CN114934037A - 用于生产3-氨基丙腈的天冬氨酸酶突变体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种天冬氨酸酶突变体SEQ ID NO:3，该突变体将催化底物丙烯腈生成3‑氨基丙腈的酶活力提升了2.9倍。采用该天冬氨酸酶突变体全细胞催化120g/L丙烯腈底物时，3‑氨基丙腈生成率超过85％。

Description

用于生产3-氨基丙腈的天冬氨酸酶突变体

技术领域

本发明属于酶催化技术领域，具体地说，涉及一种天冬氨酸酶突变体及其用于催化丙烯腈生产3-氨基丙腈的用途。

背景技术

β-丙氨酸是一种非蛋白质组成的天然β型氨基酸，是肌肽、鹅肌肽等肌源活性肽合成的前体物，也是合成泛酸钙的重要原料，在医药、食品、化工等领域应用广泛。

β-丙氨酸制备方法有发酵法、化学法、生物催化法三种方法。发酵法以葡萄糖作为起始原料，在大肠杆菌工程菌中发酵，已报道的最高产量是鲁东大学在专利文献CN112662609A中报道的β-丙氨酸产量75.6g/L，该方法目前还处在实验室研究阶段，尚未工业化应用。化学法包括丙烯腈法、β-氨基丙腈法等，即丙烯腈高压高温加氨获得β-氨基丙腈，然后再通过碱水解法获得β-丙氨酸，该方法需要高温、高压，反应过程副产物多，提取过程复杂，产物收率低，成本高，这些不可避免的缺点导致化学法合成β-丙氨酸在市场上的竞争力越来越弱，甚至被生物方法取代的趋势。生物催化法现主要是以L-天冬氨酸为底物，L-天冬氨酸α脱羧酶(ADC)催化脱羧生成β-丙氨酸，该方法催化效率高、条件温和、提取工艺简单环保，长久以来成为β-丙氨酸酶法催化合成研究的热点，但该方法需要使用相对昂贵的底物天冬氨酸，因此导致工艺成本较高，工业化受到很大的限制。

发明内容

降低β-丙氨酸的酶催化法生产成本是发明人多年的努力方向，并取得了一些进展。借助于生物信息学技术的发展和应用，我们基于对文献DOI:10.1002/cctc.201300986和专利文献CN110791493A中公开的Bacillus sp.YM55-1来源的天冬氨酸酶(AspB)的结构和活性中心等方面的研究和计算机模拟，继续对文献DOI:10.1002/cctc.201300986中公开的天冬氨酸酶(T187C,M321I,K324M,N326C)突变体(SEQ ID NO:1)进行改造，研究其将丙烯腈作为底物催化生成3-氨基丙腈的潜力和可行性。本发明利用基因工程技术来对该天冬氨酸酶突变体进行改造和筛选，构建针对丙烯腈高酶活性的突变体，以便提高全酶催化法生产3-氨酸丙腈效率，利用强碱水解3-氨基丙腈，最终获得β-丙氨酸。

因此，本发明的第一个目的在于提供一种能高效催化丙烯腈反应生成3-氨基丙腈的天冬氨酸酶突变体。

本发明的第二个目的在于提供编码上述天冬氨酸酶突变体的基因。

本发明的第三个目的在于提供包含上述基因的质粒。

本发明的第四个目的在于提供转化了上述质粒的微生物。

本发明的第五个目的在于提供上述天冬氨酸酶突变体或表达微生物在生产3-氨基丙腈、进而生产β-丙氨酸中的用途。

为了达到上述目的，本发明提供如下天冬氨酸酶突变体：

一种天冬氨酸酶突变体，其为初始天冬氨酸酶SEQ ID NO:1氨基酸序列中下述位点的一个以上、优选两个以上发生突变后所形成的突变体：I321、P322、G323、M324、V325、C326、Y401、V402、E403、K404，该天冬氨酸酶突变体具有初始天冬氨酸酶SEQ ID NO:1的功能，即催化丙烯腈进行加氨反应生成3-氨基丙腈的功能。

优选地，其为天冬氨酸酶SEQ ID NO:1氨基酸序列中下述位点的一个以上发生突变后所形成的突变体：M324、V402。

进一步地，其为天冬氨酸酶SEQ ID NO:1氨基酸序列中发生一个以上选自下组的突变后所形成的突变体：M324L、V402G。

更优选地，其是初始天冬氨酸酶SEQ ID NO:1的M324L、V402G突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3：

