CN114934120A - 一种快速鉴定早期结直肠癌的环状rna标志物的应用及诊断试剂盒 - Google Patents

一种快速鉴定早期结直肠癌的环状rna标志物的应用及诊断试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学与生物医药技术领域，提供一种快速鉴定早期结直肠癌的环状RNA标志物的应用及诊断试剂盒。本发明提供环状RNA hsa_circ_0001445作为诊断标志物在制备快速鉴定早期结直肠癌的产品中的应用，环状RNA hsa_circ_0001445具有如SEQ ID NO：1所示的序列。试剂盒中含有定量检测hsa_circ_0001445的PCR引物对，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。本发明中的标志物检测方便、快速、操作简单、微创、病人接受率高，对临床具有重大价值及意义。

Description

一种快速鉴定早期结直肠癌的环状RNA标志物的应用及诊断 试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学与生物医药技术领域，具体涉及一种快速鉴定早期结直肠癌的环 状RNA标志物的应用及诊断试剂盒。
背景技术
结直肠癌(colorectal cancer,CRC)发病率位列第三，也是全球第二大常见癌症死亡 原因，仍然是世界主要疾病负担。CRC 5年生存率65％，10年生存率58％。而生存率主要取决 于其临床TNM分期，早期CRC(I+Ⅱ期)可以治愈，晚期CRC(Ⅲ+Ⅳ期)丧失治愈机会。CRC 的筛查检测有助于清除癌前病变，如结肠腺瘤，通过诊断早期无症状癌症来改善预后，降低 死亡率。因此，迫切需要新的非侵入性生物标志物来补充和改进CRC的筛查管理策略，改善 预后。
目前临床所应用最常见的CRC筛查手段为结肠镜筛查和大便隐血实验(FecalOccult Blood Test,FOBT)。但肠镜侵入性大，对临床医师要求高，病人医从性低，普及较难；FOBT 漏诊率高，灵敏性较低。血清肿瘤标志物CEA,CA199也可协助诊断，但诊断效率有待提高。 对于疾病早期阶段，尚无公认的筛查方案，仍存在显著差异。越来越多证据表明肿瘤向血液 中释放的大量非编码RNA可用于癌症诊断和预后。其中circRNAs在血清和尿液等体液中高表 达，以其稳定的环状结构及组织细胞中的特异性成为了肿瘤液体活检的理想标志物。CRC患 者和健康对照血清中的circRNAs出现明显差异的表达模式，证明体液中的circRNAs可能是 监测癌症发展和进展的生物标记物。因此，在众多circRNA标志物中筛选出一种快速鉴定早 期结直肠癌的诊断标志物引物及方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种快速鉴定早期结直肠癌的环状 RNA标志物的应用及诊断试剂盒，有利于快速简便诊断早期结直肠癌，降低癌症死亡率。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
发明人对结直肠癌患者血清及组织进行高通量测序和基因芯片检测，通过对比分析对照 组、腺瘤、早期结直肠癌和晚期结直肠癌血清与组织中环状RNA表达情况，从中筛选出在早 期结直肠癌血清和组织中均存在特异表达的标志物hsa_circ_0001445，经过反复筛选，设计成 以上引物对，以F为上游引物，R为下游引物，所形成的产物必须跨过剪接位点以确保环状 结构。
本发明提供环状RNA hsa_circ_0001445作为诊断标志物在制备快速鉴定早期结直肠癌的 产品中的应用，所述环状RNA hsa_circ_0001445具有如SEQ ID NO：1所示的序列。
所述的产品中含有定量检测hsa_circ_0001445的PCR引物对，所述PCR引物对中，上游 引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示：CAAGATGGGCGAAAGTTCACT，下游引物的核苷酸序列 如SEQ ID NO：3所示：TGTGTTGCTCCATGTCTAATCATT。
所述的产品包括试剂、试纸、试剂盒或基因芯片。
优选地，所述定量检测hsa_circ_0001445的方法包括以下步骤：
1)从待测血清中提取RNA，得到RNA样品；
2)向提取出的RNA样品中加入反转录酶，将RNA反转录成cDNA；
3)向步骤2)所得cDNA中加入PCR引物对F/R和荧光染料，在特定条件下进行PCR扩增 反应，得到扩增产物；
4)对步骤3)所得扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳和Sanger测序，确定待测样品。
步骤3)中所述的PCR的扩增反应体系为：
Figure BDA0003701915130000021
优选地，步骤3)中所述的PCR的扩增反应的程序为：保温阶段：95℃，30s，1个循环；循环阶段：95℃，5s；60℃，34s；共40个循环；熔体曲线阶段95℃，15s；60℃，60s； 95℃，15s；1个循环。
