CN114929850A - 用晶体形式的包被基质进行胃保护的颗粒状细菌、其制备方法及其组合物 - Google Patents

用晶体形式的包被基质进行胃保护的颗粒状细菌、其制备方法及其组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及晶体胃保护颗粒状细菌，如包被有优选减少量的脂质包被基质的颗粒形式的细菌菌株，所述脂质包被基质具有晶体形式。此外，本发明涉及所述晶体胃保护颗粒状细菌的制备方法。最后，本发明涉及包含所述晶体胃保护颗粒状细菌的组合物。

Description

用晶体形式的包被基质进行胃保护的颗粒状细菌、其制备方 法及其组合物
本发明涉及晶体胃保护颗粒状细菌，如以优选减少量的脂质包被基质包被的颗粒形式的细菌菌株，所述脂质包被基质具有晶体形式。此外，本发明涉及一种制备所述晶体胃保护颗粒状细菌的方法。最后，本发明涉及包含所述晶体胃保护颗粒状细菌的组合物。
益生菌菌株被定义为“活的微生物，当以足够的量施用时，其会给宿主赋予健康益处”。为了发挥它们的有益作用，存在于益生菌产品或活生物治疗产品(LBP)(包含活细菌菌株的药物)中的活细菌菌株，一旦被口服摄入，必须通过胃区域并以活的状态到达肠道，以便在肠道内定殖并发挥其功能。为了保护细菌菌株免受胃的酸性pH环境的影响，已知用各种胃保护基质，如脂质包被基质来包被细菌菌株。
为了发挥它们的有益作用，益生菌或活细菌菌株还必须在产品的整个保质期内保持有效，直至食用。稳定性主要受到温度和湿度的损害，因此对前者的理想控制和对后者的保护可以帮助将益生菌或活细菌菌株维持在最佳条件下以发挥完全的功效。
Marino等，Journal of Functional Foods，35(2017)报告了一项关于包含饱和甘油单酯的乳化结构在冷藏长达56天期间对益生菌活力的影响的研究。该文献描述了益生菌鼠李糖乳杆菌的制备，首先冷冻干燥，然后与包含脂质相(葵花油)、水相和甘油单酯(MG)-助表面活性剂(CO)的液体混合物混合。然而，细菌菌株是冷冻干燥的，但不是颗粒状的。此外，所使用的方法涉及使用可能损害细菌的活力和/或功能的液体混合物。
文献CN 109480038描述了一种用于生产包含益生菌和巧克力的耐热产品的方法。然而，该文献没有描述具有层状晶体结构涂层的颗粒形式的细菌，也没有描述能够在不损害细菌生存力的情况下获得这种涂层的方法。
然而，出于各种原因，胃保护方法可能导致包被的细菌菌株的活力和/或功能降低。例如，鉴于细菌菌株是不耐热的，通过加热脂质包被基质(或脂肪的熟化)进行调整(tempering)通常会导致细菌菌株的活力和/或功能降低。
本发明处理和解决的技术问题在于提供一种用于益生菌产品和活生物治疗产品(LBP)的细菌菌株的制备方法(简称本发明方法)，其用使细菌细胞具有低死亡率(即保持膜完整性)的包被基质进行胃保护，并因此保持所述细胞在胃保护方法之前具有的活力和功能。同时，本发明解决的技术问题在于通过本发明的所述方法提供细菌菌株或含有它们的组合物(益生菌产品或LBP)，其具有高数量的活的和有功能的细菌，其中，所述包被基质发挥有效的胃保护作用和/或防止成品形式中的残留湿气和/或由于初级包装材料不完全不透湿和/或在打开包装后不可避免地暴露于环境湿气后湿度增加。
鉴于上述技术问题并经过大量的研究和开发阶段，在本发明中，申请人提供了一种方法(胃保护方法，简称本发明的方法)，其主要包括以下步骤：(I)将“裸”(未包被)细菌菌株制粒以获得颗粒状细菌菌株，(II)用脂质包被基质包被所述颗粒状细菌菌株，优选地以减少量包被，以获得原样的胃保护的颗粒状细菌菌株(或裸或未包被)，(III)将所述胃保护的颗粒状细菌菌株本身调整(或熟化)以获得用晶体形式的包被基质进行胃保护的颗粒状细菌，如下文所述并在本权利要求中要求保护。
在本发明的上下文中，就细菌菌株或颗粒状细菌菌株而言，术语“原样”或“裸露的”或“未包被的”本身是同义词并且可以互换使用。所有这些术语均指未包被或非微囊化的细菌菌株或颗粒状细菌菌株。
通过本发明的方法提供了用晶体形式的脂质包被基质进行胃保护的颗粒形式的细菌，其具有相对于胃保护方法之前存在的量几乎没有变化的活的和功能性细菌细胞的量(方法死亡率低)。
换言之，本发明的方法允许细菌在不导致细胞死亡的情况下对细菌进行制粒、包被和调整，例如通过流式细胞术(或流式细胞荧光术)进行评估。
有利地，根据本发明的方法在其每个步骤中在不存在溶剂和/或水相的情况下进行。不存在溶剂和/或水相使得细菌菌株的死亡率几乎为零。
在本发明的包被过程期间，在制粒步骤、包被步骤和调整步骤中，细菌菌株的较低或几乎为零的死亡率允许保持其活力和功能，从而制备含有具有大量活的和功能性细菌的所述晶体胃保护的细菌菌株的产品(组合物)，因此具有制备胃保护细菌的方法和含有它们的成本有效的产品。
有利地，由于本发明方法中的调整步骤的存在而获得的脂质包被基质的晶体结构赋予胃保护颗粒状细菌和含有所述细菌的产品对活性成分(即益生菌或活细菌)递送的更大抵抗力，这相当于一旦其通过口服途径施用后具有较高的胃耐受性和随时间的高稳定性(即长保质期，数量的长期稳定性)。
有利地，脂质涂层的晶体层状结构允许获得在胃耐受性和储存期间(保质期)对湿度和温度的耐受性方面具有更稳定的结构的涂层结构。
此外，脂质包被基质的晶体结构赋予递送活性成分(即益生菌或活细菌)更大的阻力，增强活性成分向肠道随着时间推移的延长递送。
在本文中，表达层状结构用于指示对应于片层中的分子结构的脂质的空间构型，其中脂质链或多或少垂直于片层平面。
在本文中，横向结构是指片层内分子的2D结构。
布拉格峰的存在表明长程层状顺序，它允许计算片层的间距(pitch)。
不同类型的横向组织可以在层状结构中共存，例如流体和晶体与一种或多种类型的填料。
有利地，根据本发明的方法允许获得具有拥有晶体结构的层状结构的脂质涂层结构。这反映在胃耐受性方面及对湿度和温度的耐受性方面更稳定的结构。
最后，本发明的方法优选使用包含减少量的如本发明所定义的脂质(优选植物来源的脂质)的包被基质，通过提供胃保护细菌和包含所述胃保护细菌的产品进行，这些产品在人类消费产品，特别是儿科产品的法规规定的限制范围内。
最后，本发明的细菌、组合物、混合物和方法易于制备且具有成本效益。
由于所附权利要求中要求保护的技术特征，通过本发明的细菌菌株、组合物和混合物实现了这些和其他目的，这些和其他目的将从下面的详细描述中变得更清楚。
附图
图1：X射线衍射分析示意图；
图2：测试样品的WAXS图像；
图3：测试样品的SAXS图像；
图4和5：测试样品的WAXS和SAXS分析模式图；
图6：“层状相”中脂质的空间构型示意图；
图7：具有流体或晶体结构的脂质片层的示意图；
图8-15：测试样品的SEM图像；具体而言，图8-9是样品1在不同放大倍率下的SEM图像。图10-11是样品4在不同放大倍率下的SEM图像。图12-13是样品5在不同放大倍率下的SEM图像。图14-15是样品6在不同放大倍率下的SEM图像。
