同的放大倍率，观察调整SEM电脑上的视野区域，同时选取适当的视角观测PB@PEI-POM NPs的表面形态，最后，为之后的分析而在不同的倍率下拍照，并且及时保留图像。
定量考察为：利用纳米粒度分析仪定量表征PB@PEI-POM NPs在pH分别为7.4、6.4、5.5的PBS缓冲液以及2h和24h的水合粒径的变化，以验证PB@PEI-POM NPs随着pH的降低和时间延长自组装的效果。
定性考察结果如图2，表明POM NPs负载到PB@PEI NPs后复合纳米粒子仍然具有酸响应自组装效果，可用于后续进一步载药。定量考察结果如图3，PB@PEI-POM NPs随着pH降低和时间而粒径变大，制备得到PB@PEI-POM NPs后24h在pH为5.5的PBS缓冲液中粒径可达704.7nm，定量地反应了纳米材料自组装的效果。
实施例4
考察PB@PEI-POM-DOX NPs光热转换效果。
利用近红外激光器和红外热成像仪对PB@PEI-POM-DOX NPs的热转化效应进行了研究。将PB@PEI-POM-DOX NPs分散在超纯水中，混合成不同浓度(12.5、25、50、100、200μg/mL)用于考虑热转化效应，其中以超纯水为空白对照组。用移液枪抽取1mL不同浓度的PBNPs试样液，加至石英比色皿中，通过调节近红外激光器的照明源与石英比色皿之间的距离，使得光点投射在比色皿上的孔径大小约为1cm，并调节激光器功率密度为1.0W/cm2，同时利用近红外热成像仪记下在激光照射后10min内介质的温度变化规律，每三十秒记下一次，以观察不同浓度的PB@PEI-POM-DOX NPs的光热转化效应。再配制同一浓度(100μg/mL)条件下，不同功率密度(0.5、1、1.5、2W/cm2)的PB NPs分散液，其中超纯水作为空白对照组，和不同浓度组的操作一样，考察不同功率密度的PB@PEI-POM-DOX NPs的光热转换效果。
为更直观地反映温度变化规律，本实施例也采用了近红外热成像仪，来记录不同含量浓度和不同功率密度的PB@PEI-POM-DOX NPs试样液在近红外激光下温度的变化规律。
为评估PB@PEI-POM-DOX NPs的光热稳定性，在1.5W/cm2，光点孔径为1cm，溶液容积为1mL的条件下，用激光照射浓度为100ppm的PB@PEI-POM-DOX NPs试样液十分钟，然后立即停止照射，待其自然降温，直至温度逐渐下降至常温后，再继续设置相同的功率激光，再次照射十分钟，重复该步骤共三次，期间用红外热成像仪每隔三十秒记录一次试样液的温度变化，以考察其光热稳定性。
图4a为不同浓度的PPPD NPs的升温效果，选用808nm近红外激光器，激光功率密度为1W/cm2，光斑直径为一厘米，PPPD NPs溶液在四面透光的比色皿中体积总量约为1mL，且溶液温度随照射时间增加而提高。以超纯水溶液为阴性对照，经激光照射十分钟后，升温幅度变小。当PPPD NPs溶液浓度为200ppm时，在经激光辐照10min后温度变化为35℃。当温度升高至43℃时，对肿瘤细胞具有较强的杀伤力，由实验结果可知，PPPD NPs作为一种优良的光热剂具有较好的PTT效果。
光热稳定性是指收到NIR辐射的影响，光热剂的形貌和对近红外光吸收能力在照射过程中不会发生显著变化。评价光热治疗剂的光热治疗潜力的一个重要衡量因素就是其光热稳定性。
图4c表明浓度为100ppm的PPPD NPs水溶液，经功率密度为1.5W/cm2的NIR照射十分钟后，溶液温度变化达到25℃，经过总共三次循环照射后，溶液升温幅度没有降低，第三次照射温度变化仍可为25℃，表明PPPD NPs具有优异的光热稳定性。
实施例5
考察载体材料在细胞水平的生物相容性。利用CCK-8试剂盒检测PB NPs、POM NPs、PB@PEI NPs、PB@PEI-POM NPs对MC3T3-E1和4T1的细胞毒性。
(1)细胞种板：培养细胞，选择对数生长期细胞，按8×103个/孔的密度分别添加MC3T3-E1和4T1细胞悬液各100微升至96孔板，四周孔中加入PBS保持湿润，随后置于细胞培养箱(37℃、5％CO2)中过夜。
(2)给药：将96孔板从培养箱中取出，用吸管移除旧的培养基，用细胞培养级的PBS洗涤孔板中生长细胞的底侧2～3次，用200微升的移液枪向各孔中加入100微升含PB NPs、PB@PEI NPs、POM NPs及PB@PEI-POM NPs的完全培养基(设置浓度梯度为12.5ppm、25ppm、50ppm、100ppm，用完全培养基配制)，同时设置空白完全培养基作为对照，每个浓度设置平行实验6组，放入培养箱中孵育24小时和48小时。
(3)检测：用1毫升移液枪先移除旧培养基，用细胞培养级PBS洗涤孔板三次，在避光条件下，向每孔中加入110微升检测液(CCK-8:培养基＝1:10(v/v)，现配现用)，并设置空白检测液作为标准。将加了CCK-8的96孔板放回培养箱中，继续孵育1～2小时后，在避光条件下将96孔板取出，利用全波长酶标仪可以检测96孔板中各孔在450纳米波长处的光密度，从而进一步计算各组细胞存活率。
Figure BDA0003671932840000111