MNTDVRIEKDFLGEKEIPKDAYYGVQTIRATENFPITGYRIHPELIKSLGIVKKSAALANMEVGLLDKEVGQYIVKAADEVIEGKWNDQFIVDPIQGGAGTSINMNANEVIANRALELMGEEKGNYSKISPNSHVNMSQSTNDAFPTATHIAVLSLLNQLIETTKYMQQEFMKKADEFAGVIKMGRCHLQDAVPILLGQEFEAYARVIARDIERIANTRNNLYDINMGATAVGTGLNADPEYISIVTEHLAKFSGHPLRSAQHLVDATQNTDCYTEVSSALKVCMINMSKIANDLRLMASGPRAGLSEIVLPARQPGSSIIPGLVCPVMPEVMNQVAFQVFGNDLTITSASEAGQFELNVMEPVLFFNLIQSISIMTNVFKSFTENCLKGIKANEERMKEYGEKSIGIITAINPHVGYETAAKLAREAYLTGESIRELCIKYGVLTEEQLNEILNPYEMTHPGIAGRK(SEQ ID NO:3)。

一种编码上述天冬氨酸酶突变体的基因。

优选地，编码上述天冬氨酸酶突变体SEQ ID NO:3的基因的核苷酸序列可以是SEQID NO:4。

一种包含上述基因的质粒。该质粒包含用于表达上述基因的载体，优选载体是PET系列，比如载体是pET24a，但并不受限于此。

一种转化了上述质粒的微生物，该微生物可作为宿主用于表达上述天冬氨酸酶突变体。

优选地，上述微生物选自枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、大肠杆菌，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌BL21(DE3)。

上述天冬氨酸酶突变体或者上述微生物可以作为氨化反应的催化剂用于制备3-氨基丙腈。

作为一种可选的实施方式，上述微生物可以呈菌体或者其细胞破碎物形式。

在酶法合成3-氨基丙腈反应体系中，底物丙烯腈的浓度可选择5～20wt％，优选12wt％；反应温度选择30～65℃，优选40～60℃，更优选40～50℃，最优选45±0.5℃。

上述反应体系中还添加有氨源，所述氨源可以为氨水或者无机铵盐(比如硫酸铵、碳酸铵或硝酸铵)，优选氨水。

由3-氨基丙腈水解制备β-丙氨酸可采用常规的工艺条件，其中反应温度可选择80-95℃，优选90℃；反应使用溶液为20-30wt％氢氧化钠溶液，优选30wt％。

本发明构建的酶催化+水解的方法能够避免采用昂贵的L-天冬氨酸，开辟了酶法制备β-丙氨酸的新路线。相较初始天冬氨酸酶SEQ ID NO:1，本发明构建的天冬氨酸酶突变体SEQ ID NO:3催化丙烯腈加氨反应的酶活性有明显提高，可以催化120g/L丙烯腈底物，3-氨基丙腈生成率达到85％，3-氨基丙腈再通过氢氧化钠碱水解即可获得β-丙氨酸，有工业化开发前景。

具体实施方式

文献DOI:10.1002/cctc.201300986中描述了初始天冬氨酸酶SEQ ID NO:1，是一种Bacillus sp.YM55-1来源的天冬氨酸酶的突变体，其氨基酸序列为：

MNTDVRIEKDFLGEKEIPKDAYYGVQTIRATENFPITGYRIHPELIKSLGIVKKSAALANMEVGLLDKEVGQYIVKAADEVIEGKWNDQFIVDPIQGGAGTSINMNANEVIANRALELMGEEKGNYSKISPNSHVNMSQSTNDAFPTATHIAVLSLLNQLIETTKYMQQEFMKKADEFAGVIKMGRCHLQDAVPILLGQEFEAYARVIARDIERIANTRNNLYDINMGATAVGTGLNADPEYISIVTEHLAKFSGHPLRSAQHLVDATQNTDCYTEVSSALKVCMINMSKIANDLRLMASGPRAGLSEIVLPARQPGSSIIPGMVCPVMPEVMNQVAFQVFGNDLTITSASEAGQFELNVMEPVLFFNLIQSISIMTNVFKSFTENCLKGIKANEERMKEYVEKSIGIITAINPHVGYETAAKLAREAYLTGESIRELCIKYGVLTEEQLNEILNPYEMTHPGIAGRK(SEQ ID NO:1)。