图16：在受控的温度和湿度(30℃-75％RH)下测量植物油中的裸细菌菌株和植物油中的根据本发明的包被细菌菌株的活力，持续的时间范围为0至12个月；
图17：在受控的温度和湿度(40℃-75％RH)下测量植物油中的裸细菌菌株和植物油中的根据本发明的包被细菌菌株的活力，持续的时间范围为0至60天；
具体实施方式
形成本发明的一个目的是用具有晶体结构的包被基质进行胃保护的颗粒状细菌(简称，本发明的晶体胃保护的颗粒状细菌或本发明的细菌)，其中，所述细菌属于至少一种菌株或属于本发明所述属和种的细菌细胞菌株的混合物(益生菌或活细菌)，其中，所述包被基质包含本发明所述的至少一种脂质，优选植物来源的脂质，或由其组成，并且其中，所述至少一种脂质优选具有拥有晶体结构的层状构型，更优选多层晶体结构样层状构型。
此外，形成本发明的一个目的是用具有晶体结构的包被基质进行胃保护的颗粒状细菌，其中，所述包被基质包含至少一种脂质或由至少一种脂质组成，其中所述至少一种脂质具有拥有晶体结构的层状构型，优选为多层晶体结构样层状构型。
在本发明的上下文中，术语细菌、细菌菌株、细菌细胞和细菌菌株细胞是同义词并且可以互换使用。
在本发明的上下文中，术语胃保护的、包被的、覆盖的是同义词并且可互换使用。
这些术语表明细菌包被有覆盖物，其可以获得保护细菌菌株免受胃的酸性环境的影响。
所述至少一种脂质，优选植物来源的脂质，选自A组，该组包括以下各项或由以下各项组成：
-用饱和或不饱和脂肪酸(优选单不饱和脂肪酸)酯化、优选用饱和脂肪酸酯化的单-、二-或三-甘油(即甘油单酯、甘油二酯和/或甘油三酯)，更优选用碳原子数在C16-C18范围内的饱和脂肪酸酯化的单-和二-甘油，和/或用碳原子数在C16-C22范围内的饱和脂肪酸酯化的单-、二-或三-甘油；
-游离饱和脂肪酸；
-游离不饱和脂肪酸，优选单不饱和脂肪酸；
-用饱和或不饱和脂肪酸(优选单不饱和脂肪酸)酯化的一元醇，优选用饱和脂肪酸酯化；
-用饱和或不饱和脂肪酸(优选单不饱和脂肪酸)酯化的二元醇，优选用饱和脂肪酸酯化；
-蔗糖脂肪酸酯(或者称为蔗糖酯)，优选单-二-或三-蔗糖脂肪酸酯的混合物，更优选主要是硬脂酸和/或棕榈酸的蔗糖酯；
其中，所述饱和或不饱和脂肪酸，无论是游离的还是用甘油或一元醇或二元醇或蔗糖酯化的，具有C6至C32、优选C12至C28、更优选C14至C24范围内的碳原子数，例如C16、C18、C20和/或C22。
在本发明中，术语蔗糖脂肪酸酯或糖酯或蔗糖酯是同义词并且可以互换使用。所述蔗糖酯优选为单-、二-和/或三-脂肪酸酯的混合物，优选具有C6至C32、优选C12至C28、更优选C16至C18范围内的碳原子数的脂肪酸，如硬脂酸(C18H36OR2)和/或棕榈酸(C16H32OR2)。蔗糖酯由脂肪酸的酯化或由甲基脂肪酸酯与蔗糖的酯交换获得。蔗糖酯的化学物理性质取决于酯化脂肪酸的数量和类型。
在本发明的实施方式中，所述至少一种脂质是游离的饱和脂肪酸，优选为植物来源的，并且它选自熔点在35℃至85℃，优选45℃至70℃，更优选50℃至60℃范围的饱和脂肪酸。
在本发明的一个优选实施方式中，所述至少一种脂质选自B组(A组的亚组)，其包括以下各项或由以下各项组成：
-脂质(I)：二棕榈硬脂酸甘油酯E471，例如与以下相关：CAS号85251-77-0(或1323-83-7)、EINECS：286-490-9(或215-359-0)、REACh(EC)n°1907/2006：豁免(食品)，IUPAC名称“C16-C18单-、二-甘油酯”，INCI(PCPC)：二硬脂酸甘油酯；GattefosséSAS(E471)制造的商业产品Biogapress Vegetal BM297 ATO的实例；物理状态：粉末；熔点范围：53.00-58.00℃；沸点：>250.0℃；闪点：>200.0℃；点火温度(自燃)：>350.00℃；
-脂质(ii)：棕榈硬脂酸甘油酯E471/gras，例如与以下相关：CAS号85251-77-0(或31566-31-1或123-94-4)；EINECS：286-490-9(或250-705-4或204-664-4)；REACh(EC)n°1907/2006 01-2119495562-30-0014，IUPAC名称“C16-C18单-、二-甘油酯”，INCI(CTFA)：硬脂酸甘油酯；GattefosséSAS制造的商业产品GELEOL N MB的实例；物理状态：固体；闪点：>200.0℃DIN 51376；点火温度(自燃)：>350.00℃；蒸气压：20.00℃0.0100mbar(简称，脂质(ii))；
-脂质(iii)：二山嵛酸甘油酯E471/GRAS，与以下相关：CAS号77538-19-3(或91052-55-0)(或30233-64-8)(或94201-62-4)，EINECS：278-717-5(或293-216-1)(或250-097-0)(或303-650-6)，REACh(EC)n°1907/2006：豁免(食品)，IUPAC名称“C16-22单-、二-和三-甘油酯”，INCI(PCPC)：山嵛酸甘油酯；物理状态：粉末；闪点：>200.0℃；点火温度(自燃)：>350.00℃；蒸气压：20.00℃0.0100mbar；GattefosséSAS制造的商业产品COMPRITOL EATO或COMPRITOL E ATO FPF的实例；
-脂质(iv)：蔗糖脂肪酸酯E-473的蔗糖酯或混合物，其具有以下组成：相对于脂质(iv)的总重量的重量百分比，单酯、二酯和三酯不少于80.0％(其中：蔗糖单棕榈酸酯约55％，蔗糖二棕榈酸酯约20％，蔗糖单硬脂酸酯约13％，蔗糖二硬脂酸酯约5％，其他<10％)，游离糖不超过4.0％，游离脂肪酸不超过3％(其中：棕榈酸约75％，硬脂酸约20％，其他脂肪酸约5％)，脂肪酸/碳水化合物组成约1/1，优选约52/48；由日本三菱化学食品公司生产的商品Ryoto Sugar酯P-1570的实例；
-脂质(v)：蔗糖酯或蔗糖脂肪酸酯的混合物，具有以下组成：相对于脂质(v)总重量的重量百分比，单酯、二酯和三酯不少于80.0％(其中：蔗糖单硬脂酸酯约15％，蔗糖二硬脂酸酯约22％，蔗糖三硬脂酸酯约20％，蔗糖二棕榈酸酯约10％，蔗糖聚硬脂酸酯约30％，其他适量以达100％，分别用CAS号25168-73-4、27195-16-0、27923-63-3和25637-97-2，及EINECS：246-705-9、248-317-5、248-731-6和247-147-9鉴定)，游离糖不超过4.0％，游离脂肪酸不超过3％(其中：硬脂酸约90％，其他脂肪酸约10％)，脂肪酸/碳水化合物组成约60/40；以日本三菱化学食品株式会社制造的商品Ryoto Sugar Ester S-370为例，具有以下特性：物理状态：粉末；熔点：51℃(开始)至58℃和69℃(最高)(DSC)；分解点：238℃；点火温度(自燃)：约392℃/200℃(SETA)；比重：约0.46；或者
