CN114929338A - 通过靶向内源性调控因子增强血脑屏障药物转运 - Google Patents

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Abstract

本文提供了用于增加受试者的血脑屏障渗透性以增强血脑屏障药物转运的方法和组合物，以及用于鉴定调控血脑屏障渗透性的剂的方法和组合物。

Description

通过靶向内源性调控因子增强血脑屏障药物转运
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年12月4日提交的美国临时申请号62/943,610和2020年6月25日提交的美国临时申请号63/044,048的权益，所述美国临时申请中的两者的内容以引用方式并入本文。
技术领域
本发明涉及用于增加受试者的血脑屏障渗透性以增强血脑屏障药物转运的方法和组合物，以及用于鉴定调控血脑屏障渗透性的剂的方法和组合物。
关于联邦资助的研究的声明
本发明是在由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的授权号DP1 AG053015和R01 AG059694下借助政府支持完成的。政府享有本发明的某些权利。
背景技术
血脑屏障(BBB)维持正常脑功能所必需的环境，这被认为是经由BBB对循环大分子的不渗透性而发生的。BBB的血管内皮细胞是体内最特化的细胞之一。在腔外壁细胞的支持下，BBB内皮表现出被认为对最佳中枢神经系统(CNS)功能至关重要的独特的性质，诸如紧密连接的显示和最小的囊泡运输(Obermeier等人，Nature Medicine(2013)doi：10.1038/nm.3407；Ballabh等人，Neurobiol.Dis.(2004)doi：10.1016/j.nbd.2003.12.016；Chow，B.W.&Gu，C.，Trends Neurosci.38，598-608(2015)；和Blood，T.，Barrier，B.，Daneman，R.&Prat，A.The Blood-Brain Barrier，1-23(2015))。已经使用各种外源性示踪剂报告了这种贯穿健康生活的不渗透性(Reese，T.S.&Karnovsky，M.J.，J.Cell Biol.(1967)doi：10.1083/jcb.34.1.207；Andreone等人，Neuron，94(3)：581-594(2017)；Park等人，Neuron，100(1)：167-182.e9(2018)；Yao等人，Nat.Commun.，5：3413(2014)；Janzer，R.C.&Raff，M.C.，Nature，325(6101)：253-257(1987)；和Saunders等人，Frontiers in Neuroscience，9：385(2015)。若干研究已经发现，循环环境可以影响大脑功能，并特别调控神经形成、突触可塑性和认知能力(Conboy等人，Nature，433：760-764(2005)；Villeda等人，Nat.Med.(2014).doi：10.1038/nm.3569；Tingle等人，Nature(2017).doi：doi：10.1038/nature22067；Wyss-Coray，T.，Nature，539：180-186(2016)；Katsimpardi，L.Science(80-.).(2014).doi：10.1126/science.1251141；Karnavas等人，J.Exp.Med.(2017).doi：10.1084/jem.20171320；和Gan，K.J.&Südhof，T.C.，Proc.Natl.Acad.Sci.，16(25)：12524-12533(2019)。BBB对外源性示踪剂的典型不渗透性已经激发了关于外周对CNS的这种影响机制的探索。同时，随着每次心跳，BBB会与新一波不同的血浆蛋白内源性地相遇，可能形成具有结合、信号传导和运输事件的动态界面。
仍需要鉴定血脑屏障渗透性的调控因子的方法，特别是关于大脑衰老和递送治疗中枢神经系统疾病的治疗剂。
发明内容
本公开提供了用于增加受试者的血脑屏障渗透性的方法和组合物。本公开还提供了用于鉴定调控血脑屏障渗透性的剂的方法和组合物。
在一些实施方案中，本公开提供了用于通过向受试者施用抑制碱性磷酸酶蛋白(ALPL)活性的剂来增加受试者的血脑屏障渗透性的方法和组合物。
本公开还提供了用于将治疗剂递送至受试者的大脑的方法，其包括向受试者施用：(a)抑制碱性磷酸酶蛋白(ALPL)活性的剂；和(b)治疗剂。
本公开还提供了一种用于鉴定调控哺乳动物的血脑屏障渗透性的蛋白质或其他生物分子的方法，所述方法包括以下步骤中的一个或多个或每一个：(a)可检测地标记从第一哺乳动物中分离的血浆的蛋白质组；(b)将包含标记的蛋白质组的分离血浆引入到第二哺乳动物中；(c)从形成血脑屏障的第二哺乳动物中分离出脑内皮细胞；(d)使用流式细胞术测量分离的脑内皮细胞中的每一个中的血浆摄取，以产生分选的脑内皮细胞群；(e)检测与血浆摄取相关的基因在分选的脑内皮细胞中的每一个中的表达；和(f)选择由其表达与脑内皮细胞中血浆摄取增加或减少相关的基因编码的蛋白质或其他生物分子，由此所述蛋白质或其他生物分子调控受试者的血脑屏障渗透性。
附图说明
图1a是实施例1中描述的研究原理和血浆标记策略的示意图。图1b包括静脉注射到年轻(3个月大)小鼠中并在20小时后评估的64Cu标记的IgG(上图)和去除Alb/IgG的血浆(下图)(7.7MBq匹配剂量，约20μg)的脑放射自显影图像(n＝4的代表)。64Cu信号范围从低(黑色)到高(白色)，并且用尼式染色(Nissl staining)覆盖。图1c是荧光显微照片，其示出了静脉注射150μL血浆后4小时，年轻(3个月大)小鼠的冠状脑图块中的血浆摄取(白色)和核(脑)。比例尺＝1,000微米(n＝8的代表性图像)。图1d是示出静脉注射150μL血浆后4小时，纹状体中的点状血浆+脉管系统的图像。比例尺＝20微米(n＝8只年轻小鼠的代表性图像)。图1e包括示出转胞吞血浆(白色)相对于CD31+脑内皮细胞(BEC)层(红色)和AQP4+星形胶质细胞末端(绿色)的腔外定位的图像。图1e还包括直方图，其描绘了沿白线、在每个标志物内归一化的荧光强度投影。插图放大了箭头指示的区域。比例尺＝5微米(左)和1微米(右)(n＝5只年轻小鼠的代表性图像)。图1f是荧光显微照片，其示出了静脉注射150μL血浆后20小时，海马体中的实质细胞的血浆摄取(白色)。比例尺＝50微米(n＝8只年轻小鼠的代表性图像)。图1g是荧光显微照片，其示出了静脉注射150μL血浆后20小时，CD31+脉管系统(红色)外的皮质NeuN+神经元(蓝色)的血浆摄取(绿色)。比例尺＝20微米(n＝5只年轻小鼠的代表性图像)。图1h是荧光显微照片，其示出了静脉注射150μL血浆后20小时，CD31+脉管系统(红色)之外的海马体的齿状回中的神经元的血浆摄取(绿色)。比例尺＝50微米(左)和20微米(右)(n＝5只年轻小鼠的代表性图像)。图1i是荧光显微照片，其示出了静脉注射150μL血浆后20小时，海马体的齿状回中与CD31+脉管系统(红色)相邻的血浆+(绿色)神经元。白色箭头指示与内皮细胞接触的血浆+神经元突起。比例尺＝20微米(n＝5只年轻小鼠的代表性图像)。图1j是荧光显微照片，其示出了静脉注射150μL血浆后20小时，皮质Iba1+小胶质细胞(红色)中的血浆摄取(绿色)。比例尺＝10微米(n＝5只年轻小鼠的代表性图像)。图1k包括荧光显微照片，其示出了循环转铁蛋白(红色)揭示了皮质(左图)中的血浆的神经元双阳性(绿色)和血浆的神经元单阳性(右图)。比例尺＝20微米(n＝4只年轻小鼠的代表性图像)。所有数据在至少2个独立实验中重复。所有放射自显影和荧光脑切片均源自灌注小鼠。
图2a是示意图，其示出了已公布的灌注脑RNA-seq(Kadakkuzh a等人，Front.Cell.Neurosci.(2015).doi：10.3389/fncel.2015.00063)和基于质谱的蛋白质组学数据集(Sharma等人，Neurosci.，18：1819-1831(2015))的比较，其揭示了海马体中存在1,446种蛋白质，但对应的转录物不在海马体中表达。然后，这1,446种蛋白质可能会从外周迁移到海马体中。图2b是图表，其示出了图2a中的在海马体中存在但不表达的1，446种蛋白质可能来源于血液，如通过组织特异性表达分析评估的(Dougherty等人，Nucleic AcidsRes.(2010)doi：10.1093/nar/gkq130)。图2c是图，其示出了图2a中的在海马体中存在但不表达的1,446种蛋白质可能来源于血液，如通过基因本体分析评估的(Ashburner等人，Nature Genetics(2000).doi：10.1038/75556；和Gene Ontology Consortium.The GeneOntology(GO)database and in formatics resource.Nucleic Acids Res.(2004).doi：10.1093/nar/gkh036)。图2d是图表，其描绘了通过测量脑组织中残留的、静脉注射的2mDa葡聚糖-FITC来评估灌注完整性的结果。灌注后，在注射葡聚糖-FITC和注射PBS的年轻(3个月大)小鼠之间没有观察到显著差异(n＝6-8，使用杜凯氏多重比较校正(Tukey’smultiple comparisons correction)的单因素方差分析(one-way ANOVA)；平均值+/-标准误)。图2e是图表，其示出了在处死来自图2d中的小鼠时，血浆中的循环2mDa葡聚糖-FITC(n＝6-8，****P＜0.0001，使用杜凯氏多重比较校正的单因素方差分析；平均值+/-标准误)。图2d和图2e中的数据在至少2个独立实验中重复。
图3a是示意图，其描绘了血浆标记化学和确认数百种不同血浆蛋白的标记的检测方法的综述。图3b是示出了在生理、非变性条件下经由N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯化学对血浆蛋白进行化学选择性标记的图(上图)。优化每个标签的条件以实现广泛且无扰动的蛋白质标记。示出了小亲和标签生物素和反式环辛烯的结构(下图)。图3c包括用生物素标记、在抗体阵列上孵育并用链霉亲和素(streptavidin)探测的血浆蛋白的图像。在不同活性的蛋白质组中检测到数百种生物素化的蛋白质(n＝6)。特异性蛋白质-抗体结合表明标记不干扰蛋白质结构。未标记的血浆阵列中的信号(左图)对应于生物素化阳性对照，以确保正确的抗体打印。图3d包括图表，其说明了在分馏和基于质谱的鉴定之前，用点击部分反式环辛烯标记的血浆蛋白富集在四嗪珠上。标记的蛋白质跨越丰度和尺寸，并且与整体、未标记和可检测到的血浆蛋白质组相比未表现出明显的偏差(n＝3，双因素方差分析；平均值+/-标准误)。图3b和图3c中的数据在至少2个独立实验中重复。
图4a包括由3维小鼠大脑图谱划分的、用于体内PET信号检测的大脑区域图像(Chaney等人，J.Nucl.Med.(2018).doi：10.2967/jnumed.118.209155；和Chaney等人，J.Vis.Exp.(2018).doi：10.3791/57243)。图4b是图表，其示出了在接受7.7MBq(约20μg)的静脉内剂量(ID)的64Cu标记的去除IgG或Alb/IgG的血浆后20小时，在年轻(3个月大)小鼠的大脑区域中检测到的体内PET信号。信号在20小时时针对对应的心脏血液样品中的活性进行校正(n＝7种年轻IgG，n＝6种年轻血浆，*P＜0.05，***P＜0.001，****P＜0.0001，双因素方差分析；平均值+/-标准误)。图4c包括一系列放射自显影图像，其说明了接受注射的年轻(3个月大)和老年(22个月大)小鼠的冠状脑切片中的64Cu标记的去除IgG或Alb/IgG的血浆定位的离体评估。使用尼氏染色(中图)和放射性信号/尼氏覆盖(下图)检查解剖共配准(彩色条表示放射性信号从低(黑色)到高(白色)(每组n＝4)。图4d是图表，其说明了在静脉内注射7.7MBq(约20μg)的64Cu标记的去除IgG或Alb/IgG的血浆20小时后，年轻(3个月大)小鼠的海马体和皮质中的离体放射自显影信号强度的定量(n＝3-4，双侧t检验；平均值+/-标准误)。图4e是图表，其示出了注射后20小时，在年轻(3个月大)和老年(22个月大)小鼠的血液中检测到的64Cu标记的去除IgG和Alb/IgG的血浆(n＝6种年轻IgG，n＝7种年轻血浆，n＝5种老年IgG，以及n＝6种老年血浆，****P＜0.0001，使用杜凯氏校正的单因素方差分析；平均值+/-标准误)。所有数据在至少两个独立实验中重复。
图5a是图表，其说明了在暴露于150μL盐水或血浆并在第二天通过注射3kDa葡聚糖示踪剂进行探测以通过荧光读板器进行定量后的BBB渗透性。图5b是图表，其说明了在暴露于150μL盐水或血浆并在第二天通过注射70kDa葡聚糖示踪剂进行探测以通过荧光读板器进行定量后的BBB渗透性。轻度创伤性脑损伤(TBI)用作BBB渗漏的阳性对照(对于3kDa葡聚糖，n＝7-9；对于70kDa葡聚糖，n＝4-5，使用杜凯氏多重比较校正的单因素方差分析；平均值+/-标准误)。图5c是图表，其说明了暴露于150μL盐水或血浆并且针对内源性免疫球蛋白从脉管系统(CD31区域)外外渗到实质中进行染色后的BBB渗透性(n＝4-6，不显著，双侧t检验；平均值+/-标准误)。图5d包括在暴露于150μL盐水或血浆或TBI157后，内源性免疫球蛋白(白色)外渗到实质中的代表性图像。比例尺＝50微米。图5e是图，其示出了与基线处的血浆浓度相比，在处死在整个研究中使用的年轻(3个月大)和老年(20-24个月大)小鼠时注射150μL血浆之后(注射后20小时)的血浆蛋白浓度(n＝35只基线年轻，n＝35只注射年轻，n＝22只基线老年，n＝32只注射老年，不显著，双因素方差分析；平均值+/-标准误)。图5f是在基线处和暴露于150μL血浆后，年轻(3个月大)小鼠的脑内皮细胞的t-SNE图，证明血浆转移后脑血管转录组无显著扰动(n＝3)。所有数据在至少2个独立实验中重复。
图6a包括以各种体积注射的、在四小时后进行测定的Atto 647N标记的血浆的代表性图像。150μL对应于10-15mg(0.5mg/g体重)，体积和蛋白质量之间存在线性关系(即，与150μL相比，10μL注射的蛋白质减少15倍)。CD31标记脑内皮细胞。比例尺＝100微米。图6b包括来自注射有Atto 647N标记的血浆的小鼠并且对于小鼠白蛋白(顶部)和IgG(底部)进行染色的脑切片图像。对于更高放大倍数的图像，定位白蛋白和IgG+毛细血管以进行成像(白色箭头)，而大多数脉管系统大多缺乏白蛋白和IgG(左)。非共定位的程度表明其他血浆因子负责大脑中检测到的信号。白蛋白和IgG+毛细血管的存在(尽管是少数)与溶酶体降解可能是BBB完整性的额外机制的假设一致(
Figure BDA0003727978690000071
等人，Sci.Rep.(2016).doi：10.1038/srep25658)。比例尺＝40微米(左)和10微米(右)。图6c包括Atto 647N标记的血浆的图像(左)；Alexa Fluor 647标记的血浆的图像(左边第二)；通过链霉亲和素647切片染色检测到的生物素标记的血浆的图像(右边第二)；和通过sDIBO-647点击应变促进的炔烃-叠氮环加成(SPAAC)切片染色检测到的叠氮高丙氨酸标记的血浆的图像。除了l-叠氮高丙氨酸外，血浆还经由NHS酯化学离体标记。L-叠氮高丙氨酸是通过以下方式执行的：给小鼠喂食饮用水中的L-叠氮高丙氨酸和缺乏甲硫氨酸的食物，以允许通过小鼠的甲硫氨酰基-tRNA合成酶掺入带有叠氮化物的叠氮高丙氨酸来替代内源性甲硫氨酸(Kiick等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，99：19-24(2002)；和Calve等人，Sci.Rep.(2016).doi：10.1038/srep32377)。在正常(无L-叠氮高丙氨酸)条件下，提取体内标记的L-叠氮高丙氨酸血浆并移注到不同的小鼠中。比例尺＝20微米。所有数据在至少2个独立实验中重复。
图7a是弥漫在健康成年大脑中的血浆的代表性矢状图像。比例尺＝1,000微米。图7b至7f是图像，其示出了血浆跨大脑区域渗透脉管系统和实质，所述大脑区域包括海马体(图7b)、大脑皮质(图7c)、小脑(图7d)、丘脑(图7e)和中脑(图7f)。比例尺＝100微米。图7g是正中隆起中的血浆的代表性图像。比例尺＝10微米。图7h是大动脉中血浆分布的代表性立体渲染的图像。血浆积聚在局灶簇中，这是网格蛋白介导的内吞作用的特征(Liu等人，J.Cell Biol.(2010).doi：10.1083/jcb.201008117)。比例尺＝50微米。图7i是由图1e中的白线表示的脑血管横截面的放大图像，示出了内皮细胞内外的血浆点状积聚。脑内皮细胞由CD31标记，并且星形胶质细胞末端由AQP4标记。比例尺＝1微米。图7j包括血管周围空隙中的血浆的代表性图像，其中血浆勾勒了平滑肌细胞的轮廓。比例尺＝50微米(左图)和20微米(右图)。图7k是弥漫在蛛网膜下腔中的血浆的代表性图像，定位于内皮细胞(CD31)之外但在胶质界膜(AQP4)内。比例尺＝10微米。图7l是脉络丛上皮(闭合蛋白1)中的强血浆信号的代表性图像，表明了血浆进入CSF以及胶状淋巴系统在血浆摄取和清除中的潜在作用。比例尺＝50微米。图7m包括肺组织和内皮(CD31)中的血浆积聚的代表性图像，示出了与BBB相比，肺内皮形成的脉管系统和实质之间的边界不清楚。即使在缺乏典型屏障的肺组织中，也没有来自残留的、非特异性结合的游离染料的信号。比例尺＝20微米。所有数据在至少2个独立实验中重复。
图8a包括静脉注射到年轻(3个月-上图)和老年(22个月-下图)小鼠中并且在20小时后进行评估的64Cu标记的去除Alb/IgG的血浆(7.7MBq匹配剂量，约20μg)的脑放射自显影照片(n＝5的代表)。64Cu信号范围从低(黑色)到高(白色)，并且用尼式染色覆盖。图8b和8c是图表，其示出了静脉内注射剂量(ID，7.7MBq匹配剂量，约20μg)后20小时，年轻(3个月大)和老年(22个月大)小鼠的全脑(图8b)和去血管化海马体和皮质实质(图8c)中的64Cu标记的去除IgG和Alb/IgG的血浆的γ计数器定量(n＝5-7，使用斯达克式多重比较校正(Sidak’smultiple comparisons correction)的单因素方差分析；平均值/-标准误)。图8d是图表，其示出了针对脑内皮细胞(BEC)基因随年龄增长而下调(左，绿色)和上调(右，棕色)与它们对血浆摄取(阳性)或抑制(阴性)的贡献作图。图8e是图像，其说明了推定的RMT(受体介导的转胞吞作用)受体、网格蛋白组分和小窝组分及其抑制剂(CI，小窝抑制剂)在年轻(3个月大)和老年(20个月大)小鼠的脑内皮细胞中的基因表达(Yousef等人，Nat.Med.(2019).doi：10.1038/s41591-019-0440-4)。Lrp1上的星号表示其腔外的表达(Zlokovic等人，J.Neurochem.(2010).doi：10.1111/j.1471-4159.2010.07002.x)。示出了在年轻或老年内皮细胞中平均FPKM＞1的基因。相对Z评分值以分级黄色(高)或蓝色(低)表示。图8f是来自年轻(3个月大)和老年(20个月大)小鼠的脑微血管脂质组的主组分(PC)分析图。随着年龄增长，61种脂质显著上调，并且104种脂质下调(n＝4，每个n是4只小鼠的合并(总计16只年轻，16只老年)，q＜0.1，双侧t检验的基于排列的FDR)。图8g是热图，示出了老年(20个月大)与年轻(3个月大)小鼠的脑微血管中的含有DHA的磷脂的相对丰度。该热图以分级黄色(老年上调)或蓝色(老年下调)描绘了每个脂质种类的MS信号的log-2归一化倍数变化(n＝4，每个n是4只小鼠的合并(总计16只年轻，16只老年)，*q＜0.1，双侧t检验的基于排列的FDR)。图8h包括示出了老年(20个月大)与年轻(3个月大)小鼠的脑微血管中的小鼠内源性转铁蛋白(左图)和白蛋白(右图)的相对丰度(无标记定量，LFQ)的图表。绿色圆点表示未检测到白蛋白的样品，并且值被推算到检测限(n＝5只年轻和6只老年，双侧t检验；平均值+/-标准误)。图8i包括所有CNS细胞中的荧光血浆摄取的流式细胞术门控的代表性图像。与类似地与没有缀合部分的荧光团一起孵育的血浆(上图)相比，血浆荧光只有当血浆在静脉注射前经由NHS酯化学适当标记时才会出现(下图)。设置门控以荧光减去一个对照的方式来减弱内源性自发荧光。图8j包括图表，其说明了静脉注射150μL血浆后4小时，年轻(3个月大)和老年(22个月大)小鼠的皮质和海马脑内皮细胞(BEC)的血浆摄取的流式细胞术定量，如通过为血浆+的BEC的百分比(％)和血浆+BEC的平均荧光强度(MFI)评估的(n＝4，双侧t检验；平均值+/-标准误)。图8k包括图像，其示出了静脉注射150μL血浆后4小时，年轻(3个月-左图)和老年(22个月-右图)皮质CD31+脉管系统(红色)中的血浆摄取(绿色)。箭头表示相对于相邻细胞血浆积聚更多的区域，表明RMT受体聚集和分层摄取。比例尺＝10微米(n＝4只年轻小鼠的代表性图像)。图8l包括图表，其说明了年轻(3个月大)和老年(22个月大)小鼠的皮质和海马NeuN+神经元的血浆摄取的流式细胞术定量，如通过为血浆+的BEC的百分比(左图)和血浆+BEC的平均荧光强度(MFI)(右图)评估的(n＝3-4，双侧t检验；平均值+/-标准误)。所有数据在至少2个独立实验中重复。
图9a是从年轻(3个月大)小鼠的皮质和海马体中分离的脑内皮细胞中的结构化血浆摄取的t-SNE图(彩色条表示血浆摄取从最小(黑色)到最大(白色)(来自n＝3只年轻小鼠的745个BEC))。图1b是示出19,899个脑内皮细胞基因与血浆摄取的相关性的图表(斯皮尔曼(Spearman))。相关性的尾端顶部和底部1％的基因分别表示为“相关物”和“反相关物”，并列出了示例性基因。分布中位数为0.03。图9c是说明“相关物”和“反相关物”基因的途径富集分析的示意图，其中列出了每个途径中的基因数量。图9d是说明“相关物”和“反相关物”基因的基因本体细胞组分富集分析的示意图。图9e是示出“相关物”和“反相关物”中的血脑屏障(BBB)特异性基因(Daneman等人，PLoS One(2010).doi：10.1371/journal.pone.0013741)相对于所有基因的富集的图表。示出了“相关物”、“反相关物”和所有基因内的基因的百分比和它们的富集(超几何分布)。图9f是说明动脉、毛细血管和静脉分区的脑内皮细胞分离的t-SNE图。图9g是说明动脉、毛细血管和静脉分区的血浆摄取的图表。图9h是基因与血浆摄取的相关性的热图(斯皮尔曼，红色，高；蓝色，低)，其揭示了八种主要模式：相关动脉(1)、毛细血管(2)和静脉(3)；和抗相关动脉(4)、毛细血管(5)、静脉(6)；毛细血管和静脉(7)；和整体(8)。图9i是说明表达转铁蛋白受体Tfrc(斯皮尔曼相关性)的毛细血管中的“相关物”(绿色)和“反相关物”(棕色)基因的共表达分析的矩阵。该矩阵按欧几里得距离(Euclidian distance)进行树状图排序，并且呈现了在至少15％的毛细血管细胞中表达的基因。图9j包括说明通过SPIN分选的脑内皮细胞中的血浆摄取的图表。橙色曲线测量血管段内和跨血管段的平均摄取量(LOWESS)。分区特异性标志物在下图中示出。图9k包括示例性“相关物”和“反相关物”基因的代表性t-SNE图。每个点对应单独的细胞，并且基因表达水平由色谱(log10 CPM)表示。所有数据在至少2个独立实验中重复。
图10a包括使用scRNA-seq分析进一步过滤至纯度的年轻(3个月大)小鼠的分选脑内皮细胞(BEC)的t-SNE图。图10b是每个生物重复内每个BEC表达的基因数量的小提琴图。红色的格子是异常值。图10c是t-SNE图，其中不同小鼠的BEC的颜色不同，示出了重复中的转录组的一致性。图10d是分区的每个BEC表达的基因数量的小提琴图。红色的格子是异常值。图10e是说明由SPIN轴组织或随机改组的相邻细胞中血浆摄取的成对差异的图。SPIN排序的血浆摄取差异减少意味着动静脉(ACV)树中的血浆摄取层次。图10f包括说明BEC中“相关物”和“反相关物”基因表达的稳健PCA(rPCA)图的t-SNE图。每个点代表单独的细胞，并且基因表达水平由色谱(log10CPM)表示。所有数据在至少2个独立实验中重复。