为了提高初始天冬氨酸酶SEQ ID NO:1催化底物丙烯腈的酶活力，发明人根据计算机模拟的蛋白序列3D模型，通过理性分析及半理性设计，选择两个区域共10个位点I321、P322、G323、M324、V325、C326、Y401、V402、E403、K404，进行定点饱和突变，取得了一些酶活力提高的突变体，例如(M324 L、V402G)突变体。作为构建突变体的模板，初始天冬氨酸酶的编码基因可以是SEQ ID NO:2。

氨基酸的突变包括取代、缺失或添加。其中，氨基酸的取代包括保守取代和非保守取代，“保守取代”是指具有相似侧链的残基的可互换性，并因此通常包括用相同或相似的氨基酸定义类别中的氨基酸取代多肽中的氨基酸。例如但不限于，具有脂肪族侧链的氨基酸可以用另一种脂肪族氨基酸例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸取代；具有羟基侧链的氨基酸用另一种具有羟基侧链的氨基酸例如丝氨酸和苏氨酸取代；具有芳香族侧链的氨基酸用另一种具有芳香族侧链的氨基酸例如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和组氨酸取代；具有碱性侧链的氨基酸用另一种具有碱性侧链的氨基酸例如赖氨酸和精氨酸取代；具有酸性侧链的氨基酸用另一种具有酸性侧链的氨基酸例如天冬氨酸或谷氨酸取代；并且疏水性氨基酸或亲水性氨基酸分别用另一种疏水性氨基酸或亲水性氨基酸取代。“非保守取代”是指用具有显著差别的侧链特性的氨基酸取代多肽中的氨基酸。非保守取代可以利用限定组之间而不是它们之内的氨基酸，并且影响：(a)取代区域(例如，脯氨酸取代甘氨酸)中的肽骨架的结构，(b)电荷或疏水性，或(c)侧链体积。例如但不限于，示例性非保守取代可以是用碱性或脂肪族氨基酸取代酸性氨基酸；用小氨基酸取代芳香族氨基酸；和用疏水性氨基酸取代亲水性氨基酸。

在本文中，术语“初始(型)”、“初始酶”、“初始型酶”表示相同的意义，都是指氨基酸序列为SEQ ID NO:1的天冬氨酸酶。为了表述方便起见，在本文中可以将初始型天冬氨酸酶与其突变体统称为“天冬氨酸酶”。

本发明的天冬氨酸酶突变体的氨基酸数量有468个，且序列明确，因此本领域技术人员很容易获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。

为了在基因工程中最常用的大肠杆菌中最佳地表达天冬氨酸酶或其突变体，可以对这些酶的表达基因进行了密码子优化。

密码子优化是可用于通过增加感兴趣基因的翻译效率使生物体中蛋白质表达最大化的一种技术。不同的生物体由于突变倾向和天然选择而通常示出对于编码相同氨基酸的一些密码子之一的特殊偏好性。例如，在生长快速的微生物如大肠杆菌中，优化密码子反映出其各自的基因组tRNA库的组成。因此，在生长快速的微生物中，氨基酸的低频率密码子可以用用于相同氨基酸的但高频率的密码子置换。因此，优化的DNA序列的表达在快速生长的微生物中得以改良。

为了在大肠杆菌中表达天冬氨酸酶，经密码子优化的初始天冬氨酸酶SEQ ID NO:1的编码基因可以是SEQ ID NO:2；天冬氨酸酶突变体SEQ ID NO:3的编码基因可以是SEQID NO:4。

这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。

上述转化体宿主可以使任何适合表达天冬氨酸酶的微生物，包括细菌和真菌。优选微生物是枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、或者大肠杆菌，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌BL21(DE3)。

当作为生物催化剂时，本发明的天冬氨酸酶可以呈现酶的形式或者菌体的形式。所述酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶等；所述菌体的形式包括存活菌体、死亡菌体、固定化菌体等。

作为另一种可选的实施方式，可以采用表达上述天冬氨酸酶的微生物菌体作为酶催化反应的生物催化剂。微生物可以呈菌体或者其细胞破碎物形式，菌体的形式包括存活菌体和死亡菌体，因为当微生物比如枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母或者大肠杆菌不再进行发酵增殖、而是用于酶催化反应时，本身就是一种天然的固定化酶，而且不需要进行破碎处理、甚至提取纯化处理，就可以作为一种酶制剂用于催化反应。由于反应底物和反应产物都是小分子化合物，可以很方便地穿过菌体的生物屏障--细胞膜，因此不需要对菌体进行破碎处理，这在经济方面是有利的。