以日本三菱化学食品株式会社制造的商品SURFHOPE SE COSME C-1803为例，具有以下特性：物理状态：粉末；熔点：51℃(开始)至61℃(最高)(DSC)；分解点：260℃；点火温度(自燃)：约224℃；比重：约0.46；
-脂质(vi)：聚甘油-6-二硬脂酸酯(或六甘油二酯和硬脂酸)E475，用CAS号34424-97-0鉴定，INCI名称：聚甘油-6-二硬脂酸酯，分子式C54H106O15；由GattefosséSAS制造的商品Plurol
Figure BDA0003690664880000071
Stearique WL 1009的实例(简称，脂质(vi))；
及其混合物。
在替代实施方式中，所述脂质B组包含或由以下组成：所述脂质(i)、脂质(ii)、脂质(iii)、脂质(iv)和脂质(v)。
在本发明的一个优选实施方式中，所述至少一种脂质，优选植物来源的脂质，选自B1组(B组的亚组)，其包含或由以下组成：所述脂质(i)、所述脂质(ii)、所述脂质(iii)及其混合物。作为另一种选择，所述B1组包含或由以下组成：所述脂质(i)、所述脂质(iii)及其混合物；或者，所述组B1包含或由以下组成：所述脂质(ii)、所述脂质(iii)及其混合物。
在本发明的一个优选实施方式中，所述至少一种脂质，优选植物来源的脂质，选自B2组(B组的亚组)，其包含或由以下组成：所述脂质(iv)、所述脂质(v)及其混合物。
在本发明的实施方式中，所述至少一种脂质包含至少一种第一脂质，其中，所述第一脂质是用饱和或不饱和脂肪酸(例如单不饱和脂肪酸)、优选饱和脂肪酸酯化的单-、二-或三-甘油(即甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯)，更优选具有C6至C32，优选C14至C24，更优选C16、C18、C20和/或C22范围内的碳原子数的饱和脂肪酸；并且进一步包含至少一种第二脂质，其中，所述第二脂质是如本发明所定义的蔗糖脂肪酸酯(蔗糖酯)，优选单、二或三蔗糖脂肪酸酯的混合物；其中用甘油或用蔗糖酯化的所述脂肪酸的碳原子数在C6至C32、优选C14至C24、更优选C16、C18、C20和/或C22的范围内。
有利地，所述至少一种脂质包含至少一种选自所述B1组的第一脂质，所述B1组其包含或由以下组成：所述脂质(i)、所述脂质(ii)、所述脂质(iii)及其混合物；并且其进一步包含至少一种选自所述B2组的第二脂质，所述B2组其包含或由以下组成：所述脂质(iv)、所述脂质(v)及其混合物。例如，所述脂质包括以下脂质：(i)和(iv)或(i)和(v)或(ii)和(iv)或(ii)和(v)或(iii)和(iv)或(iii)和(v)或(i)和(ii)和(iv)或(i)和(ii)和(v)或(i)和(iii)和(iv)或(i)和(iii)和(v)或(ii)和(iii)和(iv)或(ii)和(iii)和(v)或(i)和(iv)和(v)或(ii)和(iv)和(v)或(iii)和(iv)和(v)。
词首E471、E473和E476表示各甘油酯或蔗糖酯是欧盟立法允许并受意大利部长法令(D.M.1996)监管的食品添加剂。
应当理解的是，包含在包被基质中的优选植物来源的所述脂质将根据本发明的细菌或组合物的预期用途、可选地包含在包被基质中的其他组分和可选地包含在本发明的组合物中的添加剂和/或赋形剂的化学-物理性质、本发明的组合物的物理状态而选择。
有利地，根据本发明的用具有晶体结构的包被基质进行胃保护的颗粒状细菌包含以下组成或由以下组成：相对于胃保护颗粒状细菌的总重量，(a)重量百分比在60至90％的范围内的细菌(细菌本身或裸露的或未包被的)和(b)根据本说明书中报道的各种实施方式，重量百分比在10至40％的范围内的所述包被基质，其包含所述至少一种脂质，或者由所述至少一种脂质组成(根据本发明报道的实施例的A组脂质，优选B组脂质，更优选B1组脂质或与B2组脂质结合的B1组脂质)；优选细菌为65％至85％，包被基质为15％至35％；更优选细菌为70％至80％，包被基质为20％至30％。
本发明的细菌主题，如本发明的细菌、包含在本发明的组合物中的本发明的细菌和通过本发明的方法获得的本发明的细菌，包含或由以下组成：至少一种细菌细胞菌株或不同细菌细胞菌株的混合物。所述至少一种菌株或细菌细胞菌株的混合物属于一种或多种选自包含或由以下组成的科：厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actibacteria,)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)及其混合物。所述至少一种菌株或细菌细胞菌株的混合物属于一种或多种包含或由以下组成的属：乳杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、链球菌属(Streptococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、阿克曼氏菌属(Akkermansia)、肠单胞菌属(Intestinimonas)、真杆菌属(Eubacterium)、粪杆菌属(Faecalibacterium)、奈瑟菌属(Neisseria)、罗氏菌属(Roseburia)、丙酸杆菌属(Cutibacterium)及其混合物。所述至少一种菌株或细菌细胞菌株的混合物属于一种或多种包含或由以下组成的种：嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、唾液乳杆菌唾液亚种(Lactobacillus salivarius subsp.salivarius)、卷曲乳杆菌(Lactobacilluscrispatus)、副干酪乳杆菌副干酪亚种(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)、德氏乳杆菌德氏亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.delbrueckii)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacteriumanimalis subsp.lactis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、链状双歧杆菌(Bifobacterium catenulatum)、假链状双歧杆菌(Bifobacterium pseudocatenulatum)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、阿克曼氏菌(Akkermansia munichipila)、产丁酸肠杆菌(Intestinimonas butyriciproducens)、霍式真杆菌(Eubacterium halli)、普氏栖粪杆菌(Faecalobacterium prausnitzii)、乳酸奈瑟菌(Neisseria lactamica)、人罗氏菌(Roseburia hominis)、痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes)及其混合物。
