KR20220110263A - 내인성 조절인자의 표적화에 의한 혈액-뇌 장벽 약물 수송의 향상 - Google Patents

내인성 조절인자의 표적화에 의한 혈액-뇌 장벽 약물 수송의 향상 Download PDF

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앤드루 크리스 양
앤턴 위스-코레이
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더 보드 오브 트러스티스 오브 더 리랜드 스탠포드 쥬니어 유니버시티
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Abstract

혈액-뇌 장벽 약물 수송을 향상시키기 위해 대상체에서 혈액-뇌 장벽 투과성을 증가시키기 위한 방법 및 조성물, 및 혈액-뇌 장벽 투과성을 조절하는 작용제를 확인하기 위한 방법 및 조성물이 본 명세서에서 제공된다.

Description

내인성 조절인자의 표적화에 의한 혈액-뇌 장벽 약물 수송의 향상
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2019년 12월 4일자로 출원된 미국 가출원 제62/943,610호, 및 2020년 6월 25일자로 출원된 미국 가출원 제63/044,048호의 이익을 주장하며, 이들 둘 다의 내용은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
기술분야
본 발명은 혈액-뇌 장벽 약물 수송을 향상시키기 위해 대상체에서 혈액-뇌 장벽 투과성을 증가시키기 위한 방법 및 조성물, 및 혈액-뇌 장벽 투과성을 조절하는 작용제를 확인하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
연방-지원 연구에 관한 진술
본 발명은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)에 의해 수여된 보조금 번호 DP1 AG053015 및 R01 AG059694 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명의 특정 권리를 갖는다.
혈액-뇌 장벽(BBB)은 적절한 뇌 기능에 필요한 환경을 유지하며, 이는 순환 거대분자에 대한 BBB의 불투과성을 통해 발생하는 것으로 생각된다. BBB의 혈관 내피 세포는 신체에서 가장 전문화된 것 중 하나이다. 기저 측부 벽 세포의 지원으로, BBB 내피는, 밀착 연접 및 최소 소포성 교환의 표시와 같은 최적의 중추신경계(CNS) 기능에 중요한 것으로 여겨지는 고유한 특성을 나타낸다(Obermeier et al., Nature Medicine (2013) doi:10.1038/nm.3407; Ballabh et al., Neurobiol. Dis. (2004) doi:10.1016/j.nbd.2003.12.016; Chow, B. W. & Gu, C., Trends Neurosci. 38, 598-608 (2015); 및 Blood, T., Barrier, B., Daneman, R. & Prat, A. The Blood-Brain Barrier, 1-23 (2015)). 건강한 생활 전반에 걸친 이러한 불투과성은 다양한 외인성 추적자를 이용하여 보고되었다(Reese, T. S. & Karnovsky, M. J., J. Cell Biol. (1967) doi:10.1083/jcb.34.1.207; Andreone et al., Neuron, 94(3): 581-594 (2017); Park et al., Neuron, 100(1):167-182.e9 (2018); Yao et al., Nat. Commun., 5: 3413 (2014); Janzer, R. C. & Raff, M. C., Nature, 325(6101): 253-257 (1987); 및 Saunders et al., Frontiers in Neuroscience, 9: 385 (2015)). 여러 연구로 순환 환경이 뇌 기능에 영향을 미칠 수 있으며, 구체적으로 신경발생, 시냅스 가소성, 및 인지 수행을 조절하는 것이 밝혀졌다(Conboy et al., Nature, 433: 760-764 (2005); Villeda et al., Nat. Med. (2014). doi:10.1038/nm.3569; Tingle et al., Nature (2017). doi:doi:10.1038/nature22067; Wyss-Coray, T., Nature, 539: 180-186 (2016); Katsimpardi, L. Science (80-. ). (2014). doi:10.1126/science.1251141; Karnavas et al., J. Exp. Med. (2017). doi:10.1084/jem.20171320; 및 Gan, K. J. &
Figure pct00001
, T. C., Proc. Natl. Acad. Sci., 16(25): 12524-12533 (2019)). 외인성 추적자에 대한 BBB의 정준(canonical) 불투과성은 CNS에서 주변부에 의한 이와 같은 영향의 메커니즘에 관한 탐구를 자극하였다. 동시에, 각각의 심장 박동과 함께, BBB는 내인적으로 다양한 혈장 단백질의 새로운 물결과 만나서, 결합, 신호전달, 및 교환 사건으로 가득찬 동적 인터페이스를 형성할 가능성이 높다.
특히 노화된 뇌 및 중추신경계 질환을 치료하기 위한 치료제의 전달과 관련하여 혈액-뇌 장벽 투과성의 조절인자를 확인하는 방법에 대한 요구가 남아 있다.
본 개시내용은 대상체에서 혈액-뇌 장벽 투과성을 증가시키기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 본 개시내용은 혈액-뇌 장벽 투과성을 조절하는 작용제를 확인하기 위한 방법 및 조성물을 추가로 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 알칼리 포스파타제 단백질(ALPL)의 활성을 저해하는 작용제를 대상체에게 투여함으로써 대상체에서 혈액-뇌 장벽 투과성을 증가시키기 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
본 개시내용은 또한 치료제를 대상체의 뇌에 전달하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 알칼리 포스파타제 단백질(ALPL)의 활성을 저해하는 작용제; 및 (b) 치료제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 개시내용은 포유동물에서 혈액-뇌 장벽 투과성을 조절하는 단백질 또는 기타 생체분자를 확인하기 위한 방법을 추가로 제공하며, 상기 방법은 (a) 제1 포유동물로부터 분리한 혈장의 단백질체를 검출 가능하게 표지화하는 단계; (b) 표지화된 단백질체를 포함하는 분리된 혈장을 제2 포유동물에 도입하는 단계; (c) 혈액-뇌 장벽을 형성하는 제2 포유동물로부터 뇌 내피 세포를 분리하는 단계; (d) 분류된 뇌 내피 세포 집단을 생성하기 위해 유세포 분석을 사용하여 분리된 뇌 내피 세포 각각에서 혈장 흡수를 측정하는 단계; (e) 분류된 각각의 뇌 내피 세포에서 혈장 흡수와 상관관계가 있는 유전자의 발현을 검출하는 단계; 및 (f) 발현이 뇌 내피 세포에서 증가 또는 감소된 혈장 흡수와 상관관계가 있는 유전자에 의해 인코딩되는 단백질 또는 기타 생체분자를 선택하여, 단백질 또는 기타 생체분자가 대상체에서 혈액-뇌 장벽 투과성을 조절하는 단계 중 하나 이상 또는 각각의 단계를 포함한다.
도 1a는 실시예 1에 기재된 연구 근거 및 혈장 표지 전략의 개략도이다. 도 1b는 어린(3개월령) 마우스에 정맥내 주사하고 20시간 후에 평가한 64Cu-표지화 IgG(상단 패널) 및 Alb/IgG-고갈 혈장(하단 패널)(7.7 MBq 일치 선량, 약 20㎍)의 뇌 오디오라디오그래프(audioradiograph)를 포함한다(n=4를 대표함). 64Cu 신호 범위는 낮음(검은색)에서 높음(흰색)이며 Nissl 염색으로 중첩되었다. 도 1c는 150㎕ 혈장을 정맥내 주사하고 4시간 후에 어린(3개월령) 마우스의 관상 뇌 타일에서 혈장 흡수(흰색) 및 핵(뇌)을 나타내는 형광 현미경 사진이다. 스케일 바 = 1,000 마이크론(n=8의 대표적인 이미지). 도 1d는 150㎕ 혈장을 정맥내 주사하고 4시간 후에 선조체의 점상의 플라스마+ 혈관구조를 나타내는 이미지이다. 스케일 바 = 20 마이크론(n=8 어린 마우스의 대표적인 이미지). 도 1e는 CD31+ 뇌 내피 세포(BEC) 층(적색) 및 AQP4+ 성상세포 종말단추(endfeet)(녹색)과 관련하여 통과세포외배출된(transcytosed) 혈장(흰색)의 기저 측부 국소화를 나타내는 이미지를 포함한다. 도 1e는 또한 각각의 마커 내에서 정규화된 흰색 선을 따라 형광 강도 투영을 도시하는 히스토그램을 포함한다. 삽도는 화살촉으로 표시된 영역을 확대한다. 스케일 바 = 5 마이크론(좌측) 및 1 마이크론(우측)(n=5 어린 마우스의 대표적인 이미지). 도 1f는 150㎕ 혈장을 정맥내 주사하고 20시간 후 해마에서 실질 세포에 의한 혈장 흡수(흰색)를 나타내는 형광 현미경 사진이다. 스케일 바 = 50 마이크론(n=8 어린 마우스의 대표적인 이미지). 도 1g는 150㎕ 혈장을 정맥내 주사하고 20시간 후에 CD31+ 혈관구조(적색) 외부의 피질 NeuN+ 뉴런(파란색)에 의한 혈장 흡수(녹색)를 나타내는 형광 현미경 사진이다. 스케일 바 = 20 마이크론(n=5 어린 마우스의 대표적인 이미지). 도 1h는 150㎕ 혈장을 정맥내 주사하고 20시간 후 CD31+ 혈관구조(적색) 너머 해마의 치상회에 있는 뉴런에 의한 혈장 흡수(녹색)를 나타내는 형광 현미경 사진이다. 스케일 바 = 50 마이크론(좌측) 및 20 마이크론(우측)(n=5 어린 마우스의 대표적인 이미지). 도 1i는 150㎕ 혈장을 정맥내 주사하고 20시간 후 해마의 치상회에서 CD31+ 혈관구조(적색)에 인접한 혈장+(녹색) 뉴런을 나타내는 형광 현미경 사진이다. 흰색 화살촉은 내피 세포와 접촉하는 혈장+ 뉴런 과정을 나타낸다. 스케일 바 = 20 마이크론(n=5 어린 마우스의 대표적인 이미지). 도 1j는 150㎕ 혈장을 정맥내 주사하고 20시간 후 피질 Iba1+ 미세아교세포(적색)의 혈장 흡수(녹색)를 나타내는 형광 현미경 사진이다. 스케일 바 = 10 마이크론(n=5 어린 마우스의 대표적인 이미지). 도 1k는 순환하는 트랜스페린(적색)이 피질(좌측 패널)의 혈장에 대해 이중 양성인 뉴런(녹색)과 혈장에만 양성인 뉴런(우측 패널)을 보여주는 형광 현미경 사진을 포함하는 도면. 스케일 바 = 20 마이크론(n=4 어린 마우스의 대표적인 이미지). 모든 데이터는 적어도 2회의 독립적인 실험으로 복제되었다. 모든 자기방사법 및 형광 뇌 절편은 관류된 마우스에서 유래하였다.
도 2a는 공개된 관류 뇌 RNA-seq(Kadakkuzha et al., Front. Cell. Neurosci. (2015). doi:10.3389/fncel.2015.00063) 및 질량 분석법-기반 단백질체 데이터세트(Sharma et al., Neurosci., 18: 1819-1831 (2015))의 비교를 보여주는 개략도를 나타내는 도면이며, 이는 1,446개의 단백질이 해마에 존재하지만 상응하는 전사체는 해마에서 발현되지 않음을 밝혔다. 그 다음 이 1,446개의 단백질은 주변부에서 해마로 이동할 가능성이 있다. 도 2b는 조직 특이적 발현 분석(Dougherty et al., Nucleic Acids Res. (2010) doi:10.1093/nar/gkq130)에 의해 평가된 바와 같이, 도 2a의 해마에 존재하지만 발현되지 않은 1,446개의 단백질이 혈액에서 유래될 가능성이 있음을 나타내는 그래프이다. 도 2c는 유전자 온톨로지 분석(Ashburner et al., Nature Genetics (2000). doi:10.1038/75556; 및 Gene Ontology Consortium. The Gene Ontology (GO) database and informatics resource. Nucleic Acids Res. (2004). doi:10.1093/nar/gkh036)에 의해 평가된 바와 같이, 도 2a의 해마에 존재하지만 발현되지 않은 1,446개의 단백질이 혈액에서 유래할 가능성이 있음을 나타내는 플롯이다. 도 2d는 뇌 조직에 2 mDa 덱스트란-FITC를 정맥내 주사한 잔존량을 측정함으로써 관류 완전성을 평가한 결과를 도시하는 그래프이다. 관류 후 덱스트란-FITC 주사 및 PBS-주사 어린(3개월령) 마우스 간에 유의한 차이가 관찰되지 않았다(n=6 내지 8, 터키의 다중 비교 보정(Tukey's multiple comparisons correction)을 행한 일원 ANOVA; 평균 +/- s.e.m.). 도 2e는 도 2d로부터의 마우스의 희생 시에 혈장에서 2 mDa 덱스트란-FITC를 순환시키는 것을 도시하는 그래프이다(n=6-8, ****P < 0.0001, 터키의 다중 비교 보정을 행한 일원 ANOVA; 평균 +/- s.e.m.). 도 2d 및 도 2e의 데이터는 적어도 2회의 독립적인 실험으로 복제되었다.