图11a是说明来自年轻(3个月大)和老年(20个月大)小鼠的脑内皮细胞的RNA-seq的紧密连接基因表达的热图(n＝6)。相对Z评分值以分级黄色(高)或蓝色(低)表示。图11b包括图表，其说明了年轻(3个月大)和老年(20个月大)脑内皮细胞中的归一化为组蛋白H3加载对照蛋白的转铁蛋白受体(TFRC-左图)和小窝蛋白1(CAV1-右图)的蛋白质印迹定量(n＝6，双侧t检验；平均值+/-标准误)。图11c是热图，其说明了来自年轻(3个月大)和老年(20个月大)小鼠(n＝4；每个样品是4只小鼠的合并)微血管的基于无偏质谱的脂质组学的差异丰富脂质的分层聚集。数据通过Z评分归一化。FDR校正的q值低于0.1的脂质被认为是显著的。图11d-11f包括图表，其示出了年轻(3个月大)和老年(22个月大)小鼠的所有CNS细胞(图11d)、Thy1+神经元(图11e)和ACSA-2+星形胶质细胞(图11f)中的血浆摄取的流式细胞术定量(n＝4，双侧t检验；平均值+/-标准误)。数据在至少2个独立实验中重复。
图12a是脑内皮细胞上的细胞表面可成药基因(druggable gene)候选物的点状图表示。根据基因的血脑屏障特异性程度(Daneman等人，PLoS One(2010).doi：10.1371/joumal.pone.0013741)和与血浆摄取的相关性来绘制基因。用基因随年龄增长的上调(棕色)或下调(绿色)来给基团上色。图12b包括在老年(23个月大-下图)而非年轻(3个月大-上图)小鼠中检测到的钙化结节(茜素红染色)的代表性图像，概括了在周细胞缺陷型Pdgfbret/ret小鼠中看到的结节(Keller等人Nat.Genet.(2013).doi：10.1039/ng.2723)(n＝每个年龄5只小鼠的代表性图像)。图12c包括年轻(3个月大-左图)和老年(23个月大-右图)小鼠大脑皮质中的凝集素+脉管系统(红色)中的I型胶原蛋白表达(绿色)的代表性图像。比例尺＝40微米。图12d包括年轻(3个月大-左图)和老年(23个月大-右图)小鼠大脑皮质中的AQP4+脉管系统(紫色)中的ALPL表达(黄色)的代表性图像。比例尺＝40微米。图12e是说明年轻(3个月大)和老年(23个月大)小鼠的大脑皮质脉管系统中的ALPL表达的定量的图表(n＝7，双侧t检验；平均值+/-标准误)。图12f是说明脑血管ALPL抑制的示意图。对老年(22个月大)小鼠腹膜内注射媒介物或ALPL抑制剂，每天两次，持续三天，之后静脉注射血浆、人饱和铁转铁蛋白或转铁蛋白受体抗体。通过流式细胞术以及皮质和海马体的共聚焦显微镜检查评估脑内皮和脑实质中的摄取。图12g包括用ALPL抑制剂(抗ALPL)或媒介物治疗的老年(22个月大)小鼠的大脑皮质脉管系统中的和年轻(3个月大)小鼠中的异位ALPL活性(红色)的代表性图像。图12h是图表，其说明了用ALPL抑制剂(抗ALPL)或媒介物治疗的老年(22个月大)小鼠的大脑皮质脉管系统中的和年轻(3个月大)小鼠中的ALPL活性的定量(n＝6-9，使用杜凯氏多重比较校正的单因素方差分析；平均值+/-标准误)。图12i-12l包括图表，其说明了在ALPL抑制剂(抗ALPL)和媒介物治疗之后，脑实质(CD31-/CD45-)细胞摄取以下物质的流式细胞术定量：老年(22个月大)小鼠的血浆(图12i)；年轻(3个月大)小鼠的血浆(图12j)；老年(22个月大)小鼠的人饱和铁转铁蛋白(hu-Tf)(图12k)；或老年(22个月大)小鼠的转铁蛋白受体抗体(TfR Ab)(图121)，如通过为示踪剂+的实质细胞的百分比(％)和示踪剂+实质细胞的相对平均荧光强度(MFI)评估的(对于血浆，n＝4；对于hu-Tf，n＝5-6；对于TfR Ab，n＝9，双侧t检验；平均值/-标准误)。示踪剂是指血浆、hu-Tf或TfR Ab。图12m包括用ALPL抑制剂治疗的老年(22个月大)小鼠的皮质脉管系统(红色)和实质细胞中的转铁蛋白受体抗体(TfR Ab)的代表性图像。箭头表示TfR Ab+NeuN神经元。比例尺＝40微米(左)和10微米(右)。数据在至少2个独立实验中重复。
图13a包括t-SNE和小提琴图，其示出了CNS细胞中Alpl表达的scRNA-seq分析，对数归一化的每百万读数的计数(CPM)。Alpl主要在脑内皮细胞中表达(n＝7，年轻小鼠)。数据来自Tabula Muris Consortium。图13b是示出CNS、外周和组织培养物中的内皮细胞和非内皮细胞中的Alpl表达的图表(每百万的转录物，TPM)。Alpl对脑内皮具有特异性，并且在培养时表达丢失。数据来自血管内皮细胞转组学资源数据库(Vascular Endothelial CellTransomics Resource Database)(markfsabbagh.shinyapps.io/vectrdb/)(Sabbagh等人，Elife(2018).doi：10.7554/elife.36187)。图13c是示出年轻脑内皮细胞(BEC)中的Alpl表达与来自组合的流式细胞术索引分选和scRNA-seq的血浆摄取之间的相关性的图。蓝线表示线性回归，斯皮尔曼相关性。排除了不表达Alpl的BEC。图13d是气泡图(Chen等人，bioRxiv(2019).doi：10.1101/617258)，其说明了Alpl表达在毛细血管中随着年龄增长而特异性增加。图13e包括示出年轻(3个月大)和老年(23个月大)大脑中的ALPL蛋白表达的图像。比例尺＝1,000微米。图13c和图13e中的数据在至少两个独立实验中重复。
图14a至14d是图表，其说明了脑内皮细胞摄取以下物质的流式细胞术定量：年轻小鼠(3个月大)的血浆(图14a)、老年小鼠(22个月大)的血浆(图14b)、老年小鼠的人饱和铁转铁蛋白(hu-Tf)(图14c)、或经由每日两次持续三天的IP注射用媒介物(灰色)或抗ALPL(绿色)治疗的老年小鼠的转铁蛋白受体抗体(TfR Ab)(图14d)，如通过为示踪剂+的BEC的百分比和示踪剂+BEC的相对MFI评估的(对于血浆，n＝4；对于hu-Tf，n＝6只媒介物，n＝5只抗ALPL；对于TfR Ab，n＝9，双侧t检验；平均值+/-标准误)。示踪剂是指血浆、hu-Tf或TfRAb。图14e包括在用ALPL抑制剂治疗的小鼠皮质中检测到的hu-Tf+神经元的代表性图像。比例尺＝40微米。图14f包括图表，其示出了在处死以控制和确保注射量没有差异时的血浆中的循环人饱和铁转铁蛋白和转铁蛋白受体抗体(对于hu-Tf+，n＝6只媒介物，n＝5只抗ALPL；对于TfR Ab，n＝9，双侧t检验，平均值+/-标准误)。图14g包括说明用媒介物或抗ALPL治疗的老年小鼠(22个月大)的通过CD31染色测定的整体脑血管形态的图像。比例尺＝1,000微米。数据在至少2个独立实验中重复。图14h包括图表，其说明了脑内皮细胞和脑实质细胞摄取3kDa葡聚糖示踪剂的流式细胞术定量，所述示踪剂探测年轻小鼠(3个月大)和老年小鼠(22个月大)的细胞间渗透性的破坏(n＝6只媒介物，n＝5只抗ALPL，双侧t检验，平均值+/-标准误)。
图15a至15d是说明血浆+、NeuN+神经元(图15a)、Thy1(CD90)+神经元(图15b)、ACS2-A+星形胶质细胞(图15c)和CD31+/CD45-脑内皮细胞(BEC)(图15d)的代表性门控的图像。对于每种细胞类型，将血浆+门控的FMO阴性对照(未注射)扣除以避免混淆自发荧光，尤其是在老年大脑中。图15e包括图像，其说明了在有或没有ALPL抑制剂治疗的情况下体内暴露于血浆、人饱和铁转铁蛋白或转铁蛋白受体抗体之后，老年小鼠(22个月大)的CD31+/CD45-脑内皮细胞和CD31-/CD45-实质细胞的代表性门控。将血浆、人饱和铁转铁蛋白和转铁蛋白受体抗体(“示踪剂”)门控的FMO阴性对照(未注射)扣除以避免混淆自发荧光。示出的实例来自注射有转铁蛋白受体抗体的小鼠。
图16是说明BBB转胞吞作用随年龄增长的转变的工作模型的示意图。在健康成年动物中，脑内皮细胞表达高水平的网格蛋白包被内陷的受体和组分(Simionescu，M.等人，J.Submicrosc.Cytol.Pathol.，20(2)：243-61(1988)；Herv6等人，AAPS J.(2008).doi：10.1208/s12248-008-9055-2)以经由受体介导的转胞吞作用(RMT)转运选定的血浆蛋白。随着年龄增长，周细胞可能退化，从而促进血管钙化和内皮转运从配体特异性受体介导的转变成小窝转胞吞作用。小窝转胞吞作用是非特异性的，使老年BBB“易渗漏”健康中排除的神经毒性蛋白质，诸如纤维蛋白(原)、凝血酶和自身抗体(Petersen等人，Nature ReviewsNeuroscience(2018).doi：10.1038/nrn.2018.13；和Montagne等人，J.Exp.Med.(2017).doi：10.1084/jem.20171406)。RMT受体的损失使药物递送工作(包括开发中的转铁蛋白受体抗体)复杂化，并且可能损害最佳CNS稳态所必需的外周因子摄取。
图17A-17C是散点图和随附的直方图，示出了年轻和老年小鼠大脑的脑毛细血管(图17A)、静脉(图17B)和小动脉(图17C)中的血浆摄取的基因相关物。
图18包括图像和图表，其说明了ALPL-脉管系统在老年(23个月大)小鼠大脑中的循环转移的摄取增强(比例尺＝40微米；n＝6，成对的双侧t检验；平均值+/-标准误)。
图19a包括直方图和图表，其示出了施用后4小时，MFI记录的重组小鼠瘦蛋白(rLeptin)和辣根过氧化物酶(HRP)的BEC摄取(n＝7，双侧t检验；平均值+/-标准误)。图19b包括急性分离的微血管中的网格蛋白和小窝囊泡的免疫荧光图像(比例尺＝10微米)。图19c包括示出网格蛋白和小窝囊泡的定量的图表(n＝5，双侧t检验；平均值+/-标准误)。
图20a是示出老年和年轻大脑中的皮质CD13+血管周细胞和CD31+内皮细胞的图像(比例尺＝40微米)。图20b是示出皮质CD13+血管周细胞和CD31+内皮细胞的定量的图表(n＝5只年轻；n＝7只老年，双侧t检验；平均值+/-标准误)。图20c是示出TFRC和MFSD2A皮质血管表达的图像(比例尺＝40微米)。图20d是示出TFRC和MFSD2A皮质血管表达的定量的图表(n＝7只TFRC；n＝8只MFSD2A，双侧t检验；平均值+/-标准误)。
图21a包括示出ALPL+/-皮质脉管系统中的饱和铁转铁蛋白摄取的图像和直方图(n＝6，成对的双侧t检验)。图21b是施用ALPL抑制剂和媒介物之后，老年小鼠的差异表达基因(FDR＜0.05)的MA图(7,036个毛细血管细胞，n＝每组合并4只小鼠，使用邦费罗尼校正(Bonferroni correction)的MAST)。图21c包括示出血管段中的转铁蛋白受体(Tfrc)表达的小提琴图，遵循图21b中的范例(1,171个动脉细胞、7,036个毛细血管细胞和430个静脉细胞，使用邦费罗尼校正的MAST)。
图22是说明跨BBB的铁转运机制的示意图。
图23是图表，其示出了在ALPL抑制后，Tfrc和Slc40a1是在BBB上上调最多的基因。
图24a至24c是小提琴图，其示出了在ALPL抑制后，Slc40a1在脑动脉细胞(图24a)、毛细血管细胞(图24b)和静脉细胞(图24c)中的上调幅度。
具体实施方式
本公开至少部分地基于鉴定调控血脑屏障渗透性的蛋白质和其他生物分子的筛选方法的开发。如本文所述，使用全血浆蛋白质组作为新的发现工具，可以直接使容易渗透BBB保护的健康成年脑实质中的内源性蛋白质和其他生物分子可视化。此过程受到脑内皮特有的转录程序的高度调控，并且摄取因血管段而显著不同。随着年龄增长，血浆摄取的许多活性调控因子下调，从而导致BBB中从受体介导的小窝转胞吞作用转变为非特异性小窝转胞吞作用，如图16中示意性地所示。本公开提供了一种用于经由抑制BBB转胞吞作用的负调控因子来恢复BBB转胞吞作用的年龄相关的转变的方法。
定义
为了有助于理解本技术，在下文中定义了大量术语和短语。附加的定义在整个详细描述中阐述。
如本文所用，术语“核酸”、“多核苷酸”、“核苷酸序列”和“寡核苷酸”可互换使用，并且是指嘧啶和/或嘌呤碱基(分别优选胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶，以及腺嘌呤和鸟嘌呤)的聚合物或寡聚物(参见Albert L.Lehninger，Principles of Biochemistry，at 793-800(Worth Pub.1982))。所述术语涵盖任何脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或肽核酸组分及其任何化学变体，诸如这些碱基的甲基化、羟甲基化或糖基化形式。聚合物或寡聚物在组成上可以是异质的或均质的，可从天然存在的来源中分离，或者可人工或合成产生。此外，核酸可以是DNA或RNA或其混合物，并且可以永久或过渡性地以单链或双链形式(包括同源双链体、异源双链体和杂交体状态)存在。在一些实施方案中，核酸或核酸序列包含其他种类的核酸结构，诸如例如DNA/RNA螺旋、肽核酸(PNA)、吗啉代核酸(参见例如Braasch和Corey，Biochemistry，41(14)：4503-4510(2002)和美国专利5,034,506)、锁核酸(LNA；参见Wahlestedt等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，97：5633-5638(2000))、环己烯基核酸(参见Wang，J.Am.Chem.Soc.，122：8595-8602(2000))和/或核糖酶。术语“核酸”和“核酸序列”还可涵盖包含可表现出与天然核苷酸相同的功能的非天然核苷酸、经修饰的核苷酸和/或非核苷酸构件(building block)(例如，“核苷酸类似物”)的链。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，并且是指包含至少两个或更多个连续氨基酸的氨基酸的聚合形式，其可以包括编码和非编码氨基酸、化学或生物化学修饰的或衍生的氨基酸以及具有经修饰的肽骨架的多肽。
如本文所用，术语“治疗(treatment、treating)”等是指获得期望的药理学和/或生理学效果。优选地，所述效果是治疗性的，即所述效果部分地或完全地缓解或治愈损伤、疾病和/或可归因于所述损伤或疾病的不良症状。类似地，“治疗剂”是当向有需要的受试者施用时能够缓解或治愈损伤、疾病和/或不良症状的任何物质、分子或化合物。为此，本文所述的方法期望地包括施用“治疗有效量”的治疗剂。“治疗有效量”是指在必需的剂量和时间段下有效实现期望治疗结果的量。治疗有效量可根据诸如个体的损伤严重程度、年龄、性别和体重以及治疗剂在个体中引发期望反应的能力的因素而变化。
如本文所用，术语“生物分子(biomolecule、biological molecule)”是指由活的生物体或细胞产生的任何分子或化合物。生物分子通常是有机的，并且包括例如大的大分子(或聚阴离子)，诸如蛋白质、碳水化合物、脂质和核酸，以及小分子，诸如初级代谢物、次级代谢物和天然产物。
如本文所用，术语“大分子”是指由两个或更多个单体聚合生成的大聚合物分子。大分子通常由数千个或更多个原子组成。大分子的实例包括生物聚合物(例如，核酸、蛋白质和碳水化合物)和大的非聚合物分子(例如，脂质和大环化合物)。合成大分子包括例如普通塑料、合成纤维和碳纳米管。
如本文所用，术语“免疫球蛋白”或“抗体”是指在脊椎动物的血液或其他体液中发现的蛋白质，免疫系统使用所述蛋白质来鉴定和中和异物，诸如细菌和病毒。通常，免疫球蛋白或抗体是包含至少一个互补决定区(CDR)的蛋白质。CDR形成负责抗原结合的抗体的“高变区”(下文进一步讨论)。完整的免疫球蛋白通常由四个多肽组成：重(H)链多肽的两个相同拷贝和轻(L)链多肽的两个相同拷贝。每条重链含有一个N末端可变(VH)区和三个C末端恒定(CH1、CH2和CH3)区，并且每条轻链含有一个N末端可变(VL)区和一个C末端恒定(CL)区。抗体的轻链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列指定为两种不同类型中的一种，即卡帕(κ)或拉姆达(λ)。在典型的抗体中，每条轻链通过二硫键连接到重链，并且两条重链通过二硫键彼此连接。轻链可变区与重链可变区对齐，并且轻链恒定区与重链的第一恒定区对齐。重链的剩余恒定区彼此对齐。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指由B淋巴细胞的单个克隆产生的、针对抗原上的单个表位的抗体。单克隆抗体通常使用杂交瘤技术产生，如在
Figure BDA0003727978690000191
和Milstein，Eur.J.Immunol.，5：511-519(1976)中首次描述。单克隆抗体也可以使用重组DNA方法产生(参见例如美国专利4,816,567)、从噬菌体展示抗体库中分离(参见例如Clackson等人，Nature，352：624-628(1991))；和Marks等人，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991))或由携带完全人免疫球蛋白系统的转基因小鼠产生(参见例如Lonberg，Nat.Biotechnol.，23(9)：1117-25(2005)和Lonberg，Handb.Exp.Pharmacol.，181：69-97(2008))。相比之下，“多克隆”抗体是由动物体内的不同B细胞谱系分泌的抗体。多克隆抗体是识别同一抗原上多个表位的免疫球蛋白分子的集合。
术语“抗体的片段”、“抗体片段”和抗体的“抗原结合片段”在本文中可互换地用于指代保留特异性结合抗原的能力的抗体的一个或多个片段(通常参见Holliger等人，Nat.Biotech.，23(9)：1126-1129(2005))。本文所述的抗体的任何抗原结合片段都在本发明的范围内。抗体片段期望地包含例如一个或多个CDR、可变区(或其部分)、恒定区(或其部分)或其组合。抗体片段的实例包括但不限于：(i)Fab片段，它是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段，(ii)F(ab′)2片段，它是包含在铰链区处通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段，(iii)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(iv)Fab′片段，它是由使用温和还原条件断开F(ab′)2片段的二硫桥导致的，(v)二硫键稳定的Fv片段(dsFv)，和(vi)结构域抗体(dAb)，它是特异性结合抗原的抗体单可变区结构域(VH或VL)多肽。
如本文所用，术语“重组”意指特定核酸(DNA或RNA)是克隆、限制、聚合酶链反应(PCR)和/或连接步骤的各种组合的产物，所述组合产生具有可与天然系统中发现的内源核酸区分的结构编码序列或非编码序列的构建体。编码多肽的DNA序列可以由cDNA片段或由一系列合成寡核苷酸组装以提供能够由包含在细胞中或无细胞转录和翻译系统中的重组转录单元表达的合成核酸。包含相关序列的基因组DNA还可用于重组基因或转录单元的形成中。非翻译DNA的序列可存在于开放阅读框的5′端或3′端，其中此类序列不干扰编码区的操作或表达，并且可通过各种机制起到调节期望产物的产生的作用。或者，未翻译的编码RNA的DNA序列也可被认为是重组的。因此，术语“重组”核酸还指代非天然存在的(例如，通过人工干预通过人工组合序列的两个另外分开的区段而制成的)核酸。这种人工组合常常通过化学合成方式或通过人工操纵核酸的分开区段(例如，通过基因工程技术)来完成。通常这样做是为了用编码相同氨基酸、保守氨基酸或非保守氨基酸的密码子来替代密码子。或者，可以执行人工组合以将具有期望功能的核酸区段连接在一起以生成期望的功能组合。这种人工组合常常通过化学合成方式或通过人工操纵核酸的分开区段(例如，通过基因工程技术)来完成。当重组多核苷酸编码多肽时，所编码的多肽的序列可以是天然存在的(“野生型”)或可以是天然存在的序列的变体(例如，突变体)。因此，术语“重组”多肽不必是指其序列不是天然存在的多肽。相反，“重组”多肽通过重组DNA序列来编码，但多肽的序列可以是天然存在的(“野生型”)或非天然存在的(例如，变体、突变体等)。因此，“重组”多肽是人工干预的结果，但可包含天然存在的氨基酸序列。
如本文所用，术语“小分子”是指可调控生物过程的低分子量(＜900道尔顿)有机化合物，其尺寸通常为约1nm。小分子表现出多种生物学功能，并且可用于多种应用，诸如用于细胞信号传导中、用作药物和用作杀有害生物剂。小分子的实例包括但不限于氨基酸、脂肪酸、酚类化合物、生物碱、类固醇、胆素、类维生素A等。
如本文所用，术语“蛋白质组”是指由生物体表达的完整蛋白质组或在特定时间在特定细胞或组织类型中产生的特定蛋白质组。特定生物体、细胞或组织的蛋白质组响应于各种因素(包括生物体、细胞或组织的发育阶段、以及内部和外部条件)而积极变化。
术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，并且是指任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物(例如，奶牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠、和小鼠、非人灵长类动物(例如猴，诸如食蟹猴或恒河猴、黑猩猩等)和人)。在一些实施方案中，受试者可以是人或非人。在一些实施方案中，受试者是人。
血脑屏障渗透性
本公开提供了一种用于增加受试者的血脑屏障渗透性以增强将大分子(例如，治疗剂)递送至罹患中枢神经系统(CNS)疾病或病症的受试者的大脑的方法。
术语“血脑屏障(BBB)”用于描述中枢神经系统的微脉管系统的独特性质。BBB是紧密结合的内皮细胞(EC)层，其覆盖大脑中400英里毛细血管和血管，并形成大脑微脉管系统的管腔(Ransohoff等人，Nature Rev.Immun.，3：569-581(2003)；Abbott等人，Neurobiol.Dis.，37：13-25(2010))。BBB通过内皮细胞之间调控分子和细胞渗入和渗出中枢神经系统(CNS)的紧密连接实现屏障功能(Abbott等人，同上)。毛细血管内皮细胞内的特定转运系统的存在确保大脑以受控方式接收正常生长和功能所需的所有化合物。在许多情况下，这些转运系统由选择性地结合并跨屏障膜转运某些分子的膜相关蛋白组成。这些转运蛋白被称为溶质载体转运体。这种严格限制的屏障能力使BBB EC严格调控CNS稳态，这对于允许正常神经元功能以及保护CNS免受毒素、病原体、炎症、损伤和疾病至关重要。
BBB的限制性性质对药物向CNS的递送造成了障碍，并且已经做出重大努力来调节或绕过BBB以递送治疗剂(Larsen等人，Curr Top Med Chem.，14(9)：1148-60(2014)；和Daneman R.和Prat A.，Cold Spring Harb Perspect Biol，7(1)：a020412(2015))。实际上，据估计，超过98％的尺寸小于500Da的小分子药物不穿过BBB(Pardridge，“Brain DrugTargeting：the Future of Brain Drug Development，”Cambridge University Press，Cambridge，UK(2001)；Pardridge，NeuroRx，2：3-14(2005)；和美国专利申请公开2013/0224110)。当前用于CNS药物递送的策略分为三大类：化学BBB破坏、物理BBB破坏和药物修饰。
在神经系统疾病(包括中风、多发性硬化症(MS)、脑外伤和神经退行性病症)期间，一些或大部分BBB屏障性质的损失是这些疾病的病理和进展的主要组成部分(Zlokovic，B.V.，Neuron，57(2)：178-201(2008)；和Daneman R，Ann Neurol.Nov；72(5)：648-72(2012))。BBB功能障碍还可导致离子失调、信号传导稳态改变以及免疫细胞和分子进入CNS，所有这些都可导致神经元功能障碍和退化。
在一些实施方案中，本公开提供了一种用于增加受试者的血脑屏障渗透性的方法，其包括向受试者施用抑制大脑中的碱性磷酸酶蛋白(ALPL)活性的剂。除了构成BBB的毛细血管内皮细胞外，将血液与中枢神经系统(“CNS”)的脑脊液(“CSF”)分离的脉络丛(“CP”)的上皮细胞也共同充当CNS屏障。因此，在一些实施方案中，用于增加受试者的BBB渗透性的方法可以增加BBB、CP和/或CNS屏障的渗透性。