本发明还提供一种快速鉴定早期结直肠癌的试剂盒，所述的试剂盒中含有定量检测 hsa_circ_0001445的PCR引物对。经过反复筛选，所述PCR引物对中，上游引物的核苷酸序 列如SEQ ID NO：2所示：CAAGATGGGCGAAAGTTCACT，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3 所示：TGTGTTGCTCCATGTCTAATCATT。所述试剂盒中还包括PCR反应液。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、本发明通过从高通量测序和基因芯片检测筛选出在早期结直肠癌中特异表达的标志物 hsa_circ_0001445，临床病理因素分析发现其表达与患者年龄、TNM分期、分化程度和是否 远处转移有关，ROC曲线证实hsa_circ_0001445诊断早期结直肠癌的曲线下面积为0.8071， 敏感度75.00％，特异度83.33％，对疾病具有较好诊断价值。
2、本发明中的标志物检测方便、快速、操作简单、微创、病人接受率高，对临床具有重 大价值及意义。本发明通过血清中标志物检测对早期结直肠癌具有较好诊断效能，结直肠癌 若能在早期被诊断，90％死亡可以避免，因此，本发明有利于快速简便诊断早期结直肠癌，降 低癌症死亡率。
附图说明
图1为本发明实施例提供的PCR产物水平琼脂糖凝胶电泳示意图；
图2为本发明实施例提供的PCR扩增溶解曲线图；
图3为本发明实施例提供的标志物hsa_circ_0001445剪切位点测序图；
图4为本发明实施例提供的hsa_circ_0001445诊断早期直肠癌患者的ROC曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述 的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领 域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护 的范围。除非另有所指，本发明中用到的试剂可以是任何合适的市售试剂；细胞系均可以通 过市售获得。
本发明根据血清基因芯片和组织测序结果确定候选诊断标志物hsa_circ_0001445。
本发明通过反复筛选，选出特异性强的引物，其核苷酸序列如下所示：
F：CAAGATGGGCGAAAGTTCACT；
R：TGTGTTGCTCCATGTCTAATCATT。
发明人对结直肠癌患者血清及组织进行高通量测序和基因芯片检测，通过对比分析对照 组、腺瘤、早期结直肠癌和晚期结直肠癌血清与组织中环状RNA表达情况，从中筛选出在早 期结直肠癌血清和组织中均存在特异表达的标志物hsa_circ_0001445，经过反复筛选，设计成 以上引物对，以F为上游引物，R为下游引物，所形成的产物必须跨过剪接位点以确保环状 结构。
实施例1环状RNAhsa_circ_0001445与早期结直肠癌的关联性
1.1研究对象
选取早期结直肠癌患者55例，2018年9月～2021年4月于柳州市人民医院、广西医科 大学第一附属医院、柳州市中医医院确诊治疗，临床资料从病历获得。整个采集及后续实验 过程符合医学伦理道德要求并严格遵循病例资料的保密原则。取受试人员外周血1.5ml，于 -80℃冷藏保存。
1.2从待测血清中提取circRNA
a.从-80℃冰箱取出血清于4℃冰箱解冻，待血清融化成液体后放置在低温离心机中离 心，离心条件12000g，4℃，10min。用移液器小心吸取250μl血清至无DNase/RNase的1.5 ml EP管中，放冰盒中待用。
b.每250μl血清加入750μl Trizol LS，用移液枪吹打混匀，再额外加入20μl冰乙酸， 颠倒混合，室温静置5min彻底分离核蛋白复合物。
c.每750μl Trizol LS中加入200μl氯仿，盖好样品盖，双手大力摇管20s，室温孵育2-3 min。然后将EP管低温离心，离心条件12000g，4℃,15min，离心后混合物分为红色酚-氯 仿相、中间相和上层无色水相，小心转移含RNA的水相于另一个干净的EP管中(吸取400μl-500μl水相，避免吸到其他相)。
d.每400μl-500μl水相加入500μl异丙醇(异丙醇在实验开始时可放4℃冰箱中预冷待 用)，由于血清RNA较少，可在此步骤加入3-5μl糖原，增加核酸提取产出。盖好样品盖，混匀后将其存放在4℃冰箱中静置30min-60min。静置结束后，12000g，4℃,离心10min， 试管底部可见白色RNA沉淀，弃上清。
e.按750μl Trizol LS加入1ml 75％乙醇(无水乙醇与DEPC水按3:1比例，现配现用) 洗涤沉淀，轻柔颠倒混匀待沉淀漂浮起来，7500g，4℃，离心5min。弃上清后，再用迷你离心机离心数秒，移液器吸出残留液体。
f.风干RNA沉淀，每管加入10μl DEPC水吹打溶解核酸沉淀，放冰上助融备用(若不继续实验，可将RNA放-80℃冰箱中保存)。