도 3a는 수백 개의 별개의 혈장 단백질의 표지화를 확인하기 위한 혈장 표지화 화학 및 검출 방법의 개요를 도시하는 개략도이다. 도 3b는 생리학적 비-변성 조건(상단) 하에서 N-하이드록시석신이미드(NHS) 에스터 화학을 통한 혈장 단백질의 화학선택적 표지화를 나타내는 다이어그램이다. 광범위한 비-교란 단백질 표지화를 달성하기 위해 각각의 태그에 대해 조건을 최적화하였다. 작은 친화성 태그인 비오틴 및 트랜스-사이클로옥텐에 대한 구조가 나타나 있다(하단). 도 3c는 비오틴으로 표지화되고 항체 어레이에서 인큐베이션되며, 스트렙타비딘으로 프로빙된 혈장 단백질의 이미지를 포함한다. 수백 개의 비오틴화된 단백질이 다양한 활성의 단백질 그룹에서 검출되었다(n=6). 특정 단백질-항체 결합은 표지화가 단백질 구조를 방해하지 않았음을 나타낸다. 표지화되지 않은 혈장 어레이(좌측 패널)의 신호는 적절한 항체 인쇄를 보장하기 위해 비오틴화된 양성 대조군에 해당한다. 도 3d는 클릭 모이어티 트랜스-사이클로옥텐으로 표지화된 혈장 단백질이 분별 및 및 질량 분석법-기반 확인 전 테트라진 비드에 농축되었음을 예시하는 그래프를 포함한다. 표지화된 단백질은 풍부함과 크기에 걸쳐 있으며, 전반적인 비표지 및 검출 가능한 혈장 단백질체와 비교하여 명백한 편향을 나타내지 않았다(n=3, 이원 ANOVA; 평균 +/- s.e.m). 도 3b 및 도 3c의 데이터는 적어도 2회의 독립적인 실험으로 복제되었다.
도 4a는 생체내 PET 신호 검출을 위한 3차원 마우스 뇌 환추(brain atlas) 렌더링에 의해 구분된 뇌 영역의 이미지를 포함한다(Chaney et al., J. Nucl. Med. (2018). doi:10.2967/jnumed.118.209155; 및 Chaney et al., J. Vis. Exp. (2018). doi:10.3791/57243). 도 4b는 7.7 MBq(약 20㎍)의 64Cu-표지화 IgG 또는 Alb/IgG-고갈 혈장의 정맥내 용량(ID)을 받고 20시간 후에 어린(3개월령) 마우스 유래의 뇌 영역에 걸쳐 검출된 생체내 PET 신호를 보여주는 그래프이다. 20시간째에 해당하는 심장 혈액 샘플에서 활성에 대해 신호를 보정하였다(n=7 어린 IgG, n=6 어린 혈장, *P < 0.05, ***P < 0.001, ****P < 0.0001, 2원 ANOVA; 평균 +/- s.e.m). 도 4c는 주사받은 어린 마우스(3개월령) 및 노령 마우스(22개월령) 유래의 관상 뇌 절편에서 64Cu-표지화 IgG 또는 Alb/IgG-고갈 혈장 국소화의 생체외 평가를 예시하는 일련의 오디오라디오그래프를 포함한다. Nissl 염색(중간 패널) 및 방사성 신호/Nissl 오버레이(하단 패널)를 해부학적 동시-등록을 검사하는 데 사용하였다(색상 막대는 낮음(검은색)에서 높음(흰색)까지의 방사성 신호를 나타냄)(그룹당 n=4). 도 4d는 7.7 MBq(약 20㎍)의 64Cu-표지화 IgG 또는 Alb/IgG-고갈 혈장을 정맥내 주사하고 20시간 후에 어린(3개월령) 마우스의 해마 및 피질에서 생체외 자기방사법 신호 강도의 정량화를 예시하는 그래프이다(n=3 내지 4, 양측 t-검정; 평균 +/- s.e.m.). 도 4e는 주사하고 20시간 후에 어린 마우스(3개월령) 및 노령 마우스(22개월령)의 혈액에서 검출된 64Cu-표지화 IgG 및 Alb/IgG-고갈 혈장을 나타내는 그래프이다(n=6 어린 IgG, n=7 어린 혈장, n=5 노화 IgG, 및 n=6 노화 혈장, ****P < 0.0001, 터키의 보정을 행한 일원 ANOVA; 평균 +/- s.e.m.). 모든 데이터는 적어도 2회의 독립적인 실험으로 복제되었다.
도 5a는 형광 플레이트 판독기에 의한 정량화를 위해 150㎕ 식염수 또는 혈장에 노출시키고 다음날 3 kDa 덱스트란 추적자를 주사하여 프로빙한 후 BBB 투과성을 예시하는 그래프이다. 도 5b는 형광 플레이트 판독기에 의한 정량화를 위해 150㎕ 식염수 또는 혈장에 노출시키고 다음날 70 kDa 덱스트란 추적자를 주사하여 프로빙한 후 BBB 투과성을 예시하는 그래프이다. 경미한 외상성 뇌 손상(TBI)은 BBB 누출에 대한 양성 대조군 역할을 하였다(3 kDa 덱스트란의 경우, n=7 내지 9; 70 kDa 덱스트란의 경우, n=4 내지 5, 터키의 다중 비교 보정을 행한 일원 ANOVA; 평균 +/- s.e.m.). 도 5c는 150㎕ 식염수 또는 혈장에 노출시키고 혈관구조(CD31 영역)를 넘어 실질로의 내인성 면역글로불린 혈관외유출에 대해 염색한 후 BBB 투과성을 예시하는 그래프이다(n=4 내지 6, 유의하지 않음, 양측 t-검정; 평균 +/- s.e.m). 도 5d는 150㎕ 식염수 또는 혈장, 또는 TBI157에 노출시킨 후 실질로의 내인성 면역글로불린(흰색) 혈관외유출의 대표적인 이미지를 포함한다. 스케일 바 = 50 마이크론. 도 5e는 연구 전반에 걸쳐 사용된 어린 마우스(3개월령) 및 노령 마우스(20 내지 24개월령)에서 희생 시점(주사 20시간 후)에서 150㎕의 혈장으로 주사 후 혈장 단백질 농도를 기준선에서의 혈장 농도와 비교하여 나타내는 플롯이다(n=35마리의 어린 마우스 기준선, n=35마리의 주사된 어린 마우스, n=22마리의 노령 마우스 기준선, n=32마리의 주사된 노령 마우스, 유의하지 않음, 이원 ANOVA, 평균 +/- s.e.m). 도 5f는 기준선에서 및 150㎕의 혈장에 노출시킨 후 어린(3개월령) 마우스 유래의 뇌 내피 세포의 t-SNE 플롯이며, 혈장 전달(n=3) 시 뇌혈관 전사체의 유의한 교란이 없음을 입증한다. 모든 데이터는 적어도 2회의 독립적인 실험으로 복제되었다.
도 6a는 4시간 후에 분석된 다양한 부피로 주입된 Atto 647N-표지화 혈장의 대표적인 이미지를 포함한다. 부피와 단백질 양 사이에 선형 관계가 있으며, 150㎕는 10 내지 15㎎(0.5 ㎎/체중 g)에 해당한다(즉, 150㎕와 비교하여 10㎕에 대해서는 15배 더 적은 단백질이 주사됨). CD31은 뇌 내피 세포를 표시한다. 스케일 바 = 100 마이크론. 도 6b는 Atto 647N-표지화 혈장을 주사하고 마우스 알부민(상단) 및 IgG(하단)로 염색한 마우스 유래의 뇌 절편 이미지를 포함한다. 더 높은 배율 이미지의 경우, 알부민 및 IgG+ 모세관이 이미징을 위해 배치된 반면흰색 화살촉), 대부분의 혈관구조에는 알부민 및 IgG가 거의 없었다(좌측). 비-공동국소화의 정도는 다른 혈장 요인이 뇌에서 검출된 신호에 대한 책임이 있음을 시사한다. (소수이지만) 알부민 및 IgG+ 모세관의 존재는 리소좀 분해가 BBB 완전성의 추가적인 메커니즘이 될 수 있다는 가정과 일치한다(
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et al., Sci. Rep. (2016). doi:10.1038/srep25658). 스케일 바 = 40 마이크론(좌측) 및 10 마이크론(우측). 도 6c는 Atto 647N-표지화 혈장(좌측); Alexa Fluor 647-표지화 혈장(좌측에서 두 번째); 스트렙타비딘 647 슬라이스 염색에 의해 검출된 비오틴-표지화 혈장(우측에서 두 번째); 및 sDIBO-647 클릭 변형-촉진 알킨-아자이드 첨가환화(SPAAC) 슬라이스 염색에 의해 검출된 아지도호모알라닌-표지화 혈장의 이미지를 포함한다. l-아지도호모알라닌 이외에, 생체외 NHS 에스터 화학을 통해 혈정을 표지화하였다. 마우스의 메티오닐-tRNA 합성효소에 의한 내인성 메티오닌 대신에 아자이드-보유 아지도호모알라닌의 통합을 가능하게 하기 위해 식수에 있는 L-아지도호모알라닌과 메티오닌-결핍 사료를 마우스에게 공급함으로써 된 음식을 먹음으로써 L-아지도호모알라닌을 수행하였다(Kiic et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 99: 19-24 (2002); 및 Calve et al., Sci. Rep. (2016). doi:10.1038/srep32377). 생체내 표지화 l-아지도호모알라닌 혈장을 추출하고 정상적인(L-아지도호모알라닌이 없음) 조건 하에 별도의 마우스에 수혈하였다. 스케일 바 = 20 마이크론. 모든 데이터는 적어도 2회의 독립적인 실험으로 복제되었다.
도 7a는 건강한 성인 뇌에 퍼진 혈장의 대표적인 시상 이미지이다. 스케일 바 = 1,000 마이크론. 도 7b 내지 도 7f는 해마(도 7b), 대뇌 피질(도 7c), 소뇌(도 7d), 시상(도 7e) 및 중뇌(도 7f)를 포함한 뇌 영역에 걸쳐 혈관구조와 실질을 투과하는 혈장을 나타내는 이미지이다. 스케일 바 = 100 마이크론. 도 7g는 중앙 융기에서 혈장의 대표적인 이미지이다. 스케일 바 = 10 마이크론. 도 7h는 대형동맥에서 혈장 분포의 대표적인 볼륨 렌더링의 이미지이다. 혈장은 클라트린-매개 세포내섭취(endocytosis)의 특징인 국소 클러스터에 축적된다(Liu et al., J. Cell Biol. (2010). doi:10.1083/jcb.201008117). 스케일 바 = 50 마이크론. 도 7i는 도 1e에서 흰색선으로 표시된 뇌혈관 단면의 확대 이미지이고, 내피 세포 내부와 너머의 혈장 점 축적을 나타낸다. 뇌 내피 세포는 CD31로 표시되고 성상세포 종말단추는 AQP4로 표시된다. 스케일 바 = 1 마이크론. 도 7j는 평활근 세포의 윤곽을 추적하는 혈장과 함께 혈관주위 공간에서 혈장의 대표적인 이미지를 포함한다. 스케일 바 = 50 마이크론(좌측 패널) 및 20 마이크론(우측 패널). 도 7k는 내피 세포(CD31)를 넘어 위치하지만 아교 경계막(glia limitans)(AQP4) 내에 위치하는, 지주막하 공간을 채우는 혈장의 대표적인 이미지이다. 스케일 바 = 10 마이크론. 도 7l은 맥락총 상피(Claudin1)에서 강한 혈장 신호의 대표적인 이미지이고, CSF로의 혈장 진입과 혈장 흡수 및 제거에서 글림프 시스템(glymphatic system)의 잠재적 역할을 시사한다. 스케일 바 = 50 마이크론. 도 7m은 폐 조직과 내피(CD31)에서 혈장 축적의 대표적인 이미지를 포함하고, BBB와 달리 폐 내피에 의해 설정된 실질과 혈관 구조 사이에 명확한 경계가 없음을 나타낸다. 정준 장벽이 없는 폐 조직에서도 잔류하고 비특이적으로 결합된 유리 염료로부터 신호가 없었다. 스케일 바 = 20 마이크론. 모든 데이터는 적어도 2회의 독립적인 실험으로 복제되었다.