碱性磷酸酶是在高pH下水解各种单磷酸酯的膜结合糖蛋白(Weiss等人，Proc.Nat.Acad.Sci.，83：7182-7186(1986))。肝/骨/肾碱性磷酸酶，也称为组织非特异性碱性磷酸酶(TNAP)，在生理上充当脂质锚定的磷酸乙醇胺(PEA)和吡哆醛-5-磷酸盐(PLP)外磷酸酶。组织非特异性碱性磷酸酶由ALPL基因编码(Weiss等人，同上)。推导出的524个氨基酸的ALPL蛋白具有17个氨基酸的推测的信号肽和57.2kD的预测分子量。ALPL蛋白与胎盘碱性磷酸酶共享52％的序列同一性。ALPL蛋白是骨钙化的关键效应物，并且对正常骨骼发育至关重要，因为ALPL中的次形态突变导致低磷酸酯酶症患者的矿化缺陷(Sheen等人，JBone Miner Res.，30(5)：824-836(2015)；Murshed等人，Genes Dev.，19(9)：1093-1104(2005)；Lomashvili等人，Kidney Int.，85(6)：1351-1356(2014)；Savinov等人，J AmHeart Assoc.，4(12)：e002499(2015)；Romanelli等人；PLoS One，12(10)：e0186426(2017)；和Whyte等人，N Engl J Med.，366(10)：904-913(2012))。如本文所证明的(参见实施例)，ALPL在老年大脑的BBB中上调，并且ALPL的抑制增强了血浆以及转铁蛋白和转铁蛋白受体抗体的脑摄取。ALPL基因的核酸序列可从例如国家生物技术信息中心(NCBI)的GenBank数据库以登录号NG_008940.1公开获得。ALPL氨基酸序列可从例如GenBank数据库以登录号NP_001356734.1、NP_001356733.1和NP_001356732.1公开获得。
ALPL活性的抑制可将BBB渗透性增加任何合适的量或程度。例如，ALPL抑制可将BBB渗透性增加约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25倍，或由前述值中的任意两个限定的范围。BBB渗透性的增加可在任何合适的持续时间内发生。例如，BBB渗透性的增加可持续5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、24小时或更长时间。
如本文所用，短语“抑制ALPL”是指物质或方法干扰ALPL的表达和/或生物活性或功能的能力。抑制程度可以是部分完全(例如，10％或更多、25％或更多、50％或更多或75％或更多)、基本上完全(例如，85％或更多、90％或更多或95％或更多)或充分完全(例如，98％或更多或99％或更多)。如本文所公开的ALPL的抑制可涉及干扰或抑制ALPL的生物活性。可使用任何合适的剂来抑制ALPL生物活性。在一个实施方案中，例如，抑制ALPL包括使受试者与抑制ALPL蛋白活性的剂接触。任何合适的抑制碱性磷酸酶的剂都可用于所公开的方法中。此类剂包括但不限于磷酸盐衍生物、膦酸盐、钒酸盐、砷酸盐和高精氨酸(Fernley，H.N.和Walker，P.G.，Biochem.J.，104(3)：1011-1018(1967)；Shirazi等人，Biochem J.，194(3)：803-809(1981))或其他抑制酶活性的小分子。抑制组织非特异性碱性磷酸酶(即，ALPL蛋白)的小分子包括但不限于芳基磺酰胺，诸如描述于例如Dahl等人，J.Med.Chem.，52(21)：6919-6925(2009)和WO 2013/126608中的那些，所述文献和专利各自以引用方式整体并入本文。其他抑制剂包括例如含有吡唑、三唑或咪唑支架的小分子(参见例如Chung等人，Molecules，15.5：3010-3037(2010))、干扰ALPL二聚化的小分子和与蛋白降解子(degron)连接以诱导蛋白质降解的小分子。ALPL抑制剂还包括针对ALPL的抗体(例如，在任何合适的动物物种中产生的单克隆或多克隆抗体，或其抗原结合片段)。
在一些实施方案中，可向受试者施用两种或更多种抑制ALPL的剂的组合。例如，本文所述的任何小分子抑制剂可与在血脑屏障上具有受体或转运体的其他蛋白质配体(例如，瘦蛋白或重组抗体)同时或依次施用。可从多种来源商购获得的抗ALPL抗体也可与在血脑屏障上具有受体或转运体的其他蛋白质配体同时或依次施用。
在其他实施方案中，抑制受试者的ALPL包括抑制ALPL的表达。ALPL表达的抑制可以在mRNA或蛋白质水平，并且可以由合成减少、降解增加或两者导致。在某些实施方案中，所述方法包括抑制编码ALPL的基因的表达。ALPL基因表达可使用本领域已知的任何合适的剂和/或方法来抑制。例如，ALPL基因表达可使用抑制性核酸分子来抑制，包括例如小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、反义寡核苷酸、适体或核糖酶。或者，可通过将一种或多种突变(例如，核酸的插入或缺失或点突变)引入到ALPL基因中来抑制ALPL基因表达，从而损害或消除转录。在一些实施方案中，所有或部分ALPL基因是缺失的。ALPL基因中可缺失任意数量的核酸，只要缺失足以消除或损害基因转录或基因功能。期望地，整个ALPL基因在合适的细胞(例如，脑内皮细胞)中是去除的或缺失的。用于灭活基因的任何合适的“敲除”技术可用于抑制ALPL基因表达，这些技术中的多种是本领域已知的。此类方法包括但不限于同源重组、位点特异性核酸酶(例如，CRISPR/Cas9系统、锌指核酸酶)和条件敲除系统(例如，Cre/lox技术)。基因编辑技术进一步描述于例如Appasani，K.(编)，Genome Editing andEngineering：From TALENs，ZFNs and CRISPRs to Molecular Surgery，第1版，CambridgeUniversity Press(2018))。
跨血脑屏障递送治疗剂
本公开还提供了一种用于将治疗剂递送至有需要的受试者的大脑的方法，其包括向受试者施用：(a)抑制大脑中的碱性磷酸酶蛋白(ALPL)活性的剂；和(b)治疗剂。治疗剂可与抑制大脑中ALPL活性的剂同时施用于受试者。或者，治疗剂可以在施用抑制大脑中的ALPL活性的剂之前或之后施用于受试者。当治疗剂和抑制ALPL活性的剂分开施用时，每种剂的施用可以间隔多达5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5，小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时或24小时。
可向受试者施用任何合适的治疗剂。理想地，治疗剂适用于治疗中枢神经系统(CNS)的疾病或病症。在一些实施方案中，治疗剂是大分子。大分子可以是生物聚合物，诸如核酸序列、蛋白质或多肽，或碳水化合物。大分子治疗剂可具有任何合适的尺寸。例如，大分子治疗剂的尺寸可为约150kDa至约70,000kDa(例如，尺寸为约200kDa、约500kDa、约1,000kDa、约2,000kDa、约5,000kDa、约10,000kDa、约15,000kDa、约20,000kDA、约30,000kDa、约40,000kDa、约50,000kDa或约60,000kDa，或由前述值中的任意两个限定的范围)。
在某些实施方案中，大分子治疗剂可以是生物活性蛋白或肽。此类蛋白质的实例包括抗体、酶、类固醇、生长激素和生长激素释放激素、促性腺激素释放激素及其激动剂和拮抗剂类似物、生长抑素及其类似物、促性腺激素、肽T、甲状腺降钙素、甲状旁腺激素、胰高血糖素、加压素、催产素、血管紧张素I和II、缓激肽、胰激肽、促肾上腺皮质激素、促甲状腺激素、胰岛素、胰高血糖素以及任何前述分子的类似物或衍生物。蛋白质或肽可以是合成的或天然存在的肽，包括天然存在的肽的变体或衍生物。肽治疗剂可以是线性肽、环肽、约束肽或模拟肽。
在一些实施方案中，蛋白质或肽治疗剂可特异性结合与神经系统病状相关的靶蛋白或结构。因此，根据本公开，蛋白质或肽治疗剂可用于选择性靶向与神经系统病状相关的靶蛋白或结构(例如，用于诊断或治疗)(参见例如美国专利申请公开2009/0238754)。特异性结合与神经系统病状相关的靶蛋白或结构的蛋白质或肽治疗剂包括但不限于阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)、大脑淀粉样血管病(CAA)和脑血管疾病(CVD)的淀粉样斑块中的Aβ肽；帕金森病(Parkinson’s disease)中的路易体(Lewy body)中的α-突触核蛋白沉积物、额颞叶痴呆和皮克病(Pick’s disease)的神经原纤维缠结中的tau；肌萎缩侧索硬化症中的过氧化物歧化酶；以及亨廷顿舞蹈症(Huntington’s disease)和良性和癌性脑肿瘤(诸如胶质母细胞瘤、垂体瘤或脑膜瘤)中的亨廷顿蛋白(Huntingtin)。
在其他实施方案中，大分子治疗剂可以是抗体，诸如单克隆或多克隆抗体(如上所述)。抗体可特异性结合与神经系统病状相关的靶蛋白或结构，诸如与淀粉样疾病相关的靶蛋白或结构(诸如特定构象或自聚集状态)。此类抗体包括例如抗淀粉样蛋白抗体6E10和NG8(参见例如Hunter S.，Brayne C.，J Negat Results Biomed.，16(1)：1(2017))。其他抗淀粉样蛋白抗体是本领域已知的，特异性结合与其他神经系统病状相关的蛋白质或结构的抗体也是本领域已知的，其中任何一种都可以用于本文公开的方法中。
在某些实施方案中，大分子治疗剂是单克隆抗体。合适的单克隆抗体包括但不限于：6E10、PF-04360365、131I-chTNT-1/B MAb、131I-L19SIP、177Lu-J591、ABT-874、AIN457、阿仑单抗(alemtuzumab)、抗PDGFRα单克隆抗体IMC-3G3、砹At211单克隆抗体81C6、巴匹珠单抗(bapineuzumab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、西妥木单抗(cixutumumab)、达利珠单抗(daclizumab)、Hu MiK-β-1、HuMax-EGFr、碘I 131单克隆抗体3F8、碘I 131单克隆抗体81C6、碘I 131单克隆抗体8H9、碘I 131单克隆抗体TNT-1/B、LMB-7免疫毒素、MAb-425、MGAWN1、Me1-14F(ab’)2、M-T412、那他珠单抗(natalizumab)、neuradiab、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、帕尼单抗(panitumumab)、雷莫卢单抗(ramucirumab)、兰尼单抗(ranibizumab)、SDZ MSL-109、索拉珠单抗(solanezumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、乌司奴单抗(ustekinumab)、扎妥木单抗(zalutumumab)、他尼珠单抗(tanezumab)、阿柏西普(aflibercept)、MEDI-578、REGN475、莫罗单抗-CD3(muromonab-CD3)、阿比昔单抗(abiximab)、利妥昔单抗(rituximab)、巴利昔单抗(basiliximab)、帕利珠单抗(palivizumab)、英夫利西单抗(infliximab)、吉妥单抗(gemtuzumab ozogamicin)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、阿达木单抗(adalimumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、托西莫单抗(tositumomab)、托西莫单抗-I131、依法利珠单抗(efalizumab)、阿昔单抗(abciximab)、赛妥珠单抗(certolizumab pegol)、艾库组单抗(eculizumab)、AMG-162、扎诺莫单抗(zanolimumab)、MDX-010、抗0MRSA mAb、培克珠单抗(pexelizumab)、美泊利单抗(mepolizumab)、依帕珠单抗(epratuzumab)、抗RSVmAb、阿非莫单抗(afelimomab)、卡妥索单抗(catumaxomab)、WX-G250或其组合。用于治疗大脑病症的治疗性抗体进一步描述于例如
Figure BDA0003727978690000271
P.O.，Urich E.，Neuropharmacology，120：38-55(2017)；和Yu Y.J.和Watts R.J.，Neurotherapeutics，10(3)：459-72(2013)。
在其他实施方案中，大分子治疗剂可以是神经营养蛋白。合适的神经营养蛋白包括但不限于神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3(NT-3)、神经营养因子-4(NT-4)、神经营养因子-5(NT-5)、胰岛素样生长因子(IGF-I和IGF-II)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、睫状神经营养因子(CNTF)、表皮生长因子(EGF)、胶质源性连接蛋白(GDN)、转化生长因子(TGF-α和TGF-β)、白介素、血小板衍生生长因子(PDGF)和S100β蛋白及其类似物和衍生物。
在其他实施方案中，大分子治疗剂可以是与突触囊泡膜相关的蛋白质，诸如钙结合蛋白和其他突触囊泡蛋白。钙结合蛋白包括例如细胞骨架相关蛋白，诸如钙调蛋白结合蛋白(caldesmon)、膜联蛋白、钙电蛋白(哺乳动物)、钙电蛋白(电鳐)、依钙结合蛋白I(calpactin I)、依钙结合蛋白复合物、依钙结合蛋白II、内联蛋白I、内联蛋白II、蛋白质II、会联蛋白I和酶调控因子，诸如p65。其他突触囊泡蛋白包括动员抑制剂(诸如突触蛋白Ia、Ib和突触蛋白IIa、IIb)、突触素(synaptophysin)和功能未知的蛋白，诸如p29、VAMP-1、2(小突触囊泡蛋白(synaptobrevin))、VAT1、rab 3A和rab 3B。
大分子治疗剂还包括α、β和γ干扰素、依泊汀(epoetin)、非格司亭(fligrastim)、沙格莫丁(sargramostin)、CSF-GM、人IL、TNF和其他生物技术药物。大分子治疗剂还可以是使用重组生物技术方法获得的肽、蛋白质或抗体。
在其他实施方案中，治疗剂可以是小分子药物。可以向受试者施用任何合适的小分子药物。理想地，小分子药物是能够治疗中枢神经系统疾病或病症的剂。用于治疗CNS的疾病、病症或病状的合适小分子药物包括但不限于：对乙酰氨基酚(acetaminophen)、乙酰水杨酸(acetylsalicylic acid)、酰基转移酶、阿普唑仑(alprazolam)、金刚烷胺(amantadine)、氨磺必利(amisulpride)、阿米替林(amitriptyline)、安非他命-右旋安非他命(amphetamine-dextroamphetamine)、安吖啶(amsacrine)、抗精神病药物、抗病毒剂、阿扑吗啡(apomorphine)、阿瑞洛莫(arimoclomol)、阿立哌唑(aripiprazole)、阿塞那平(asenapine)、天冬酰转移酶(aspartoacyclase enzyme)、阿托莫西汀(atomoxetine)、非典型抗精神病药物、硫唑嘌呤(azathioprine)、巴氯芬(baclofen)、苄氯丙酰胺(beclamide)、苄丝肼(benserazide)、苄丝肼-左旋多巴(benserazide-levodopa)、苯二氮
Figure BDA0003727978690000291
类(benzodiazepines)、苯扎托品(benztropine)、博来霉素(bleomycin)、布瓦西坦(brivaracetam)、溴隐亭(bromocriptine)、丁丙诺啡(buprenorphine)、安非他酮(bupropion)、卡麦角林(cabergoline)、卡马西平(carbamazepine)、carbatrol、卡比多巴(carbidopa)、卡比多巴-左旋多巴、卡铂(carboplatin)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、氯丙嗪(chlorpromazine)、氯普噻吨(chlorprothixene)、顺铂(cisplatin)、西酞普兰(citalopram)、氯巴占(clobazam)、氯米帕明(clomipramine)、氯硝西泮(clonazepam)、氯氮平(clozapine)、可待因(codeine)、COX-2抑制剂、环磷酰胺、放线菌素D(dactinomycin)、右哌甲酯(dexmethylphenidate)、右旋安非他命(dextroamphetaine)、二乙酰吗啡(diamorphine)、地西泮直肠凝胶(diastat)、地西泮(diazepam)、双氯芬酸(diclofenac)、多奈哌齐(donepezil)、阿霉素(doxorubicin)、氟哌利多(droperidol)、恩他卡朋(entacapone)、泛艾霉素(epirubicin)、艾司西酞普兰(escitalopram)、乙琥胺(ethosuximide)、依托泊苷(etoposide)、非氨酯(felbamate)、氟西汀(fluoxetine)、三氟噻吨(flupenthixol)、氟奋乃静(fluphenazine)、磷苯妥英(fosphenytoin)、加巴喷丁(gabapentin)、加兰他敏(galantamine)、γ羟基丁酸、吉非替尼(gefitinib)、氟哌啶醇(haloperidol)、乙内酰脲类(hydantoins)、氢可酮(hydrocordone)、羟嗪、布洛芬(ibuprofen)、异环磷酰胺(ifosfamide)、IGF-1、伊潘立酮(iloperidone)、伊马替尼(imatinib)、丙咪嗪(imipramine)、干扰素类、伊立替康(irinotecan)、KNS-760704、拉考沙胺(lacosamide)、拉莫三嗪(lamotrigine)、左乙拉西坦(levetiracetam)、左旋多巴、左美丙嗪(levomepromazine)、赖氨酸安非他命(lisdexamfetamine)、麦角乙脲(lisuride)、碳酸锂、解酯酶(lypolytic enzyme)、氮芥(mechlorethamine)、mGluR2激动剂、美金刚(memantine)、哌替啶(meperidine)、巯嘌呤(mercaptopurine)、美索达嗪(mesoridazine)、甲琥胺(mesuximide)、甲基苯丙胺(methamphetamine)、派醋甲酯(methylphenidate)、米诺环素(minocycline)、莫达非尼(modafinil)、吗啡(morphine)、N-乙酰半胱氨酸、萘普生(naproxen)、奈非那韦(nelfinavir)、neurotrin、硝西泮(nitrazepam)、NSAID类、奧氮平(olanzapine)、阿片类(opiates)、奥司他韦(oseltamivir)、奥沙利铂(oxaplatin)、帕利哌酮(paliperidone)、泛酸激酶2、Parkin、帕罗西汀(paroxetine)、培高利特(pergolide)、哌氰嗪(periciazine)、奋乃静(perphenazine)、苯乙酰脲(phenacemide)、苯乙肼(phenelzine)、苯巴比妥(phenobarbitol)、芬脲(phenturide)、苯妥英(phenyloin)、匹莫齐特(pimozide)、Pink1、吡贝地尔(piribedil)、鬼臼毒素(podophyllotoxin)、普拉克索(pramipexole)、普瑞巴林(pregabalin)、扑米酮(primidone)、丙氯拉嗪(prochlorperazine)、普马嗪(promazine)、异丙嗪(promethazine)、普罗替林(protriptyline)、嘧啶二酮类、喹硫平(quetiapine)、雷沙吉兰(rasagiline)、瑞马西胺(remacemide)、利鲁唑(riluzole)、利培酮(risperidone)、利托那韦(ritonaVir)、卡巴拉汀(rivastigmine)、罗匹尼罗(ropinirole)、罗替戈汀(rotigotine)、卢非酰胺(rufinamide)、选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRI)、selegine、司来吉兰(selegiline)、舍吲哚(sertindole)、舍曲林(sertraline)、丙戊酸钠、司替戊醇(stiripentol)、紫杉烷类(taxanes)、替马西泮(temazepam)、替莫唑胺(temozolomide)、泰诺福韦(tenofovir)、丁苯那嗪(tetrabenazine)、硫胺素(thiamine)、硫利达嗪(thioridazine)、氨砜噻吨(thiothixene)、噻加宾(tiagabine)、托卡朋(tolcapone)、托吡酯(topiramate)、拓扑替康(topotecan)、曲马多(tramadol)、反苯环丙胺(tranylcypromine)、三环类抗抑郁药、三氟拉嗪(trifluoperazine)、三氟丙嗪(triflupromazine)、苯海索(trihexyphenidyl)、奥卡西平(trileptal)、伐昔洛韦(valaciclovir)、戊诺酰胺(valnoctamide)、丙戊酰胺(valproamide)、丙戊酸、文拉法辛(venlafaxine)、水疱性口炎病毒(vesicularstomatitis virus)、氨己烯酸(vigabatrin)、长春花生物碱(vinca alkaloid)、扎那米韦(zanamivir)、齐拉西酮(ziprasidone)、唑尼沙胺(zonisamide)、佐替平(zotepine)、珠氯噻醇(zuclopenthixol)和任何前述项的类似物或衍生物。
可根据本发明施用的其他治疗剂或化合物可以是期望穿过BBB的任何类别的药物或药剂。此类治疗剂包括但不限于抗生素、抗寄生虫剂、抗真菌剂、抗病毒剂和抗肿瘤剂。
CNS疾病、病症或病状是影响大脑和/或脊髓(统称为中枢神经系统(CNS))的任何疾病、病症或病状。可根据本发明的方法治疗的CNS疾病、病症或病状包括但不限于成瘾、蛛网膜囊肿(arachnoid cysts)、自闭症(autism)、僵硬症(catalepsy)、脑炎(encephalitis)、闭锁综合征(locked-in syndrome)、脑膜炎(meningitis)、多发性硬化症(MS)、脊髓病(myelopathy)、代谢性疾病、行为障碍、人格障碍、痴呆、癌症、神经退化性疾病(例如，阿尔茨海默病、亨廷顿舞蹈症和帕金森病)、中风、疼痛、病毒感染、睡眠障碍、癫痫(epilepsy)/癫痫症(seizure disorder)、酸性脂肪酶疾病、法布里病(Fabry disease)、韦尼克-科尔萨科夫综合征(Wernicke-Korsakoff syndrome)、注意力缺陷/多动障碍(ADHD)、焦虑症、边缘性人格障碍(borderline personality disorder)、双相障碍(bipolardisorder)、抑郁症、进食障碍、强迫症(obsessive-compulsive disorder)、精神分裂症(schizophrenia)、巴氏綜合症(Barth syndrome)、图雷特氏综合征(Tourette’ssyndrome)、卡拿弯病(Canavan disease)、哈勒沃登-施帕茨病(Hallervordeh-Spatzdisease)、路易体病、卢伽雷氏症(Lou Gehrig’s disease)、马查多-约瑟夫病(Machado-Joseph disease)、不安腿综合征(restless Leg syndrome)、创伤性脑损伤(traumaticbrain injury，TBI)和自身免疫疾病。