如本发明所述，本发明的晶体胃保护颗粒状细菌可以包含或由如本发明所述的单一细菌菌株或属于相同种或不同种和/或属的细菌菌株的混合物组成；特别是，它可以是2、3、4、5或6种不同细菌菌株的混合物。
本发明的晶体胃保护颗粒状细菌可包含低百分比的未被所述包被基质包被的细菌。
本发明的晶体胃保护颗粒状细菌优选为固体形式，特别是颗粒、粉末、干粉或冷冻干粉的形式。
形成本发明的一个目的是一种组合物(简称，本发明的组合物)，其包含一种混合物，该混合物包含或由根据本发明的任一实施方式的用具有晶体结构的包被基质进行胃保护的颗粒状细菌组成，和可选地，所述组合物包含至少一种食品级或药物或化妆品添加剂和/或赋形剂。
本发明的组合物可以是药物组合物(活生物治疗产品，Live BiotherapeuticProducts，LBP)或医疗器械组合物或化妆品用途组合物、膳食补充剂或食品(益生菌产品)或特殊医学用途食品(FSMP)或新食品。
有利地，本发明的组合物包含浓度范围为1x106AFU/g至1x1014AFU/g，优选1x107AFU/g至1x1013AFU/g，更优选1x108AFU/g至1x1012AFU/g的本发明的所述细菌，其中AFU/g(AFU；活性荧光单位)是使用本发明定义的流式细胞术方法测量的，它是指在一克组合物中具有完整细胞膜的细菌。
本发明的组合物可选地包含所述至少一种药物或食品或化妆品级添加剂和/或赋形剂，即适用于药物或食品或化妆品用途的缺乏治疗活性的物质。在本发明的上下文中，药物或食品或化妆品用途可接受的添加剂和/或赋形剂包括本领域技术人员已知的用于制备固体、半固体或液体形式的组合物的所有辅助物质，诸如，稀释剂、溶剂(包括水、甘油、乙醇)、增溶剂、酸化剂、增稠剂、甜味剂、增味剂、着色剂、润滑剂、表面活性剂、防腐剂、pH稳定缓冲剂及其混合物。
包含本发明所述的各种实施方式中的本发明的晶体胃保护颗粒状细菌的本发明的组合物可以是药物组合物、或医疗器械组合物、或用于美容用途的组合物、或膳食补充剂组合物或食品组合物或用于特殊医学目的的食品(FSMP)，所有这些组合物出于简洁起见称为“本发明的组合物”。
在本发明的上下文中，表述“医疗器械”的含义根据日期为1997年2月24日的意大利第46号法令或根据新的医疗器械法规(EU)2017/745(MDR)使用。
本发明的组合物可以是固体形式，如可咀嚼的固体、颗粒、薄片或粉末，半固体形式，如软凝胶，或液体形式，如溶液、水性或水醇或油性悬浮液，分散体、乳液或糖浆。
例如，本发明的组合物可以是在油相，优选植物油中用根据本发明的晶体形式的包被基质进行胃保护的所述颗粒状细菌的悬浮液。
优选地，本发明的组合物被配制用于口服。
形成本发明的一个目的是根据制备本发明任一实施方式的用具有晶体结构的包被基质进行胃保护的颗粒状细菌的方法(简称本发明的方法)，其包括以下步骤：
(I)对至少一种菌株或细菌细胞菌株的混合物(活细菌本身或裸露或未包被)进行制粒，优选冻干形式的细菌，属于本说明书中定义的细菌物种，筛孔范围为50μm至900μm，以获得颗粒状细菌；
(II)用包含至少一种脂质(优选植物来源的脂质)的包被基质包被所述颗粒状细菌，其中，所述至少一种脂质选自根据本发明报道的实施例的A组脂质，优选B组脂质，更优选B1组脂质或与B2组脂质结合的B1组脂质，以获得胃保护颗粒状细菌本身；和
(III)将所述胃保护颗粒状细菌本身在20℃至60℃范围内的温度调整(或熟化)，持续48小时至96小时范围内的时间段，以获得用具有晶体结构的包被基质进行胃保护的颗粒状细菌，其中，所述至少一种脂质优选在所述调整步骤(III)之后采用具有晶体结构的层状构型，更优选多层晶体结构样层状构型。
在一个实施方式中，包括步骤(I)-(III)的本发明的方法进一步在步骤(III)之后包括用分析方法，优选如下文所述的流式细胞术方法对用从步骤(III)获得的用具有晶体结构的包被基质进行胃保护的颗粒状细菌的样品进行细菌计数的步骤(IV)，这允许检测具有完整(因此是活的)细胞膜的细菌细胞的数量。
优选地，在包括步骤(I)至(III)和可选地步骤(VI)的本发明方法中，在步骤(I)中，细菌用100μm至600μm，优选150μm至500μm，更优选180μm或450μm范围内的筛孔制粒。
优选地，在包括步骤(I)至(III)和可选地步骤(VI)的本发明方法中，在步骤(II)中，所述颗粒状细菌和所述包被基质以6:4至9:1，优选6.5:3.5至8.5:1.5，更优选7:3至8:2范围内的重量比进行处理。
优选地，在包括步骤(I)至(III)和可选地步骤(VI)的本发明方法中，在步骤(III)中，所述胃保护颗粒状细菌本身在30℃至40℃，优选在约35±1℃的温度范围内调整。
在本发明方法的一个实施方式中，在步骤(I)中，所述细菌用在100μm至600μm、优选150μm至500μm、更优选180μm或450μm范围内的筛孔制粒；在步骤(ii)中，所述颗粒状细菌和所述包被基质以6:4至9:1、优选6.5:3.5至8.5:1.5，更优选7:3至8:2的重量比进行处理，优选其中所述包被基质包含根据本发明报道的实施例的至少一种A组脂质，优选至少一种B组脂质，更优选至少一种B1组脂质或与至少一种B2组脂质结合的至少一种B1组脂质；在步骤(III)中，将所述微囊化细菌在30℃至40℃，优选在约35±1℃的温度范围内调整60小时至84小时，优选72小时；并且，可选地，在步骤(IV)中，使用流式细胞荧光法进行细菌计数。
在本发明方法的一个优选实施方式中，在步骤(I)中，将所述细菌用180μm或450μm的筛孔制粒；在步骤(II)中，所述颗粒状细菌和所述包被基质以7:3至8:2的重量比进行处理，优选其中所述包被基质包含根据本发明报道的实施例的至少一种A组脂质，优选至少一种B组脂质，更优选至少一种B1组脂质或与至少一种B2组脂质结合的至少一种B1组脂质；在步骤(III)中，将所述微囊化细菌在约35±1℃的温度下调整约72小时的时间；并且，可选地，在步骤(IV)中，使用流式细胞荧光法进行细菌计数。
用包含至少一种脂质(优选植物来源的脂质)的包被基质包被所述颗粒状细菌的所述步骤(II)，其中所述至少一种脂质选自根据本发明报道的实施例的A组脂质，优选B组脂质，更优选B1组脂质或与B2组脂质结合的B1组脂质以获得胃保护的颗粒状细菌本身，可根据本领域技术人员已知的技术进行，如喷涂技术(将包被基质喷涂在颗粒状细菌上)。
在本发明方法的一个优选实施方式中，在步骤(II)中，在具有细菌的流化床室(顶部喷雾或底部喷雾)中，在40℃至60℃，更优选40℃至50℃的温度范围内，用包被基质包被所述颗粒状细菌：包被基质比率范围为6.5:3.5至8.5:1.5，更优选7:3至8:2；其中，所述包被基质包含或由根据本发明报道的实施例的至少一种A组脂质、优选至少一种B组脂质、更优选至少一种B1组脂质或与至少一种B2组脂质结合的至少一种B1组脂质组成，如本发明所定义。