도 8a는 어린 마우스(3개월 - 상단 패널) 및 노령 마우스(22개월 - 하단 패널)에 정맥내 주사하고 20시간 후에 평가한 64Cu-표지화 Alb/IgG-고갈 혈장(7.7 MBq 일치 선량, 약 20㎍)의 뇌 자기방사사진을 포함하는 도면(n=5를 대표함). 64Cu 신호 범위는 낮음(검은색)에서 높음(흰색)이며 Nissl 염색으로 중첩되었다. 도 8b 및 도 8c는 정맥내 주사된 용량(ID, 7.7 MBq 일치 선량, 약 20㎍)의 20시간 후 어린 마우스(3개월령) 및 노령 마우스(22개월령) 유래의 전체 뇌에서 64Cu-표지화 IgG 및 Alb/IgG-고갈 혈장(도 8b) 및 혈관을 제거한 해마 및 피질 실질(도 8c)의 감마 계수기 정량화를 나타내는 그래프이다(n=5 내지 7, 시닥의 다중 비교 보정(Sidak's multiple comparisons correction)을 행한 일원 ANOVA; 평균 +/- s.e.m.). 도 8d는 혈장 흡수(양성) 또는 저해(음성)에 대한 기여도에 대해 플롯팅된 연령에 따라 하향 조절된(좌측, 녹색) 및 상향 조절된(우측, 갈색) 뇌 내피 세포(BEC) 유전자를 보여주는 그래프이다. 도 8e는 어린 마우스(3개월령) 및 노령 마우스(20개월령)의 뇌 내피 세포에서 추정되는 RMT(receptor-mediated transcytosis; 수용체-매개 통과세포외배출) 수용체, 클라트린 구성요소, 및 카베올라 구성요소 및 이의 저해제(CI, caveolar inhibitor; 카베올라 저해제)의 유전자 발현을 예시하는 이미지이다(Yousef et al., Nat. Med. (2019). doi:10.1038/s41591-019-0440-4). Lrp1의 별표는 이의 기저 측부 발현을 나타낸다(Zlokovic et al., J. Neurochem. (2010). doi:10.1111/j.1471-4159.2010.07002.x). 어리거나 노화된 내피 세포에서 평균 FPKM이 1 초과인 유전자가 나타나 있다. 상대 Z 점수 값은 노란색(높음) 또는 파란색(낮음) 등급으로 표시되어 있다. 도 8f는 어린 마우스(3개월령) 및 노령 마우스(20개월령) 유래의 뇌 미세혈관 리피돔의 주요 구성요소(PC) 분석 플롯이다. 연령에 따라 61개 지질이 유의하게 상향 조절되었고 104개 지질이 하향 조절되었다(n=4, 각각의 n은 4마리의 풀임(총 16마리의 어린 마우스, 16마리의 노령 마우스), q<0.1, 양측 t-검정의 순열-기반 FDR). 도 8g는 노령 마우스(20개월령) 대 어린 마우스(3개월령)의 뇌 미세혈관에서 DHA-포함 인지질의 상대적인 풍부함을 나타내는 히트맵이다. 히트맵은 등급이 지정된 노란색(상향 조절된 노령 마우스) 또는 파란색(하향 조절된 노령 마우스)의 각각의 지질 종에 대한 MS 신호의 log-2 정규화 배수 변화를 도시한다(n=4, 각각의 n은 4마리의 마우스의 풀임(총 16마리의 어린 마우스, 16마리의 노령 마우스), *q<0.1, 양측 t-검정의 순열-기반 FDR). 도 8h는 노령 마우스(20개월령) 대 어린 마우스(3개월령)의 뇌 미세혈관에서 마우스 내인성 트랜스페린(좌측 패널) 및 알부민(우측 패널)의 상대적 풍부도(무-표지 정량화, LFQ)를 보여주는 그래프를 포함한다. 녹색 점은 알부민이 검출되지 않은 샘플을 표시하며 값은 검출 한계까지 귀속되었다(n=5마리의 어린 마우스 및 6마리의 노령 마우스, 양측 t-검정; 평균 +/- s.e.m.). 도 8i는 모든 CNS 세포에 걸친 형광 혈장 흡수의 유세포 분석 게이팅의 대표적인 이미지를 포함한다. 혈장 형광은 접합 모이어티 없이 형광단과 유사하게 인큐베이션된 혈장(상단 패널)과 비교하여, 혈장이 정맥내 주사(하단 패널) 전에 NHS 에스터 화학을 통해 적절하게 표지화된 경우에만 나타난다. 게이트는 형광에서 하나의 대조군을 뺀 내인성 자가형광을 완화하도록 설정되었다. 도 8j는 150㎕ 혈장을 정맥내 주사하고 4시간 후, 혈장+ 및 혈장+ BEC의 평균 형광 강도(MFI)인 BEC의 백분율(%)로 평가된 어린 마우스(3개월령) 및 노령 마우스(22개월령) 마우스의 피질 및 해마 뇌 내피 세포(BEC)에 의한 혈장 흡수의 유세포 분석 정량화를 예시하는 그래프를 포함한다(n=4, 양측 t-검정; 평균 +/- s.e.m.). 도 8k는 150㎕ 혈장을 정맥내 주사하고 4시간 후 어린 마우스(3개월 - 좌측 패널) 및 노령 마우스(22개월 - 우측 패널) 피질 CD31+ 혈관구조(적색)의 혈장 흡수(녹색)를 나타내는 이미지를 포함한다. 화살촉은 RMT 수용체 클러스터링 및 계층적 흡수를 나타내는 인접 세포에 비해 혈장 축적이 더 큰 영역을 나타낸다. 스케일 바 = 10 마이크론(n=4 어린 마우스의 대표적인 이미지). 도 8l은 혈장+(좌측 패널) 및 혈장+ BEC의 평균 형광 강도(MFI)(우측 패널)인 BEC의 %로 평가된 어린 마우스(3개월령) 및 노령 마우스(22개월령) 마우스의 피질 및 해마 NeuN+ 뉴런에 의한 혈장 흡수의 유세포 분석 정량화를 예시하는 그래프를 포함한다(n=3 내지 4, 양측 t-검정; 평균 +/- s.e.m.). 모든 데이터는 적어도 2회의 독립적인 실험으로 복제되었다.
도 9a는 어린(3m.o.) 마우스의 피질 및 해마로부터 분리된 뇌 내피 세포에 걸친 구조화된 혈장 흡수의 t-SNE 플롯이다(색상 막대는 최소(검은색)에서 최대(흰색)까지의 혈장 흡수를 나타냄(n=3 어린 마우스 유래의 745 BEC)). 도 1b는 19,899개의 뇌 내피 세포 유전자와 혈장 흡수의 상관관계를 나타내는 그래프이다(스피어만(Spearman)). 상관관계에 의해 유전자의 꼬리 말단 상단 및 하단 1%는 각각 "상관관계" 및 "반상관관계(Anticorrelate)"로 표시되며 예시 유전자가 열거되어 있다. 분포 중앙값은 0.03이었다. 도 9c는 열거된 각각의 경로의 유전자 수와 함께 "상관관계" 및 "반상관관계" 유전자의 경로 농축 분석을 예시하는 개략도이다. 도 9d는 "상관관계" 및 "반상관관계" 유전자의 유전자 온톨로지 세포 구성요소 농축 분석을 예시하는 개략도이다. 도 9e는 모든 유전자에 대한 "상관관계" 및 "반상관관계" 중 혈액-뇌 장벽(BBB)-특이적 유전자(Daneman et al., PLoS One (2010). doi:10.1371/journal.pone.0013741)의 농축을 보여주는 그래프이다. "상관관계", "반상관관계", 및 모든 유전자 내의 유전자 및 이의 농축(초기하 분포)의 백분율이 나타나 있다. 도 9f는 동맥, 모세혈관 및 정맥 구역화에 의한 뇌 내피 세포 분리를 예시하는 t-SNE 플롯이다. 도 9g는 동맥, 모세혈관 및 정맥 구역화에 의한 혈장 흡수를 나타내는 그래프이다. 도 9h는 동맥(1), 모세혈관(2), 및 정맥(3)의 상관관계; 및 동맥(4), 모세혈관(5), 정맥(6)의 반상관관계; 모세혈관 및 정맥(7); 및 전반(8)의 8가지 주요 패턴을 나타내는 혈장 섭취(스피어만, 적색, 높음; 파란색, 낮음)와 유전자 상관관계의 히트맵이다. 도 9i는 트랜스페린 수용체인 Tfrc(스피어만 상관관계)를 발현하는 모세혈관에서 "상관관계"(녹색) 및 "반상관관계"(갈색) 유전자의 공동-발현 분석을 예시하는 매트릭스이다. 매트릭스는 유클리드 거리에 의해 덴드로그램으로 정렬되었으며 모세혈관 세포의 적어도 15%에서 발현되는 유전자를 나타낸다. 도 9j는 SPIN에 의해 분류된 뇌 내피 세포에 걸친 혈장 흡수를 예시하는 그래프를 포함한다. 주황색 곡선은 혈관 분절 내 및 전체의 평균 섭취량(LOWESS)을 측정한다. 구획-특이적 마커는 하단 패널에 나타나 있다. 도 9k는 "상관관계" 및 "반상관관계" 유전자의 대표적인 t-SNE 플롯을 포함한다. 각각의 점은 개별 세포에 해당하며, 유전자 발현 수준은 색상 스펙트럼(log10 CPM)으로 표시된다. 모든 데이터는 적어도 2회의 독립적인 실험으로 복제되었다.
도 10a는 scRNA-seq 분석을 사용하는 순도로 추가 여과된 어린(3개월령) 마우스로부터 분류된 뇌 내피 세포(BEC)의 t-SNE 플롯을 포함한다. 도 10b는 각각의 생물학적 복제물 내에서 BEC당 발현되는 유전자 수의 바이올린 플롯이다. 적색으로 표시된 세포는 이상치(outlier)이다. 도 10c는 복제물 전반에 걸쳐 전사체의 일관성을 보여주는 별개의 마우스의 BEC가 뚜렷하게 착색된 t-SNE 플롯이다. 도 10d는 구역화에 의해 BEC당 발현되는 유전자 수의 바이올린 플롯이다. 적색으로 표시된 세포는 이상치이다. 도 10e는 SPIN 축으로 구성되거나 무작위로 섞인 인접 세포에 걸친 혈장 흡수의 쌍별 차이를 예시하는 플롯이다. SPIN 정렬에 의한 혈장 흡수의 감소된 차이는 동정맥(ACV) 트리 전반에 걸친 혈장 흡수의 단계적 변화를 의미한다. 도 10f는 BEC에 걸친 "상관관계" 및 "반상관관계" 유전자 발현의 강력한 PCA(rPCA) 플롯을 예시하는 t-SNE 플롯을 포함한다. 각각의 점은 개별 세포를 나타내며, 유전자 발현 수준은 색상 스펙트럼(log10 CPM)으로 표시된다. 모든 데이터는 적어도 2회의 독립적인 실험으로 복제되었다.
도 11a는 어린 마우스(3개월령) 및 노령 마우스(20개월령) 마우스의 뇌 내피 세포의 RNA-seq로부터의 밀착 연접 유전자 발현을 예시하는 히트 맵이다(n=6). 상대 Z-점수 값은 노란색(높음) 또는 파란색(낮음) 등급으로 표시된다. 도 11b는 히스톤 H3 로딩 대조군 단백질로 정규화된 어린 마우스(3개월령) 및 노령 마우스(20개월령) 뇌 내피 세포에서 트랜스페린 수용체(TFRC - 좌측 패널) 및 카베올린 1(CAV1 - 우측 패널)의 웨스턴 블롯 정량화를 예시하는 그래프를 포함한다(n=6, 양측 t-검정; 평균 +/- s.e.m.). 도 11c는 어린 마우스(3개월령) 및 노령 마우스(20개월령)의 미세혈관의 편향되지 않은 질량 분석-기반 지질체학에서 차등적으로 풍부한 지질의 계층적 클러스터링을 예시하는 히트 맵이다(n=4; 각각의 샘플은 4마리 마우스의 풀임). 데이터는 Z-점수로 정규화되었다. 0.1 미만의 FDR-보정 q-값을 갖는 지질은 유의한 것으로 간주되었다. 도 11d 내지 도 11f는 어린 마우스(3개월령) 및 노령 마우스(22개월령) 유래의 모든 CNS 세포(도 11d), Thy1+ 뉴런(도 11e), 및 ACSA-2+ 성상세포(도 11f)에 걸친 혈장 흡수의 유세포 분석 정량화를 예시하는 그래프를 포함한다(n=4, 양측 t-검정; 평균 +/- s.e.m.). 데이터는 적어도 2회의 독립적인 실험으로 복제되었다.