治疗剂和抑制ALPL活性的剂可一起配制成单一组合物。或者，可将治疗剂和抑制ALPL活性的剂配制成可如本文所述同时或依次施用的分开的组合物。在任一种情况下，组合物期望地是药学上可接受的(例如，生理学上可接受的)组合物，其包含载体，优选药学上可接受的(例如，生理学上可接受的)载体，以及治疗剂和/或ALPL抑制剂。在本公开的上下文中可以使用任何合适的载体，并且此类载体是本领域众所周知的。载体通常将是液体，但也可以是固体，或液体和固体组分的组合。载体的选择将至少部分地由靶组织和/或细胞的位置以及用于施用组合物的特定方法来确定。
组合物还可包含任何其他合适的组分，尤其是用于增强组合物的稳定性和/或其最终用途。因此，本发明的组合物有多种合适的制剂。以下制剂和方法仅具有示例性，并且决不具有限制性。
适于肠胃外施用的制剂包括水性和非水性等渗无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂、和使制剂与预期接收者的血液等渗的溶质、以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、以及防腐剂。制剂可以存在于单位剂量或多剂量密封容器(诸如安瓿和小瓶)中，并且可以在冷冻干燥(冻干)条件下储存，仅需要在临使用之前添加无菌液体赋形剂(例如，水)来注射。在本公开的上下文中可以使用任何合适的载体，并且此类载体是本领域众所周知的。例如，组合物可含有防腐剂，例如像对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。可任选地使用两种或更多种防腐剂的混合物。此外，组合物中可包括缓冲剂。合适的缓冲剂包括例如谷氨酸(谷氨酸盐)、柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和各种其他酸和盐。可任选地使用两种或更多种缓冲剂的混合物。
临时注射溶液和悬浮液可以由无菌粉末、颗粒和片剂制备。组合物可被配制用于口服施用。合适的口服制剂包括例如片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等。组合物可被配制用于肠胃外施用，例如静脉注射、腹腔内注射、肌肉内注射、皮下注射等。本发明的化合物或剂还可以气溶胶的形式直接施用于气道。对用作气溶胶来说，呈溶液或悬浮液形式的本发明的化合物可与合适的推进剂(例如使用常规佐剂的烃推进剂，如丙烷、丁烷或异丁烷)一起包装在加压气溶胶容器中。组合物还可以非加压形式(诸如在喷雾器或雾化器中)施用。用于制备药用组合物的方法是本领域技术人员已知的，并且描述于例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，Lippincott Williams&Wilkins；第21版(2005年5月1日)。
本公开还提供了一种用于鉴定调控哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、灵长类动物或人)的血脑屏障渗透性的蛋白质或其他生物分子的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：(a)可检测地标记从第一哺乳动物中分离的血浆的蛋白质组或其他表达的生物分子(RNA)；(b)将包含标记的蛋白质组或其他表达的生物分子的分离血浆引入到第二哺乳动物中；(c)从形成血脑屏障的第二哺乳动物中分离出脑内皮细胞；(d)使用流式细胞术测量分离的脑内皮细胞中的每一个中的血浆摄取，以产生分选的脑内皮细胞群；(e)检测与血浆摄取相关的基因在分选的脑内皮细胞中的每一个中的表达；和(f)选择由其表达与脑内皮细胞中血浆摄取增加或减少相关的基因编码的蛋白质或其他生物分子，由此所述蛋白质或其他生物分子调控受试者的血脑屏障渗透性。在一些实施方案中，此类鉴定的分子用于研究或临床目的以调控血脑屏障渗透性。例如，如上文针对ALPL所述，操纵此类分子的表达或活性以实现期望结果。
可使用任何期望的方法来完成血液收集和全血的血浆分离(separation/isolation)。应当理解，血清是在使血液凝结之后收集的全血的液体馏分。通过离心去除凝块，并使用移液管小心地去除所得上清液(命名为血清)。当将全血收集在用抗凝剂处理的管中时产生血浆。血液不在血浆管中凝结。通过离心去除细胞。使用移液管小心地将上清液(命名为血浆)从细胞沉淀物中去除。用于血液收集和血浆分离的系统和方法可从多种来源商购获得，这些系统和方法中的任何一种都可用于本文所述的方法中。
用于可检测地标记从哺乳动物中分离的血浆的蛋白质组或其他生物分子的方法是本领域已知的并且可以与本文所述的方法结合使用。例如，使用等压串联质量标签(诸如用于相对和绝对定量试剂的等压标签(iTRAQ)和串联质量标签(TMT)试剂)进行化学标记已经被用于广泛的不同临床导向的血清和血浆蛋白质组学研究(参见例如Moulder等人，MassSpectrometry Reviews，37(5)：583-606(2018))。还可以使用荧光标记方法，诸如描述于例如Liu等人，Proteomics，12(14)：2258-70(2012)；Leclerc等人，Bioconjugate Chem.，29(8)：2541-2549(2018)；Volke，D.和R.Hoffmann，Electrophoresis，29(22)：4516-4526(2008)；和Obermaier等人，Methods Mol Biol.，1295：153-65(2015)中的那些，所述文献以引用的方式整体并入本文。在某些实施方案中，使用荧光标记方法来可检测地标记血浆蛋白质组。
一旦已经可检测地标记从第一哺乳动物中分离的血浆的蛋白质组，然后就将包含标记的蛋白质组的分离血浆引入到第二哺乳动物中以允许BBB渗透性的可视化和测量。第二哺乳动物和第一哺乳动物期望地是相同类型的哺乳动物(例如，均为小鼠、大鼠或非人灵长类动物)。在允许将包含标记的蛋白质组的血浆摄取到第二哺乳动物的BBB的内皮细胞中的条件下，将包含标记的蛋白质组的分离血浆引入到第二哺乳动物中。在足以使第二哺乳动物的BBB摄取包含标记的蛋白质组的血浆一段时间后，可使用本领域已知的任何合适方法从第二哺乳动物中分离形成血脑屏障的脑内皮细胞。脑内皮细胞分离方案描述于例如Assmann等人，Bio Protoc.，7(10)：e2294(2017)；Welser-Alves等人，Methods Mol Biol.，1135：345-56(2014)；Luo等人，Methods Mol Biol.，1135：357-64(2014)；和Navone等人，Nature Protocols，8：1680-1693(2013)，所述文献以引用的方式整体并入本文。
BBB的脑内皮细胞的血浆摄取可使用本领域中用于测量跨BBB的药物转运的体外或体内方法来测量。体内方法包括例如静脉注射/脑取样、脑灌注、定量放射自显影、微透析和CSF取样。体外方法包括例如分析新鲜分离的脑微血管和内皮细胞培养物。用于测量跨BBB的药物和蛋白质转运的方法进一步详细描述于例如Bickel，U.，NeuroRx，2(1)：15-26(2005)；和Feng，M.R.，Curr Drug Metab.，3(6)：647-57(2002)。在一些实施方案中，可使用流式细胞术测量分离的脑内皮细胞中的每一个中的血浆摄取以产生分选的脑内皮细胞群。流式细胞术是一种当单个细胞或颗粒悬浮在缓冲的基于盐的溶液中时，快速分析单个细胞或颗粒流过单个或多个激光器的技术。分析每个颗粒的可见光散射和一个或多个荧光参数(例如，1个至30个或更多个参数)。在两个不同方向上测量可见光散射：(1)前向(前向散射或FSC)，其可以指示细胞的相对尺寸；和(2)90°(侧向散射或SSC)，其指示细胞的内部复杂性或粒度。光散射与荧光无关。通过荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白，GFP)的转染和表达、用荧光染料(例如，碘化丙啶、DNA)染色或用荧光缀合抗体(例如，CD3 FITC)染色来制备用于荧光测量的样品(参见例如McKinnon，K.M.，Curr Protoc Immunol.，120：5.1.1-5.1.11(2018))。特别是用于分析血脑屏障的流式细胞术方法描述于例如Williams等人，Cytometry A，87(10)：897-907(2015)，所述文献以引用的方式整体并入本文。
对分离的脑内皮细胞执行流式细胞术会导致流式细胞术分选(也称为“分选”)的脑内皮细胞群，然后分析这些细胞以检测与每个分选脑内皮细胞中的血浆摄取相关的基因的表达。就这一点而言，可以对脑内皮细胞进行分选，并且可记录每个分选细胞的荧光。然后可使用本领域已知的用于测量基因表达的任何合适方法来检测和量化每个分选细胞中的mRNA表达。此类方法包括但不限于定量或实时RT-PCR(qRT-PCR)、微阵列分析、RNA测序、原位杂交或Northern印记。在某些实施方案中，RNA测序(也称为“RNA-Seq”)用于检测与血浆摄取相关的基因的表达。RNA-Seq使用新一代测序(NGS)在特定时刻检测和量化生物样品中的RNA，从而允许分析不断变化的细胞转录组(Chu，Y.和Corey D.R.，Nucleic AcidTherapeutics，22(4)：271-274(2012)；和Wang等人，Nature Reviews Genetics，10(1)：57-63(2009))。RNA-Seq有利于检查替代基因剪接转录物、转录后修饰、基因融合、突变/单核苷酸多态性(SNP)和基因表达随时间变化的能力(Maher等人，Nature，458(7234)：97-101(2009))。除了mRNA转录物之外，RNA-Seq还可以用于分析不同的RNA群，诸如小RNA、miRNA、tRNA和核糖体。RNA-Seq方法和技术描述于例如Maekawa等人，Methods Mol Biol.，1164：51-65(2014)，并且用于单一细胞RNA-Seq的技术描述于例如Chen等人，Front.Genet.，10：317(2019)。
特定基因的表达可能与特定脑内皮细胞中蛋白质或其他生物分子的血浆摄取增加或减少相关。就这一点而言，特定基因表达的上调或下调可直接或间接导致蛋白质的血浆摄取增加(即，BBB渗透性增加)或蛋白质的血浆摄取减少(即，BBB渗透性降低)。如果与参照或对照水平相比，基因的表达降低了至少约20％(例如，25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多)，则所述表达下调。如果与参照或对照水平相比，基因的表达提高了至少约20％(例如，25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多)，则所述表达上调。由其上调或下调与血浆摄取增加或减少相关的基因编码的蛋白质或其他生物分子可被选择作为血脑渗透性的调控因子。
以下实施例进一步说明本发明，但是当然，不应解释为以任何方式限制其范围。
实施例
在描述于实施例中的实验中使用以下材料和方法。
动物
老年C57BL/6小鼠(20-24个月大)从国家老年啮齿动物群落研究所(NationalInstitute on Aging rodent colony)获得。年轻的雄性C57BL/6小鼠(3个月大)从Jackson实验室或Charles River实验室获得。所有实验均使用雄性小鼠。所有小鼠都保持12小时的光照/黑暗循环，并随意提供食物和水。所有动物护理和程序均遵守《动物福利法》，并符合机构指导，并得到V.A.Palo Alto动物研究委员会(V.A.Palo Alto Committee on AnimalResearch)和斯坦福大学实验动物护理机构管理小组(institutional administrativepanel of laboratory animal care at Stanford University)的批准。
血浆收集和标记
用250mM EDTA(Millipore Sigma)作为抗凝剂通过终末心内出血收集血液。通过在4℃下以1,000g离心15分钟来分离EDTA血浆，之后合并、等分、在液氮中快速冷冻并在-80℃下储存。丢弃溶血的血浆。在标记之前，将冷冻血浆在冰上解冻，轻轻混合，并检查沉淀物。血浆蛋白摩尔浓度大约为750μM。标记依赖于胺反应性NHS酯部分，并且每个指定标记的标记比率和时间根据经验确定：对于放射性示踪，NHS-DOTA(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸，大环化合物)以10倍摩尔比添加；对于荧光，NHS-Atto 647N(MilliporeSigma，ATTO-TEC)以1.4倍摩尔比添加；并且为了表征标记的血浆蛋白质组，NHS-生物素(Thermo Fisher)和NHS-反式环辛烯(Click Chemistry Tools)以17.5倍摩尔比添加。NHS-Atto 647N与血浆在室温下孵育1.5小时，然后PBS透析过夜。第二天，在室温下添加50mMTris pH 8.0，持续10分钟，并用Amicon Ultra-15离心过滤器，3KDa截止频率(MilliporeSigma，对于NHS-Atto 647N为10KDa)充分洗涤标记的血浆三次，并且随后在冷冻PBS中用Zeba脱盐离心柱(Zeba Spin Desalting Column)，7K MWCO截留值(Thermo Fisher)洗涤四次。在4℃下进行其他缀合过夜，之后洗涤。这些步骤扩展了洗涤，始终产生＞99％的64Cu标记的DOTA(下图)的放射化学纯度，以最大限度地减少来自残留游离标记的污染。在整个标记和洗涤步骤中，监测血浆样品的聚集和絮凝迹象。使用Nanodrop分光光度计(ThermoFisher)测量血浆浓度，并且每只小鼠静脉内(眼球后)施用大约10-15mg(0.5mg/g体重，与先前使用辣根过氧化物酶5、6、126的研究一致)，体积小于或等于150μL。
质谱和蛋白质微阵列对标记血浆的表征
对于通过质谱进行表征，使用ProteoPrep免疫亲和白蛋白和IgG去除试剂盒(ProteoPrep Immunoaffinity Albumin&IgG Depletion Kit，Millipore Sigma)去除标记的血浆中的白蛋白和IgG，在4℃下用四嗪琼脂糖(Click Chemistry Tools)富集过夜，并充分洗涤，如先前所述127。同时，使用顺磁珠处理未标记的血浆，称为单锅固相增强样品制备(Single-Pot Solid-Phase-enhanced Sample Preparation，SP3)，如先前所述128。使用Pierce高pH反相肽分馏试剂盒(Pierce High pH Reversed-Phase PeptideFractionation Kit，Thermo Fisher)分馏血浆，并使用基于C18的STAGE吸头清洁级联馏分并冻干。在LTQ Orbitrap Fusion Lumos Tribrid质谱仪(Thermo Fisher Scientific)上分析肽。通过毛细管反相色谱法在24cm反相柱(100μm内径，内部填充ReproSil-Pur C18-AQ3.0m树脂(Dr.Maisch))上分离肽180分钟。如下使用Dionex Ultimate 3000LC系统(ThermoFisher Scientific)实现四步线性梯度：97％A+3％B持续15分钟，75％A+25％B持续135分钟，55％A+45％B持续15分钟，以及5％A+95％B持续15分钟，其中缓冲液A为水中的0.1％甲酸，并且缓冲液B为乙腈中的0.1％甲酸。在Orbitrap质量分析器中以数据依赖性模式以120,000(FWHM)的分辨率和340-1540m/z扫描范围获取全MS扫描。AGC目标为4*105，并且FTMS1的最大注射时间为50ms。然后选择最强的离子进行测序，并在Orbitrap质量分析器中使用归一化碰撞能量为30％并且分辨率为15,000(FWHM)的高能碰撞解离(HCD)使所述最强的离子碎裂。启用了单同位素前体选择，并且从MS2分析中排除了单电荷离子种类和没有未分配电荷状态的离子。启用动态排除，其中重复计数为2，并且为MS2选择的离子周围±10ppm m/z窗口内的离子被排除在进一步选择的碎裂之外，持续30秒。AGC目标为5*104，并且最大注射时间为200ms。使用MaxQuant和Perseus(Max Planck)129、130处理和分析原始数据文件。简而言之，光谱与从uniprot.org下载的小家鼠数据库以及污染物和诱饵数据库匹配。前体质量耐受性设置为4.5p.p.m.，碎片离子耐受性设置为10p.p.m.，具有固定的Cys残基修饰(羧酰胺甲基化+57.021Da)以及可变的Met残基(Ox+15.995Da)、Lys残基(乙酰化+42.011Da)、Asn和Gln残基修饰(脱酰胺化+0.984Da)和N末端修饰(氨甲酰化+43.006Da)。使用FDR＜0.01计算肽鉴定，并且对于蛋白质定量，最小比率计数设置为1，使用unique和razor peptides两者进行定量。
为了通过蛋白质微阵列进行表征，从商业来源获得了针对数百个分泌的和可能切割的跨膜小鼠或人信号蛋白的ELISA级抗体，并使用机器人微阵列仪(NanoPrint LM210，Arrayit)以五个重复打印到SuperEpoxy2载玻片(Arrayit)上，如先前所述13。然后用3％(重量/体积)酪蛋白溶液封闭阵列，之后在4℃下与生物素化的血浆样品一起孵育过夜。洗涤后，将阵列与Alexa Fluor647缀合的链霉亲和素二抗(Thermo Fisher)一起孵育，并使用GenePix4400A扫描仪和GenePix Pro7软件(Molecular Devices)检测荧光信号。数据处理和分析按照先前描述的方法13。
脑灌注
用2.5％(体积/体积)的阿佛丁(Avertin)对小鼠实施安乐死，并用至少50ml的冷冻PBS经心脏灌注。使用蠕动泵执行灌注，其中流速不超过10ml/分钟以接近小鼠循环系统131-133的生理压力。灌注液从鼻孔漏出的小鼠未进一步处理用于分析。对于免疫组织化学(下文)，随后用4％多聚甲醛对小鼠进行灌注，取半脑进行流式细胞术(下文)时除外。
免疫组织化学
如先前所述12、13执行脑组织处理、免疫组织化学和免疫荧光实验。将半脑分离并且在4℃下后固定在4％(重量/体积)多聚甲醛中过夜，之后保存在PBS中的30％(重量/体积)蔗糖中。半脑在冷冻滑动切片机上以50μm的厚度进行冠状或矢状切片，并且切片保存在-20℃的冷冻保护介质中。用适当的血清封闭自由浮动切片，之后在4℃下与以下浓度的一抗一起孵育以进行共聚焦显微镜检查∶山羊单克隆抗CD31(1∶100，AF3628，R&D)、荧光素标记的凝集素(1∶200，Vector Laboratories)、兔单克隆抗水通道蛋白4(1∶500，AB2218，Millipore Sigma)、大鼠抗CD13(1∶100，MCA2183EL，Bio-Rad)、山羊抗Alpl/ALPL(1∶100，AF2909，R&D)、小鼠抗NeuN(1∶400，MAB377，Millipore)、山羊抗白蛋白(1∶100，NB600，Novus)、兔抗胶原蛋白I(1∶100，ab21286，Abcam)和山羊抗Iba1(1∶500，ab5076，Abcam)。洗涤切片，用Alexa Fluor缀合的二抗(1：250)染色，用ProLong Gold(Life Technologies)封片并盖上盖玻片，之后在共聚焦激光扫描显微镜(Zeiss LSM880)上成像。在50mM乙酸铵缓冲液(pH 5)中用1mM CuSO4淬灭年龄相关的自发荧光，如先前所述73。使用美国国立卫生研究院ImageJ软件量化由CD13、AQP4或ALPL覆盖的脉管系统(CD31或AQP4)的百分比，如先前所述63。所有分析均由不知情的观察者执行。如先前所述83执行茜素红(Alizarin red)染色，稍作修改：切片在室温下在PBS(pH 7.4)中的40mM茜素红中孵育1小时，并且在封片前用PBS充分洗涤过夜。通过常规光学显微镜检查获取脑切片图像以检测钙化结节。将具有生物素化血浆的切片在室温下在6％BSA中封闭过夜，用链霉亲和素-Alexa Fluor647(1∶1500，Thermo Fisher)检测2小时，并在封片前洗涤过夜。将含有L-叠氮高丙氨酸标记的血浆的切片在室温下在6％BSA中封闭过夜，在100％甲醇中的45mM碘乙酰胺(Millipore Sigma)中孵育1小时，洗涤，用100％甲醇中的1.2μM sDIBO(Thermo Fisher Scientific)检测，并且在封片前洗涤过夜。将全脑冠状和矢状切片以100μm处理，在Focusclear(CellExplorerLabs)中孵育，并且在图块中成像。使用红碱性磷酸酶底物试剂盒(Red AlkalinePhosphatase Substrate Kit，SK-5100，Vector Laboratories)测量血管ALPL活性，孵育20分钟。
γ计数、放射自显影和PET扫描
大鼠IgG2a(400501，BioLegend)和白蛋白/IgG血浆与1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(DOTA)的缀合使用无金属缓冲液执行，如先前所述13、134、135。在4℃下，用HEPES缓冲液(0.1mol 1-1，pH 8)中的10倍摩尔比的DOTA-NHS酯进行缀合过夜，并且用50mM Tris-HCl(Millipore Sigma)淬灭。通过Zeba脱盐离心柱(0.5ml，7K截留分子量，Thermo Fisher)去除过量的DOTA-NHS，并且将所得溶液缓冲液交换为乙酸铵缓冲液(0.1M，pH 5.5)以进行Cu-64标记。通过超滤(Amicon 0.5ml，Millipore Sigma)浓缩DOTA缀合物溶液并将其保持在冰上。如先前所述13执行使用64Cu(半衰期＝12.7小时)的放射性标记。简而言之，在37℃下将DOTA-IgG2a或DOTA-血浆(50μl中的25μg等分试样中)与pH平衡的[64Cu]Cl2溶液(pH 4.5-5.5，University of Wisconsin，Madison)混合，以400r.p.m轻轻摇动。孵育(对于IgG2a-DOTA为30分钟并且对于血浆-DOTA为60分钟)后，添加0.1M EDTA(0.5M，pH 8.0)至最终浓度为0.01M，并且在环境温度下孵育15分钟以清除未螯合的[64Cu]Cl2。通过G25 Sephadex尺寸排阻纯化(GE Life Sciences)实现纯化。放射化学纯度通过使用在盐水中开发的TEC-Control Chromatography试纸条(Biodex Medical Systems)的即时薄层色谱法和使用SEC 3000柱(Phenomenex)的尺寸排阻液相色谱法确定。
对小鼠静脉注射7.7±1.5MBq的64Cu标记的DOTA-IgG2a或64Cu标记的DOTA-血浆(放射化学纯度＞99％)。20小时后，将小鼠置于双microPET/CT扫描仪(Inveon，Siemens)中以捕获静态图像(10分钟)，以随后使用VivoQuant软件(4.0版，inviCRO)进行分析，如先前所述136、137。麻醉后，在经心脏灌注之前立即通过心脏穿刺收集血液样品(100-200μl)。按照文献13程序使用自动γ计数器(automated gamma counter，Hidex Oy，使用初始施用剂量的等分试样作为标准进行校准)评估血液和大脑中的组织相关放射性(剂量和衰减校正至注射时间)。使用处死时的心脏血液样品中的活性校正血浆和IgG的差异体内稳定性和清除率。将脑组织包埋在最佳切割温度化合物(Tissue-Tek)中，并且获得冠状切片(40μm)以进行离体放射自显影。放射自显影使用先前描述的方法13、138进行：对40μm切片进行封片，风干10分钟，然后在-20℃下暴露于数字存储荧光屏(Amersham Biosciences)72小时。使用台风9410可变模式成像仪(Typhoon 9410Variable Mode Imager，Perkin Elmer)分析图像板。然后对载玻片进行尼氏染色并使用Nanozoomer 2.0-RS(Hamamatsu)进行扫描，以实现解剖学共定位。使用ImageJ对图像进行盲法可视化、处理和定量。为了定量，为每只小鼠绘制了至少10个尺寸一致的海马区和皮质区。对每只小鼠的平均像素强度进行剂量和衰减校正。
用于流式细胞术分析的原代CNS细胞分离