在本发明方法的一个优选实施方式中，在步骤(III)中，所述胃保护颗粒状细菌本身根据本领域技术人员已知的程序进行调整。
在对包被有脂质基质的颗粒状细菌进行调整(也称为脂肪熟化)的步骤之后，脂质呈现与片层(脂质片层)中的分子结构相对应的空间构型，其中脂质链或多或少垂直于片层平面，如图6所示。当脂质呈现所述空间构型时，它们被定义为“层状相”脂质。在片层中可以有流体(没有规则结构)或晶体(堆积型结构)结构，如图7所示。此外，脂质片层可以呈现形成脂质多层的片层的堆叠结构。
包括所述调整(或脂肪熟化)的步骤(III)的本发明的方法导致片层中脂质包被基质的构型具有结晶结构，其中所述片层优选堆叠以形成结晶脂质多层，并且因此，制备了本发明的用结晶形式的脂质包被基质进行胃保护的颗粒状细菌。
优选在本发明方法的步骤(IV)中用于检测具有完整(活)细胞膜的细菌细胞的量的流式细胞术分析方法是专利申请IT 102019000006056第33页第24行至第35页第17行中描述的分析方法。简而言之，所述流式细胞仪分析方法包括以下步骤：
-(VI.I)使从步骤(III)获得的具有拥有晶体结构的包被基质的胃保护颗粒状细菌的样品(简称，本发明的细菌样品)或包含从步骤(III)获得的本发明的细菌的本发明的组合物的样品(简称本发明组合物的样品)与两种不同的荧光染料接触，从而获得本发明的胃保护细菌或组合物的荧光样品；然后
(VI.II)通过流式细胞术检测本发明的胃保护细菌或组合物的荧光样品中完整的(并因此存活的)细胞膜的量。
特别是，在流式细胞术方法中，根据ISO 19344:2015(E)标准建立的方法，通过提供本发明的胃保护细菌或组合物的荧光样品的总荧光单位或细胞(TFU)，通过细胞膜的第一可渗透染料(优选：噻唑橙或SYTO
Figure BDA0003690664880000131
24-一种绿色光谱荧光染料)能够穿透所有细菌细胞。第二染料(优选：碘化丙啶)仅能够渗透到具有受损细胞膜的细菌细胞中，提供本发明的胃保护细菌或组合物的荧光样品的非活性或无活性荧光单位或细胞(nAFU)。
因此，具有完整细胞膜的活细菌细胞的量可以表示为活性荧光单位或细胞(AFU)，即在荧光分析中仅对第一染料呈阳性的单位(优选：噻唑橙或SYTO
Figure BDA0003690664880000132
24)，对其适用以下相关性：TFU＝AFU+nAFU，其中
-TFUs是总荧光细菌单位或细胞；
-nAFU是非活性荧光细菌单位或细胞，其具有非完整或受损的细胞膜(即对第二染料呈阳性的单位，优选碘化丙锭)。
根据一个实施方式，流式细胞仪被配置和/或校准以对所分析的包含本发明的细菌的样品进行体积测定，并直接计算细胞浓度(AFU和TFU)。
有利地，为了获得本发明的胃保护细菌或组合物的荧光样品中的AFU和TFU值，流式细胞荧光计使用添加到本发明的胃保护细菌或组合物的荧光样品中的至少一种内部荧光标准。在一个优选的实施方式中，内部荧光标准是荧光球或珠的形式，并且它以已知浓度添加到待分析的本发明细菌或本发明组合物的每个样品中。因此，所分析的本发明的胃保护细菌或组合物的荧光样品的AFU和TFU的w值可以相对于已知标准量成比例地计算。
形成本发明的一个目的是本发明的晶体胃保护颗粒状细菌或本发明的组合物，其用作有需要的受试者的药物。
本发明涉及一种用于预防或治疗或医学治疗的方法，其包括将有效量的本发明的晶体胃保护颗粒状细菌或本发明的组合物施用于有需要的受试者。
形成本发明的一个目的是本发明的细菌或本发明的组合物的化妆品用途。
在本发明的上下文中，表述“受试者”用于表示人类受试者或动物受试者(例如宠物，如狗或猫或其他哺乳动物)。优选地，本发明的组合物用于人类受试者的治疗方法。
除非另有说明，表述组合物包含“在从x至y的范围内”的量的组分用于指示所述组分可以以存在于所述范围内的所有量存在于组合物中，即使未指定，包括范围的极端。
除非另有说明，否则本发明的胃保护的晶体颗粒状细菌或本发明的组合物的表述包含％的组分，所述％是相对于胃保护的晶体颗粒状细菌或组合物的总重量的重量％。
此外，以下实施方式(FRan)是本发明的目的。
FRa1.用具有晶体结构的包被基质进行胃保护的颗粒状细菌，其中，所述包被基质包含至少一种脂质或由至少一种脂质组成，其中，所述至少一种脂质具有拥有晶体结构的层状构型，优选多层晶体结构样层状构型。
FRa2.如FRa 1所述的细菌，其中，所述至少一种脂质选自包含以下或由以下组成的组：
-用饱和或不饱和脂肪酸，优选饱和脂肪酸酯化的单-、二-或三-甘油；
-游离饱和脂肪酸；
-游离不饱和脂肪酸，优选单不饱和脂肪酸；
-用饱和或不饱和脂肪酸，优选饱和脂肪酸酯化的一元醇；
-用饱和或不饱和脂肪酸，优选饱和脂肪酸酯化的二元醇；
-蔗糖脂肪酸酯(蔗糖酯)，优选单-二-和/或三-蔗糖脂肪酸酯的混合物；
其中，游离的或用甘油或一元醇或二醇或蔗糖酯化的所述饱和或不饱和脂肪酸具有C6至C32、优选C14至C24、更优选C16、C18和/或C22范围内的碳原子数。
FRa 3.如FRa 2所述的细菌，其中，所述至少一种脂质，优选植物来源的脂质，包含：
-至少一种第一脂质，其中，所述第一脂质是用饱和或不饱和脂肪酸，优选饱和脂肪酸酯化的单-、二-或三-甘油；和
-至少一种第二脂质，其中，所述第二脂质是蔗糖脂肪酸酯(蔗糖酯)，优选单-二-和/或三-蔗糖脂肪酸酯的混合物；
其中，所述用甘油或用蔗糖酯化的脂肪酸具有C6至C32、优选C14至C24、更优选C16、C18、C20和/或C22范围内的碳原子数。
FRa 4.如权利要求1至3中任一项所述的细菌，其中，
-所包含的细菌本身的重量百分比在60％至90％的范围内，并且
-相对于胃保护颗粒状细菌的总重量，所包括的包含至少一种脂质或由至少一种脂质组成的包被基质的重量百分比在10％至40％的范围内；优选细菌本身为65％至85％，包被基质为15％至35％；更优选细菌本身为70％至80％，包被基质为20％至30％。
FRa 5.一种组合物，其包含含有FRa 1至4中任一项所述的细菌或其组成的混合物，并且可选地，所述组合物包含至少一种食品级或药物或化妆品添加剂和/或赋形剂。
FRa 6.如FRa 5所述的组合物，其中，所包含的权利要求1至5中任一项所述的细菌的浓度在1x106AFU/g至1x1014AFU/g，优选1x107AFU/g至1x1013AFU/g，更优选1x108AFU/g至1x1012AFU/g的范围内，其中AFU/g是指在一克组合物中具有完整的细胞膜的活细胞。
FRa 7.如FRa 1至4中任一项所述的细菌的制备方法，其包括以下步骤：
(I)用具有50微米至900微米范围的筛孔对至少一种细菌细胞菌株制粒以获得颗粒状细菌；
(II)用权利要求3或4所述的包含优选植物来源的至少一种脂质的包被基质包被所述颗粒状细菌，以获得胃保护颗粒状细菌本身；和