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

实施例

本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

材料和方法

实施例中的全基因合成、引物合成及测序皆由苏州金唯智生物科技有限公司完成。

实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》第三版(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。

PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。

LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，pH7.2。(LB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)

TB培养基：24g/L酵母提取物、12g/L胰蛋白胨、16.43g/L K₂HPO₄.3H₂O、2.31g/LKH₂PO₄、5g/L甘油，pH7.0-7.5。(TB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)

丙烯腈、3-氨基丙腈和β-丙氨酸的HPLC测定条件：

HLIIC Silica 5μm，4.6×250mm；检测波长210nm；流动相A：40mM磷酸二氢钾；流动相B：乙腈；流动相A：流动相B＝30：70；操作温度30℃；流速1ml/min。

实施例1初始冬氨酸酶基因重组大肠杆菌的构建

对于初始天冬氨酸酶，根据文献DOI:10.1002/cctc.201300986上已经公布的氨基酸序列即SEQ ID NO:1，以此为基础进行密码子优化，全基因合成基因序列SEQ ID NO:2，并在基因两端设计限制性内切酶位点Nde I和XhoI，亚克隆到载体pET24a(Novagen)的相应位点，获得重组质粒pET24a-ASP0。将重组质粒pET24a-ASP0转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)，得到表达初始天冬氨酸酶的重组大肠杆菌pET24a-ASP0/BL21(DE3)。

实施例2第一轮突变-单点饱和突变体库建立及筛选

2.1第324位单点饱和突变体库建立

以初始型酶的基因SEQ ID NO:2为模板，以简并密码子引物进行扩增的方式获得第324位单位点的饱和突变体库。

正向引物Asp-324-F：

5’-GTTCCTCCATCATCCCGGGTNNKGTTTGCCCGGTTATGCCGGAAG-3’，

反向引物Asp-324-R：

5’CTTCCGGCATAACCGGGCAAACMNNACCCGGGATGATGGAGGAAC-3’，

其中M＝A/C，K＝G/T，N＝A/G/C/T。

50μL PCR反应体系包括：10ng质粒模板，10pmol的引物对，1xKOD plus buffer，0.2mM dNTP，1.5mM MgSO₄，5个单位的KOD-plus DNA聚合酶。

PCR反应条件为：95℃3min；98℃10s，57℃30s，68℃2min/kbp，30个循环；68℃10min。

扩增的PCR产物中加入1μL DpnI消化1小时，电转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，得到超过10³个克隆的随机突变体库。

2.2突变体库的高通量筛选

选取突变体库中的转化子接种到500μL含有50μg/mL卡那霉素LB液体培养基的96孔深孔培养板中，培养过夜，然后取80μl过夜培养物，转接至800μl含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养3h后，加入终浓度0.5mM IPTG，降温至25℃，培养过夜。4000rpm离心15min，弃上清，加入100μL含无菌水重悬菌体用于活力测定。

2.3高通量酶活力测定

酶活力定义：在45℃下每分钟消耗1微摩尔(μmol)底物丙烯腈所需要的酶量定义为1个单位(U)。

将上述步骤2.2中100μL菌悬液加入100μL底物反应液(5wt％丙烯腈，浓氨水校正PH至9.5)，在45℃的条件下反应3小时，然后4℃，5000rpm离心10min。取离心上清，检测240nm下的吸光度。

通过对约100个突变体克隆筛选，结果显示获得一株克隆pET24a-ASP-E9/BL21(DE3)克隆菌株消耗底物的能力明显增强。委托苏州金唯智生物科技有限公司对菌株pET24a-ASP-E9/BL21(DE3)的基因组进行测序，通过与初始酶进行序列对比，确认该突变体的突变位点为M324L。