CNS细胞分离采用先前描述的方法42、139、140。简而言之，使用神经解离试剂盒(Neural Dissociation Kit，Miltenyi)对皮质和海马体进行显微解剖、切碎和消化。通过100μm过滤器过滤悬浮液，并通过在0.9M蔗糖中离心来去除髓磷脂。将剩余的去除髓磷脂的细胞悬浮液在冰上用Fc预封闭剂(CD16/CD32，BD 553141)封闭十分钟，并用抗体染色30分钟以区分脑内皮细胞(CD31+/CD45-)、星形胶质细胞(ACSA-2+)和神经元(NeuN+或CD90.2/Thy1.2+)。为了分析血浆摄取，每个样本分析了每个感兴趣群体的至少1,000个细胞。抗体稀释液∶大鼠抗CD31-PE/CF594(1∶100，克隆MEC 13.3，BD，目录号563616)、大鼠抗CD45-PE/Cy7(1∶200，克隆30-F11，Biolegend，目录号103114)、大鼠抗ACSA-2-PE(1∶200，克隆IH3-18A3，Miltenyi，目录号130-102-365)、小鼠抗NeuN-PE(1∶100，克隆A60，Millipore Sigma，目录号FCMAB317PE)和大鼠抗CD90.2-FITC(1∶100，克隆30-H12，Biolegend，目录号105305)。
流式索引分选和单细胞RNA测序
如先前所述139-141使用Smart-seq-2方案在384孔格式中执行细胞裂解、第一链合成和cDNA合成，其中进行了一些修改。简而言之，使用SH800S(Sony)分选机在最高纯度设置(“单细胞”)下对脑内皮细胞(CD31+/CD45-)进行分选。记录每个细胞和对应的分选孔的血浆-647荧光。使用Smart-seq2方案140-142执行cDNA合成。在cDNA扩增(23个循环)后，经由PicoGreen定量测定法确定浓度。通过自定义脚本选择通过质量控制的细胞，并使用TPPLabtech Mosquito HTS和Mantis(Formulatrix)机器人平台将cDNA浓度归一化至约0.2ng/μL。按照制造商的说明，使用Nextera XT试剂盒(Illumina)制备和合并库。然后在Nextseq或Novaseq(Illumina)上使用2x75bp配对末端读数和2x8bp索引读数、使用200循环试剂盒(Illumina，20012861)对库进行测序。以每个细胞平均1.5M读数对样品进行测序。使用bcl2fastq对原始测序文件进行多路分解，使用STAR比对读数，并使用HTSEQ 0.6.1p1版本进行基因计数。如先前所述58执行下游分析，并且每个细胞的血浆荧光与基因表达和分区59相关(斯皮尔曼)。
ALPL抑制剂治疗
小鼠在三天内用六个剂量的ALPL抑制剂(613810，Millipore Sigma；2，5-二甲氧基-N-(喹啉-3-基)苯磺酰胺，组织非特异性碱性磷酸酶抑制剂，MLS-0038949；C17H16N2O4S；CAS号496014-13-2)或“媒介物”对照进行治疗，每天两次腹膜内注射(8.75mg/kg)。“媒介物”治疗由磷酸盐缓冲盐水(PBS)和匹配浓度的DMSO(小于4％体积/体积)组成。第六次治疗后，对小鼠静脉注射150μL的Atto 647N标记的血浆(如上)、人饱和铁转铁蛋白(T4132，Millipore Sigma，40mg/kg)、转铁蛋白受体抗体(BE0175，BioXcell，20mg/kg)或3-kDa葡聚糖-FITC(10mg/kg，Thermo Fisher)。如先前所述143，在处死前20小时注入血浆、人饱和铁转铁蛋白和转铁蛋白受体抗体，同时在处死前2小时给予3-kDa葡聚糖-FITC。在充分灌注后，如上所述分离CNS细胞。将细胞沉淀物另外在红细胞裂解缓冲液(Millipore Sigma，R7757)中孵育2分钟以确保高CNS细胞纯度。通过CD31+/CD45-染色区分脑内皮细胞，并且通过CD31-/CD45-染色区分实质细胞。
蛋白质印迹
对于TFRC和CAV1的脑微血管蛋白质印迹，如先前所述51、55、144分离皮质和海马微血管。通过以下方式制备蛋白质裂解物：将细胞沉淀物在冰上在50mM HEPES中的1％SDS中与完全蛋白酶抑制剂混合物(Thermo Fisher Scientific)一起孵育，并且以13,000xg旋转10分钟。收集上清液，并且用Pierce BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce BCA Protein AssayKit，Thermo Fisher Scientific)测量蛋白质浓度。将来自每个样品的含有10-20ug蛋白质的等分试样与4倍上样缓冲液(Thermo Fisher Scientific)混合并在95℃下煮沸5分钟，之后进行SDS-PAGE并转移到硝酸纤维素膜(Bio-Rad)。首先用5％牛奶封闭膜，并在4℃下用指定浓度的一抗染色过夜∶兔抗小窝蛋白-1(1∶1000，D46G3，CST)、兔抗转铁蛋白受体(1∶1000，ab214039，Abcam)和兔抗组蛋白H3(1∶4000，ab1791，Abcam)。洗涤膜，用IRDye缀合的二抗(1∶15,000，LI-COR)染色，并且在Odyssey CLx(LI-COR)上成像。使用ImageStudio软件(LI-COR)分析图像的条带强度。
脑内皮细胞脂质组学，质谱
在过夜禁食(约12小时)后，如先前所述51、55、144-148从年轻(3个月大)和老年(20个月大)小鼠中分离脑微血管。使用每个年龄的十六只小鼠，每组(n＝4组)合并来自4只小鼠的微血管。如先前所述149，经由使用冷甲基叔丁基醚(MTBE)、甲醇和水的双相分离以随机顺序提取脂质。简而言之，将260μl甲醇和40μl水添加至脑微血管并涡旋20秒。在每个样品中加入脂质内部标准混合物(EquiSPLASH LIPIDOMIX，Avanti Polar Lipids(目录号：330731)和d17-油酸，Cayman chemicals(目录号：9000432))以控制提取效率、评价LC-MS性能并将LC-MS数据归一化。将样品用1,000μl MTBE稀释，涡旋10秒，在水浴中超声波处理30秒三次，并且在4℃下在搅拌下孵育30分钟。添加250μl水后，将样品涡旋1分钟并在20℃下以14,000g离心5分钟。收集含有脂质的上层相并在氮气下干燥。用150μl的9：1甲醇：甲苯将干燥的提取物复原。
如先前所述150，使用Ultimate 3000 RSLC系统和Q Exactive质谱仪(ThermoFisher Scientific)结合以随机顺序分析脂质提取物。每个样品以正电离和负电离模式运行两次。使用Accucore C18柱2.1x150mm，2.6μm(Thermo Fisher Scientific)分离脂质，并且流动相溶剂由以下组成：10mM乙酸铵和60/40乙腈/水中的0.1％甲酸(A)以及10mM乙酸铵和90/10异丙醇/乙腈中的0.1％甲酸(B)。使用的梯度曲线为：30％B持续3分钟、30-43％B 2分钟内、43-55％B 0.1分钟内、55-65％B 10分钟内、65-85％B 6分钟内、85-100％B 2分钟内以及100％持续5分钟。脂质以0.4ml/分钟从柱中洗脱出来，烘箱温度设置为45℃，并且注射体积为5μl。自动取样机温度设置为20℃以防止脂质聚集。Q Exactive配备有HESI-II探针，并且以数据依赖性采集模式对所有样品进行操作。为了最大限度地增加鉴定的脂质的数量，从MS/MS事件中排除在空白中发现的100个丰度最高的峰。使用注入Pierce LTQVelos ESI正离子校准溶液或Pierce ESI负离子校准溶液来进行外部校准。
使用LipidSearch软件4.2.21版本(Thermo Fisher Scientific)执行LC-MS峰提取、比对、定量和注释。通过将前体离子质量与数据库进行匹配并将实验MS/MS光谱与含有理论碎片光谱的光谱库进行匹配来鉴定脂质。使用每种脂质种类中丰度最高的离子进行定量，即[M+H]+用于LPC、LPE、PC、SM和Cer，[M-H]-用于PI、PS、PA和PG，并且[M+NH4]+用于CE、DAG和TAG。为了降低错误鉴定的风险，对来自感兴趣脂质的MS/MS光谱进行如下验证：1)正模式和负模式MS/MS光谱均与预期的碎片匹配，2)在正模式和负模式下检测到的主要脂质加合物形式与鉴定的脂质类别一致，3)保留时间与鉴定的脂质类别相容，以及4)峰形可接受。使用脂质内部标准对每个脂质类别的碎片模式进行实验验证。使用(i)类别特异性内部标准以控制提取效率并使用(ii)所有注释脂质的中值以校正起始材料的差异量来将数据归一化。
脑内皮细胞蛋白质组学，质谱
将SP3制备的和STAGE吸头清洁的脑微血管肽重悬在0.1％甲酸中，并通过在线毛细管纳米LC-MS/MS进行分析。样品在内部制造的配备有激光驱动(1aser-pulled)纳米电喷雾发射器尖端的20cm反相柱(100μm内径，填充有ReproSil-Pur C18-AQ 3.0μm树脂(Dr.Maisch GmbH))上分离。在Dionex Ultimate 3000 LC系统(Thermo FisherScientific)中使用四步线性梯度以400nL/分钟的流速洗脱肽，四步线性梯度包括2-4％缓冲液B 1分钟内、4-25％缓冲液B 120分钟内和25-40％B 30分钟内、40-98％缓冲液B 2分钟内(缓冲液A：水中的0.2％甲酸和5％DMSO；缓冲液B：乙腈中的0.2％甲酸和5％DMSO)。然后使用LTQ Orbitrap Elite质谱仪(Thermo Fisher Scientific)分析肽。数据采集以数据依赖性模式执行，其中在Orbitrap质量分析器中以60000的分辨率和340-1600的m/z扫描范围获取全MS扫描。使用碰撞诱导解离(CID)选择强度阈值高于500个计数并且电荷状态2及以上的前20个丰度最高的离子进行碎裂，其中分离窗口为2m/z，归一化碰撞能量为35％，激活Q为0.25并且激活时间为5ms。在离子阱中以快速扫描速率分析CID碎片。启用动态排除，其中重复计数为1，并且排除持续时间为30秒。全FTMS扫描和ITMSn扫描的AGC目标分别设置为1000000和5000。全FTMS扫描和ITMSn扫描的最大注射时间分别设置为250ms和100ms。原始文件如上分析，但前体质量耐受性设置为20p.p.m.，碎片离子耐受性设置为0.6Da，并且对于蛋白质定量，最小比率计数设置为2，使用unique peptides进行定量。
血脑屏障渗透性和灌注评估
静脉注射150μL盐水或血浆(如上制备)后，20小时后注射示踪剂，如先前所述90、139、143。简而言之，对小鼠注射溶解在盐水中的可固定的3-kDa葡聚糖-FITC(10μg/g，Thermo Fisher)、70-kDa葡聚糖-TMR(100μg/g，ThermoFisher)或2-mDa葡聚糖-FITC(100μg/g，Thermo Fisher)。2小时(对于3-kDa葡聚糖-TMR)或4小时(对于70-kDa葡聚糖-TMR)后，对小鼠进行麻醉和灌注，并且对皮质和海马体进行显微解剖。将冷冻组织解冻并悬浮在300μL的自定义裂解缓冲液(200mM Tris，4％CHAPS，1M NaCl，8M尿素，pH 8.0)中。然后使用设置为20％振幅的Branson Digital Sonifier超声波破碎仪将组织均质化3秒，使其在冰上静置30秒，并重复3次。将样品在4℃下以14,000g离心20分钟，并且提取上清液以进行分析。使用Varioskan Flash微板读数器(Thermo Fisher Scientific)测量FITC和德克萨斯红(Texas Red)的荧光。使用Pierce BCA蛋白质测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific)将荧光信号标准化为每个样品的蛋白质数量。如上所述，处理来自不同小鼠的大脑以进行免疫组织化学，并且对内源小鼠IgG进行成像和定量。作为阳性对照，使用Benchmark立体定位撞击器(Benchmark Stereotaxic Impactor，MyNeurolab)在小鼠中诱导皮质轻度创伤性脑损伤(mTBI，也称为脑震荡)损伤，如先前所述151。
实施例1
此实施例描述了证明血浆蛋白渗透健康成年小鼠大脑的实验。
BBB排除了几乎100％的外源性大分子(Pardridge，W.M.Neuro Rx(2005).doi：10.1602/neurorx.2.1.3；Abbott等人，Neurobiol.Dis.(2010).doi：10.1016/j.nbd.2009.07.030；Banks，W.A.BMC Neurology(2009).doi：10.1186/1471-2377-9-S1-S3；St-Amour等人，J.Cereb.B lood Flow Metab.(2013).doi：10.1038/jcbfm.2013.160)，从用于临床前研究中的示踪剂到治疗性免疫球蛋白(IgG)。然而，BBB排除其组成性暴露于的数千种内源性血液蛋白的程度在很大程度上仍是未知的(Anderson，N.L.&Anderson，N.G.，Mol.Cell.Proteomics(2002).doi：10.1074/mcp.R200007-MCP200；和Hood等人，J.Proteome Res.(2005).doi：10.1021/pr050107r)。为了解决这个问题，用各种小标签对小鼠血浆蛋白质组进行了化学选择性标记(Bragg，P.D.&Hou，C.，Arch.Biochem.Biophys.(1975).doi：10.1016/0003-9861(75)90467-1；Sélo，I.等人，J.Immunol.Methods(1996).doi：10.1016/S0022-1759(96)00173-1；和Anderson等人，J.Am.Chem.Soc.(1964).doi：10.1021/ja01063a037)，以允许在转移到受体年轻或老年小鼠中时进行一组研究(图1a；图2d-2e)。优化胺反应性N-羟基琥珀酰亚胺酯化学的条件之后，使用抗体阵列和基于质谱的蛋白质组学在丰度、尺寸和类别方面确认了数百种血浆蛋白的标记，其中覆盖范围在很大程度上受到检测方法的限制(图3a-3d)。转移到健康成年小鼠中二十小时后，放射性示踪剂Cu64标记的去除白蛋白和IgG的血浆在更易渗漏的、有孔的脑室周围器官和BBB保护的脑组织内的积聚水平显著高于IgG对照(图1b；图4a-4e)。
为了研究细胞分辨率下的血浆摄取，使用在超分辨率成像中使用的小但明亮的远红Atto 647N荧光团标记血浆(Dempsey等人，Nat.Methods(2011).doi：10.1038/nmeth.1768；Han等人，Nat.Commun.(2017).doi：10.1038/s41467-017-01503-6)。荧光成像与放射自显影非常相似(图1c)。血浆施用不会引起高蛋白血症或扰乱BBB，如通过各种可固定的和不可固定的示踪剂在功能上测量的以及通过单细胞RNA测序在转录上测量的(图5a-5f)。此外，血浆摄取在低至10μL(小于循环体积的0.5％)的注射体积中可检测到；在各种离体和体内标记化学中可见；即使在含有它们的少数脉管系统中也不与白蛋白或IgG共定位(图6a-6c)；并且不会被残留的游离染料混淆(图7m；图8i)。
在更大的放大率下，观察到两个主要特征：点状脉管系统和含有血浆(血浆+)的实质细胞(图1d-1k；图7a-7h)。指示溶酶体降解或主动转胞吞作用，点状脉管系统表明BBB内皮对内源性血浆蛋白的内吞作用水平令人惊讶的高，而对于外源性示踪剂未见所述内吞作用(Chow，B.W.&Gu，C.Trends Neurosci.，38：598-608(2015)；Reese，T.S.&Karnovsky，M.J.，J.Cell Biol.(1967).doi：10.1083/jcb.34.1.207，St-Amour等人J.Cereb.BloodFlow Metab.(2013).doi：10.1038/jcbfm.2013.160；Rubin，L.L.&Staddon，J.M.，Annu.Rev.Neur osci.(1999).doi：10.1146/annurev.neuro.22.1.11；Triguero等人Proc.Natl.Acad.Sci.(1989).doi：10.1073/pnas.86.12.4761；和
Figure BDA0003727978690000481
等人，Sci.Rep.(2016).doi：10.1038/srep25658)。高分辨率成像揭示了血浆蛋白转胞吞作用，在CD31+内皮的实质侧具有分散和点状信号(图1e；图7i)。此外，血浆还积聚在脉络丛、蛛网膜下腔和血管周围间隙中，这表明胶状淋巴系统对其摄取、分布和清除有潜在贡献(图7j-7l)(Iliff等人，Sci.Transl.Med.(2012).doi：10.1126/scitranslmed.3003748；Louveau等人，Nature，523：337-341(2015)；Da Mesquita等人，Nature(2018).doi：10.1038/s41586-018-0368-8)。虽然已经在粗脑匀浆或分离血管中研究了选择蛋白如转铁蛋白和胰岛素的BBB渗透性(Pardridge等人，Metabolism(1987).doi：10.1016/0026-0495(87)90099-0；Poduslo等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，91，5705-5709(1994)；Pardridge，W.M.，Journal ofNeuroVirology(1999).doi：10.3109/13550289909021285；Pardridge，W.M.，Endocr.Rev.(1986).doi：10.1210/edrv-7-3-314；Pardridge，W.M.，Drug Discovery Today(2007).doi：10.1016/j.drudis.2006.10.013；和Poduslo等人，Neurobiol.Dis.(2001).doi：10.1006/nbdi.2001.0402)，但血浆+神经元和小胶质细胞可以直接在大脑区域(包括皮质和海马体)中原位可视化(图1g-1k)。在海马齿状回，血浆追踪脉管系统和邻接的神经元突起(图1i)。通过对转铁蛋白进行染色(现有BBB药物递送程序的基础)(
Figure BDA0003727978690000491
等人，Cell Rep.，21：3256-3270(2017)；Zuchero等人，Neuron(2016).doi：10.1016/j.neuron.2015.11.024；Couch等人，Sci.Transl.Med.(2013).doi：10.1126/scitranslmed.3005338；Atwal等人，Sci.Transl.Med.(2011).doi：10.1126/scitranslmed.3002254；Yu等人，Sci.Transl.Med.(2011).doi：10.1126/scitranslmed.3002230；和Niewoehner等人，Neuron(2014).doi：10.1016/j.neuron.2013.10.061)，在神经元中观察到大量非共定位血浆信号，这表明其他循环因子类似地具有BBB渗透性(图1k)。
总之，这些数据表明内源性循环蛋白组成性地进入并渗透健康成年大脑。
实施例2
此实施例证明了大脑脉管系统对血浆摄取的调控。
由于大脑的血浆摄取量出乎意料的高，因此对血浆利用以增强BBB转运的复杂遗传调控系统进行了研究(Jefferies等人，Nature(1984).doi：10.1038/312162a0；Broadwell，R.D.；Acta Neuropathologica(1989).doi：10.1007/BF00294368；Daneman，R.，Ann.Neurol.(2012).doi：10.1002/ana.23648；和Zlokovic，B.V.，Neuron(2008).doi：10.1016/j.neuron.2008.01.003)。开发了“功能性转录组学”平台，所述平台经由流式细胞术记录内皮细胞的血浆摄取，并对它们进行索引分类，以进行深度单细胞RNA测序(scRNA-seq，每个细胞平均读取150万次)。将每个细胞的转录组数据和血浆摄取联系起来允许在每个基因的表达和血浆摄取程度之间实现无偏的和高通量的相关性。在施用荧光标记的血浆四小时后，对来自健康成年小鼠的745个脑内皮细胞进行处理，以确保测量转胞吞作用，如先前所述(Niewoehner，同上；Zuchero等人，Neuron(2016).doi：10.1016/j.neuron.2015.11.024；和Friden等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(2006).doi：10.1073/pnas.88.11.4771)。在745个脑内皮细胞和19,899个测序基因中，观察到表明调控控制的血浆摄取分层(图9a；图10a-10d)。
尽管19,899个测序基因中的绝大多数未表现出影响，但鉴定了增强或抑制摄取的特定遗传相关物，如表1和图9b所示。某些基因，如转铁蛋白受体(Tfrc)和CD98hc(Slc3a2)，充当验证对照；并且如预期的那样，与血浆摄取增强相关的基因(“相关物”)在囊泡介导的转运途径中富集(图9c)。令人惊讶的是，相关基因还富含通常负责穿梭葡萄糖、金属离子和其他小分子的溶质载体(SLC)跨膜蛋白。它们的富集表明可能在蛋白质转胞吞作用中发挥双重作用，如最近发现的编码CD98hc的新受体介导的转胞吞作用(RMT)BBB递送靶标Slc3a2(Zuc hero等人，Neuron(2016).doi：10.1016/j.neuron.2015.11.024)。有趣的是，若干相关物已被证明促进BBB完整性，所述相关物诸如Apoe(Bell等人，Nature(2012).doi：10.1038/nature11087；Zlokovic，JAMA Neurol.(2013).doi：10.1001/jamaneurol.2013.2152)和Mfsd2a(Andreo ne等人，Neuron，94：581-594.e5(2017)；和Ben-Zvi等人，Nature(2014).doi：10.1038/nature13324)，这表明驱动血浆摄取的机制受到调控而不是损害。这还表明，这些基因要么经由未知机制促进特定血浆蛋白的摄取，要么与促进特定血浆蛋白的摄取的已知受体紧密共表达(图9i)。其表达与血浆摄取呈负相关的基因(“反相关物”)聚集在细胞外血管和软组织钙化和骨化途径周围(图9c)。相关物和反相关物均定位在细胞表面，这表明血浆摄取由与受体的直接结合介导；并且被细胞外基质中以顺式或螯合发挥作用的细胞表面蛋白抑制(图2d)。最后，在相关物和反相关物中发现了BBB特异性基因的强烈富集(Dan eman等人，PLoS One(2010).doi：10.1371/journal.pone.0013741)，这表明这些血浆摄取和转胞吞作用的调控因子可能是BBB独有的(图9e)。细胞表面相关物和反相关物的鉴定提供了新的分子靶标以调节BBB转运。
表1
Figure BDA0003727978690000511
Figure BDA0003727978690000521
Figure BDA0003727978690000531
Figure BDA0003727978690000541
大脑脉管系统遵循动静脉分区(Vanlandewijck等人，Nature，554：475-480(2018)；Chen等人，bioRxiv(2019).doi：10.1101/617258；Simionescu等人，J.Cell Biol.(1976).doi：10.1083/jcb.68.3.705)(图9f)。出乎意料的是，血浆摄取因血管段而明显不同，其中静脉细胞内吞血浆最多，动脉细胞最少，并且毛细血管介于两者之间但表现出最广的分布(图9g)。因此，血浆摄取与血管段感受到的血压呈负相关。每种血管段都表现出与血浆摄取及其抑制相关的独特转录程序(图9h)。在毛细血管内，Tfrc表达与其他相关物(诸如Mfsd2a)平行，形成共表达模块，其表明通过共同的上游信号传导途径进行共协调(图9i)。这种Tfrc模块的表达与强反相关物(如Alpl)的表达相互排斥，标志着毛细血管内相互排斥的群体。为了进一步研究毛细血管中的可变血浆摄取，通过SPIN(将点分选成邻域)将内皮细胞排列成一维轴线(Vanlandewijck等人，同上；和Tsafrir等人，Bioinformatics(2005).doi：10.1093/bioinformatics/bti329)。与动脉细胞在转录上更相似的毛细血管像动脉细胞一样内吞血浆，并且静脉样毛细血管反之亦然(图9j；图10e)。这表明了沿脑动静脉树的血浆摄取的转录梯度和可能的空间梯度。尽管血浆摄取的个体遗传相关物在整个动静脉分区中表达(图9k；图10f)，但它们组装成不同的共表达模块可能决定摄取中的血管段差异。