도 12a는 뇌 내피 세포 상의 세포 표면, 약물 기량성(druggable) 유전자 후보의 점도포 표현이다. 유전자는 혈액-뇌 장벽 특이성의 정도(Daneman et al., PLoS One (2010). doi:10.1371/journal.pone.0013741) 및 혈장 섭취와의 상관관계에 의해 플롯팅되었다. 유전자는 연령에 따른 상향 조절(갈색) 또는 하향 조절(녹색)에 따라 착색되었다. 도 12b는 노령 마우스(23개월 - 하단 패널)에서 검출되지만 어린 마우스(3개월 - 상단 패널)에서는 검출되지 않는 석회화된 결절(알리자린 레드 염색)의 대표적인 이미지를 포함하며, 이는 주피세포-결핍 Pdgfbret/ret 마우스에서 보이는 결절을 반복한다(Keller et al., Nat. Genet. (2013). doi:10.1038/ng.2723)(연령당 n=5 마우스의 대표적인 이미지). 도 12c는 어린 마우스(3개월 - 좌측 패널) 및 노령 마우스(23개월 - 우측 패널)의 대뇌 피질에서 렉틴+ 혈관구조(적색)의 I형 콜라겐 발현(녹색)의 대표적인 이미지를 포함한다. 스케일 바 = 40 마이크론. 도 12d는 어린 마우스(3개월 - 좌측 패널) 및 노령 마우스(23개월 - 우측 패널) 마우스의 대뇌 피질에서 AQP4+ 혈관구조(보라색)의 ALPL 발현(노란색)의 대표적인 이미지를 포함한다. 스케일 바 = 40 마이크론. 도 12e는 어린 마우스(3개월령) 및 노령 마우스(23개월령)의 대뇌 피질 혈관구조에서 ALPL 발현의 정량화를 예시하는 그래프이다(n=7, 양측 t-검정; 평균 +/- s.e.m.). 도 12f는 뇌혈관 ALPL 저해를 예시하는 개략도이다. 노령(22개월령) 마우스에 혈장, 인간 홀로트랜스페린, 또는 트랜스페린 수용체 항체의 정맥내 주사 전에 3일 동안 하루에 2번 비히클 또는 ALPL 저해제를 복강내 주사하였다. 뇌 내피 및 실질의 흡수를 피질 및 해마의 유세포 분석 및 공초점 현미경으로 평가하였다. 도 12g는 ALPL 저해제(항-ALPL) 또는 비히클로 처리된 노령(22개월령) 마우스 및 어린(3개월령) 마우스의 대뇌 피질 혈관구조에서 이소성 ALPL 활성(적색)의 대표적인 이미지를 포함한다. 도 12h는 ALPL 저해제(항-ALPL) 또는 비히클로 처리된 노령(22개월령) 마우스 및 어린(3개월령) 마우스의 대뇌 피질 혈관구조에서 ALPL 활성의 정량화를 예시하는 그래프이다(n=6 내지 9, 터키의 다중 비교 보정을 행한 일원 ANOVA; 평균 +/- s.e.m.). 도 12i 내지 도 12l은, 추적자+인 실질 세포의 백분율(%) 및 추적자+ 실질 세포의 상대 평균 형광 강도(MFI)에 의해 평가될 때, ALPL 저해제(항-ALPL) 및 비히클 처리 후, 노령(22개월령) 마우스(도 12i)에서 혈장; 어린(3개월령) 마우스에서 혈장(도 12j); 노령(22개월령) 마우스에서 인간 홀로-트랜스페린(hu-Tf)(도 12k); 또는 노령(22개월령) 마우스에서 트랜스페린 수용체 항체(TfR Ab)(도 12l)의 뇌 실질(CD31-/CD45-) 세포 흡수의 유세포 분석 정량화를 예시하는 그래프를 포함한다(혈장의 경우, n=4; hu-Tf의 경우, n=5 내지 6; TfR Ab의 경우, n=9, 양측 t-검정; 평균 +/- s.e.m.). 추적자는 혈장, hu-Tf, 또는 TfR Ab를 지칭한다. 도 12m은 ALPL 저해제-처리된 노령(22개월령) 마우스의 피질 혈관구조(적색) 및 실질 세포에 있는 트랜스페린 수용체 항체(TfR Ab)의 대표적인 이미지를 포함한다. 화살촉은 TfR Ab+ NeuN 뉴런을 표시한다. 스케일 바 = 40 마이크론(좌측) 및 10 마이크론(우측). 데이터는 적어도 2회의 독립적인 실험으로 복제되었다.
도 13a는 백만개 판독당 로그-정규화 카운트(CPM)인, CNS 세포에서 Alpl 발현의 scRNA-seq 분석 결과를 나타내는 바이올린 플롯 및 t-SNE를 포함하는 도면. Alpl은 주로 뇌 내피 세포에서 발현된다(n=7, 어린 마우스). 데이터는 Tabula Muris Consortium에서 가져온 것이다. 도 13b는 CNS, 말초 및 조직 배양에서 내피 및 비-내피 세포에 걸친 Alpl 발현을 나타내는 그래프이다(백만개당 전사체, TPM). Alpl은 뇌 내피에 특이적이며 배양 시 발현이 손실되었다. 데이터는 Vascular Endothelial Cell Transomics Resource Database(markfsabbagh.shinyapps.io/vectrdb/)(Sabbagh et al., Elife (2018). doi:10.7554/elife.36187)에서 가져온 것이다. 도 13c는 어린 뇌 내피 세포(BEC)에서 Alpl 발현과 결합된 유세포 분석 지수 분류 및 scRNA-seq로부터의 혈장 흡수 사이의 상관관계를 나타내는 플롯이다. 파란색 선은 선형 회귀, 스피어만 상관관계를 나타낸다. 비-Alpl 발현 BEC는 제외되었다. 도 13d는 Alpl 발현이 연령에 따라 모세혈관에서 특이적으로 증가함을 예시하는 버블 플롯(Chen et al., bioRxiv (2019). doi:10.1101/617258)이다. 도 13e는 어린(3개월령) 및 노화(23개월령) 뇌에서 ALPL 단백질 발현을 나타내는 이미지를 포함한다. 스케일 바 = 1,000 마이크론. 도 13c 및 도 13e의 데이터는 적어도 2회의 독립적인 실험으로 복제되었다.
도 14a 내지 도 14d는 추적자+인 BEC의 % 및 추적자+ BEC의 상대 MFI에 의해 평가될 때, 3일 동안 1일 2회 IP 주사를 통해 비히클(회색) 또는 항-ALPL(녹색)으로 처리한 어린 마우스(3개월령) 유래의 혈장(도 14a), 노령 마우스(22개월령) 유래의 혈장(도 14b), 노령 마우스 유래의 인간 홀로-트랜스페린(hu-Tf)(도 14c), 또는 노령 마우스 유래의 트랜스페린 수용체 항체(TfR Ab)(도 14d)의 뇌 내피 세포 흡수의 유세포 분석 정량화를 예시하는 그래프이다(혈장의 경우, n=4; hu-Tf의 경우, n=6 비히클, n=5 항-ALPL; TfR Ab의 경우, n=9, 양측 t-검정; 평균 +/- s.e.m.). 추적자는 혈장, hu-Tf, 또는 TfR Ab를 지칭한다. 도 14e는 ALPL 저해제로 처리된 마우스의 피질에서 검출된 hu-Tf+ 뉴런의 대표적인 이미지를 포함한다. 스케일 바 = 40 마이크론. 도 14f는 주사량의 차이를 제어하고 차이가 없음을 보장하기 위해 희생 시간에 혈장 내 순환 인간 홀로-트랜스페린 및 트랜스페린 수용체 항체를 보여주는 그래프를 포함한다(hu-Tf+의 경우, n=6 비히클, n=5 항-ALPL; TfR Ab의 경우, n=9, 양측 t-검정, 평균 +/- s.e.m.). 도 14g는 비히클 또는 항-ALPL로 처리된 노령 마우스(22개월령)로부터 CD31 염색에 의해 분석된 바와 같은 전체 뇌혈관 형태를 예시하는 이미지를 포함한다. 스케일 바 = 1,000 마이크론. 데이터는 적어도 2회의 독립적인 실험으로 복제되었다. 도 14h는 어린 마우스(3개월령) 및 노령 마우스(22개월령)에서 세포사이 투과성의 파괴를 프로빙하는 3 kDa 덱스트란 추적자의 뇌 내피 세포 및 뇌 실질 세포 흡수의 유세포 분석 정량화를 예시하는 그래프를 포함한다(n=6 비히클, n=5 항-ALPL, 양측 t-검정, 평균 +/- s.e.m.).
도 15a 내지 도 15d는 혈장+, NeuN+ 뉴런(도 15a); Thy1(CD90)+ 뉴런(도 15b); ACS2-A+ 성상세포(도 15c); 및 CD31+/CD45- 뇌 내피 세포(BEC)(도 15d)에 대한 대표적인 게이팅을 예시하는 이미지이다. 각각의 세포 유형에 대해, 특히 노화된 뇌에서 자가형광의 혼동을 피하기 위해 혈장+ 게이트를 FMO 음성 대조군(주사되지 않음)으로 설정하였다. 도 15e는 ALPL 저해제 처리가 있거나 없는 혈장, 인간 홀로-트랜스페린, 또는 트랜스페린 수용체 항체에 생체내 노출 후 노령 마우스(22개월령)로부터 CD31+/CD45- 뇌 내피 세포 및 CD31-/CD45- 실질 세포에 대한 대표적인 게이팅을 예시하는 이미지를 포함한다. 자가형광의 혼동을 피하기 위해 혈장, 인간 홀로-트랜스페린, 및 트랜스페린 수용체 항체("추적자") 게이트를 FMO 음성 대조군(주사되지 않음)으로 설정하였다. 나타낸 예는 트랜스페린 수용체 항체를 주사한 마우스의 것이다.
도 16은 연령에 따른 BBB 통과세포외배출 이동의 작업 모델을 예시하는 개략도이다. 건강한 성인에서 뇌 내피 세포는 높은 수준의 수용체 및 클라트린-코팅된 구덩이의 구성요소를 발현하여(Simionescu, M. et al. J. Submicrosc. Cytol. Pathol., 20(2): 243-61 (1988);
Figure pct00003
et al., AAPS J. (2008). doi:10.1208/s12248-008-9055-2) 수용체-매개 통과세포외배출(RMT)을 통해 선택된 혈장 단백질을 수송한다. 나이가 들면서, 주피세포는 퇴화하여 혈관 석회화 및 리간드-특이적 수용체-매개에서 카베올라 통과세포외배출로 내피 수송의 이동을 촉진시킬 수 있다. 카베올라 통과세포외배출은 비특이적이어서, 노화된 BBB가 피브린(ogen), 트롬빈, 및 자가-항체와 같은 건강한 대상체에서 배제된 신경독성 단백질에 "누설"되게 만든다(Petersen et al., Nature Reviews Neuroscience (2018). doi:10.1038/nrn.2018.13; 및 Montagne et al., J. Exp. Med. (2017). doi:10.1084/jem.20171406). RMT 수용체의 손실은 개발 중인 트랜스페린 수용체 항체를 포함하여 약물 전달 노력을 복잡하게 하고, 최적의 CNS 항상성에 필요한 말초 인자의 흡수를 손상시킬 수 있다.
도 17a 내지 도 17c는 어린 마우스 및 노령 마우스 뇌 유래의 뇌 모세혈관(도 17a), 정맥(도 17b), 및 세동맥(도 17c)에서 혈장 흡수에 대한 유전자 상관관계를 보여주는 산점도 및 동반 히스토그램이다.
도 18은 노령 마우스 뇌(23개월령)에서 ALPL- 혈관구조에 의한 순환 전달의 향상된 흡수를 예시하는 이미지 및 그래프를 포함한다(스케일 바 = 40 마이크론; n=6, 쌍별 양측 t-검정; 평균 +/- s.e.m.).
도 19a는 투여 4시간 후에 재조합 마우스 렙틴(r렙틴) 및 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)의 BEC 흡수를 기록하는 MFI를 나타내는 히스토그램 및 그래프를 포함한다(n=7, 양측 t-검정; 평균 +/- s.e.m.). 도 19b는 급격하게 분리된 미세혈관에서 클라트린 및 카베올라 소포체의 면역형광 이미지를 포함하는 도면(스케일 바 = 10 마이크론). 도 19c는 클라트린 및 카베올라 소포체의 정량화를 나타내는 그래프를 포함한다(n=5, 양측 t-검정; 평균 +/- s.e.m.).
도 20a는 노화 및 어린 뇌에서 피질 CD13+ 혈관 주피세포 및 CD31+ 내피 세포를 나타내는 이미지를 포함하는 도면(스케일 바 = 40 마이크론). 도 20b는 피질 CD13+ 혈관 주피세포 및 CD31+ 내피 세포의 정량화를 나타내는 그래프이다(n=5 어린 뇌, n=7 노화 뇌, 양측 t-검정; 평균 +/- s.e.m.). 도 20c는 TFRC 및 MFSD2A 피질 혈관 발현을 나타내는 이미지를 나타내는 도면(스케일 바 = 40 마이크론). 도 20d는 TFRC 및 MFSD2A 피질 혈관 발현의 정량화를 나타내는 그래프이다(n=7 TFRC; n=8 MFSD2A, 양측 t-검정; 평균 +/- s.e.m.).
도 21a는 ALPL+/- 피질 혈관구조에서 홀로-트랜스페린 흡수를 나타내는 이미지 및 히스토그램을 포함한다(n=6, 쌍별 양측 t-검정). 도 21b는 ALPL 저해제 및 비히클(7,036개 모세혈관 세포, n=그룹당 풀링된 4마리 마우스, 본페로니(Bonferroni) 보정이 적용된 MAST)의 투여 후 노령 마우스로부터 차등적으로 발현된 유전자(FDR < 0.05)의 MA 플롯이다. 도 21c는 도 21b의 패러다임(1,171개의 동맥, 7,036개의 모세혈관, 및 430개의 정맥 세포, 본페로니 보정이 적용된 MAST)에 따라, 혈관 분절에 걸쳐 트랜스페린 수용체(Tfrc) 발현을 보여주는 바이올린 플롯을 포함한다.
도 22는 BBB를 가로지르는 철분 수송의 메커니즘을 예시하는 개략도이다.
도 23은 Tfrc 및 Slc40a1이 ALPL 저해 시 BBB에서 상향 조절되는 상위 유전자 중 하나임을 보여주는 그래프이다.
도 24a 내지 도 24c는 ALPL 저해 시 뇌 동맥 세포(도 24a), 모세혈관 세포(도 24b), 및 정맥 세포(도 24c)에 걸친 Slc40a1 상향 조절의 크기를 보여주는 바이올린 플롯이다.