(III)在25℃至60℃的温度范围内将所述胃保护颗粒状细菌本身调整48小时至96小时的时间段，以获得用具有晶体结构的包被基质进行胃保护的颗粒状细菌；优选地，其中，所述至少一种脂质在所述调整步骤(III)之后呈现具有晶体结构的层状构型。
FRa 8.如FRa 7所述的方法，其中，所述方法在所述步骤(III)之后进一步包括步骤(IV)，所述步骤(IV)使用分析方法对由步骤(III)获得的用具有晶体结构的包被基质进行胃保护的颗粒状细菌的样品进行细菌计数，其中所述分析方法允许检测具有完整细胞膜的细菌细胞的量；优选地，所述分析方法为流式细胞术。
FRa 9.如FRa 7或8所述的方法，其中，在步骤(I)中，用在100微米至600微米、优选150微米至500微米、更优选180微米或450微米范围内的筛孔对所述细菌进行制粒；其中，在步骤(II)中，优选在流化床室中进行，所述颗粒状细菌和所述包被基质以6:4至9:1，优选6.5:3.5至8.5:1.5，更优选7:3至8:2范围内的重量比进行处理；并且其中，在步骤(III)中，将所述胃保护颗粒状细菌本身在30℃至40℃，优选约35+1℃的温度范围内调整60小时至84小时，优选约72小时的时间段。
FRa 10.用具有晶体结构的包被基质进行胃保护的颗粒状细菌，其能够用如FRa7-9所述的方法获得。
此外，以下实施方式(FRbn)是本发明的目的。
FRb1.用具有晶体结构的包被基质进行胃保护的颗粒状细菌，其中，所述包被基质包含至少一种脂质或由至少一种脂质组成，其中，所述至少一种脂质具有拥有晶体结构的层状构型，优选多层晶体结构样层状构型。
FRb 2.如FRb 1所述的细菌，其中，所述至少一种脂质选自包含以下或由以下组成的组：
-用饱和或不饱和脂肪酸，优选饱和脂肪酸酯化的单-、二-或三-甘油；
-游离饱和脂肪酸；
-游离不饱和脂肪酸，优选单不饱和脂肪酸；
-用饱和或不饱和脂肪酸，优选饱和脂肪酸酯化的一元醇；
-用饱和或不饱和脂肪酸，优选饱和脂肪酸酯化的二元醇；
-蔗糖脂肪酸酯(蔗糖酯)，优选单-二-和/或三-蔗糖脂肪酸酯的混合物；
其中，游离的或用甘油或一元醇或二醇或蔗糖酯化的所述饱和或不饱和脂肪酸具有C6至C32、优选C14至C24、更优选C16、C18和/或C22范围内的碳原子数。
FRb 3.如FRb 2所述的细菌，其中，所述至少一种脂质，优选植物来源的脂质，包含：
-至少一种第一脂质，其中，所述第一脂质是用饱和或不饱和脂肪酸，优选饱和脂肪酸酯化的单-、二-或三-甘油；和
-至少一种第二脂质，其中，所述第二脂质是蔗糖脂肪酸酯(蔗糖酯)，优选单-二-和/或三-蔗糖脂肪酸酯的混合物；
其中，所述用甘油或用蔗糖酯化的脂肪酸具有C6至C32、优选C14至C24、更优选C16、C18、C20和/或C22范围内的碳原子数。
FRb 4.如FRb 1至3中任一项所述的细菌，其中
-所包含的细菌本身的重量百分比在60％至90％的范围内，并且
-相对于胃保护颗粒状细菌的总重量，所包括的包含至少一种脂质或由至少一种脂质组成的包被基质的重量百分比在10％至40％的范围内；优选细菌本身为65％至85％，包被基质为15％至35％；更优选细菌本身为70％至80％，包被基质为20％至30％。
FRb 5.一种组合物，其包含含有FRb 1至4中任一项所述的细菌或由其组成的混合物，并且可选地，所述组合物包含至少一种食品级或药物或化妆品添加剂和/或赋形剂。
FRb 6.如FRb 5所述的组合物，其中，所包含的权利要求1至5中任一项所述的细菌的浓度在1x106AFU/g至1x1014AFU/g，优选1x107AFU/g至1x1013AFU/g，更优选1x108AFU/g至1x1012AFU/g的范围内，其中AFU/g是指在一克组合物中具有完整的细胞膜的活细胞。
FRb 7.如FRb 1至4中任一项所述的细菌的制备方法，其包括以下步骤：
(I)用具有50微米至900微米范围的筛孔对至少一种细菌细胞菌株制粒以获得颗粒状细菌；
(II)用权利要求3或4所述的包含优选植物来源的至少一种脂质的包被基质包被所述颗粒状细菌，以获得胃保护颗粒状细菌本身；和
(III)在25℃至60℃的温度范围内将所述胃保护颗粒状细菌本身调整48小时至96小时的时间段，以获得用具有晶体结构的包被基质进行胃保护的颗粒状细菌；优选地，其中，所述至少一种脂质在所述调整步骤(III)之后呈现具有晶体结构的层状构型。
FRb 8.如FRb 7所述的方法，其中，所述方法在所述步骤(III)之后进一步包括步骤(IV)，所述步骤(IV)使用分析方法对由步骤(III)获得的用具有晶体结构的包被基质进行胃保护的颗粒状细菌的样品进行细菌计数，其中，所述分析方法允许检测具有完整细胞膜的细菌细胞的量；优选地，所述分析方法为流式细胞术。
FRb 9.如FRb 7或8所述的方法，其中，在步骤(I)中，用在100微米至600微米、优选150微米至500微米、更优选180微米或450微米范围内的筛孔对所述细菌进行制粒；其中，在步骤(II)中，优选在流化床室中进行，所述颗粒状细菌和所述包被基质以6:4至9:1，优选6.5:3.5至8.5:1.5，更优选7:3至8:2范围内的重量比进行处理；并且其中，在步骤(III)中，将所述胃保护颗粒状细菌本身在30℃至40℃，优选约35+1℃的温度范围内调整60小时至84小时，优选约72小时的时间段。
FRb 10.用具有晶体结构的包被基质进行胃保护的颗粒状细菌，其能够用FRb7-9所述的方法获得。
实验部分1
下面报告的研究(试验B和C)旨在查看所分析样品涂层的形态，并将它们与其晶体结构进行比较。此外，研究A旨在分析所分析样品中包含的细菌菌株的活力。
材料和方法
所分析的样品
-样品0(WBR05018)：冻干的菌株，未制粒、未包被且未调整。
-样品1：GG 107-18(450μm，裸露的)菌株，制粒至450微米；未包被；未调整。
-样品2：GG107-18(180μm，裸露的)菌株，制粒至180微米；未包被；未调整。
-样品3：MCPM-P1(450μm，包被的)菌株，制粒至450微米；用包被基质包被，所述包被基质包含脂质(i)Gattefossé SAS E471制造的Biogapress Vegetal BM297ATO(简称，Biogapress Vegetal E471)；包被方法：在50℃流化床室，以80％菌株\20％BiogaressVegetal E471比率；未调整，在-20℃储存。
-样品4：MCPM-P2(180μm，包被的)菌株，制粒至180微米；用包被基质包被，所述包被基质包含脂质(i)Biogapress Vegetal E471，在50℃流化床室，以80％菌株\20％Biogaress Vegetal E471比率；未调整，在-20℃储存。
-样品5：MCPM-P1/20(450μm，包被+35℃熟化，72h)菌株，制粒至450微米；用包被基质包被，所述包被基质包含脂质(i)Biogapress Vegetal E471，在50℃流化床室，以80％菌株\20％Biogaress Vegetal E471比率；在35℃调整72小时，在-20℃储存.