总之，这些数据表明，在健康的情况下，BBB特异性和治疗相关的转录程序积极调控血浆转运，并且对于每种血管段都是独特的。
实施例3
此实施例描述了BBB转胞吞作用的年龄相关的转变。
随着年龄增长，BBB对外源性示踪剂“更易渗漏”(Montagne等人，Neuron(2015).doi：10.1016/j.neuron.2014.12.032)。在与先前工作一致的水平上检测到IgG脑摄取(Poduslo等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，91：5705-5709(1994))，并且一致地，通过放射自显影和定量γ计数均观察到IgG积聚随年龄增加(图4c；图8b-8c)。然而，令人惊讶的是，老年大脑中的血浆摄取减弱了(图8a-8b；图4c)。无论是分析全脑还是分析去血管化的皮质和海马实质匀浆，这都是真实的(图8b-8c)。然而，血浆摄取始终超过IgG，进一步表明不依赖于小窝的机制介导增强的跨BBB的血浆转运。
为了研究负责年龄相关的血浆转运损伤的机制，将scRNA-seq数据与先前公布的脑内皮细胞转录组衰老数据集相结合(Yousef等人，Nat.Med.(2019).doi：10.1038/s41591-019-0440-4)(图8d)。在随年龄下调的基因中，显著的85％与青年血浆摄取相关(92％的曲线下面积)。富集分析强调网格蛋白适体活性和ATP利用率的损失，暗示活性RMT中存在缺陷。实际上，在脑内皮细胞中观察到随着年龄增长从配体特异性RMT到非特异性小窝转胞吞作用的整体转变(图8e；图11a-11b)。推定的RMT受体(包括Tfrc)在转录和蛋白质水平上均随着年龄增长而下降，下游网格蛋白组分及其适体也是如此。Cav1是小窝形成所必需的(Andreone等人，同上)，在转录物和蛋白质水平上均随着年龄增长而增加，而抑制小窝转胞吞作用的Mfsd2a随着年龄增长而降低。
为了在功能上验证内皮转胞吞作用的这种年龄相关转变，采用了三种独立的方法：脂质组学、蛋白质组学和流式细胞术。最近的工作表明，脑内皮细胞的独特的脂质组成是它们的小窝转胞吞作用率低的基础；并且Mfsd2a通过将含有ω-3脂肪酸二十二碳六烯酸(DHA)的磷脂嵌入到腔浆膜(luminal plasma membrane)中以防止形成小窝来维持这些性质(Andreone等人，Neuron(2017).doi：10.1016/j.neuron.2017.03.043；Ben-Zvi等人，Nature(2014).doi：10.1038/nature13324；和Nguyen等人，Nature(2014).doi：10.1038/nature13241)。与随年龄增长而减弱的Mfsd2a表达一致，无偏脂质组学分析揭示了溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰丝氨酸(PS)类别中的含有DHA的磷脂种类的年龄相关的减少(图8f-8g；图11c)。这些正是在大脑中与外周内皮细胞差异富集的含有DHA的类别(Andreone等人，Neuron(2017).doi：10.1016/j.neuron.2017.03.043)。在不同的160种丰度脂质中，还观察到特定小窝相关脂质(诸如鞘磷脂、乙醇胺缩醛磷脂(PE-p)和神经酰胺)的年龄上调(扩展数据图8c)。
转铁蛋白和白蛋白分别是蛋白质RMT和小窝转胞吞作用的典型配体(Fishman等人，J.Neurosci.Res.(1987).doi：10.1002/jnr.490180206；Roberts等人，J.Cell Sci.(1993)；Lajoie，J.M.&Shusta，E.V.，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.(2014).doi：10.1146/annurevpharmtox-010814-124852；和Schubert等人，J.Biol.Chem.(2001).doi：10.1074/jbc.C100613200)。通过基于质谱的蛋白质组学，在老年微血管内观察到内源性转铁蛋白的减少和白蛋白丰度的伴随的增加(图8h)。此结果与Tfrc和网格蛋白表达的年龄相关的下降以及配体非特异性小窝的增加是一致的。尽管在大多数年轻小鼠的微血管样品中，内源性白蛋白的丰度低于检测限，但随着年龄增长始终可以检测到。转铁蛋白丰度超过白蛋白，但差异随着年龄增长而缩小，这支持了以下假设，即RMT是跨年轻BBB的转胞吞作用的主要途径，但随着年龄增长转变为小窝转胞吞作用。使用注射的RMT配体瘦蛋白和小窝转运配体辣根过氧化物酶(HRP)观察到类似的模式，即年轻内皮吸收更多的瘦蛋白，但老年内皮吸收更多的HRP(图19a)。
最后，由于测量的功能转运中的年龄相关的变化与预测的从受体介导的(以转铁蛋白、瘦蛋白为例)到小窝(IgG、白蛋白、HRP)转胞吞作用的转变一致，因此网格蛋白和小窝囊泡的频率随年龄增长而可视化和量化。通过对抗体染色微血管进行高分辨率显微镜检查，在年轻的脑内皮中观察到密度更高的网格蛋白囊泡，但在老年大脑中观察到更多的小窝囊泡(图19b和图19c)。
与内皮细胞中分层的RMT(图9a)相比，小窝转运途径表现出广泛的配体非特异性摄取(Nabi等人，Journal of Cell Biology(2003).doi：10.1083/jcb.200302028；和
Figure BDA0003727978690000571
等人，Cellular and Molecul ar Lie Sciences(2019).doi：10.1007/s00018-018-2982-x)。因此假设随着年龄增长，内皮细胞应该具有更均匀的摄取模式。使用流式细胞术，首先确认检测到的血浆信号具有特异性，从而允许避免年龄相关的自发荧光的可靠定量(Spitzer等人，J.Neurosci.Methods(2011).doi：10.1016/j.jneumeth.2011.01.029；Schnell等人，J.Histochem.Cytochem.(1999).doi：10.1177/002215549904700601(图3i；扩展数据图8d；扩展数据177图11a-e)。观察到血浆+内皮细胞的比例随着年龄增长而增加，这与小窝转运的非特异性一致(图8j)。相比之下，内吞细胞内的血浆平均量随着年龄增长而减少，这与放射自显影和γ计数数据一致(图8a-8b)，并且表明RMT是比小窝更有效的血浆蛋白转胞吞途径。这种年龄相关的转变也通过显微镜检查鉴定，与随着年龄增长观察到的更加分散和均匀的信号相比，在年轻脉管系统中观察到更加异质和分层的血浆摄取模式(图8k)。这种转变在NeuN+和Thy1+神经元中也很明显(图81；图11e)，但在ACS2-A+星形胶质细胞中不明显(图11f)。
上述数据表明，老年BBB经历了从受体介导的到小窝转胞吞作用的转变，并且这导致BBB渗透性蛋白的组成改变和血浆摄取的总体减少。图16中示意性地描绘了BBB转胞吞作用随年龄转变的模型。
实施例4
此实施例描述了CNS中的年龄相关的钙化，以及ALPL抑制恢复BBB转胞吞作用。
为了发现与脑内皮转运的年龄相关的转变相关的明显解剖学变化，随年龄增长评估血管密度、星形胶质细胞覆盖率和周细胞覆盖率(图20a和图20b)。观察到周细胞覆盖率的明确损失(图20A和图20b)，若干周细胞诱导基因(诸如Tfrc、Lrp8和Mfsd2a)在周细胞缺陷型Pdg fret/ret转基因模型(Armulik等人，Nature，468：557-561(2010))和正常衰老中均减少(图20b和图20c)。这表明周细胞在维持成熟BBB功能中发挥作用。周细胞缺陷型转基因模型显示异位钙化，表现为骨致密结节和血管球体(Keller等人，Nat.Genet.(2013).doi：10.1038/ng.2723；和Zarb等人，Brain(2019).doi：10.1093/brain/awz032)。值得注意的是，此类钙化在正常、无病衰老中被表型复制(phenocopied)(图12b)。因此，周细胞损失和伴随的异位脑钙化和BBB功能障碍可能是脑衰老的正常特征。在分子上，钙化是由I型胶原蛋白和碱性磷酸酶ALPL的共定位引起的(Murshed等人，Genes Dev.(2005).doi：10.1101/gad.1276205)，两者都随着年龄增长而并行增加(图12d和图12e)。
增强CNS药物递送的若干主要药物和临床开发程序依赖于BBB RMT，其中大多数靶向转铁蛋白受体TFRC(Atwal等人，Sci.Transl.Med.(2011).doi：10.1126/scitranslmed.3002254；Yu等人，Sci.Transl.Med.(2011).doi：10.1126/scitranslmed.3002230；Zuchero等人，Neuron(2016).doi：10.1016/j.neuron.2015.11.024；Sonoda等人，Mol.Ther.(2018).doi：10.1016/j.ymthe.2018.02.032；Bien-Ly等人，J.Exp.Med.(2014).doi：10.1084/jem.20131660；和Oller-Salvia等人，Chemical Society Reviews(2016).doi：10.1039/c6cs00076b)。已经观察到BBB RMT随着年龄增长的损失，搜索分子靶标以增强老年BBB转胞吞作用(图12a)通过过滤以下特征的基因来执行：(1)BBB富集(图13a-13b)；(2)在内皮细胞表面上表达(图12a)；(3)随着年龄增长而上调(图12d-12e；图13d-13e)；(4)血浆摄取的反相关物(图9b；图13c)；和(5)可使用FDA批准的小分子和改进的衍生物进行抑制(Debray等人，BioorganicMed.Chem.(2013).doi：10.1016/j.bmc.2013.09.053；和Sheen等人J.Bone Miner.Res.(2015).doi：10.1002/jbmr.2420)。只有碱性磷酸酶基因Alpl满足这些标准。
然而，Alpl的典型作用是骨钙化的关键效应物(Sheen等人，J.Bone Miner.Res.(2015)；Murshed等人，Genes Dev.(2005).doi：10.1101/gad.1276205；Villa-Bellosta，R.&O’Neill，W.C.，Kidney Inte rnational(2018).doi：10.1016/j.kint.2017.11.035；Savinov等人，J.Am.Heart Assoc.(2015).doi：10.1161/JAHA.115.002499；Romanelli，F.，PLoS One(2017).doi：10.1371/journal.pone.0186426))。值得注意的是，茜素红染色在正常老年大脑中检测到钙化(骨致密结节)(图12b)。这些钙化概括了在周细胞缺陷型Pdgfret/ret小鼠模型中观察到的那些(Keller，A.等人，Nat.Genet.(2013).doi：10.1038/ng.2723；Vanlande wijck，M.等人，PLoS One(2015).doi：10.1371/joufnal.pone.0143407；Zarb等人，Brain(2019).doi：10.1093/brain/awz032；Sagare等人，Nat.Commun.(2013).doi：10.1038/ncomms3932；Montagne等人，Nat.Med.(2018).doi：10.1038/nm.4482；；和Bell等人，Neuron(2010).doi：10.1016/j.neuron.2010.09.043)，尽管周细胞损失还未在正常、无病衰老中得到证明。在分子上，血管钙化的标志是I型胶原蛋白和ALPL(由Alpl编码)的共定位，因为只有在这种情况下才会发生细胞外基质矿化(Murshed等人，Genes Dev.(2005).doi：10.1101/gad.1276205；和Villa-Bellosta，R.&O’Neill，W.C.，Kidney International(2018).doi：10.1016/j.kint.2017.11.035)。使有效的矿化抑制剂焦磷酸盐水解的ALPL的血管过表达足以诱导异位血管钙化(Sheen等人，J.Bone Miner.Res.(2015)；Savinov等人，J.Am.Heart Assoc.(2015).doi：10.1161/JAHA.115.002499；和Romanelli，F.，PLoS One(2017).doi：10.1371/journal.pone.0186426)。因此，老年脑内皮中的I型胶原蛋白和ALPL的令人惊讶的增加与成骨环境和血管钙化随着年龄增长而增加是一致的(图12c-12e)。
与毛细血管中Alpl和Tfrc的非重叠表达一致(图9i)，饱和铁转铁蛋白优先被ALPL缺陷型毛细血管吸收(图21a)。为了确定这种相关性是否暗示了因果机制，在药理学ALPL抑制后对老年脑内皮细胞执行scRNA-seq。值得注意的是，ALPL抑制后上调最多的基因是转铁蛋白受体，其中毛细血管中的表达增加约70％，并且静脉细胞中的表达增加约89％(图21b和21c)。
施用选择性ALPL抑制剂(Dahl等人，J.Med.Chem.(2009).doi：10.1021/jm900383s；以引用方式整体并入本文)降低了ALPL活性，并因此降低了老年大脑脉管系统中的矿化活性(图12f-12g)。ALPL表达对老年小鼠大脑(23个月大)中的转铁蛋白摄取的影响在图18中示出。
为了验证Alpl在BBB蛋白质摄取中的多效性作用，采用了来自先前的工作的注射范例(Armulik等人，Nature，468：557-561(2010))(图12f)，并且在选择性ALPL抑制剂治疗后，在年轻和老年小鼠的脑内皮细胞中观察到血浆摄取增加(图14a-14b；图15e)。在老年小鼠中，观察到跨内皮至脑实质细胞的血浆转运增加(图12i)。血浆+细胞的百分比没有变化，但参与细胞吸收的血浆量增加了。因此，基于先前的流式细胞术和成像数据(图8i-81；图11d-11e)，ALPL抑制可能不改变年龄上调的小窝转运(图14h)，而是促进蛋白质RMT。有趣的是，ALPL抑制趋于但没有显著增强跨年轻BBB至实质的血浆转胞吞作用，尽管在内皮中有更多的摄取(图12j；图14a)。这可能是由于ALPL对年轻BBB中的动脉细胞的表达受限，所述动脉细胞构成脉管系统的一小部分并因此数量不足以在ALPL抑制后赋予显著增强的转胞吞作用(图12d-12e；图13d-13e)。ALPL磷酸酶活性的抑制可能与伊马替尼相反，伊马替尼是一种酪氨酸激酶抑制剂，先前被证明可阻止BBB转胞吞作用(Armulik等人，Nature(2010).doi：10.1038/nature09522；和Su等人，Nat.Med.(2008).doi：10.1038/nm178791，92)。
因为临床开发中现有的转铁蛋白受体抗体类似地经由RMT跨BBB，所以研究了ALPL抑制是否可以例示一类新的促进大脑摄取的通用“佐剂”。实际上，在ALPL抑制后观察到人饱和铁转铁蛋白和高亲和力、可商购获得的转铁蛋白受体抗体的实质摄取增加(图12k-121；图14c-14f)。转铁蛋白受体抗体摄取的增强不如饱和铁转铁蛋白强，这与先前的工作一致，表明这种高亲和力的二价抗体变体优先在内皮中被捕获和降解(Yu等人，Sci.Transl.Med.(2011).doi：10.1126/scitranslmed.3002230；Niewoehner等人，Neuron(2014).doi：10.1016/j.neuron.2013.10.061，Bien-Ly等人，J.Exp.Med.(2014).doi：10.1084/jem.20131660，Haqqani等人，J.Neurochem.(2018).doi：10.1111/jnc.14482；和Johnsen等人，Theranostics(2018).doi：10.7150/thno.25228)。在原位目视确认在ALPL抑制后，饱和铁转铁蛋白和转铁蛋白受体抗体的实质进入，在若干细胞类型(诸如皮质NeuN+神经元)中积聚(图12m；图14e)。ALPL抑制不会扰乱血管形态或损害细胞间紧密连接(图14g-14h)。
此实施例的结果表明，脑钙化归因于正常衰老，并且抑制脉管系统中的年龄上调、促进钙化的ALPL可以增强血浆和治疗相关生物制剂的摄取。
实施例5
测定年轻和年长受试者的脑毛细血管、静脉和小动脉的血浆摄取的基因相关物，并且结果分别在图17A-17C中示出。此信息可用于靶向特别涉及特定疾病或其他上下文的基因和/或血管类型，以潜在地最大限度地减少毒性。
实施例6
此实施例证明了ALPL抑制上调了血脑屏障铁转运体Tfrc和Slc40a1，并且提供了用于治疗不安腿综合征(RLS)的治疗性方法。
不安腿综合征(RLS)是一种严重的与运动相关的睡眠病症，其影响7-10％的普通人群，其中3％需要治疗干预(Allen等人，Arch.Intern.Med.(2005).doi：10.1001/archinte.165.11.1286；Innes，K.E.，Selfe，T.K.&Agarwal，P.Sleep Medicine(2011).doi：10.1016/j.sleep.2010.12.018；Ohayon等人，Sleep Medicine Reviews(2012).doi：10.1016/j.smrv.2011.05.002)。患病率和严重程度都随着年龄增长而加剧(Milligan，S.A.&Chesson，A.L.，Drugsand Aging(2002).doi：10.2165/00002512-200219100-00003)。尽管RLS的确切发病机制尚不清楚，但临床研究一致表明脑铁不足与RLS相关。然而，铁跨血脑屏障(BBB)的有限渗透性阻碍了外周铁的补充，从而需要经由专用转运体来促进递送(Mills等人，Future Medicinal Chemistry(2010).doi：10.4155/fmc.09.140；和Chiou，B.等人，PLoS One(2018)doi：10.1371/joumal.pone.0198775)。最近的研究已经揭示了介导RLS患者的跨BBB的稳态铁转运的基因表达受损(Mizuno等人，J.Sleep Res.(2005).doi：10.1111/j.1365-2869.2004.00403.x；和Connor等人，Brain(2011).doi：10.1093/brain/awr0127，8)。因此，仍然存在对可以促进向大脑递送铁以恢复铁不足的治疗剂的显著未满足的需求。
已发现，采用本文所述的方法静脉内施用选择性ALPL抑制剂足以增强跨BBB的铁转运途径(在图22中示意性地示出)。具体地，铁转运由两个关键基因决定：用于将铁输入到脑内皮细胞中的转铁蛋白受体(TFRC)和用于将输入的铁恰当有效地导入到脑实质中的转铁蛋白。ALPL抑制强烈上调老年BBB上的TFRC和转铁蛋白表达(图23)。实际上，在整个基因组中，在抑制ALPL后，TFRC是最强上调的受体，并且转铁蛋白是最强上调的转运体，如表2和表3以及图23所示。ALPL抑制促进了TFRC和转铁蛋白在BBB毛细血管和静脉细胞中的表达，它们在这些细胞中正常表达(图24a-24c)。
表2
受体 ％增加 pct，ALPL抑制剂 pct，对照 P_val_adj
Tfrc 70.1％ 0.723 0.508 8.06E-107
Lpar6 37.0％ 0.446 0.283 2.99E-42
Fcgrt 24.2％ 0.849 0.732 6.16E-39
Scarb1 11.1％ 0.45 0.365 1.34E-08
表3
转运体 ％增加 pct，ALPL抑制剂 pct，对照 P_val_adj
Slc40a1 35.0％ 0.62 0.44 1.22E-50
Slc6a6 24.9％ 0.99 0.97 2.39E-64
Slc16a4 18.8％ 0.42 0.29 2.91E-28
Slc26a10 17.8％ 0.19 0.14 1.83E-06
Slc16a2 16.5％ 0.66 0.55 6.72E-18
Slco1c1 15.7％ 0.97 0.94 1.46E-22
Slc7a1 12.2％ 0.72 0.66 1.31E-03
Slc39a10 12.1％ 0.89 0.82 1.23E-12
Slc22a8 11.0％ 0.71 0.66 9.75E-03
Slc39a8 10.9％ 0.34 0.27 1.24E-04
Slc25a1 10.7％ 0.24 0.17 1.15E-08
这些发现证明了ALPL抑制提供了上调铁转运到大脑中的决定因素的药理学方法，从而为RLS提供了治疗性方法。
在一些实施方案中，ALPL抑制与用于RLS的其他治疗或疗法组合使用。例如，在一些实施方案中，ALPL抑制与以下组合：罗匹尼罗(REQUIP)、罗替戈汀(NEUPRO)、普拉克索(MIRAPEX)、加巴喷丁(NEURONTIN，GRALISE)、加巴喷丁恩那卡比(HORIZANT)、普瑞巴林(LYRICA)、曲马多(ULTRAM，CONZIP)、可待因、氧可酮(OXYCONTIN，ROXICODONE)、氢可酮(HYSINGLA ER，ZOHYDRO ER)、肌肉松弛剂和睡眠药物。
本文所引用的所有参考文献(包括出版物、专利申请和专利)特此以引用方式并入，其程度如同每个参考文献都单独地并具体地被指示为以引用方式并入并且以其全部内容在本文中进行阐述一样。
除非本文另外指明或明显与上下文矛盾，否则描述本发明的上下文中(尤其是在以下权利要求的上下文中)的术语“一个”和“一种”和“所述”和“至少一个”以及类似指示物解释为同时包括单数和复数。除非本文另外指明或明显与上下文矛盾，否则使用术语“至少一个”后跟一个或多个项目(例如“A和B中的至少一个”)的列表应解释为意指选自列出的项目(A或B)的一个项目或列出的项目(A和B)中的两个或更多个的任何组合。除非另外指出，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应解释为开放式术语(即，意指“包括但不限于”)。除非本文另外指明，否则本文中值范围的表述仅仅旨在用作个别地指代落入所述范围的各单独值的速记方法，并且如同本文个别表述地那样将每个单独值并入到本说明书中。可以按任何合适的顺序执行本文所述的所有方法，除非本文另外指明或明显与上下文矛盾。本文所提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地说明本发明并且除非另外要求，否则不会对本发明的范围施加限制。本说明书中的语言不应解释为将任何非要求的元素指示为实践本发明所必需的。
本文描述了本发明的优选实施方案，包括为发明者所知用来进行本发明的最佳模式。阅读上述说明书后，那些优选实施方案的变型对于本领域普通技术人员可变得显而易见。发明人希望技术人员视情况采用此类变型，并且发明人旨在以不同于如本文具体描述的方式来实践本发明。因此，经适用法律许可，本发明包括在此所附的权利要求书中所表述的主题的所有修改和等效物。此外，除非本文另外指明或明显与上下文矛盾，否则本发明涵盖上述元素在其所有可能的变型中的任何组合。
参考文献
1.Obermeier，B.，Daneman，R.&Ransohoff，R.M.Development，maintenance anddisruption of the blood-brain barrier.Nature Medicine(2013)doi：10.1038/nm.3407
2.Ballabh，P.，Braun，A.&Nedergaard，M.The blood-brain barrier：anoverview：structure，regulation，and clinical implications.Neurobiol.Dis.(2004).doi：10.1016/j.nbd.2003.12.016
3.Chow，B.W.&Gu，C.The Molecular Constituents of the Blood-BrainBarrier.Trends Neurosci.38，598-608(2015).