본 개시내용은 혈액-뇌 장벽의 투과성을 조절하는 단백질 및 기타 생체분자를 확인하는 스크리닝 방법의 개발에 적어도 부분적으로 기초한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 전체 혈장 단백질체를 신규 발견 도구로 사용하면, BBB로 보호되는 건강한 성인 뇌 실질에 용이하게 침투하여 내인성 단백질 및 기타 생체분자가 직접 시각화될 수 있다. 이 과정은 뇌 내피에 고유한 전사 프로그램에 의해 크게 조절되며, 흡수는 혈관 분절에 따라 크게 다르다. 나이가 들어감에 따라, 혈장 흡수의 많은 활성 조절인자가 하향 조절되어, 도 16에 개략적으로 나타낸 바와 같이 BBB에서 수용체-매개에서 비특이적 카베올라(caveolar) 통과세포외배출로의 이동을 초래한다. 본 개시내용은 BBB 통과세포외배출의 음성 조절인자의 저해를 통해 BBB 통과세포외배출의 연령-관련 이동을 회복하기 위한 방법을 제공한다.
정의
본 기술의 이해를 용이하게 하기 위해, 다수의 용어 및 어구가 하기에 정의되어 있다. 추가적인 정의는 상세한 설명 전반에 걸쳐 제시된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "핵산", "폴리뉴클레오타이드", "뉴클레오타이드 서열", 및 "올리고뉴클레오타이드"는 호환 가능하게 사용되며, 피리미딘 및/또는 퓨린 염기, 바람직하게는 각각 사이토신, 티민과 우라실, 및 아데닌과 구아닌의 중합체 또는 올리고머를 지칭한다(문헌[Albert L. Lehninger, Principles of Biochemistry, 793-800 (Worth Pub. 1982)] 참조). 용어는 임의의 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 또는 펩타이드 핵산 구성요소, 및 이들의 임의의 화학적 변이체, 예컨대, 이들 염기의 메틸화, 하이드록시메틸화, 또는 글라이코실화 형태를 포함한다. 중합체 또는 올리고머는 조성이 불균질하거나 균질할 수 있고, 자연 발생 공급원으로부터 분리될 수 있거나, 인공적으로 또는 합성적으로 생성될 수 있다. 추가적으로, 핵산은 DNA 또는 RNA, 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 동종이중나선, 이종이중나선, 및 하이브리드 상태를 포함하여 단일-가닥 또는 이중-가닥 형태로 영구적으로 또는 일시적으로 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산 또는 핵산 서열은, 예를 들어 DNA/RNA 나선, 펩타이드 핵산(PNA), 모폴리노 핵산(예를 들어, 문헌[Braasch and Corey, Biochemistry, 41(14): 4503-4510 (2002)] 및 미국 특허 제5,034,506호 참조), 잠금형 핵산(locked nucleic acid(LNA); 문헌[Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97: 5633-5638 (2000)] 참조), 사이클로헥세닐 핵산(문헌[Wang, J. Am. Chem. Soc., 122: 8595-8602 (2000)] 참조), 및/도는 리보자임과 같은 다른 종류의 핵산 구조를 포함한다. 용어 "핵산" 및 "핵산 서열"은 또한 비-천연 뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드, 및/또는 천연 뉴클레오타이드와 동일한 기능을 나타낼 수 있는 비-뉴클레오타이드 빌딩 블록(예를 들어, "뉴클레오타이드 유사체")을 포함하는 사슬을 포함할 수 있다.
용어 "펩타이드", "폴리펩타이드", 및 "단백질"은 본 명세서에서 호환 가능하게 사용되며, 코딩된 아미노산 및 코딩되지 않은 아미노산, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형되거나 유도체화된 아미노산, 및 변형된 펩타이드 골격을 갖는 폴리펩타이드를 포함할 수 있는 적어도 2개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 아미노산의 중합체 형태를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료", "치료하는" 등은 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 지칭한다. 바람직하게는, 효과는 치료적이며, 즉 효과는 상해, 질환, 및/또는 상해 또는 질환에 기인하는 유해 증상을 부분적으로 또는 완전히 완화시키거나 치유한다. 유사하게, "치료제"는 필요로 하는 대상체에게 투여될 때 상해, 질환, 및/또는 유해 증상을 완화시키거나 치유할 수 있는 임의의 물질, 분자, 또는 화합물이다. 이를 위해, 본 명세서에 기재된 방법은 바람직하게는 치료제의 "치료적 유효량"을 투여하는 것을 포함한다. "치료적 유효량"은 원하는 치료 효과를 달성하기 위해 필요한 투약량 및 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다. 치료적 유효량은 개체의 상해 중증도, 연령, 성별, 및 체중, 및 개체에서 원하는 반응을 유도하는 치료제의 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "생체분자" 및 "생물학적 분자"는 살아있는 유기체 또는 세포에 의해 생성되는 임의의 분자 또는 화합물을 지칭한다. 생체분자는 전형적으로 유기물이며, 예를 들어 단백질, 탄수화물, 지질, 및 핵산과 같은 큰 거대분자(또는 다중음이온)뿐만 아니라, 1차 대사산물, 2차 대사산물, 및 천연 생성물과 같은 소분자를 포함합니다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "거대분자"는 2종 이상의 단량체의 중합에 의해 생성되는 큰 중합체 분자를 지칭한다. 거대 분자는 전형적으로 수천 개 이상의 원자로 구성된다. 거대분자의 예는 생체고분자(예를 들어, 핵산, 단백질, 및 탄수화물)와 대형 비-중합체 분자(예를 들어, 지질 및 거대고리)를 포함한다. 합성 거대분자는, 예를 들어 일반 플라스틱, 합성 섬유, 및 탄소 나노튜브를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "면역글로불린" 또는 "항체"는 척추동물의 혈액 또는 기타 체액에서 발견되는 단백질을 지칭하며, 이는 면역계에 의해 박테리아 및 바이러스와 같은 외래 물질을 확인하고 중화시키는 데 사용된다. 전형적으로, 면역글로불린 또는 항체는 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 단백질이다. CDR은 항원 결합을 담당하는 항체의 "초가변 영역"을 형성한다(하기에서 추가로 논의됨). 전체 면역글로불린은 전형적으로 4개의 폴리펩타이드, 즉 중쇄(H) 폴리펩타이드의 동일한 복사체 2개와 경쇄(L) 폴리펩타이드의 동일한 복사체 2개로 이루어진다. 각각의 중쇄는 1개의 N-말단 가변(VH) 영역과 3개의 C-말단 불변(CH1, CH2, 및 CH3) 영역을 포함하고, 각각의 경쇄는 1개의 N-말단 가변(VL) 영역과 1개의 C-말단 불변(CL) 영역을 포함한다. 항체의 경쇄는 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로, 카파(κ) 또는 람다(λ)의 2가지 별개의 유형 중 하나로 지정될 수 있다. 전형적인 항체에서, 각각의 경쇄는 이황화 결합에 의해 중쇄에 연결되고, 2개의 중쇄는 이황화 결합에 의해 서로 연결된다. 경쇄 가변 영역은 중쇄의 가변 영역과 정렬되고, 경쇄 불변 영역은 중쇄의 제1 불변 영역과 정렬된다. 중쇄의 나머지 불변 영역은 서로 정렬된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "단클론성 항체"는 항원 상의 단일 에피토프에 대해 지시되는 B 림프구의 단일 클론에 의해 생성되는 항체를 지칭한다. 단클론성 항체는 전형적으로 문헌[
Figure pct00004
and Milstein, Eur. J. Immunol., 5: 511-519 (1976)]에 처음 기재된 바와 같이 하이브리도마 기술을 사용하여 생성된다. 단클론성 항체는 또한 파지 디스플레이 항체 라이브러리로부터 분리되거나(예를 들어, 문헌[Clackson et al. Nature, 352: 624-628 (1991); 및 Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)] 참조), 완전한 인간 면역글로불린 시스템을 보유하는 유전자이식 마우스로부터 생성된(예를 들어, 문헌[Lonberg, Nat. Biotechnol., 23(9): 1117-25 (2005), 및 Lonberg, Handb. Exp. Pharmacol., 181: 69-97 (2008)] 참조) 재조합 DNA 방법(예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 참조)을 사용하여 생성될 수 있다. 대조적으로, "다클론성" 항체는 동물 내에서 상이한 B 세포 계통에 의해 분비되는 항체이다. 다클론성 항체는 동일한 항원에 있는 여러 에피토프를 인식하는 면역글로불린 분자의 집합이다.
용어 "항체의 단편", "항체 단편", 및 항체의 "항원-결합 단편"은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭하기 위해 본 명세서에서 호환 가능하게 사용된다(일반적으로, 문헌[Holliger et al., Nat. Biotech., 23(9): 1126-1129 (2005)] 참조). 본 명세서에 기재된 항체의 임의의 항원-결합 단편은 본 발명의 범주 내에 있다. 항체 단편은 바람직하게는, 예를 들어 하나 이상의 CDR, 가변 영역(또는 이의 부분), 불변 영역(또는 이의 부분), 또는 이들의 조합을 포함한다. 항체 단편의 예는 (i) VL, VH, CL, 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편, (ii) 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결되는 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편, (iii) 항체의 단일 암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (iv) 온화한 환원 조건을 사용하여 F(ab')2 단편의 이황화 가교를 절단하여 생성된 Fab' 단편, (v) 이황화-안정화된 Fv 단편(dsFv), 및 (vi) 항원에 특이적으로 결합하는 항체 단일 가변 영역 도메인(VH 또는 VL) 폴리펩타이드인 도메인 항체(dAb)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "재조합"은 특정 핵산(DNA 또는 RNA)이 자연계에서 발견되는 내인성 핵산과 구별되는 구조적 코딩 또는 비-코딩 서열을 갖는 작제물을 생성하는 클로닝, 제한, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 및/또는 결찰 단계의 다양한 조합의 산물임을 의미한다. 폴리펩타이드를 인코딩하는 DNA 서열은 세포 또는 무세포 전사 및 번역 시스템에 포함된 재조합 전사 단위로부터 발현될 수 있는 합성 핵산을 제공하기 위해 cDNA 단편 또는 일련의 합성 올리고뉴클레오타이드로부터 조립될 수 있다. 관련 서열을 포함하는 게놈 DNA는 또한 재조합 유전자 또는 전사 단위의 형성에 사용될 수 있다. 번역되지 않은 DNA의 서열은 오픈 리딩 프레임으로부터 5' 또는 3'에 존재할 수 있으며, 이와 같은 서열은 코딩 영역의 조작 또는 발현을 방해하지 않으며, 다양한 메커니즘에 의해 원하는 생성물의 생성을 조절하는 역할을 할 수 있다. 대안적으로, 번역되지 않는 RNA를 인코딩하는 DNA 서열도 또한 재조합으로 간주될 수 있다. 따라서, 용어 "재조합" 핵산은 또한 자연적으로 발생하지 않는 핵산, 예를 들어 인간 개입을 통해 2개의 달리 분리된 서열 절편의 인공 조합에 의해 만들어진 핵산을 지칭한다. 이러한 인공적인 조합은 종종 화학적 합성 수단에 의해, 또는 예를 들어 유전 공학 기법에 의해 분리된 핵산 절편의 인공 조작에 의해 달성된다. 이는 보통 코돈을 동일한 아미노산, 보존적 아미노산 또는 비-보존적 아미노산을 인코딩하는 코돈으로 교체하기 위해 수행된다. 대안적으로, 인공적인 조합은 원하는 기능의 핵산 절편을 함께 연결하여 원하는 기능의 조합을 생성하기 위해 수행될 수 있다. 이러한 인공적인 조합은 종종 화학적 합성 수단에 의해, 또는 예를 들어 유전 공학 기법에 의해 분리된 핵산 절편의 인공 조작에 의해 달성된다. 재조합 폴리뉴클레오타이드가 폴리펩타이드를 인코딩하는 경우, 인코딩된 폴리펩티드의 서열은 자연 발생("야생형")일 수 있거나 자연 발생 서열의 변이체(예를 들어, 돌연변이)일 수 있다. 따라서, 용어 "재조합" 폴리펩타이드는 반드시 서열이 자연적으로 발생하지 않는 폴리펩타이드를 지칭하지는 않는다. 대신에, "재조합" 폴리펩타이드는 재조합 DNA 서열에 의해 인코딩되지만, 폴리펩타이드의 서열은 자연 발생("야생형") 또는 비-자연 발생(예를 들어, 변이체, 돌연변이체 등)일 수 있다. 따라서, "재조합" 폴리펩타이드는 인간 개입의 결과이지만, 자연 발생 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "소분자"는 생물학적 과정을 조절할 수 있는 저분자량(900 달톤 미만)의 유기 화합물을 지칭하며, 크기는 전형적으로 1 ㎚ 정도이다. 소분자는 다양한 생물학적 기능을 나타내며, 세포 신호전달, 의약품 및 살충제와 같은 다양한 용도로 사용될 수 있다. 소분자의 예는 아미노산, 지방산, 페놀 화합물, 알칼로이드, 스테로이드, 빌린(bilin), 레티노이드 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "단백질체"는 유기체에 의해 발현되는 완전한 단백질 세트 또는 특정 세포 또는 조직 유형에서 특정 시간에 생성되는 특정 단백질 세트를 지칭한다. 특정 유기체, 세포, 또는 조직의 단백질체는 유기체, 세포, 또는 조직의 발달 단계, 및 내부 및 외부 조건 둘 다를 포함한 다양한 요인에 반응하여 능동적으로 변화한다.