表1、突变菌在相对比活结果

实施例3第二轮突变-双位点饱和突变体库建立及筛选

3.1第402位和第404位双位点饱和突变体库建立

以pET24a-ASP-E9/BL21(DE3)菌种提取的质粒为模板，建立第402位和第404位双位点的饱和突变体库。

正向引物Asp-402/404-F：

5’-GAAGAACGTATGAAAGAATACNNKGAANNKTCCATCGGTATCATCACCGCTATC-3’，

反向引物Asp-402/404-R：

5’-GATAGCGGTGATGATACCGATGGAMNNTTCMNNGTATTCTTTCATACGTTCTTC-3’，

其中M＝A/C，K＝G/T，N＝A/G/C/T。

PCR反应体系、条件及电转化体系同实施例2中的步骤2.1所述。

电转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，最终得到超过10⁴个克隆的随机突变体库。

3.2突变体库的高通量筛选

方法同实施例2步骤2.2。

3.3高通量酶活力测定

方法同实施案例2步骤2.3。

通过对约3000个突变体克隆筛选，结果显示获得一株克隆菌株消耗底物的能力明显增强，该克隆菌体编号为pET24a-ASP-E9-G12/BL21(DE3)。委托苏州金唯智生物科技有限公司对菌株pET24a-ASP-E9-G12/BL21(DE3)的基因组进行测序，确定该菌株表达天冬氨酸酶的第402位氨基酸由缬氨酸突变成甘氨酸，菌体测活对比结果如下表3所示。

表2、突变菌株发酵液与初始型酶表达菌株发酵液的酶活力对比结果

菌种编号	突变位点	发酵液相对比活
			pET24a-ASP0/BL21(DE3)	-	1.0
pET24a-ASP-E9/BL21(DE3)	M324L	2.6
			pET24a-ASP-E9-G12/BL21(DE3)	M324L,V402G	3.9

实施例4突变菌株发酵及酶催化转化

从pET24a-ASP-E9-G12/BL21(DE3)的LB培养平板上挑取单菌落，分别接种至5mL含50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，250rpm培养过夜。取2mL过夜培养物接种至200mL TB培养基中，于37℃，250rpm培养2-3h，至OD₆₀₀ 0.6-0.8时，加入0.1mM IPTG，于28℃，200rpm培养过夜。然后于4℃，10000rpm，离心10min，收集菌体。

将12wt％丙烯腈溶液用浓氨水校正PH至9.5，然后加入终浓度10wt％的pET24a-ASP-E9-G12/BL21(DE3)冻融菌体，于45℃下搅拌反应。反应过程中控制温度45±1℃，反应18-24个小时。通过HPLC检测反应样品，结果显示，在反应18个小时后，反应体系3-氨基丙腈生成率超过85％，底物丙烯腈的转化率超过95％。

实施例5生产β-丙氨酸的应用

将50ml实施例4中的转化液，缓慢加入100ml 90℃的30wt％氢氧化钠溶液中，搅拌反应，然后90±1℃下保温2个小时，通过HPLC检测反应显示，3-氨基丙腈水解率超过99％，终止反应，检测产物β-丙氨酸生成率大约90％。

上述实验表明，初始天冬氨酸酶SEQ ID NO:3和天冬氨酸酶突变体SEQ ID NO:3都能催化丙烯腈反应生成3-氨基丙腈，3-氨基丙腈可进一步水解成β-丙氨酸；天冬氨酸酶突变体SEQ ID NO:3的酶活力比初始酶提高了2.9倍，显示出工业化应用潜力。