4.Blood，T，Barrier，B，Daneman，R.&Prat，A.The Blood-Brain Barrier.1-23(2015).
5.Reese，T.S.&Karnovsky，M.J.Fine structural localization of a blood-brain barrier to exogenous peroxidase.J.Cell Biol.(1967).doi：10.1083/jcb.34.1.207
6.Andreone，B.J.et al.Blood-Brain Barrier Permeability Is Regulated byLipid Transport-Dependent Suppression of Caveolae-MediatedTranscytosis.Neuron(2017).doi：10.1016/j.neuron.2017.03.043
7.Park，M.H.et al.Vascular and Neurogenic Rejuvenation in Aging Miceby Modulation of ASM.Neuron(2018).doi：10.1016/j.neuron.2018.09.010
8.Yao，Y.，Chen，Z.L.，Norris，E.H.&Strickland，S.Astrocytic lamininregulates pericyte differentiation and maintains blood brain barrierintegrity.Nat.Commun.(2014).doi：10.1038/ncomms4413
9.Janzer，R.C.&Raff，M.C.Astrocytes induce blood-brain barrierproperties in endothelial cells.Nature(1987).doi：10.1038/325253a0
10.Saunders，N.R.，Dziegielewska，K.M.，Mollgard，K.&Habgood，M.D.Markersfor blood-brain barrier integrity：How appropriate is Evans blue in thetwenty-first century and what are the alternatives？Frontiers in Neuroscience(2015).doi：10.3389/fnins.2015.00385
11.Conboy，I.M.et al.Rejuvenation of aged progenitor cells by exposureto a young systemic environment.Nature 433，760-764(2005).
12.Villeda，S.A.et al.Young blood reverses age-related impairments incognitive function and synaptic plasticity in mice.Nat.Med.(2014).doi：10.1038/nm.3569
13.Tingle et al.Human umbilical cord plasma proteins revitalizehippocampal function in aged mice.Nature(2017).doi：doi：10.1038/nature22067
14.Wyss-Coray，T.Ageing，neurodegeneration and brainrejuvenation.Nature 539，180-186(2016).
15.Katsimpardi，L.et al.Vascular and neurogenic rejuvenation of theaging mouse brain by young systemic factors.Science(80-.).(2014).doi：101126/science.1251141
16.Karnavas，T.et al.Gpr158 mediates osteocalcin’s regulation ofcognition.J.Exp.Med.(2017).doi：10.1084/jem.20171320
17.Gan，K.J.&Sudhof，T.C.Specific factors in blood from young but notold mice directly promote synapse formation and NMDA-receptor recruitment.Proc.Natl.Acad.Sci.116，201902672(2019).
18.Pardridge，W.M.The blood-brain barrier：Bottleneck in brain drugdevelopment.NeuroRx(2005).doi：10.1602/neurorx.2.1.3
19.Abbott，N.J.，Patabendige，A.A.K.，Dolman，D.E.M.，Yusof，S.R.&Begley，D.J.Structure and function of the blood-brain barrier.Neurobiol.Dis.(2010).doi：10.1016/j.nbd.2009.07.030
20.Banks，W.A.Characteristics of compounds that cross the blood-brainbarrier.in BMC Neurology(2009).doi：10.1186/1471-2377-9-SI-S3
21.St-Amour，I.et al.Brain bioavailability of human intravenousimmunoglobulin and its transport through the murine blood-brainbarrier.J.Cereb.Blood Flow Metab.(2013).doi：10.1038/jcbfm.2013.160
22.Anderson，N.L.&Anderson，N.G.The Human PlasmaProteome.Mol.Cell.Proteomics(2002).doi：10.1074/mcp.R200007-MCP200
23.Hood，B.L.et al.Investigation of the mouse serumproteome.J.Proteome Res.(2005).doi：10.1021/pr050107r
24.Bragg，P.D.&Hou，C.Subunit composition，function，and spatialarrangement in the Ca2+-and Mg2+-activated adenosine triphosphatases ofEscherichia coli and Salmonella typhimurium.Arch.Biochem.Biophys.(1975).doi：10.1016/0003-9861(75)90467-1
25.Selo，I.，Negroni，L.，Creminon，C.，Grassi，J.&Wal，J.M.Preferentiallabeling ofα-amino N terminal groups in peptides by biotin.Application to thedetection of specific anti-peptide antibodies by enzymeimmunoassays.J.Immunol.Methods(1996).doi：10.1016/S0022-1759(96)00173-1
26.Anderson，G.W.，Zimmerman，J.E.&Callahan，F.M.The Use of Esters of N-Hydroxysuccinimide in Peptide Synthesis.J.Am.Chem.Soc.(1964).doi：.10.1021/ja01063a03727.Dempsey，G.T.，Vaughan，J.C.，Chen，K.H.，Bates，M.&Zhuang，X.Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-basedsuper-resolution imaging.Nat.Methods(2011).doi：10.1038/nmeth.1768
28.Han，Y.，Li，M.，Qiu，F.，Zhang，M&Zhang，Y.H.Cell-permeable organicfluorescent probes for live-cell long-term super-resolution imaging reveallysosome-mitochondrion interactions.Nat.Commun.(2017).doi：10.1038/s41467-017-01503-6
29.Rubin，L.L.&Staddon，J.M.THE CELL BIOLOGY OF THE BLOOD-BRAINBARRIER.Annu.Rev.Neurosci.(1999).doi：10.1146/annurev.neuro.22.1.11
30.Triguero，D.，Buciak，J.B.，Yang，J.&Pardridge，W.M.Blood-brain barriertransport of cationized immunoglobulin G：enhanced delivery compared to nativeprotein.Proc.Natl.Acad.Sci.(1989).doi：10.1073/pnas.86.12.4761
31.Villasenor，R.et al.Trafficking of Endogenous Immunoglobulins byEndothelial Cells at the Blood-Brain Barrier.Sci.Rep.(2016).doi：10.1038/srep25658
32.lliff，J.J.et al.A paravascular pathway facilitates CSF flowthrough the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes，including amyloidβ.Sei.Transl.Med.(2012).doi：10.1126/scitranslmed.3003748
33.Louveau，A.et al.Structural and functional features of centralnervous system lymphatic vessels.Nature523，337-341(2015).
34.Da Mesquita，S.et al.Functional aspects of meningeal lymphatics inageing and Alzheimer’s disease.Nature(2018).doi：10.1038/s41586-018-0368-8
35.Pardridge，W.M.，Eisenberg，J&Yang，J.Human blood-brain barriertransferrin receptor.Metabolism(1987).doi：10.1016/0026-0495(87)90099-0
36.Poduslo，J.F.，Curran，G.L.&Berg，C.T.Macromolecular permeabilityacross the blood-nerve and blood-brain barriers.Proc.Natl.Acad.Sci.91，5705-5709(1994).
37.Pardridge，W.M.Blood-brain barrier biology and methodology.Journalof NeuroVirology(1999).doi：10.3109/13550289909021285
38.Pardridge，W.M.Receptor-mediated peptide transport through theblood-brain barrier.Endocr.Rev.(1986).doi：10.1210/edrv-7-3-314
39.Pardridge，W.M.Blood-brain barrier delivery.Drug Discovery Today(2007).doi：10.1016/j.drudis.2006.10.013
40.Poduslo，J.F.，Curran，G.L.，Wengenack，T.M.，Malester，B&Duff，K.Permeability of proteins at the blood-brain barrier in the normal adultmouse and double transgenic mouse model of Alzheimer’s disease.Neurobiol.Dis.(2001).doi：10.1006/nbdi.2001.0402
41.Villasenor，R.，Schilling，M.，Sundaresan，J.，Lutz，Y.&Collin，L.SortingTubules Regulate Blood-Brain Barrier Transcytosis.Cell Rep.21，3256-3270(2017).
42.Zuchero，Y.J.Y.et al.Discovery of Novel Blood-Brain Barrier Targetsto Enhance Brain Uptake of Therapeutic Antibodies.Neuron(2016).doi：10.1016/j.neuron.2015.11.024
43.Couch，J.A.et al.Addressing safety liabilities of TfR bispecificantibodies that cross the blood-brain barrier.Sci.Transl.Med.(2013).doi：10.1126/scitranslmed.3005338
44.Atwal，J.K.et al.A therapeutic antibody targeting BACE1 inhibitsamyloid-β production in vivo.Sci.Transl.Med.(2011)doi：10.1126/scitranslmed.3002254
45.Yu，Y.J.et al.Boosting brain uptake of a therapeutic antibody byreducing its affinity for a transcytosis target.Sci.Transl.Med.(2011).doi：10.1126/scitranslmed.3002230
46.Niewoehner，J.et al.Increased Brain Penetration and Potency of aTherapeutic Antibody Using a Monovalent Molecular Shuttle.Neuron(2014).doi：10.1016/j.neuron.2013.10.061
47.Jefferies，W.A.et al.Transferrin receptor on endothelium of braincapillaries.Nature(1984).doi：10.1038/312162a0
48.Broadwell，R.D.Transcytosis of macromolecules through the blood-brain barrier：a cell biological perspective and critical appraisal.ActaNeuropathologica(1989).doi：10.1007/BF00294368
49.Daneman，R.The blood-brain barrier in health anddisease.Ann.Neurol.(2012).doi：10.1002/ana.23648
50.Zlokovic，B.V.The blood-brain barrier in health and chronicneurodegenerative disorders.Neuron(2008).doi：10.1016.j.neuron.2008.01.003
51.Zuchero，Y.J.Y.et al.Discovery of Novel Blood-Brain Barrier Targetsto Enhance Brain Uptake of Therapeutic Antibodies.Neuron(2016).doi：10.1016/j.neuron.2015.11.024
52.Friden，P.M.et al.Anti-transferrin receptor antibody and antibody-drug conjugates cross the blood-brain barrier.Proc.Natl.Acad.Sci.(2006).doi：10.1073/pnas.88.11.4771
53.Bell，R.D.et al.Apolipoprotein e controls cerebrovascular integrityvia cyclophiTin A.Nature(2012).doi：10.1038/naturel 1087
54.Zlokovic，B.V.Cerebrovascular effects ofapolipoprotein E：Implications for Alzheimer disease.JAMA Neurol.(2013).doi：10.1001/jamaneurol.20132152
55.Andreone，B.J.et al.Blood-Brain Barrier Permeability Is Regulatedby Lipid Transport-Dependent Suppression of Caveolae-MediatedTranscytosis.Neuron94，581-594.e5(2017).
56.Ben-Zvi，A.et al.Mfsd2a is critical for the formation and functionof the blood-brain barrier.Nature(2014).doi：10.1038/nature13324
57.Daneman，R.et al.The mouse blood-brain barrier transcriptome：A newresource for understanding the development and function of brain endothelialcells.PLoS One(2010).doi：10.1371/journal.pone.0013741
58.Vanlandewijck，M.et al.A molecular atlas of cell types and zonationin the brain vasculature.Nature 554，475-480(2018).
59.Chen，M.B.et al.Brain endothelial cells are exquisite sensors ofage-related circulatory cues.bioRxiv(2019).doi：10.1101/617258
60.Simionescu，M.，Simionescu，N.&Palade，G.E.Segmental differentiationsof cell junctions in the vascular endothelium：Arteries and veins.J.Cell Biol.(1976).doi：10.1083/jcb.68.3.705
61.Tsafrir，D.et al.Sorting points into neighborhoods(SPIN)：Dataanalysis and visualization by ordering distance matrices.Bioinformatics(2005).doi：10.1093/bioinformatics/bti329
62.Montagne，A.et al.Blood-Brain barrier breakdown in the aging humanhippocampus.Neuron(2015).doi：10.1016/j.neuron.2014.12.032
63.Yousef，H.et al.Aged blood impairs hippocampal neural precursoractivity and activates microglia via brain endothelial cell VCAM1.Nat.Med.(2019).doi：101038/s41591-019-0440-4
64.Ben-Zvi，A.et al.Mfsd2a is critical for the formation and functionof the blood-brain barrier.Nature(2014).doi：10.1038/nature13324
65.Nguyen，L.N.et al.Mfsd2a is a transporter for the essential omega-3fatty acid docosahexaenoic acid.Nature(2014).doi：10.1038/nature13241
66.Fishman，J.B.，Rubin，J.B.，Handrahan，J.V.，Connor，J.R.&Fine，R.E.Receptor-mediated transcytosis of transferrin across the blood-btainbarrier.J.Neurosci.Res.(1987).doi：10.1002/jnr.490180206
67.Roberts，R.L.，Fine，R.E.&Sandra，A.Receptor-mediated endocytosis oftransferrin at the bloodbrain barrier.J.Cell Sci.(1993).
68.La.joie，J.M&Shusta，E.V.Targeting Receptor-Mediated Transport forDelivery of Biologics Across the Blood-Brain Barrier.Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.(2014).doi：10.1146/annurevpharmtox-010814-124852
69.Schubert，W.et al.Caveolae-deficient Endothelial Cells Show Defectsin the Uptake and Transport of Albumin in Vivo.J.Biol.Chem.(2001).doi：10.1074/jbc.C100613200
70.Nabi，I.R.&Le，P.U.Caveolae/raft-dependent endocytosis.Journal ofCell Biology(2003).doi：10.1083/jcb.200302028
71.Villasenor，R.，Lampe，J.，Schwaninger，M.&Collin，L.Intracellulartransport and regulation of transcytosis across the blood-brainbarrier.Cellular and Molecular Life Sciences(2019).doi：10.1007/s00018-018-2982-x
72.Spitzer，N，Sammons，G.S.&Price，E.M.Autofluorescent cells in ratbrain can be convincing impostors in green fluorescent reporterstudies.J.Neurosci.Methods(2011).doi：10.1016/j.jneumeth.2011.01.029
73.Schnell，S.A，Staines，W.A.&Wessendorf，M.W.Reduction of lipofuscin-like autofluorescence in fluorescently labeled tissue.J.Histochem.Cytochem.(1999).doi：10.1177/002215549904700601
74.Sonoda.H.et al.A Blood-Brain-Barrier-Penetrating Anti-humanTransferrin Receptor Antibody Fusion Protein for NeuronopathicMucopolysaccharidosis II.Mol.Ther.(2018).doi：10.1016/j.ymthe.2018.02.032
75.Bien-Ly，N.et al.Transferrin receptor(TfR)trafficking determinesbrain uptake of TfR antibody affinity variants.J.Exp.Med.(2014).doi：10.1084/jem.20131660
76.Oller-Salvia，B.，Sanchez-Navarro，M.，Giralt，E.&Teixido，M.Blood-brainbarrier shuttle peptides：An emerging paradigm for brain delivery.ChemicalSociety Reviews(2016).doi：10.1039/c6cs00076b
77.Debray，J.et al.Inhibitors of tissue-nonspecific alkalinephosphatase：Design，synthesis，kinetics，biomineralization and cellular testsBioorganic Med.Chem.(2013).doi：10.1016/j.bmc.2013.09.053
78.Sheen，C.R.et al.Pathophysiological role of vascular smooth musclealkaline phosphatase in medial artery calcification.J.Bone Miner.Res.(2015).doi：10.1002/jbmr.2420
79.Murshed，M.，Harmey，D.，Millan，J.L.，McKee，M.D.&Karsenty，G.Uniquecoexpression in osteoblasts of broadly expressed genes accounts for thespatial restriction of ECM mineralization to bone.Genes Dev.(2005).doi：10.1101/gad.1276205
80.Villa-Bellosta，R.&O’Neill，W.C.Pyrophosphate deficiency in vascularcalcification.Kidney International(2018).doi：10.1016/j.kint.2017.11.035
81.Savinov，A.Y.et al.Transgenic overexpression of tissue-nonspecificalkaline phosphatase(TNAP)in vascular endothelium results in generalizedarterial calcification.J.Am.Heart Assoc.(2015).doi：10.1161/JAHA.115.002499
82.Romanelli，F.et al.Overexpression of tissue-nonspecific alkalinephosphatase(TNAP)in endothelial cells accelerates coronary artery disease ina mouse model of familial hypercholesterolemia.PLoS One(2017).doi：10.1371/journal.pone01864126
83.Keller，A.et al.Mutations in the gene encoding PDGF-B cause braincalcifications in humans and mice.Nat.Genet.(2013).doi：10.1038/ng.2723
84.Vanlandewijck，M.et al.Functional characterization of germlinemutations in PDGFB and PDGFRB in primary familial brain calcification.PLoSOne(2015).doi：10.1371/joumnal.pone.0143407
85.Zarb，Y.et al.Ossified blood vessels in primary familial braincalcification elicit a neurotoxic astrocyte response.Brain(2019).doi：10.1093/brain/awz032
86.Sagare，A.P.et al.Pericyte loss influences Alzheimer-likeneurodegeneration in mice.Nat.Commun.(2013).doi：10.1038/ncomms3932
87.Montagne，A.et al.Pericyte degeneration causes white matterdysfunction in the mouse central nervous system.Nat.Med.(2018).doi：10.1038/nm.4482
88.Bell，R.D.et al.Pericytes Control Key Neurovascular Functions andNeuronal Phenotype in the Adult Brain and during Brain Aging.Neuron(2010).doi：10.1016/j.neuron.2010.09.043
89.Dahl，R.et al.Discovery and validation ofa series of arylsulfonamides as selective inhibitors of tissue-nonspecific alkalinephosphatase(TNAP).J.Med.Chem.(2009).doi：10.1021/jm900383s
90.Armulik，A.et al.Pericytes regulate the blood-brain barrier.Nature468，557-561(2010).