용어 "대상체" 및 "환자"는 본 명세서에서 호환 가능하게 사용되며 포유동물(예를 들어, 소, 돼지, 낙타, 라마, 말, 염소, 토끼, 양, 햄스터, 기니피그, 고양이, 개, 래트, 및 마우스, 비-인간 영장류(예를 들어, 원숭이, 예컨대, 사이노몰거스 또는 히말라야 원숭이(rhesus monkey), 침팬지 등) 및 인간)을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 임의의 척추동물을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간 또는 비-인간일 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다.
혈액-뇌 장벽 투과성
본 개시내용은 중추신경계(CNS) 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체의 뇌로 거대분자(예를 들어, 치료제)의 전달을 향상시키기 위해 대상체에서 혈액-뇌 장벽 투과성을 증가시키기 위한 방법을 제공한다.
용어 "혈액-뇌 장벽(BBB)"은 중추 신경계의 미세혈관구조의 독특한 특성을 기재하는 데 사용된다. BBB는 뇌의 400마일의 모세혈관과 혈관을 덮고 뇌 미세혈관의 내강을 형성하는 내피 세포(EC)의 면밀히 짜여진 층이다(Ransohoff et al., Nature Rev. Immun., 3: 569-581 (2003); Abbott et al., Neurobiol. Dis., 37: 13-25 (2010)). BBB는 중추신경계(CNS) 안팎으로 분자와 세포의 혈관외유출을 조절하는 내피 세포 사이의 밀착 연접을 통해 장벽 기능을 달성한다(Abbott et al., 상기함). 모세혈관 내피세포 내 특정 수송 시스템의 존재는 뇌가 정상적인 성장과 기능에 필요한 모든 화합물을 통제된 방식으로 수용하는 것을 보장한다. 많은 경우에, 이러한 수송 시스템은 특정 분자에 선택적으로 결합하여 장벽 막을 가로질러 수송하는 막-연관 단백질로 이루어진다. 이러한 운반체 단백질은 용질 운반체 수송체로 알려져 있다. 이러한 크게 제한하는 장벽 용량은 BBB EC가 CNS 항상성을 엄격하게 조절하도록 하며, 이는 적절한 신경 기능을 허용할 뿐만 아니라 독소, 병원체, 염증, 상해 및 질환으로부터 CNS를 보호하는 데 중요하다.
BBB의 제한적인 특성은 CNS로의 약물 전달에 대한 장애물을 제공하고, 치료제 전달을 위해 BBB를 조절하거나 우회하기 위한 주요 노력이 이루어졌다(Larsen et al., Curr Top Med Chem., 14(9): 1148-60 (2014); 및 Daneman R. and Prat A., Cold Spring Harb Perspect Biol, 7(1): a020412 (2015)). 실제로, 크기가 500 Da 미만인 소분자 약물의 98% 초과가 BBB를 통과하지 못하는 것으로 추정되었다(Pardridge, "Brain Drug Targeting: the Future of Brain Drug Development," Cambridge University Press, Cambridge, UK (2001); Pardridge, NeuroRx, 2: 3-14 (2005); 및 미국 특허 출원 공개 제2013/0224110호). CNS 약물-전달을 위한 현재 전략은, 화학적 BBB 파괴, 물리적 BBB 파괴, 및 약물 변형의 3가지 광범위한 카테고리로 나뉜다.
뇌졸중, 다발성 경화증(MS), 뇌 외상 및 신경퇴행성 장애를 포함하는 신경학적 질환 동안 BBB 장벽 특성의 일부 또는 대부분의 손실은 이러한 질환의 병리 및 진행의 주요 구성요소이다(Zlokovic, B.V., Neuron, 57(2): 178-201 (2008); 및 Daneman R, Ann Neurol. Nov; 72(5):648-72 (2012)). BBB 기능장애는 또한 이온 조절장애, 변경된 신호전달 항상성뿐만 아니라, CNS로의 면역 세포 및 분자 진입으로 이어질 수 있으며, 이 모두는 신경 기능장애 및 퇴행으로 이어질 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 대상체에서 혈액-뇌 장벽 투과성을 증가시키기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 뇌에서 알칼리 포스파타제 단백질(ALPL)의 활성을 저해하는 작용제를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. BBB를 구성하는 혈액 모세혈관의 내피 세포에 추가적으로, 혈액을 중추 신경계("CNS")의 뇌척수액("CSF")에서 분리하는 맥락총("CP")의 상피 세포는 함께 CNS 장벽으로 기능한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 대상체에서 BBB 투과성을 증가시키기 위한 방법은 BBB, CP 및/또는 CNS 장벽의 투과성을 증가시킬 수 있다.
알칼리 포스파타제는 높은 pH에서 다양한 모노포스페이트 에스터를 가수분해하는 막-결합 당단백질이다(Weiss et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 83: 7182-7186 (1986)). 조직-비특이적 알칼리 포스파타제(TNAP)라고도 알려진 간/뼈/신장 알칼리 포스파타제는 생리학적으로 지질-고정 포스포에탄올아민(PEA) 및 피리독살-5-프라임-포스페이트(PLP) 엑토포스파타제로 작용한다. 조직-비특이적 알칼리 포스파타제는 ALPL 유전자에 의해 인코딩된다(Weiss et al., 상기함). 추론된 524개 아미노산 ALPL 단백질은 17개 아미노산으로 구성된 추정 신호 펩타이드와 57.2 kD의 예상 분자량을 갖는다. ALPL 단백질은 태반 알칼리 포스파타제와 52% 서열 동일성을 공유한다. ALPL 단백질은 골 석회화의 주요 이펙터이며 ALPL의 정상하위 대립인자(hypomorphic) 돌연변이가 저인산효소증 환자에서 결핍된 광물화를 유도하기 때문에, 정상적인 골격 발달에 필수적이다(Sheen et al., J Bone Miner Res., 30(5): 824-836 (2015); Murshed et al., Genes Dev., 19(9): 1093-1104 (2005); Lomashvili et al., Kidney Int., 85(6): 1351-1356 (2014); Savinov et al., J Am Heart Assoc., 4(12): e002499 (2015); Romanelli et al.; PLoS One, 12(10): e0186426 (2017); 및 Whyte et al., N Engl J Med., 366(10): 904-913 (2012)). 본 명세서에서 입증된 바와 같이(실시예 참조), ALPL은 노화된 뇌의 BBB에서 상향 조절되고 ALPL의 저해는 트랜스페린 및 트랜스페린 수용체 항체뿐만 아니라 혈장의 뇌 흡수를 향상시킨다. ALPL 유전자의 핵산 서열은, 예를 들어 미국 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information: NCBI)의 GenBank 데이터베이스에서 수탁 번호 NG_008940.1로 공개적으로 이용 가능하다. ALPL 아미노산 서열은, 예를 들어 GenBank 데이터베이스에서 수탁 번호 NP_001356734.1, NP_001356733.1, 및 NP_001356732.1로 공개적으로 이용 가능하다.
ALPL 활성의 저해는 BBB 투과성을 임의의 적합한 양 또는 정도만큼 증가시킬 수 있다. 예를 들어, ALPL 저해는 BBB 투과성을 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 또는 25배, 또는 상기 값 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위만큼 증가시킬 수 있다. BBB 투과성의 증가는 임의의 적합한 기간 동안 발생할 수 있다. 예를 들어, BBB 투과성이 증가는 5분, 10분, 15분, 20분, 25분, 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 24시간, 또는 그 이상 동안 지속될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 어구 "ALPL을 저해하는"은 ALPL의 발현 및/또는 생물학적 활성 또는 기능을 방해하는 물질의 능력 또는 방법을 지칭한다. 저해 정도는 부분적으로 완전하거나(예: 10% 이상, 25% 이상, 50% 이상 또는 75% 이상), 실질적으로 완전하거나(예를 들어, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상), 또는 온전히 완전(예를 들어, 98% 이상, 또는 99% 이상)할 수 있다. 본 명세서에 개시된 바와 같은 ALPL의 저해는 ALPL의 생물학적 활성을 방해하거나 저해하는 것을 포함할 수 있다. ALPL 생물학적 활성은 임의의 적합한 작용제를 사용하여 저해될 수 있다. 일 실시형태에서, 예를 들어 ALPL을 저해하는 것은 대상체를 ALPL 단백질의 활성을 저해하는 작용제와 접촉시키는 것을 포함한다. 알칼리 포스파타제를 저해하는 임의의 적합한 작용제가 개시된 방법에서 사용될 수 있다. 이와 같은 작용제는 포스페이트 유도체, 포스포네이트, 바나데이트, 비산염, 및 호모아르기닌(Fernley, H.N. and Walker, P.G., Biochem. J., 104(3): 1011-1018 (1967); Shirazi et al., Biochem J., 194(3): 803-809 (1981) 또는 효소 활성을 저해하는 다른 소분자를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 조직-비특이적 알칼리 포스파타제를 저해하는 소분자(즉, ALPL 단백질)는, 예를 들어 문헌[Dahl et al., J. Med. Chem., 52(21): 6919-6925 (2009)] 및 WO 제2013/126608호(이들 각각은 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용됨)에 기재된 것과 같은 아릴 설폰아마이드를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 다른 저해제는, 예를 들어 피라졸, 트라이아졸, 또는 이미다졸 스캐폴드(예를 들어, 문헌[Chung et al., Molecules, 15.5: 3010-3037 (2010)] 참조), ALPL 이량체화를 방해하는 소분자, 및 단백질 분해를 유도하는 데그론에 연결된 소분자를 포함한다. ALPL 저해제는 또한 ALPL에 대해 지시된 항체(예를 들어, 임의의 적합한 동물 종에서 생성되는 단클론성 또는 다클론성 항체, 또는 이의 항원-결합 단편)를 포함한다.
일부 실시형태에서, ALPL을 저해하는 2종 이상의 작용제의 조합이 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 소분자 저해제는 혈액 뇌 장벽에 수용체 또는 수송체를 갖는 다른 단백질 리간드(예를 들어, 렙틴 또는 재조합 항체)와 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 다양한 공급원으로부터 상업적으로 입수 가능한 항-ALPL 항체는 또한 혈액 뇌 장벽에 수용체 또는 수송체를 갖는 다른 단백질 리간드와 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 대상체에서 ALPL을 저해하는 것은 ALPL의 발현을 저해하는 것을 포함한다. ALPL 발현의 저해는 mRNA 또는 단백질 수준에서 일어날 수 있으며 합성 감소, 분해 증가, 또는 둘 다로 인해 발생할 수 있다. 특정 실시형태에서, 방법은 ALPL을 인코딩하는 유전자의 발현을 저해하는 것을 포함한다. ALPL 유전자 발현은 당업계에 알려진 임의의 적합한 작용제 및/또는 방법을 사용하여 저해될 수 있다. 예를 들어, ALPL 유전자 발현은, 예를 들어 작은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 앱타머, 또는 리보자임을 포함하는 저해 핵산 분자를 사용하여 저해될 수 있다. 대안적으로, ALPL 유전자 발현은 전사를 손상시키거나 없애는 ALPL 유전자에 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, 핵산의 삽입 또는 결실 또는 점 돌연변이)를 도입함으로써 저해될 수 있다. 일부 실시형태에서, ALPL 유전자의 전부 또는 일부가 결실된다. 결실이 유전자 전사 또는 유전자 기능을 제거하거나 손상시키기에 충분하다면, 임의의 수의 핵산이 ALPL 유전자에서 결실될 수 있다. 바람직하게는, 전체 ALPL 유전자가 적합한 세포(예를 들어, 뇌 내피 세포)에서 제거되거나 결실된다. 유전자를 불활성화시키기 위한 임의의 적합한 "넉-아웃" 기술을 사용하여 ALPL 유전자 발현을 저해할 수 있으며, 이들 중 다양한 것이 당업계에 알려져 있다. 이와 같은 방법은 상동 재조합, 부위-특이적 뉴클레아제(예를 들어, CRISPR/Cas9 시스템, 징크-핑거 뉴클레아제), 및 조건부 넉-아웃 시스템(예를 들어, Cre/lox 기술)을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 유전자 편집 기술은, 예를 들어 문헌[Appasani, K. (ed.), Genome Editing and Engineering: From TALENs, ZFNs and CRISPRs to Molecular Surgery, 1st ed., Cambridge University Press (2018)]에 추가로 기재되어 있다.
혈액-뇌 장벽을 통한 치료제의 전달
본 개시내용은 또한 (a) 뇌에서 알칼리 포스파타제 단백질(ALPL)의 활성을 저해하는 작용제; 및 (b) 치료제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체의 뇌에 치료제를 전달하기 위한 방법을 제공한다. 치료제는 뇌에서 ALPL 활성을 저해하는 작용제와 동시에 대상체에게 투여될 수 있다. 대안적으로, 치료제는 뇌에서 ALPL 활성을 저해하는 작용제의 투여 전 또는 후에 대상체에게 투여될 수 있다. 치료제 및 ALPL 활성을 저해하는 작용제가 별도로 투여되는 경우, 각각의 작용제의 투여는 최대 5분, 10분, 15분, 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간, 또는 24시간 분리될 수 있다.