序列表

<110> 上海邦林生物科技有限公司

<120> 用于生产3-氨基丙腈的天冬氨酸酶突变体

<130> SHPI2110298

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 468

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 1

Met Asn Thr Asp Val Arg Ile Glu Lys Asp Phe Leu Gly Glu Lys Glu

1 5 10 15

Ile Pro Lys Asp Ala Tyr Tyr Gly Val Gln Thr Ile Arg Ala Thr Glu

20 25 30

Asn Phe Pro Ile Thr Gly Tyr Arg Ile His Pro Glu Leu Ile Lys Ser

35 40 45

Leu Gly Ile Val Lys Lys Ser Ala Ala Leu Ala Asn Met Glu Val Gly

50 55 60

Leu Leu Asp Lys Glu Val Gly Gln Tyr Ile Val Lys Ala Ala Asp Glu

65 70 75 80

Val Ile Glu Gly Lys Trp Asn Asp Gln Phe Ile Val Asp Pro Ile Gln

85 90 95

Gly Gly Ala Gly Thr Ser Ile Asn Met Asn Ala Asn Glu Val Ile Ala

100 105 110

Asn Arg Ala Leu Glu Leu Met Gly Glu Glu Lys Gly Asn Tyr Ser Lys

115 120 125

Ile Ser Pro Asn Ser His Val Asn Met Ser Gln Ser Thr Asn Asp Ala

130 135 140

Phe Pro Thr Ala Thr His Ile Ala Val Leu Ser Leu Leu Asn Gln Leu

145 150 155 160

Ile Glu Thr Thr Lys Tyr Met Gln Gln Glu Phe Met Lys Lys Ala Asp

165 170 175

Glu Phe Ala Gly Val Ile Lys Met Gly Arg Cys His Leu Gln Asp Ala

180 185 190

Val Pro Ile Leu Leu Gly Gln Glu Phe Glu Ala Tyr Ala Arg Val Ile

195 200 205

Ala Arg Asp Ile Glu Arg Ile Ala Asn Thr Arg Asn Asn Leu Tyr Asp

210 215 220

Ile Asn Met Gly Ala Thr Ala Val Gly Thr Gly Leu Asn Ala Asp Pro

225 230 235 240

Glu Tyr Ile Ser Ile Val Thr Glu His Leu Ala Lys Phe Ser Gly His

245 250 255

Pro Leu Arg Ser Ala Gln His Leu Val Asp Ala Thr Gln Asn Thr Asp

260 265 270

Cys Tyr Thr Glu Val Ser Ser Ala Leu Lys Val Cys Met Ile Asn Met

275 280 285

Ser Lys Ile Ala Asn Asp Leu Arg Leu Met Ala Ser Gly Pro Arg Ala

290 295 300

Gly Leu Ser Glu Ile Val Leu Pro Ala Arg Gln Pro Gly Ser Ser Ile

305 310 315 320

Ile Pro Gly Met Val Cys Pro Val Met Pro Glu Val Met Asn Gln Val

325 330 335

Ala Phe Gln Val Phe Gly Asn Asp Leu Thr Ile Thr Ser Ala Ser Glu

340 345 350

Ala Gly Gln Phe Glu Leu Asn Val Met Glu Pro Val Leu Phe Phe Asn

355 360 365

Leu Ile Gln Ser Ile Ser Ile Met Thr Asn Val Phe Lys Ser Phe Thr

370 375 380

Glu Asn Cys Leu Lys Gly Ile Lys Ala Asn Glu Glu Arg Met Lys Glu

385 390 395 400

Tyr Val Glu Lys Ser Ile Gly Ile Ile Thr Ala Ile Asn Pro His Val

405 410 415

Gly Tyr Glu Thr Ala Ala Lys Leu Ala Arg Glu Ala Tyr Leu Thr Gly

420 425 430

Glu Ser Ile Arg Glu Leu Cys Ile Lys Tyr Gly Val Leu Thr Glu Glu

435 440 445

Gln Leu Asn Glu Ile Leu Asn Pro Tyr Glu Met Thr His Pro Gly Ile

450 455 460

Ala Gly Arg Lys

465

<210> 2

<211> 1407

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

atgaacaccg acgttcgtat cgaaaaagac ttcctgggtg aaaaagaaat cccgaaagac 60

gcttactacg gtgttcagac catccgtgct accgaaaact tcccgatcac cggttaccgt 120

atccacccgg aactgatcaa atccctgggt atcgttaaaa aatccgctgc tctggctaac 180

atggaagttg gtctgctgga caaagaagtt ggtcagtaca tcgttaaagc tgctgacgaa 240

gttatcgaag gtaaatggaa cgaccagttc atcgttgacc cgatccaggg tggtgctggt 300

acctccatca acatgaacgc taacgaagtt atcgctaacc gtgctctgga actgatgggt 360

gaagaaaaag gtaactactc caaaatctcc ccgaactccc acgttaacat gtcccagtcc 420