91.Armulik，A.et al.Pericytes regulate the blood-brain barrier.Nature(2010).doi：10.1038/nature09522
92.Su，E.J.et al.Activation of PDGF-CC by tissue plasminogen activatorimpairs blood-brain barrier integrity during ischemic stroke.Nat.Med.(2008).doi：10.1038/nm1787
93.Junger，M.A&Aebersold，R.Mass spectrometry-driven phosphoproteomics：Patterning the systems biology mosaic.Wiley Interdisciplinary Reviews：Developmental Biology(2014).doi：10.1002/wdev.121
94.Olsen，J.V et al.Quantitative phosphoproteomics reveals widespreadfull phosphorylation site occupancy during mitosis.Sci.Signal.(2010).doi：10.1126/scisignal.2000475
95.Sharma，K.et al.Ultradeep Human Phosphoproteome Reveals a DistinctRegulatory Nature of Tyr and Ser/Thr-Based Signaling.Cell Rep.(2014).doi：10.1016/j.celrep.2014.07.036
96.Haqqani，A.S.et al.Intracellular sorting and transcytosis of therat transferrin receptor antibody OX26 across the blood-brain barrier invitro is dependent on its binding affinity.J.Neurochem.(2018).doi：10.1111/jnc.14482
97.Johnsen，K.B.et al.Antibody affinity and valency impact brainuptake of transferrin receptortargeted gold nanoparticles.Theranostics(2018).doi：10.7150/thno.25228
98.Pardridge，W.M.Drug transport across the blood-brainbarrier.Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism(2012).doi：10.1038/jcbfm.2012.126
99.Banks，W.A.From blood-brain barrier to blood-brain interface：Newopportunities for CNS drug delivery.Nature Reviews Drug Discovery(2016).doi：10.1038/nrd.2015.21
100.Karnovsky，M.J.The ultrastructural basis of capillary permeabilitystudied with peroxidase as a tracer.J.Cell Biol.(1967).doi：10.1083/jcb.35.1.213
101.Saunders，N.R.，Habgood，M.D.，Mollgard，K.&Dziegielewska，K.M.Thebiological significance of brain barrier mechanisms：help or hindrance in drugdelivery to the central nervous system？F1000Research(2016).doi：10.12688/f1000research.7378.1
102.Liddelow，S.A.Fluids and barriers of the CNS：A historicalviewpoint.Fluids and Barriers of the CNS(2011).doi：10.1186/2045-8118-8-2
103.Nadal，A.，Fuentes，E.，Pastor，J.&McNaughton，P.A.Plasma albumin is apotent trigger of calcium signals and DNA synthesis inastrocytes.Proc.Natl.Acad.Sci.(2006).doi：10.1073/pnas.92.5.1426
104.Gingrich，M.B.&Traynelis，S.F.Serine proteases and brain damage-Isthere a link？Trends in Neurosciences(2000).doi：10.1016/S0166-2236(00)01617-9
105.Petersen，M.A.，Ryu，J.K.&Akassoglou，K.Fibrinogen in neurologicaldiseases：Mechanisms，imaging and therapeutics.Nature Reviews Neuroscience(2018).doi：10.1038/nm.2018.13
106.Davalos，D.et al.Fibrinogen-induced perivascular microglialclustering is required for the development of axonal damage inneuroinflammation Nat.Commun.(2012).doi：10.1038/ncomms2230
107.Davalos，D.&Akassoglou，K.Fibrinogen as a key regulator ofinflammation in disease.Seminars in lmmunopathology(2012).doi：10.1007/s00281-011-0290-8
108.Sweeney，M.D.，Sagare，A.P.&Zlokovic，B.V.Blood-brain barrierbreakdown in Alzheimer disease and other neurodegenerativedisorders.Nat.Rev.Neurol.(2018).doi：10.1038/nrneurol.2017.188
109.Xiao，G&Gan，L.-S.Receptor-Mediated Endocytosis and Brain Deliveryof Therapeutic Biologics.Int.J.Cell Biol.(2013).doi：10.1155/2013/703545
110.Daneman，R.，Zhou，L.，Kebede，A.A.&Barres，B.A.Pericytes are requiredfor blood-brain barrier integrity during embryogenesis.Nature 468，562-566(2010).
111.Ammanamanchi，M.，Li，X.，Li，X.，Qin，Z.&Hayenga，H.Substrate stiffnessmodulates the route of transport and not the permeability of the human brainendothelium.in P2574(8th World Congress of Biomechanics，2018).
112.Zlokovic，B.V.Neurovascular pathways to neurodegeneration inAlzheimer’s disease and other disorders.Nature Reviews Neuroscience(2011).doi：10.1038/nrn3114
113.Nelson，A.R.，Sweeney，M.D，Sagare，A.P.&Zlokovic，B.V.Neurovasculardysfunction and neurodegeneration in dementia and Alzheimer’sdisease.Biochim.Biophys.Acta-Mol.Basis Dis.(2016).doi：10.1016/j.bbadis.2015.12.016
114.Harold，D.et al.Genome-wide association study identifies variantsat CLU and PICALM associated with Alzheimer’s disease.Nat.Genet.(2009).doi：10.1038/ng.440
115.Vardy，E.RL.C.，Kellett，K.A.B.，Cocklin，S.L.&Hooper，N.M.AlkalinePhosphatase Is Increased in both Brain and Plasma in Alzheimer’sDisease.Neurodegener.Dis.(2011).doi：10.1159/000329722
116.Kellett，K.A.B.&Hooper，N.M.The role of tissue non-specificalkaline phosphatase(TNAP)in neurodegenerative diseases：Alzheimer’s diseasein the focus.Subcell.Biochem.(2015).doi：10.1007/978～94-017-7197-9_17
117.Murakami，Y.et al.Mechanism for release of alkaline phosphatasecaused by glycosylphosphatidylinositol deficiency in patients withhyperphosphatasia mental retardation syndrome.J.Biol.Chem.(2012).doi：10.1074/jbc.M111.331090
118.Iadecola，C.The Pathobiology of Vascular Dementia.Neuron(2013).doi：10.1016/j.neuron.2013.10.008
119.Muhire，G.et al.Arterial Stiffness Due to Carotid CalcificationDisrupts Cerebral Blood Flow Regulation and Leads to CognitiveDeficits.J.Am.Heart Assoc.8，(2019).
120.Kapasi，A.&Schneider，J.A.Vascular contributions to cognitiveimpairment，clinical Alzheimer’s disease，and dementia in olderpersons.Biochim.Biophys.Acta-Mol.Basis Dis.(2016).doi：10.1016/j.bbadis.2015.12.023
121.Iulita，M.F.，Noriega de la Colina，A&Girouard，H.Arterial stiffness，cognitive impairment and dementia：confounding factor or real risk？Journal ofNeurochemistry(2018).doi：10.1111/jnc.14235
122.Iadecola，C.&Davisson，R.L.Hypertension and CerebrovascularDysfunction.Cell Metabolism(2008).doi：10.1016/j.cmet.2008.03.010
123.Louveau，A.，Harris，T.H.&Kipnis，J.Revisiting the Mechanisms of CNSImmune Privilege.Trends in Immunology(2015).doi：10.1016/j.it.2015.08.006
124.Da Mesquita，S.，Fu，Z.&Kipnis，J.The Meningeal Lymphatic System：ANew Player in Neurophysiology.Neuron(2018).doi：10.1016/j.neuron.2018.09.022
125.Zlokovic，B.V.，Deane，R.，Sagare，A.P.，Bell，R.D.&Winkler，E.A.Low-density lipoprotein receptor-related protein-1：A serial clearance homeostaticmechanism controlling Alzheimer’s amyloid β-peptide elimination from thebrain.J.Neurochem.(2010).doi：10.1111/j.1471-4159.2010.07002.x
126.Ben-Zvi，A.et al.Mfsd2a is critical for the formation and functionof the blood-brain barrier.Nature 509，507-511(2014).
127.Yang，A.C.et al.Multiple Click-Selective tRNA Synthetases ExpandMammalian Cell-Specific Proteomics.J.Am.Chem.Soc.(2018).doi：10.1021/jacs.8b03074
128.Hughes，C.S.et al.Ultrasensitive proteome analysis usingparamagnetic bead technology.Mol.Syst.Biol.(2014).doi：10.15252/msb.20145625
129.Cox，J.&Mann，M.MaxQuant enables high peptide identification rates，individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide proteinquantification.Nat.Biotechnol.(2008).doi：10.1038/nbt.1511
130.Tyanova，S.，Temu，T.&Cox，J.The MaxQuant computational platform formass spectrometrybased shotgun proteomics.Nat.Protoc.(2016).doi：10.1038/nprot.2016.136
131.Treweek，J.B.et al.Whole-body tissue stabilization and selectiveextractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuitmapping and phenotyping.Nat.Protoc.(2015).doi：10.1038/nprot.2015.122
132.Tournoux，F.et al.Validation of noninvasive measurements ofcardiac output in mice using echocardiography.J.Am.Soc.Echocardiogr.(2011).doi：10.1016/j.echo.2010.12.019
133.Dominguez，E.et al.Non-invasive in vivo measurement of cardiacoutput in C57BL/6 mice using high frequency transthoracic ultrasound：evaluation of gender and body weight effects.Int.J.Cardiovasc.Imaging(2014).doi：101007/s10554-014-0454-4
134.Ferreira，C.L.et al.Comparison of bifunctional chelates for 64Cuantibody imaging.Eur.J.Nucl.Med.Mol.Imaging(2010).doi：10.1007/s00259-010-1506-1
135.Ilovich，O.et al.Development and Validation of an Immuno-PETTracer as a Companion Diagnostic Agent for Antibody-Drug Conjugate Therapy toTarget the CA6 Epitope.Radiology(2015).doi：10.1148/radiol.15140058
136.Chaney，A.et al.11 C-DPA-713 Versus 18 F-GE-180：A PreclinicalComparison of Translocator Protein 18 kDa PET Tracers to Visualize Acute andChronic Neuroinflammation in a Mouse Model of Ischemic Stroke.J.Nucl.Med.(2018).doi：10.2967/jnumed.118.209155137.Chaney，A.M.，Johnson，E.M.，Cropper，H.C.&James，M.L.PET Imaging of Neuroinflammation Using[11C]DPA-713 in a MouseModel of Ischemic Stroke.J.Vis.Fxp.(2018).doi：10.3791/57243
138.James，M.L.et al.New positron emission tomography(PET)radioligandfor imaging σ-1receptors in living subjects.J.Med.Chem.(2012).doi：10.1021/jm300371c
139.Yousef，H.et al.Aged blood inhibits hippocampal neurogenesis andactivates microglia through VCAM1 at the blood-brain barrier，bioRxiv(2018).doi：10.1101/242198
140.Schaum，N.et al.Single-cell transcriptomics of 20 mouse organscreates a Tabula Muris.Nature(2018).doi：10.1038/s41586-018-0590-4
141.Picelli，S.et al.Full-length RNA-seq from single cells usingSmart-seq2 Nat.Protoc.(2014).doi：10.1038/nprot.2014.006
142.Wu，A.R.et al.Quantitative assessment of single-cell RNA-sequencing methods.Nat.Methods(2014).doi：10.1038/nmeth.2694
143.Yanagida，K.et al.Size-selective opening of the blood-brainbarrier by targeting endothelial sphingosine l-phosphate receptor1.Proc.Natl.Acad.Sci.(2017).doi：10.1073/pnas.1618659114
144.Triguero，D.，Buciak，J.&Pardridge，W.M.Capillary Depletion Methodfor Quantification of Blood-Brain Barrier Transport of Circulating Peptidesand Plasma Proteins.J.Neurochem.(1990)doi：10.1111/j.1471-4159.1990.tb04886.x
145.Singh，I.et al.Low levels of copper disrupt brain amyloid-βhomeostasis by altering its production and clearance.Proc.Natl.Acad.Sci.(2013).doi：10.1073/pnas.1302212110
146.Paris-Robidas，S.，Brouard，D.，Emond，V.，Parent，M.&Calon，F.Internalization of targeted quantum dots by brain capillary endothelialcells in vivo.J.Cereb.Blood Flow Metab.(2015).doi：10.1177/0271678X15608201
147.Preston，J.E.，Al-Sarraf，H.&Segal，M.B.Permeability of thedeveloping blood-brain barrier to 14C-mannitol using the rat in situ brainperfusion technique.Dev.Brain Res.(1995).doi：10.1016/0165-3806(95)00060-Q
148.Dan，M.，Cochran，D.B.，Yokel，R.A&Dziubla，T.D.Binding，transcytosisand biodistribution of anti-PECAM-1 iron oxide nanoparticles for brain-targeted delivery.PLoS One(2013).dei：10.1371/journal.pone.0081051
149.Cajka，T.，Smilowitz，J.T.&Fiehn，O.Validating QuantitativeUntargeted Lipidomics Across Nine Liquid Chromatography-High-Resolution MassSpectrometry Platforms.Anal.Chem.(2017).doi：10.1021/acs.analchem.7b03404
150.Contrepois，K.et al.Cross-Platform Comparison of Untargeted andTargeted Lipidomics Approaches on Aging Mouse Plasma.Sci.Rep.(2018).doi：10.1038/s41598-018-35807-4
151.Luo，J.et al.Long-term cognitive impairments and pathologicalalterations in a mouse model of repetitive mild traumatic braininjury.Front.Neurol.(2014).doi：10.3389/fneur.2014.00012
152.Kadakkuzha，B.M.et al.Transcriptome analyses of adult mouse brainreveal enrichment of lncRNAs in specific brain regions and neuronal populations.Front.Cell.Neurosci.(2015).doi：10.3389/fncel.2015.00063
153.Sharma，K.et al.Cell type-and brain region-resolved mouse brainproteome.Nat.Neurosci.18，1819-1831(2015).
154.Dougherty，J.D.，Schmidt，E.F.，Nakajima，M.&Heintz，N.Analyticalapproaches to RNA profiling data for the identification of genes enriched inspecific cells.Nucleic Acids Res.(2010).doi：10.1093/nar/gkq130
155.Ashburner，M.et al.Gene ontology：Tool for the unification ofbiology.Nature Genetics(2000).doi：10.1038/75556
156.Gene Ontology Consortium.The Gene Ontology(GO)database andinformatics resource.Nucleic Acids Res.(2004).doi：10.1093/nar/gkh036
157.Zhang，X.D.et al.Traumatic Brain Injury Imaging in the SecondNear-Infrared Window with a Molecular Fluorophore.Adv.Mater.(2016).doi：10.1002/adma.201600706
158.Kiick，K.L.，Saxon，E.，Tirrell，D.A.&Bertozzi，C.R.Incorporationofazides into recombinant proteins for chemoselective modification by theStaudinger ligation.Proc.Natl.Acad.Sci.99，19-24(2002).
159.Calve，S.，Witten，A.J.，Ocken，A.R.&Kinzer-Ursem，T.L.Incorporation ofnon-canonical amino acids into the developing murine proteome.Sci.Rep.(2016).doi：10.1038/srep32377
160.Liu，A.P.，Aguet，F.，Danuser，G.&Schmid，S.L.Local clustering oftransferrin receptors promotes clathrin-coated pit initiation.J.Cell Biol.(2010).doi：10.1083/jcb.201008117
161.Sabbagh，M.F.et al.Transcriptional and epigenomic landscapes ofCNS and non-CNS vascular endothelial cells.Elife(2018).doi：10.7554/elife.36187
162.Simionescu，M.et al.The cerebral microvasculature of the rat：structure and luminal surface properties during early development.J.Submicrosc.Cytol.Pathol.(1988).
163.Herve，F.，Ghinea，N.&Scherrmann，J.-M.CNS Delivery Via AdsorptiveTranscytosis.AAPS J.(2008).doi：10.1208/s12248-008-9055-2
164.Montagne，A.，Zhao，Z.&Zlokovic，B.V.Alzheimer’s disease：A matter ofblood-brain barrier dysfunction？J.Exp.Med.(2017).doi：10.1084/jem.20171406
165.Anstrom，J.A.et al.Anatomical analysis of the developing cerebralvasculature in premature neonates：Absence of precapillary arteriole-to-venousshunts.Pediatr.Res.(2002).doi：10.1203/00006450-200210000-00015
166.Norman，M.G.&O’Kusky，J.R.The growth and development ofmicrovasculature in human cerebral cortex.J.Neuropathol.Exp.Neurol.(1986).doi：10.1097/00005072-198605000-00004
167.Bien-Ly，N.et al.Lack of Widespread BBB Disruption in Alzheimer’sDisease Models：Focus on Therapeutic Antibodies.Neuron 88，289-297(2015).
168.Pardridge，W.M.，Buciak，J.L.&Friden，P.M.Selective transport of ananti-transferrin receptor antibody through the blood-brain barrier invivo.J.Pharmacol.Exp.Ther.(1991).
169.Villasenor，R.et al.Trafficking of Endogenous Immunoglobulins byEndothelial Cells at the Blood-Brain Barrier.Sci.Rep.6，1-10(2016).
170.Pappolla，M.A.&Andorn，A.C.Serum protein leakage in aged humanbrain and inhibition of ligand binding at alpha2-adrenergic and cholinergicbinding sites.Synapse(1987).doi：10.1002/syn.890010111
171.Harrison，L.et al.Fluorescent blood-brain barrier tracing showsintact leptin transport in obese mice.International Journal of Obesity(2018).doi：10.1038/s41366-018-0221-z
172.Vazana，U.et al.Glutamate-Mediated Blood-Brain Barrier Opening：Implications for Neuroprotection and Drug Delivery.J.Neurosci.(2016).doi：10.1523/jneurosci.0587-16.2016
173.Armulik，A.，Genove，G.&Betsholtz，C.Pericytes：Developmental，Physiological，and Pathological Perspectives，Problems，andPromises.Developmental Cell(2011).doi：10.1016/j.devcel.2011.07.001
174.Nagatsu-Ishibashi，I.，Nagatsu，T.&Yagi，K.Changes of quantity offlavin in the brain after peripheral administration of flavins.Nature(1961).doi：10.1038/190728a0
175.Tiwary，S.et al.Metastatic brain tumors disrupt the blood-brainbarrier and alter lipid metabolism by inhibiting expression of theendothelial cell fatty acid transporter Mfsd2a.Sci.Rep.(2018).doi：10.1038/s41598-018-26636-6
176.Schlageter，N.L.，Carson，R.E.&Rapoport，S.I.Examination of blood-brain barrier permeability in dementia of the Alzheimer type with[68Ga]EDTAand positron emission tomography.J.Cereb.Blood Flow Metab.(1987).doi：10.1038/jcbfm.1987.1
177.Montagne，A.et al.Blood-Brain barrier breakdown in the aging humanhippocampus.Neuron 85，296-302(2015).
178.van de Haar，H.J.et al.Neurovascular unit impairment in earlyAlzheimer’s disease measured with magnetic resonance imaging.Neurobiol.Aging(2016).doi：10.1016/j.neurobiolaging.2016.06.006
179.Miller，J.J.et al.13C Pyruvate Transport Across the Blood-BrainBarrier in Preclinical Hyperpolarised MRI.Sci.Rep.(2018).doi：10.1038/s41598-018-33363-5
180.Hunt，A.et al.Reduced cerebral glucose metabolism in patients atrisk for Alzheimer’s Disease Psychiatry Res.-Neuroimaging(2007).doi：10.1016/j.pscychresns.2006.12.003
181.Allen，R.P.et al.Restless Legs Syndrome Prevalence andImpact.Arch.Intern.Med.(2005).doi：10.1001/archinte.165.11.1286
182.Innes，K.E.，Selfe，T.K.&Agarwal，P.Prevalence of restless legssyndrome in North American and Western European populations：A systematicreview.Sleep Medicine(2011).doi：10.1016/j.sleep.2010.12.018
183.Ohayon，M.M.，O’Hara，R.&Vitiello，M.V.Epidemiology of restless legssyndrome：A synthesis of the literature.Sleep Medicine Reviews(2012).doi：10.1016/j.smrv.2011.05.002
184.Milligan，S.A.&Chesson，A.L.Restless legs syndrome in the olderadult：Diagnosis and management.Drugs and Aging(2002).dei：10.2165/00002512-200219100-00003
185.Mills，E.，Dong，X.P.，Wang，F.&Xu，H.Mechanisms of brain irontransport：Insight into neurodegeneration and CNS disorders.Future MedicinalChemistry(2010).doi：10.4155/fmc.09.140
186.Chiou，B.et al.Pharmaceutical iron formulations do not cross amodel of the human blood-brain barrier.PLoS One(2018).doi：10.1371/journal.pone.0198775
187.Mizuno，S.，Mihara，T，Miyaoka，T.，Inagaki，T.&Horiguchi，J.CSF iron，ferritin and transferrin levels in restless legs syndrome.J.Sleep Res.(2005).doi：10.1111/j.1365-2869.2004.00403.x
189.Connor，J.R.et al.Profile of altered brain iron acquisition inrestless legs syndrome.Brain(2011).doi：10.1093/brain/awr012

Claims (19)

1.一种用于增加受试者的血脑屏障渗透性的方法，其包括向所述受试者施用抑制碱性磷酸酶蛋白(ALPL)活性的剂。
2.一种用于将治疗剂递送至有需要的受试者的大脑的方法，其包括向所述受试者施用：(a)抑制所述大脑中的碱性磷酸酶蛋白(ALPL)活性的剂；和(b)所述治疗剂。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述治疗剂是大分子。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述大分子是蛋白质。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述大分子是抗体。
6.如权利要求2所述的方法，其中所述治疗剂是小分子药物。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述剂是碱性磷酸酶蛋白(ALPL)的小分子抑制剂。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述受试者罹患中枢神经系统(CNS)疾病。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述中枢神经系统疾病是代谢性疾病、创伤、行为障碍、人格障碍、痴呆、癌症、感染、自身免疫疾病、血管疾病、睡眠障碍或神经退化性疾病。
10.如权利要求8或权利要求9所述的方法，其中所述中枢神经系统疾病是不安腿综合征(RLS)。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述受试者为50岁或以上。
12.一种用于鉴定调控哺乳动物的血脑屏障渗透性的生物分子的方法，所述方法包括：
(a)可检测地标记从第一哺乳动物中分离的血浆的生物分子；
(b)将包含所述标记的生物分子的所述分离血浆引入到第二哺乳动物中；
(c)从形成所述血脑屏障的所述第二哺乳动物中分离出脑内皮细胞；
(d)使用流式细胞术测量所述分离的脑内皮细胞中的每一个中的血浆摄取，以产生分选的脑内皮细胞群；
(e)检测与血浆摄取相关的基因在所述分选的脑内皮细胞中的每一个中的表达；和
(f)选择由其表达与脑内皮细胞中血浆摄取增加或减少相关的基因编码的生物分子，由此所述生物分子调控所述受试者的血脑屏障渗透性。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述分离血浆的所述生物分子被荧光标记。
14.如权利要求12或权利要求13所述的方法，其中基因的表达使用单细胞RNA测序(scRNA-seq)来检测。
15.如权利要求12至14中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物是小鼠。
16.如权利要求12至15中任一项所述的方法，其中所述生物分子增加血脑屏障渗透性。
17.如权利要求12至15中任一项所述的方法，其中所述生物分子降低血脑屏障渗透性。
18.如权利要求12至17中任一项所述的方法，其中所述生物分子是蛋白质或肽。
19.如权利要求12至17中任一项所述的方法，其中所述生物分子是核酸。
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
WO1989011299A1 (en) 1988-05-18 1989-11-30 State Of Oregon Acting By And Through The State Bo Method for delivery of therapeutic agents to target brain tissue using monoclonal antibody conjugates
AU698101B2 (en) * 1993-06-01 1998-10-22 Cortex Pharmaceuticals, Inc. Alkaline and acid phosphatase inhibitors in treatment of neurological disorders
JP2001238681A (ja) * 2000-03-03 2001-09-04 Japan Science & Technology Corp 共培養による血液脳関門再構築モデル
AU2003295268A1 (en) * 2002-12-19 2004-07-14 To-Bbb Holding B.V. Nucleic acids involved in blood-brain barrier control
CN102014959B (zh) * 2008-03-10 2016-01-20 康奈尔大学 血脑屏障通透性的调节
CA2718860A1 (en) 2008-03-21 2009-09-24 Adlyfe, Inc. Use of pyrene to carry peptides across the blood brain barrier
JP2013540748A (ja) 2010-09-16 2013-11-07 コーネル ユニバーシティー 血液脳関門の透過性を調節するためのアデノシン受容体シグナル伝達の使用法
EP2817292B1 (en) 2012-02-22 2019-12-18 Sanford-Burnham Medical Research Institute Sulfonamide compounds and uses as tnap inhibitors
US20170072027A1 (en) * 2014-04-30 2017-03-16 Amrif Bv The Application of RESCAP to Attenuate and Prevent the Progression of Neurodegenerative Brain and Neuronal Diseases
GB2563899A (en) * 2017-06-29 2019-01-02 Ernst Ludwig Georg Muller Werner Inorganic polyphosphate formulations for use in the treatment of Alzheimer disease

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