-样品6：MCPM-P2/20(180μm，包被+35℃熟化，72h)菌株，制粒至180微米；用包被基质包被，所述包被基质包含脂质(i)Biogapress Vegetal E471，在50℃流化床室，以80％菌株\20％Biogaress Vegetal E471比率；在35℃调整72小时，在-20℃储存。
样品0-6以粉末形式。
用于样品0和1-6的细菌菌株：鼠李糖乳杆菌GG ATCC 53103。
制粒尺寸由制粒机目数限定，在实施例中分别评估了180μm或450μm的颗粒
分析方法
(A)流式细胞术分析方法。
根据ISO 19344:2015(E)标准建立的方法使用的流式细胞术分析方法。所述方法在时间t0应用于样品1-6，即在其制备之后和将其提交给电子显微镜(SEM)和X射线衍射分析之前(参见段落(B)和(C))。
TFU是总细菌单位或细胞；
AFU是具有完整(或活)细胞膜的细菌单位或细胞。
样品储存在-20℃(标准储存)。
(B)X射线衍射分析(图1)。
使用的分析方法：X射线衍射来表征脂质的晶体结构。
所述方法应用于样品1、4、5和6。
样品的制备：将粉末形式的样品引入直径为1mm的玻璃毛细管中。
衍射：
-透射设置
-Beamline PROXIMA 2al sincrotrone SOLEIL(法国)
-波长：
Figure BDA0003690664880000191
，
-样品检测器距离：400mm
-2D DECTRIS(像素75x75μm2)检测器
-T＝22℃，HR 40％
分析：使用ESIT FIT2D软件分析X射线图谱并相互比较。
本报告中显示的强度分布对应于在180°处积分的角度分布。
衍射设置允许收集SAXS和WAXS衍射图谱。
SAXS图谱提供有关脂质片层的堆叠结构(网状距离、晶体尺寸)的信息并且
WAXS模式提供脂质层内的横向顺序信息。
(C)电子显微镜(SEM)
采用的分析方法：SEM FEG(低压EM)观察涂层表面以评价涂层质量。
所述方法应用于样品1、4、5和6。
样品的制备：将粉末沉积在固定在介质上的碳粘合剂上。
注意不要压碎粉末并且不要使沉积物过载。
图像采集：在SUPE 55VP di ZEISS电子显微镜上进行观察。
选择1.20kV电压以获得在电子束下的产品强度、表面电荷和稳定性之间的最佳折衷。
采集具有不同放大倍率(x200、x500、x1500、x3000和x8000)的图像，以覆盖广阔的视野并查看高分辨率细节。
结果
(A)流式细胞术分析方法
从样品1-6的流式细胞术中的细菌计数观察到(表1)：
-样品1-6是同质的，因为识别总细胞计数的TFU数据对于样品1-3-5(450μm颗粒)和2-4-6(180μm颗粒)保持不变，这意味着观察(B)和(C)的分析是一致的；
-没有推断在AFU(活细胞/完整细胞计数)中评估的过程死亡率，因为从两种不同粒度(样品1和2)的裸细菌菌株开始，AFU数据在用脂质基质包被(样品3和4)和调整(样品5和6)的过程中实际上保持不变。
表1
Figure BDA0003690664880000211
*35℃持续72小时
(B)X射线衍射分析。
(C.I)样品1(图2-5)。
样品1(非颗粒、未包被的冻干细菌细胞)是完全无定形的(没有明显的衍射特性)。
(C.ii)样品4、5和6(图2-5)。
样品4、5和6的特征在于SAXS和WAXS区域中的一系列特征衍射。
需要注意的是，样品5和6的信号在位置和强度上几乎相同。
·WAXS区域(图4)
所有样品4、5和6均在
Figure BDA0003690664880000222
(脂质的六角形堆积)处显示一个峰。
对于样品5和6，在
Figure BDA0003690664880000223
附近也观察到了几个WAXS峰，这意味着六角网的其他层内网共存于脂质层中。
·SAXS区域(图5)
样品5和6在
Figure BDA0003690664880000224
(及其谐波(harmonics))处显示了一个尖峰，而样品4在
Figure BDA0003690664880000225
(及其谐波)处显示了一个尖峰。
这些峰的位置与脂质片层堆叠的网状距离有关。
样品1、4、5、6的晶体特性比较显示在表2中：
表2
Figure BDA0003690664880000221
综上所述：
-样品1是纯无定形的，没有任何层状有序的痕迹；
-所有样品4、5和6仅显示一个层状系统。网状距离从一个样本到另一个样本略有变化；
-在所有样品4、5和6中都存在具有六角形横向顺序的系统；
-在样品5和6中也可检测到第二横向系统；
-样品5和6具有相同的晶体结构。
除了完全无定形的样品1(没有明显的衍射特性)外，所有其他样品的特征都是具有“层状相”的典型脂质衍射图案。
“层状相”是脂质的空间构型，对应于片层中的分子结构，其中脂质链或多或少垂直于片层平面，如图6所示。
总结：
-样品1：WAXS和SAXS数据显示没有涂层；
-样品4：WAXS和SAXS数据证实存在非多层涂层；
-样品5和6：WAXS和SAXS数据证实存在多层涂层。
(C)电子显微镜(SEM)
-样品1
样品1显示了典型尺寸为数百微米的大型不规则形状结构(图8)。这些结构相互连接并形成更大的三维物体(可达毫米)。低放大率表面具有凸起和粗糙度，但总体上是光滑的。
在更大的放大倍率下(图9)，样品1的表面显示条纹或几何图案，有时显得更颗粒状。可以注意到，通过形成非常窄的地毯，可以经常观察到杆状细菌(大小约为0.5x2微米)。
由细胞壁赋予的细菌形式可能是由于三种基本类型：球菌或球形、杆菌：杆菌形式的细胞轴比其他形式更长。
-样品4(MCPM-P2)
样品4显示了小颗粒、形状不规则的大颗粒和扁平颗粒的混合物(图10)。在高放大倍率样品4中，没有清楚地观察到细菌(图11)。
-样品5(MCPM-P1/20)
样品5显示了较大的扁平颗粒(几十或几百微米)和较小的球形或不规则形状的颗粒(从几微米到几十微米)的混合物。它们的表面略微粗糙并显示出粗糙度(图12)。在高放大倍率下(图13)，细菌在局部略微可见。表面非常光滑，带有某些粗糙度和颗粒。
-样品6(MCPM-P2/20)
样品6显示了小颗粒、形状不规则的较大颗粒和扁平颗粒的混合物(图14)。在高放大倍率下(图15)，表面非常光滑，但可以看到某些颗粒，并且可以略微看到细菌。
样品1、4、5、6在电镜下的特性对比如表3所示：
表3
表3是正确的，数据是从两个报告中获得的，因此不必重复。
Figure BDA0003690664880000241
总结：
-样品1和2：细菌菌株在电子显微镜下清晰可见；
-样品3、4、5和6：光场中微生物的消失\减少。在这些样品中没有观察到裸露的样品，这表明有效的微囊化。
结果讨论
1)非颗粒化冻干细菌菌株(对照空白)通过电子显微镜(SEM)可清晰区分；此外，X射线衍射分析未显示任何涂层。
2)将冻干的裸菌株用180μm和450μm的两种不同筛孔制粒，用Biogapress VegetalE471包被，并可选地进行调整以获得样品4(未调整)或样品5和6(调整)。
电子显微镜(SEM)显示细菌菌株在样品4和样品5和6中都被包被。
X射线衍射分析(WAXS和SAXS)显示，在样品5和6中存在结晶多层，而样品4中不存在这种结晶多层，因为考虑到相同的工艺，没有进行调整步骤。
最后，通过流式细胞术分析，观察到样品5和6的细菌菌株经受根据本发明的制粒、包被和调整步骤的过程中没有死亡。
因此，通过根据本发明的方法，可以用脂质基质有效地包被颗粒状细菌菌株，并且通过调整过程获得良好的结晶(横向多层的发展)，同时在本发明的制粒、包被和调整过程前后，维持活菌菌株浓度不变或几乎不变。
实验部分2
下面报道的研究(研究D)比较了在受控湿度下加热后，裸细菌菌株及其相应的根据本发明的用晶体形式的包被基质进行胃保护的细菌菌株的细菌活力(细菌负荷)。
试验D材料与方法
分析的样品
-样品7：裸细菌菌株鼠李糖乳杆菌GG ATCC 53103(未包被和未调整的)；简称，裸露未包被的细菌菌株。
-样品8：根据本发明的用结晶形式的包被基质进行胃保护的细菌菌株鼠李糖乳杆菌GG ATCC 53103(包被和调整的)：所述包被基质包含脂质(i)Biogaress Vegetal E471；例如：在50℃流化床室上包被，以80％菌株\20％Biogaress Vegetal E471比率；在35℃调整72小时；简称，包被的细菌菌株。
方法学