accaacgacg ctttcccgac cgctacccac atcgctgttc tgtccctgct gaaccagctg 480

atcgaaacca ccaaatacat gcagcaggaa ttcatgaaaa aagctgacga attcgctggt 540

gttatcaaaa tgggtcgttg ccacctgcag gacgctgttc cgatcctgct gggtcaggaa 600

ttcgaagctt acgctcgtgt tatcgctcgt gacatcgaac gtatcgctaa cacccgtaac 660

aacctgtacg acatcaacat gggtgctacc gctgttggta ccggtctgaa cgctgacccg 720

gaatacatct ccatcgttac cgaacacctg gctaaattct ccggtcaccc gctgcgttcc 780

gctcagcacc tggttgacgc tacccagaac accgactgct acaccgaagt ttcctccgct 840

ctgaaagttt gcatgatcaa catgtccaaa atcgctaacg acctgcgtct gatggcttcc 900

ggtccgcgtg ctggtctgtc cgaaatcgtt ctgccggctc gtcagccggg ttcctccatc 960

atcccgggta tggtttgccc ggttatgccg gaagttatga accaggttgc tttccaggtt 1020

ttcggtaacg acctgaccat cacctccgct tccgaagctg gtcagttcga actgaacgtt 1080

atggaaccgg ttctgttctt caacctgatc cagtccatct ccatcatgac caacgttttc 1140

aaatccttca ccgaaaactg cctgaaaggt atcaaagcta acgaagaacg tatgaaagaa 1200

tacgttgaaa aatccatcgg tatcatcacc gctatcaacc cgcacgttgg ttacgaaacc 1260

gctgctaaac tggctcgtga agcttacctg accggtgaat ccatccgtga actgtgcatc 1320

aaatacggtg ttctgaccga agaacagctg aacgaaatcc tgaacccgta cgaaatgacc 1380

cacccgggta tcgctggtcg taaataa 1407

<210> 3

<211> 468

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 3

Met Asn Thr Asp Val Arg Ile Glu Lys Asp Phe Leu Gly Glu Lys Glu

1 5 10 15

Ile Pro Lys Asp Ala Tyr Tyr Gly Val Gln Thr Ile Arg Ala Thr Glu

20 25 30

Asn Phe Pro Ile Thr Gly Tyr Arg Ile His Pro Glu Leu Ile Lys Ser

35 40 45

Leu Gly Ile Val Lys Lys Ser Ala Ala Leu Ala Asn Met Glu Val Gly

50 55 60

Leu Leu Asp Lys Glu Val Gly Gln Tyr Ile Val Lys Ala Ala Asp Glu

65 70 75 80

Val Ile Glu Gly Lys Trp Asn Asp Gln Phe Ile Val Asp Pro Ile Gln

85 90 95

Gly Gly Ala Gly Thr Ser Ile Asn Met Asn Ala Asn Glu Val Ile Ala

100 105 110

Asn Arg Ala Leu Glu Leu Met Gly Glu Glu Lys Gly Asn Tyr Ser Lys

115 120 125

Ile Ser Pro Asn Ser His Val Asn Met Ser Gln Ser Thr Asn Asp Ala

130 135 140

Phe Pro Thr Ala Thr His Ile Ala Val Leu Ser Leu Leu Asn Gln Leu

145 150 155 160

Ile Glu Thr Thr Lys Tyr Met Gln Gln Glu Phe Met Lys Lys Ala Asp

165 170 175

Glu Phe Ala Gly Val Ile Lys Met Gly Arg Cys His Leu Gln Asp Ala

180 185 190

Val Pro Ile Leu Leu Gly Gln Glu Phe Glu Ala Tyr Ala Arg Val Ile

195 200 205

Ala Arg Asp Ile Glu Arg Ile Ala Asn Thr Arg Asn Asn Leu Tyr Asp

210 215 220

Ile Asn Met Gly Ala Thr Ala Val Gly Thr Gly Leu Asn Ala Asp Pro

225 230 235 240

Glu Tyr Ile Ser Ile Val Thr Glu His Leu Ala Lys Phe Ser Gly His

245 250 255

Pro Leu Arg Ser Ala Gln His Leu Val Asp Ala Thr Gln Asn Thr Asp

260 265 270

Cys Tyr Thr Glu Val Ser Ser Ala Leu Lys Val Cys Met Ile Asn Met

275 280 285

Ser Lys Ile Ala Asn Asp Leu Arg Leu Met Ala Ser Gly Pro Arg Ala

290 295 300

Gly Leu Ser Glu Ile Val Leu Pro Ala Arg Gln Pro Gly Ser Ser Ile

305 310 315 320

Ile Pro Gly Leu Val Cys Pro Val Met Pro Glu Val Met Asn Gln Val

325 330 335

Ala Phe Gln Val Phe Gly Asn Asp Leu Thr Ile Thr Ser Ala Ser Glu

340 345 350

Ala Gly Gln Phe Glu Leu Asn Val Met Glu Pro Val Leu Phe Phe Asn