(4)细胞毒性等级：按照表1，根据细胞相对增殖率(Relative growth rate,RDR)的数值来评估材料的细胞毒性等级。根据标准规定，只有当毒性级别为0级或1级时，该材料才能判定为合格，即具有良好的生物相容性；毒性级别为2级时，需要综合细胞状态进行系统分析；毒性级别为3级时，判定材料不合格。
表1毒性分级标准
Figure BDA0003671932840000112
由图5和图6可知四种材料在浓度达到100μg/mL时正常细胞和癌细胞的细胞增值率均在80％以上，表明四种材料在细胞水平的生物相容性良好。
实施例6
考察PB@PEI-POM-DOX NPs的光热/化疗协同抑瘤效果。
首先种板，将4组对数生长期的4T1细胞接种于96孔板(接种密度为1×104个/孔)，将孔板放入培养箱中过夜。第二步加药，将96孔板从培养箱中取出，4个板每孔分别加药物混悬液100微升(浓度分别为0ppm、12.5ppm、25ppm、50ppm和100ppm，用完全培养基配制)，施以PB NPs+NIR、PPPD NPs、DOX、PPPD NPs+NIR四组，每个浓度在96孔板中平行设置6个复孔。其中，PPPD NPs+NIR组在加药培养4h后，纳米材料被细胞摄取，此时将96孔板从培养箱中取出，用808nm的激光器以1.5W/cm2的功率密度，照射每孔细胞5分钟，照射完毕后将96孔板放回培养箱中继续培养至24h，以CCK-8法测定细胞增殖率。
将处于对数生长期的4T1细胞消化后接种于24孔板中(种板密度为1×105个/孔)，将24孔板放入培养箱中培养24h。每孔依次加入1mL PB NPs、PPPD NPs、PPPD NPs、free DOX悬浮液(用完全培养基配制)，每组设置3个平行，培养4h后，将一组PPPD NPs以1.5W/cm2照射5分钟，继续培养至24h后弃去旧含药培养基，加入1mL PBS漂洗，每孔滴加AM/PI工作液100μL，孵育15min后，弃去旧液，加100μL细胞培养级PBS，在倒置荧光显微镜下选取合适视角并拍照保留图片以供进一步分析。
图7a结果表明，PPPD NPs的光热/化疗协同抑瘤效果比单独的光热或者化疗的抑瘤效果好得多，表明合成的PPPD NPs纳米体系具有良好的协同治疗效果。图7b同样表明光热/化疗协同治疗效果显著优于单独的光热或者化疗的治疗效果，与上述CCK-8法检测的结果对应。
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (10)

1.一种用于肿瘤光热/化疗协同治疗的智能酸响应性自组装复合纳米载药体系，其特征在于：所述复合纳米载药体系包括普鲁士蓝纳米粒，所述普鲁士蓝纳米粒上通过聚乙烯亚胺连接有多金属氧酸盐量子点，并负载有盐酸阿霉素。
2.根据权利要求1所述的用于肿瘤光热/化疗协同治疗的智能酸响应性自组装复合纳米载药体系，其特征在于：所述复合纳米载药体系的粒径为80～120nm。
3.一种权利要求1所述的用于肿瘤光热/化疗协同治疗的智能酸响应性自组装复合纳米载药体系的制备方法，其特征在于：包括：
1)合成普鲁士蓝纳米粒；
2)将聚乙烯亚胺通过静电吸附作用修饰于普鲁士蓝纳米粒，得到聚乙烯亚胺修饰的普鲁士蓝纳米粒；
3)制备多金属氧酸盐量子点；
4)将多金属氧酸盐量子点与聚乙烯亚胺修饰的普鲁士蓝纳米粒通过静电相互作用制备得到复合纳米材料；
5)将盐酸阿霉素通过静电吸附作用负载到复合纳米材料，得到复合纳米载药体系。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中，将pH 4.8～5.2的聚乙烯亚胺水溶液滴加于普鲁士蓝纳米粒的水分散液中，搅拌，离心，洗涤，得到聚乙烯亚胺修饰的普鲁士蓝纳米粒。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中，所用聚乙烯亚胺水溶液的浓度为11～13mg/mL。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中，钼酸铵、磷酸二氢钠和L-抗坏血酸在水中反应后，加入乙醇沉淀，离心，洗涤，得到多金属氧酸盐量子点。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤4)中，聚乙烯亚胺修饰的普鲁士蓝纳米粒的水分散液与多金属氧酸盐量子点的水分散液混合均匀，离心，洗涤，得到复合纳米材料。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤5)中，在复合纳米材料的水分散液中加入盐酸阿霉素，得到复合纳米载药体系。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述步骤5)中，盐酸阿霉素与复合纳米材料的投药比例为1：1～3。
10.一种用于肿瘤光热/化疗协同治疗的智能酸响应性自组装复合纳米载药体系在制备抗肿瘤药物中的应用。
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