试验D是通过将样品7和8(裸露和包被的细菌菌株)加入植物油中以在油中形成细菌悬浮液来进行的。植物油中的所述细菌悬浮液经受两种不同的温度和受控湿度(RH：相对湿度)，例如：分别为：30℃-75％RH(图16)和40℃-75％RH(图17)，时间范围为0至12个月和0至60天。在所述时间范围内，测量了两个样品(样品7和8)的细菌菌株的活力。
分析方法
通过细胞计数法(数据以AFU表示)评估细菌菌株的活力(细菌负荷)。
根据ISO 19344:2015(E)标准建立的方法使用的流式细胞术分析方法。
AFU是具有完整(或活)细胞膜的细菌单位或细胞。
结果
如图16和17所示，在40℃在60天和30℃在12个月时，包被细菌菌株的负荷相对于裸细菌菌株的对数更大。因此，考虑到相同的温度和湿度，显然根据本发明的具有晶体形式的包被基质的胃保护细菌菌株比裸细菌菌株具有更强的抗性。

Claims (10)

1.用具有晶体结构的包被基质进行胃保护的颗粒状细菌，其中，所述包被基质包含至少一种脂质或由至少一种脂质组成，其中，所述至少一种脂质具有拥有晶体结构的层状构型，优选多层晶体结构样层状构型。
2.如权利要求1所述的细菌，其中，所述至少一种脂质选自包含以下或由以下组成的组：
-用饱和或不饱和脂肪酸，优选饱和脂肪酸酯化的单-、二-或三-甘油；
-游离饱和脂肪酸；
-游离不饱和脂肪酸，优选单不饱和脂肪酸；
-用饱和或不饱和脂肪酸，优选饱和脂肪酸酯化的一元醇；
-用饱和或不饱和脂肪酸，优选饱和脂肪酸酯化的二元醇；
-蔗糖脂肪酸酯(蔗糖酯)，优选单-、二-和/或三-蔗糖脂肪酸酯的混合物；
其中，游离的或用甘油或一元醇或二醇或蔗糖酯化的所述饱和或不饱和脂肪酸具有C6至C32、优选C14至C24、更优选C16、C18和/或C22范围内的碳原子数。
3.如权利要求2所述的细菌，其中，所述至少一种脂质，优选植物来源的脂质，包含：
-至少一种第一脂质，其中，所述第一脂质是用饱和或不饱和脂肪酸，优选饱和脂肪酸酯化的单-、二-或三-甘油；和
-至少一种第二脂质，其中，所述第二脂质是蔗糖脂肪酸酯(蔗糖酯)，优选单-、二-和/或三-蔗糖脂肪酸酯的混合物；
其中，用甘油或用蔗糖酯化的所述脂肪酸具有C6至C32、优选C14至C24、更优选C16、C18、C20和/或C22范围内的碳原子数。
4.如权利要求1至3中任一项所述的细菌，其中，
-所包含的细菌本身的重量百分比在60％至90％的范围内，并且
-相对于胃保护颗粒状细菌的总重量，所包括的包含至少一种脂质或由至少一种脂质组成的包被基质的重量百分比在10％至40％的范围内；优选细菌本身为65％至85％，包被基质为15％至35％；更优选细菌本身为70％至80％，包被基质为20％至30％。
5.一种组合物，其包含含有权利要求1至4中任一项所述的细菌或由其组成的混合物，并且可选地，所述组合物包含至少一种食品级或药物或化妆品添加剂和/或赋形剂。
6.如权利要求5所述的组合物，其中，所包含的权利要求1至5中任一项所述的细菌的浓度在1x106AFU/g至1x1014AFU/g，优选1x107AFU/g至1x1013AFU/g，更优选1x108AFU/g至1x1012AFU/g的范围内，其中，AFU/g是指在一克组合物中具有完整的细胞膜的活细胞。
7.如权利要求1至6中任一项所述的细菌的制备方法，其包括以下步骤：
(I)用具有50微米至900微米范围的筛孔对至少一种细菌细胞菌株制粒以获得颗粒状细菌；
(II)用权利要求3或4所述的包含优选植物来源的至少一种脂质的包被基质包被所述颗粒状细菌，以获得胃保护颗粒状细菌本身；和
(III)在25℃至60℃的温度范围内将所述胃保护颗粒状细菌本身调整48小时至96小时的时间段，以获得用具有晶体结构的包被基质进行胃保护的颗粒状细菌；优选地，其中，所述至少一种脂质在所述调整步骤(III)之后呈现具有晶体结构的层状构型。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述方法在所述步骤(III)之后进一步包括步骤(IV)，所述步骤(IV)使用分析方法对由步骤(III)获得的用具有晶体结构的包被基质进行胃保护的颗粒状细菌的样品进行细菌计数，其中，所述分析方法允许检测具有完整细胞膜的细菌细胞的量；优选地，所述分析方法为流式细胞术。
9.如权利要求7或8所述的方法，其中，在步骤(I)中，用在100微米至600微米、优选150微米至500微米、更优选180微米或450微米范围内的筛孔对所述细菌进行制粒；其中，在步骤(II)中，优选在流化床室中进行，所述颗粒状细菌和所述包被基质以6:4至9:1，优选6.5:3.5至8.5:1.5，更优选7:3至8:2范围内的重量比进行处理；并且其中，在步骤(III)中，将所述胃保护颗粒状细菌本身在30℃至40℃，优选约35+1℃的温度范围内调整60小时至84小时，优选约72小时的时间段。
10.用具有晶体结构的包被基质进行胃保护的颗粒状细菌，其能够用权利要求7至9所述的方法获得。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0383406A1 (en) * 1989-02-15 1990-08-22 Unilever N.V. A process for encapsulating an active ingredient
JPH0787950A (ja) * 1993-09-21 1995-04-04 Nippon Oil & Fats Co Ltd 二重被覆粒子および製造方法
US20140370107A1 (en) * 2012-02-01 2014-12-18 Probiotical North America Inc. Multilayer microincapuslated probiotic bacteria
CN108779433A (zh) * 2016-02-12 2018-11-09 波比奥泰克股份公司 属于开菲尔乳杆菌种的细菌菌株在用于产生和/或维持体内稳态状态的儿科学中的应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10287574A (ja) * 1997-04-10 1998-10-27 Nof Corp 耐圧性腸内有用細菌製剤及びそれを用いた打錠製剤
KR20090071020A (ko) * 2007-12-27 2009-07-01 주식회사 제이팜제약 액상더블코팅으로 제조된 김치 유산균 분말
IT1400821B1 (it) * 2009-03-09 2013-07-02 Probiotical Spa Sospensione oleosa contenente batteri probiotici per uso pediatrico
IT1398648B1 (it) * 2010-03-09 2013-03-08 Probiotical Spa Prodotto alimentare comprendente batteri probiotici rivestiti con un rivestimento di origine vegetale.
CN109480038B (zh) * 2018-12-21 2024-10-11 杭州远大生物制药有限公司 一种耐温益生菌巧克力制品及其制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0383406A1 (en) * 1989-02-15 1990-08-22 Unilever N.V. A process for encapsulating an active ingredient
JPH0787950A (ja) * 1993-09-21 1995-04-04 Nippon Oil & Fats Co Ltd 二重被覆粒子および製造方法
US20140370107A1 (en) * 2012-02-01 2014-12-18 Probiotical North America Inc. Multilayer microincapuslated probiotic bacteria
CN108779433A (zh) * 2016-02-12 2018-11-09 波比奥泰克股份公司 属于开菲尔乳杆菌种的细菌菌株在用于产生和/或维持体内稳态状态的儿科学中的应用

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