355 360 365

Leu Ile Gln Ser Ile Ser Ile Met Thr Asn Val Phe Lys Ser Phe Thr

370 375 380

Glu Asn Cys Leu Lys Gly Ile Lys Ala Asn Glu Glu Arg Met Lys Glu

385 390 395 400

Tyr Gly Glu Lys Ser Ile Gly Ile Ile Thr Ala Ile Asn Pro His Val

405 410 415

Gly Tyr Glu Thr Ala Ala Lys Leu Ala Arg Glu Ala Tyr Leu Thr Gly

420 425 430

Glu Ser Ile Arg Glu Leu Cys Ile Lys Tyr Gly Val Leu Thr Glu Glu

435 440 445

Gln Leu Asn Glu Ile Leu Asn Pro Tyr Glu Met Thr His Pro Gly Ile

450 455 460

Ala Gly Arg Lys

465

<210> 4

<211> 1407

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

atgaacaccg acgttcgtat cgaaaaagac ttcctgggtg aaaaagaaat cccgaaagac 60

gcttactacg gtgttcagac catccgtgct accgaaaact tcccgatcac cggttaccgt 120

atccacccgg aactgatcaa atccctgggt atcgttaaaa aatccgctgc tctggctaac 180

atggaagttg gtctgctgga caaagaagtt ggtcagtaca tcgttaaagc tgctgacgaa 240

gttatcgaag gtaaatggaa cgaccagttc atcgttgacc cgatccaggg tggtgctggt 300

acctccatca acatgaacgc taacgaagtt atcgctaacc gtgctctgga actgatgggt 360

gaagaaaaag gtaactactc caaaatctcc ccgaactccc acgttaacat gtcccagtcc 420

accaacgacg ctttcccgac cgctacccac atcgctgttc tgtccctgct gaaccagctg 480

atcgaaacca ccaaatacat gcagcaggaa ttcatgaaaa aagctgacga attcgctggt 540

gttatcaaaa tgggtcgttg ccacctgcag gacgctgttc cgatcctgct gggtcaggaa 600

ttcgaagctt acgctcgtgt tatcgctcgt gacatcgaac gtatcgctaa cacccgtaac 660

aacctgtacg acatcaacat gggtgctacc gctgttggta ccggtctgaa cgctgacccg 720

gaatacatct ccatcgttac cgaacacctg gctaaattct ccggtcaccc gctgcgttcc 780

gctcagcacc tggttgacgc tacccagaac accgactgct acaccgaagt ttcctccgct 840

ctgaaagttt gcatgatcaa catgtccaaa atcgctaacg acctgcgtct gatggcttcc 900

ggtccgcgtg ctggtctgtc cgaaatcgtt ctgccggctc gtcagccggg ttcctccatc 960

atcccgggtc tggtttgccc ggttatgccg gaagttatga accaggttgc tttccaggtt 1020

ttcggtaacg acctgaccat cacctccgct tccgaagctg gtcagttcga actgaacgtt 1080

atggaaccgg ttctgttctt caacctgatc cagtccatct ccatcatgac caacgttttc 1140

aaatccttca ccgaaaactg cctgaaaggt atcaaagcta acgaagaacg tatgaaagaa 1200

tacggtgaaa aatccatcgg tatcatcacc gctatcaacc cgcacgttgg ttacgaaacc 1260

gctgctaaac tggctcgtga agcttacctg accggtgaat ccatccgtga actgtgcatc 1320

aaatacggtg ttctgaccga agaacagctg aacgaaatcc tgaacccgta cgaaatgacc 1380

cacccgggta tcgctggtcg taaataa 1407

Claims (10)

1.一种天冬氨酸酶突变体，其特征在于，其为天冬氨酸酶SEQ ID NO:1氨基酸序列中下述位点的一个以上、优选两个以上发生突变后所形成的突变体：I321、P322、G323、M324、V325、C326、Y401、V402、E403、K404，该天冬氨酸酶突变体具有天冬氨酸酶SEQ ID NO:1的功能。

2.如权利要求2所述的天冬氨酸酶突变体，其特征在于，其为天冬氨酸酶SEQ ID NO:1氨基酸序列中下述位点的一个以上发生突变后所形成的突变体：M324、V402。

3.如权利要求2所述的天冬氨酸酶突变体，其特征在于，其为天冬氨酸酶SEQ ID NO:1氨基酸序列中发生一个以上选自下组的突变后所形成的突变体：M324L、V402G。

4.如权利要求3所述的天冬氨酸酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3，其为SEQ ID NO:1的M324L、V402G突变体。

5.编码如权利要求1-4中任一项所述天冬氨酸酶突变体的基因。

6.如权利要求5所述的基因，其特征在于，编码天冬氨酸酶突变体SEQ ID NO:3的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:4。

7.包含如权利要求6所述基因的质粒。

8.一种用于表达如权利要求4所述天冬氨酸酶突变体的微生物。例如，该微生物是转化了如权利要求7所述质粒的转化子。

9.如权利要求7所述的微生物，其特征在于，选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌BL21(DE3)。

10.如权利要求1-4中任一项所述天冬氨酸酶突变体或者如权利要求8所述微生物在生产3-氨基丙腈中的用途。