임의의 적합한 치료제가 대상체에게 투여될 수 있다. 이상적으로, 치료제는 중추신경계(CNS)의 질환 또는 장애의 치료를 위해 필요하다. 일부 실시형태에서, 치료제는 거대분자이다. 거대분자는 생체고분자, 예컨대, 핵산 서열, 단백질 또는 폴리펩타이드, 또는 탄수화물일 수 있다. 거대분자 치료제는 임의의 적합한 크기를 가질 수 있다. 예를 들어, 거대분자 치료제는 크기가 약 150 kDa 내지 약 70,000 kDa(예를 들어, 크기가 약 200 kDa, 약 500 kDa, 약 1,000 kDa, 약 2,000 kDa, 약 5,000 kDa, 약 10,000 kDa, 약 15,000 kDa, 약 20,000 kDA, 약 30,000 kDa, 약 40,000 kDa, 약 50,000 kDa, 또는 약 60,000 kDa, 또는 상기 값 중 임의의 2개에 의해 정의된 범위)일 수 있다.
특정 실시형태에서, 거대분자 치료제는 생활성 단백질 또는 펩타이드일 수 있다. 이와 같은 단백질의 예는 항체, 효소, 스테로이드, 성장 호르몬 및 성장 호르몬-방출 호르몬, 성선자극호르몬-방출 호르몬 및 이의 효현제 및 길항제 유사체, 소마토스타틴 및 이의 유사체, 성선자극호르몬, 펩타이드 T, 타이로칼시토닌, 부갑상선 호르몬, 글루카곤 바소프레신, 옥시토신, 안지오텐신 I 및 II, 브래디키닌, 칼리딘, 부신피질 자극 호르몬, 갑상선 자극 호르몬, 인슐린, 글루카곤, 및 상기 분자 중 임의의 것의 유사체 또는 유도체를 포함한다. 단백질 또는 펩타이드는 자연 발생 펩타이드의 변이체 또는 유도체를 포함하는 합성 또는 자연 발생 펩타이드일 수 있다. 펩타이드 치료제는 선형 펩타이드, 고리형 펩타이드, 억제된 펩타이드(constrained peptide), 또는 펩타이드모방체일 수 있다.
일부 실시형태에서, 단백질 또는 펩타이드 치료제는 신경학적 병태와 연관된 표적 단백질 또는 구조에 특이적으로 결합할 수 있다. 따라서, 본 개시내용에 따르면, 단백질 또는 펩타이드 치료제는 (예를 들어, 진단 또는 치료를 위해) 신경학적 병태와 연관된 표적 단백질 또는 구조의 선택적 표적화에 유용할 수 있다(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2009/0238754호 참조). 신경학적 병태와 연관된 표적 단백질 또는 구조에 특이적으로 결합하는 단백질 또는 펩타이드 치료제는 알츠하이머병(AD), 대뇌 아밀로이드 혈관병증(CAA), 및 뇌 혈관 질환(CVD)의 아밀로이드 플라크에 있는 Aβ-펩타이드; 파킨슨병의 루이소체에 있는 α-시누클레인 침착물, 전두 측두엽 치매 및 피크병의 신경원섬유 매듭에 있는 타우(tau); 근위축성 측삭 경화증에서 슈퍼옥사이드 디스뮤타제; 및 헌팅턴병 및 양성과 암성 뇌 종양, 예컨대, 교모세포종, 뇌하수체 종양, 또는 뇌수막종에서 헌팅턴을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
다른 실시형태에서, 거대분자 치료제는 (상기 기재된 바와 같은) 단클론성 또는 다클론성 항체와 같은 항체일 수 있다. 항체는 아밀로이드 생성 질환과 연관된 표적 단백질 또는 구조(예컨대, 특정 형태 또는 자가-응집 상태)와 같은 신경학적 병태와 연관된 표적 단백질 또는 구조에 특이적으로 결합할 수 있다. 이와 같은 항체는, 예를 들어 항-아밀로이드 항체인 6E10 및 NG8을 포함한다(예를 들어, 문헌[Hunter S., Brayne C., J Negat Results Biomed., 16(1): 1 (2017)] 참조). 다른 항-아밀로이드 항체는 당업계에 알려져 있으며, 다른 신경학적 병태와 연관된 단백질 또는 구조에 특이적으로 결합하는 항체도 있지만, 이들 중 임의의 것이 본 명세서에 개시된 방법에 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 거대분자 치료제는 단클론성 항체이다. 적합한 단클론성 항체는 6E10, PF-04360365, 131I-chTNT-1/B MAb, 131I-L19SIP, 177Lu-J591, ABT-874, AIN457, 알렘투주맙, 항-PDGFR 알파 단클론성 항체 IMC-3G3, 아스타틴 At 211 단클론성 항체 81C6, 바피뉴주맙, 베바시주맙, 세툭시맙, 식수투무맙, 다클리주맙, Hu MiK-베타-1, HuMax-EGFr, 아이오딘 I 131 단클론성 항체 3F8, 아이오딘 I 131 단클론성 항체 81C6, 아이오딘 I 131 단클론성 항체 8H9, 아이오딘 I 131 단클론성 항체 TNT-1/B, LMB-7 면역독소, MAb-425, MGAWN1, Me1-14 F(ab')2, M-T412, 나탈리주맙, 뉴라디압, 니모투주맙, 오파투무맙, 파니투무맙, 라무시루맙, 라니비주맙, SDZ MSL-109, 솔라네주맙, 트라스투주맙, 우스테키누맙, 잘루투무맙, 타네주맙, 애플리버셉트, MEDI-578, REGN475, 무로모납-CD3, 압식시맙, 리툭시맙, 바실릭시맙, 팔리비주맙, 인플릭시맙, 젬투주맙 오조가마이신, 이브리투모맙 튜세탄, 아달리무맙, 오말리주맙, 토시투모맙, 토시투모맙-I131, 에팔리주맙, 압식시맙, 세톨리주맙 페골, 에쿨리주맙, AMG-162, 자놀리무맙, MDX-010, 항-MRSA mAb, 펙셀리주맙, 메폴리주맙, 에프라투주맙, 항-RSV mAb, 아펠리모맙, 카투막소맙, WX-G250, 또는 이들의 조합물을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 뇌 장애의 치료를 위한 치료 항체는, 예를 들어 문헌 [
Figure pct00005
P.O., Urich E., Neuropharmacology, 120: 38-55 (2017); 및 Yu Y.J., and Watts R.J., Neurotherapeutics, 10(3): 459-72 (2013)]에 추가로 기재되어 있다.
다른 실시형태에서, 거대분자 치료제는 신경영양 단백질일 수 있다. 적합한 신경영양 단백질은 신경 성장 인자(NGF), 뇌-유래 신경영양 인자(BDNF), 뉴로트로핀-3(NT-3), 뉴로트로핀-4(NT-4), 뉴로트로핀-5(NT-5), 인슐린-유사 성장 인자(IGF-I 및 IGF-II), 신경아교 세포계-유래 신경영양 인자(GDNF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 섬모 신경영양 인자(CNTF), 표피 성장 인자(EGF), 신경교-유래 넥신(GDN), 형질전환 성장 인자(TGF-α 및 TGF-β), 인터루킨, 혈소판-유래 성장 인자(PDGF) 및 S100β 단백질, 및 이들의 유사체 및 유도체를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
다른 실시형태에서, 거대분자 치료제는 칼슘-결합 단백질 및 다른 시냅스 소포 단백질과 같은 시냅스 소포의 막과 회합된 단백질일 수 있다. 칼슘-결합 단백질은, 예를 들어 세포골격-연관 단백질, 예컨대, 칼데스몬, 아넥신, 칼레렉트린(포유동물), 칼레렉트린(전기메기(torpedo)), 칼팩틴 I, 칼팩틴 복합체, 칼팩틴 II, 엔도넥신 I, 엔도넥신 II, 단백질 II, 시넥신 I, 및 효소 조절제, 예컨대, p65를 포함한다. 다른 시냅스 소포 단백질은 동원 저해제(예컨대, 시냅신 Ia,b 및 시냅신 IIa,b), 시냅토파이신, 및 알려지지 않은 기능의 단백질, 예컨대, p29, VAMP-1,2(시냅토브레빈), VAT1, rab 3A, 및 rab 3B를 포함한다.
거대분자 치료제는 또한 α-, β- 및 γ-인터페론, 에포에틴, 플리그라스팀, 사그라모스틴, CSF-GM, 인간-IL, TNF, 및 기타 생명공학 약물을 포함한다. 거대분자 치료제는 또한 재조합 생명공학 방법을 사용하여 얻은 펩타이드, 단백질, 또는 항체일 수 있다.
다른 실시형태에서, 치료제는 소분자 약물일 수 있다. 임의의 적합한 소분자 약물이 대상체에게 투여될 수 있다. 이상적으로, 소분자 약물은 중추신경계의 질환 또는 장애를 치료할 수 있는 작용제이다. CNS의 질환, 장애, 또는 병태를 치료하는 데 적합한 소분자 약물은 아세트아미노펜, 아세틸살리실산, 아실트랜스퍼라제, 알프라졸람, 아만타딘, 아미설프라이드, 아미트립틸린, 암페타민-덱스트로암페타민, 암사크린, 항정신병제, 항바이러스제, 아포몰핀, 아리모클로몰, 아리피프라졸, 아세나핀, 아스파토아사이클라제 효소, 아토목세틴, 비정형 항정신병제, 아자티오프린, 바클로펜, 베클라미드, 벤세라자이드, 벤세라자이드-레보도파, 벤조디아제핀, 벤즈트로핀, 블레오마이신, 브리바라세탐, 부로모크립틴, 부프레노르핀, 부프로피온, 카베르골린, 카르바마제핀, 카르바트롤, 카르비도파, 카르비도파-레보도파, 카보플라틴, 클로람부실, 클로르프로마진, 클로르프로틱센, 시스플라틴, 시탈로프람, 클로바잠, 클로미프라민, 클로나제팜, 클로자핀, 코데인, COX-2 저해제, 사이클로포스파마이드, 닥티노마이신, 덱스메틸페니데이트, 덱스트로암페타인, 디아몰핀, 디아스타트(diastat), 디아제팜, 디클로페낙, 도네페질, 독소루비신, 드로페리돌, 엔타카폰, 에피루비신, 에스시탈로프람, 에토석시마이드, 에토포사이드, 펠바메이트, 플루옥세틴, 플루펜틱솔, 플루페나진, 포스페니토인, 가바펜틴, 갈란타민, 감마 하이드록시부티레이트, 게피티닙, 할로페리돌, 히단토인, 하이드로코르돈, 하이드록시진, 이부프로펜, 이포스파마이드, IGF-1, 이로페리돈, 이마티닙, 이미프라민, 인터페론, 이리노테칸, KNS-760704, 라코사마이드, 라모트리진, 레베티라세탐, 레보도파, 레보메프로마진, 리스덱삼페타민, 리수라이드, 탄산리튬, 지방용해 효소, 메클로레타민, mGluR2 효현제, 메만틴, 메페리딘, 머캅토퓨린, 메소리다진, 메석시마이드, 메스암페타민, 메틸페니데이트, 미노사이클린, 모다피닐, 몰핀, N-아세틸시스테인, 나프록센, 넬피나비르, 뉴로트린, 니트라제팜, NSAID, 올란자핀, 아편제, 오셀타미비르, 옥사플라틴, 팔리페리돈, 판토테네이트 키나제 2, 파킨(Parkin), 파록세틴, 페르골라이드, 페리시아진, 퍼페나진, 페나세마이드, 페넬진, 페노바르비톨, 펜투라이드, 페닐로인, 피모자이드, 핑크1(Pink1), 피리베딜, 포도필로톡신, 프라미펙솔, 프레가발린, 프리미돈, 프로클로르페라진, 프로마진, 프로메타진, 프로트립틸린, 피리미딘디온, 퀘티아핀, 라사길린, 레마세마이드, 릴루졸, 리스페리돈, 리토나비르, 리바스티그민, 로피니롤, 로티고틴, 루피나마이드, 선택적 세로토닌 재흡수 저해제(SSRI), 셀레긴, 셀레길린, 세르틴돌, 세르트랄린, 발프로산나트륨, 스티리펜톨, 탁산, 테마제팜, 테모졸로마이드, 테노포비르, 테트라베나진, 티아민, 티오리다진, 티오틱센, 티아가빈, 톨카폰, 토피라메이트, 토포테칸, 트라마돌, 트라닐사이프로민, 삼환계 항우울제, 트리플루오페라진, 트리플루프로마진, 트리헥실페니딜, 트리렙탈, 발라시크로비르, 발톡타마이드, 발프로아마이드, 발프로산, 벤라팍신, 수포성 구내염 바이러스, 비가바트린, 빈카 알칼로이드, 자나미비르, 지프라시돈, 조니사마이드, 조테핀, 주클로펜틱솔, 및 상기한 것 중 임의의 것의 유사체 또는 유도체를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
본 발명에 따라 투여될 수 있는 다른 치료제 또는 화합물은 BBB를 횡단하는 것이 바람직한 임의의 부류의 약물 또는 약제일 수 있다. 이와 같은 치료제는 항생제, 항기생충제, 항진균제, 항바이러스제, 및 항종양제를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
CNS 질환, 장애, 또는 병태는 뇌 및/또는 척수(집합적으로 중추신경계(CNS)로 알려짐)에 영향을 미치는 임의의 질환, 장애, 또는 병태이다. 본 발명의 방법에 따라 치료될 수 있는 CNS 질환, 장애, 또는 병태는 중독, 지주막 낭종, 자폐증, 강경증, 뇌염, 락트인 증후군, 뇌수막염, 다발성 경화증(MS), 척수병증, 대사성 질환, 행동 장애, 성격 장애, 치매, 암, 신경퇴행성 장애(예를 들어, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 및 파킨슨병), 뇌졸중, 통증, 바이러스 감염, 수면 장애, 간질/발작 장애, 산성 리파제 질환, 파브리병, 베르니케-코르사코프 증후군, 주의력 결핍/과잉 행동 장애(ADHD), 불안 장애, 경계성 성격 장애, 양극성 장애, 우울증, 섭식 장애, 강박 장애, 조현병, 바르트 증후군, 투렛 증후군, 카나반병, 할러보르덴-스파츠병, 루이소체병, 루게릭병, 마카도-조셉병, 하지 불안 증후군, 외상성 뇌손상(TBI), 및 자가면역 질환을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
치료제 및 ALPL의 활성을 저해하는 작용제는 단일 조성물로서 함께 제형화될 수 있다. 대안적으로, 치료제 및 ALPL의 활성을 저해하는 작용제는 본 명세서에 기재된 바와 같이 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있는 별개의 조성물로서 제형화될 수 있다. 어느 경우든, 조성물은 바람직하게는 담체, 바람직하게는 약제학적으로 허용 가능한(예를 들어, 생리학적으로 허용 가능한) 담체, 및 치료제 및/또는 ALPL 저해제를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한(예를 들어, 생리학적으로 허용 가능한) 조성물이다. 임의의 적합한 담체가 본 개시내용의 맥락 내에서 사용될 수 있으며, 이와 같은 담체는 당업계에 잘 알려져 있다. 담체는 전형적으로 액체이지만, 고체이거나 액체와 고체 구성요소의 조합물일 수도 있다. 담체의 선택은 표적 조직 및/또는 세포의 위치, 및 조성물을 투여하는 데 사용되는 특정 방법에 의해 적어도 부분적으로 결정될 것이다.