1.3以提取的RNA为模板，去除基因组DNA反应
按50ng总量血清计算出所加RNA总体积，按反应数+2配制MIX混合液，试剂如下表1， 再分装至每管中，每管总量10μl。
表1
Figure BDA0003701915130000051
室温放置5min(或更长时间)。Total RNA最多不能超过1μg。
1.4向提取出的RNA样品中加入反转录酶，将RNA反转录成cDNA
试剂如下表2，按反应数+2配制MIX混合液，再分装10μl至每管中，最终每管总体积20μl。
表2
Figure BDA0003701915130000052
转录反应：37℃，15min；85℃，5s；4℃，冰上待用(如不进行后续实验可于-20℃ 保存)，得cDNA。
1.5以F和R为上下游引物，30ng～60ng cDNA为模板，向步骤得cDNA中加入PCR引物对F/R和荧光染料，进行PCR扩增，其扩增反应体系如下表3：
表3
Figure RE-GDA0003764120070000053
两步法扩增，保温阶段：95℃，30s，1个循环；循环阶段：95℃，5s；60℃，34s；共 40个循环；熔体曲线阶段95℃，15s；60℃，60s；95℃，15s；1个循环。反应结束后 观察溶解曲线及扩增曲线，溶解曲线为单峰。
1.6PCR产物电泳分析
对PCR产物进行水平琼脂糖凝胶电泳。使用超纯水和西班牙琼脂糖配制2％琼脂糖凝胶。 微波炉加热至液体变澄清透明后按说明书比例加入核酸染料Gelred轻柔混匀，待琼脂糖冷却 至60℃左右时，均匀倒入制胶板中，插上梳板，静置至凝胶完全凝固后取下梳板。按说明书 配制0.5×TBE工作浓度，将缓冲液倒入电泳槽中，再放入凝胶。5μl PCR产物与1μl 6×Loading Buffer充分混匀后加入点样孔，同时加入5μl MarkerIDNA Ladder。120V，电泳35min，电 泳结束，在凝胶成像分析仪上观察结果，见图1，电泳条带清晰明亮单一。
1.7PCR产物Sanger测序分析
对PCR产物进行Sanger双向测序。双链变性后结合引物，将其等量加入带有A,T,G,C 荧光标记的3’端去OH的ddNTP四个体系中。将反应结束的四个体系进行变性聚丙烯酰胺凝 胶电泳，从下往上读取序列。所得序列与circbase数据库进行比对，其序列如SEQ IDNO：1， 证实PCR扩增产物为目的circRNA。
1.8关联分析
用IBM SPSS Statistics 23.0软件对数据进行统计分析。以2-ΔΔCt方法计算circRNA相对表 达量。计量资料采用
Figure BDA0003701915130000061
表示。通过独立样本t检验以及单因素方差分析统计学方法对CRC 患者中hsa_circ_0001445表达水平与临床病理因素关系进行分析，ROC曲线评判指标诊断价 值，P<0.05时认为差异显著具有统计学意义。
对55例患者临床资料进行分析，以hsa_circ_0001445的ΔCt作为统计量，结果发现 SEQ ID NO：1中的hsa_circ_0001445表达水平与患者年龄，TNM分期、分化程度和是否远处转移病理因素有关(P<0.05)。提示hsa_circ_0001445表达与早期结直肠癌有显著关联。详细结果见表4。ROC曲线分析发现hsa_circ_0001445曲线下面积AUC为0.8071(95％CI：0.6880-0.9263)，最大约登指数为0.5833，cut-off值为1.2370，敏感度为75.00％(95％CI：0.5664-0.8732)，特异度83.33％(95％CI：0.6644-0.9266)，阳性似然比4.5000，阴性似然比0.3000，差异具有统计学意义(P<0.001，图4)
表4 hsa_circ_0001445表达水平与CRC血清临床病理特征相关性
Figure BDA0003701915130000071
Figure BDA0003701915130000081
实施例2快速鉴定早期结直肠癌的试剂盒
由于hsa_circ_0001445与早期结直肠癌高度相关，因此可基于此设计特异性引物，再以 病人的DNA为模板进行扩展检测。制备鉴定早期结直肠癌的试剂盒，该试剂盒含有定量检测 hsa_circ_0001445的PCR引物对，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示：CAAGATGGGCGAAAGTTCACT，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示：TGTGTTGCTCCATGTCTAATCATT。
该试剂盒还含有PCR反应液，其组成见表3。
本发明的试剂盒在使用时，抽取受试者外周血2ml，按照上述1.2-1.7的方法进行处理， 利用本发明的试剂盒进行PCR反应，将反应产物进行测序，将测序结果利用Meglign7.0和 Chromas 2.33软件进行检验和分析。检测结果中受试者hsa_circ_0001445的ΔCt值高于 5.084±1.417则表明受试者患有早期结直肠癌的可能性较高。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专 利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明 所涵盖专利范围。
序列表
<110> 柳州市人民医院
<120> 一种快速鉴定早期结直肠癌的环状RNA标志物的应用及诊断试剂盒
<130> 2022.06.17
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 269
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
ggaggcttgt ggatcagaat ctgaacaaaa ttgggaaaga tgaaatgctt caaatgatta 60
gacatggagc aacacatgtg tttgcttcaa aggaaagtga gatcactgat gaagatatcg 120
atggtatttt ggaaagaggt gcaaagaaga ctgcagagat gaatgaaaag ctctccaaga 180
tgggcgaaag ttcacttaga aactttacaa tggatacaga gtcaagtgtt tataacttcg 240
aaggagaaga ctatagagaa aaacaaaag 269
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 2
caagatgggc gaaagttcac t 21
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 3
tgtgttgctc catgtctaat catt 24

Claims (9)

1.环状RNA hsa_circ_0001445作为诊断标志物在制备快速鉴定早期结直肠癌的产品中的应用，所述环状RNA hsa_circ_0001445具有如SEQ ID NO：1所示的序列。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于：所述的产品中含有定量检测hsa_circ_0001445的PCR引物对，所述PCR引物对中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示：CAAGATGGGCGAAAGTTCACT，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示：TGTGTTGCTCCATGTCTAATCATT。
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于：所述的产品包括试剂、试纸、试剂盒或基因芯片。
4.根据权利要求2所述应用，其特征在于：所述定量检测hsa_circ_0001445的方法包括以下步骤：
1)从待测血清中提取RNA，得到RNA样品；
2)向提取出的RNA样品中加入反转录酶，将RNA反转录成cDNA；
3)向步骤2)所得cDNA中加入PCR引物对F/R和荧光染料，在特定条件下进行PCR扩增反应，得到扩增产物；
4)对步骤3)所得扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳和Sanger测序，确定待测样品。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于：步骤3)中所述的PCR的扩增反应体系为：
Figure FDA0003701915120000011
6.根据权利要求4所述应用，其特征在于：步骤3)中所述的PCR的扩增反应的程序为：保温阶段：95℃，30s，1个循环；循环阶段：95℃，5s；60℃，34s；共40个循环；熔体曲线阶段95℃，15s；60℃，60s；95℃，15s；1个循环。
7.一种快速鉴定早期结直肠癌的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒中含有定量检测hsa_circ_0001445的PCR引物对。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述PCR引物对中，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示：CAAGATGGGCGAAAGTTCACT，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示：TGTGTTGCTCCATGTCTAATCATT。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括PCR反应液。
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