조성물은 특히 조성물의 안정성 및/또는 이의 최종 용도를 향상시키기 위해 임의의 다른 적합한 구성요소를 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물의 매우 다양한 적합한 제형이 존재한다. 하기 제형 및 방법은 단지 예시일 뿐이고 제한적이지 않다.
비경구 투여에 적합한 제형은 항산화제, 완충제, 정균제, 및 제형을 의도된 수용체의 혈액과 등장성으로 만드는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 등장성 멸균 주사 용액, 및 현탁화제, 가용화제, 증점제, 안정화제 및 방부제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 제형은 앰플 및 바이알과 같은 단위 용량 또는 다중 용량 밀봉 용기로 제공될 수 있으며, 사용 직전 멸균 액체 부형제, 예를 들어 주사용 물의 추가만을 필요로 하는 냉동 건조(동결 건조) 상태로 보관될 수 있다. 임의의 적합한 담체가 본 개시내용의 맥락 내에서 사용될 수 있고, 이와 같은 담체는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 조성물은, 예를 들어 메틸파라벤, 프로필파라벤, 소듐 벤조에이트, 및 벤잘코늄 클로라이드와 같은 방부제를 포함할 수 있다. 선택적으로 2종 이상의 방부제의 혼합물을 사용할 수 있다. 추가적으로, 완충제가 조성물에 포함될 수 있다. 적합한 완충제는, 예를 들어 글루탐산(글루타메이트), 시트르산, 시트르산나트륨, 인산, 인산칼륨, 및 다양한 기타 산 및 염을 포함한다. 2종 이상의 완충제의 혼합물이 선택적으로 사용될 수 있다.
즉석 주사 용액 및 현탁액은 멸균 분말, 과립, 및 정제로부터 제조될 수 있다. 조성물은 경구 투여용으로 제형화될 수 있다. 적합한 경구 제형은, 예를 들어 정제, 환제, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등을 포함한다. 조성물은 비경구 투여용, 예를 들어 정맥내 주사, 복강내 주사, 근육내 주사, 피하 주사 등으로 제형화될 수 있다. 본 발명의 화합물 또는 작용제는 또한 에어로졸 형태로 기도에 직접 투여될 수 있다. 에어로졸로서 사용하기 위해, 용액 또는 현탁액 중 본 발명의 화합물은 통상적인 보조제 및 적합한 추진제, 예를 들어 프로판, 부탄, 또는 아이소부탄과 같은 탄화수소 추진제와 함께 가압 에어로졸 용기에 포장될 수 있다. 조성물은 또한 네뷸라이저 또는 아토마이저에서와 같은 비-가압 형태로 투여될 수 있다. 약제학적 용도용 조성물을 제조하기 위한 방법은 당업자에게 알려져 있으며, 예를 들어 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005)]에 기재되어 있다.
본 개시내용은 또한 포유동물(예를 들어, 마우스, 래트, 영장류, 또는 인간)에서 혈액-뇌 장벽 투과성을 조절하는 단백질 또는 기타 생체분자를 확인하기 위한 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 방법은 (a) 제1 포유동물로부터 분리한 혈장의 단백질체 또는 기타 발현된 생체분자(RNA)를 검출 가능하게 표지화하는 단계; (b) 표지화된 단백질체 또는 기타 발현된 생체분자를 포함하는 분리된 혈장을 제2 포유동물에 도입하는 단계; (c) 혈액-뇌 장벽을 형성하는 제2 포유동물로부터 뇌 내피 세포를 분리하는 단계; (d) 분류된 뇌 내피 세포 집단을 생성하기 위해 유세포 분석을 사용하여 분리된 뇌 내피 세포 각각에서 혈장 흡수를 측정하는 단계; (e) 분류된 각각의 뇌 내피 세포에서 혈장 흡수와 상관관계가 있는 유전자의 발현을 검출하는 단계; 및 (f) 발현이 뇌 내피 세포에서 증가 또는 감소된 혈장 흡수와 상관관계가 있는 유전자에 의해 인코딩되는 단백질 또는 기타 생체분자를 선택하여, 단백질 또는 기타 생체분자가 대상체에서 혈액-뇌 장벽 투과성을 조절하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이와 같은 확인된 분자는 혈액-뇌 장벽 투과성을 조절하기 위한 연구 또는 임상 목적으로 이용된다. 예를 들어, 이와 같은 분자의 발현 또는 활성은 ALPL에 대해 상기 기재한 바와 같이 조작되어 원하는 결과를 달성한다.
전혈로부터 혈액 수집 및 혈장 분리/단리는 임의의 원하는 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 혈청은 혈액이 응고된 후에 수집되는 전혈의 액체 분획이라는 것이 이해될 것이다. 응고물은 원심분리에 의해 제거되고 생성된 상청액(혈청으로 지정됨)은 피펫을 사용하여 조심스럽게 제거된다. 혈장은 전혈이 항응고제로 처리된 튜브에 수집될 때 생성된다. 혈액은 혈장 튜브에서 응고되지 않는다. 세포는 원심분리에 의해 제거된다. 혈장으로 지정된 상청액은 피펫을 사용하여 세포 펠릿에서 조심스럽게 제거된다. 혈액 수집 및 혈장 분리를 위한 시스템 및 방법은 다양한 공급원에서 상업적으로 입수할 수 있으며, 이 중 임의의 것이 본 명세서에 기재된 방법에 사용될 수 있다.
포유동물로부터 분리된 혈장의 단백질체 또는 기타 생체분자를 검출 가능하게 표지화하기 위한 방법은 당업계에 알려져 있으며 본 명세서에 기재된 방법과 관련하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 상대 및 절대 정량화 시약(iTRAQ) 및 탠덤 질량 태그(TMT) 시약에 대한 동중 태그와 같은 동중 탠덤 질량 태그를 이용한 화학적 표지화는 광범위한 다양한 임상 지향 혈청 및 혈장 단백질체학 연구에서 이용되어 왔다(예를 들어, 문헌[Moulder et al., Mass Spectrometry Reviews, 37(5): 583-606 (2018)] 참조). 또한 예를 들어 문헌[Liu et al., Proteomics, 12(14): 2258-70 (2012); Leclerc et al., Bioconjugate Chem., 29(8): 2541-2549 (2018); Volke, D. and R. Hoffmann, Electrophoresis, 29(22): 4516-4526 (2008); 및 Obermaier et al., Methods Mol Biol., 1295: 153-65 (2015)]에 기재된 것과 같은 형광 표지화 방법이 사용될 수 있으며, 이들 문헌은 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다. 특정 실시형태에서, 혈장 단백질체는 형광 표지화 방법을 사용하여 검출 가능하게 표지화된다.
일단 제1 포유동물로부터 분리한 혈장의 단백질체가 검출 가능하게 표지화되면, 표지화된 단백질체를 포함하는 분리된 혈장은 제2 포유동물에 도입되어 BBB 투과성의 시각화 및 측정을 가능하게 한다. 제2 포유동물 및 제1 포유동물은 바람직하게는 동일한 유형의 포유동물(예를 들어, 둘 다 마우스, 래트, 또는 비-인간 영장류)이다. 표지화된 단백질체를 포함하는 분리된 혈장은 표지화된 단백질체를 포함하는 혈장이 제2 포유동물의 BBB의 내피 세포로 흡수되도록 하는 조건 하에 제2 포유동물에 도입된다. 제2 포유동물의 BBB에 의해 표지화된 단백질체를 포함하는 혈장을 흡수하기에 충분한 시간 후에, 혈액-뇌 장벽을 형성하는 뇌 내피 세포는 당업계에 알려진 임의의 적합한 방법을 사용하여 제2 포유동물로부터 분리될 수 있다. 뇌 내피 세포 분리 프로토콜은, 예를 들어 문헌[Assmann et al., Bio Protoc., 7(10): e2294 (2017); Welser-Alves et al., Methods Mol Biol., 1135: 345-56 (2014); Luo et al., Methods Mol Biol., 1135: 357-64 (2014); 및 Navone et al., Nature Protocols, 8: 1680-1693 (2013)]에 기재되어 있으며, 이들 문헌은 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다.
BBB의 뇌 내피 세포에 의한 혈장 흡수는 BBB를 통한 약물 수송을 측정하기 위해 당업계에서 사용되는 시험관내 또는 생체내 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 생체내 방법은, 예를 들어 정맥내 주사/뇌 샘플링, 뇌 관류, 정량적 자가방사법, 미세투석, 및 CSF 샘플링을 포함한다. 시험관내 방법은, 예를 들어 새로 분리된 뇌 미세혈관 및 내피 세포 배양물의 분석을 포함한다. BBB를 통한 약물 및 단백질 수송을 측정하기 위한 방법은, 예를 들어 문헌[Bickel, U., NeuroRx, 2(1): 15-26 (2005); 및 Feng, M.R., Curr Drug Metab., 3(6): 647-57 (2002)]에 더 상세하게 기재되어 있다. 일부 실시형태에서, 분리된 뇌 내피 세포 각각의 혈장 흡수는 분류된 뇌 내피 세포 집단을 생성하기 위해 유세포 분석을 사용하여 측정될 수 있다. 유세포 분석은 완충된 염-기반 용액에 현탁된 상태에서 단일 또는 다중 레이저를 통과하여 흐를 때 단일 세포 또는 입자를 빠르게 분석하는 기술이다. 각각의 입자는 가시광선 산란 및 하나 또는 다수의 형광 매개변수(예를 들어, 1개에서 최대 30개 또는 그 이상의 매개변수)에 대해 분석된다. 가시광선 산란은 2가지 상이한 방향, 즉 (1) 세포의 상대적인 크기를 나타낼 수 있는 정방향(전방 산란(Forward Scatter) 또는 FSC) 및 (2) 세포의 내부 복잡성 또는 과립을 나타내는 90°(측방 산란(Side Scatter) 또는 SSC)로 측정된다. 광 산란은 형광과 무관하다. 형광 단백질(예를 들어, 녹색 형광 단백질, GFP)의 형질감염 및 발현, 형광 염료(예를 들어, 프로피듐 요오다이드, DNA)로의 염색 또는 형광 접합 항체(예를 들어, CD3 FITC)로의 염색을 통해 형광 측정을 위한 샘플을 준비한다(예를 들어, 문헌[McKinnon, K.M., Curr Protoc Immunol., 120: 5.1.1-5.1.11 (2018)] 참조). 특히 혈액-뇌 장벽의 분석을 위한 유세포 분석 방법이, 예를 들어 문헌[Williams et al., Cytometry A, 87(10): 897-907 (2015)]에 기재되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다.
분리된 뇌 내피 세포에 대해 유세포 분석을 수행하면 유세포 분석으로 분류된(또한 "분류된"으로도 지칭됨) 뇌 내피 세포의 집단이 생성되고, 그 다음 이는 각각의 분류된 뇌 내피 세포에서 혈장 흡수와 상관관계가 있는 유전자의 발현을 검출하기 위해 분석된다. 이와 관련하여, 뇌 내피 세포를 분류하고, 각각의 분류된 세포에 대해 형광을 기록할 수 있다. 그 다음, 각각의 분류된 세포에서 mRNA 발현은 유전자 발현을 측정하기 위해 당업계에 알려진 임의의 적합한 방법을 사용하여 검출 및 정량화될 수 있다. 이와 같은 방법은 정량적 또는 실시간 RT-PCR(qRT-PCR), 마이크로어레이 분석, RNA 서열결정, 현장 혼성화(in situ hybridization), 또는 노던 블롯을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, RNA 서열결정(또한 "RNA-Seq"로도 지칭됨)은 혈장 흡수와 상관관계가 있는 유전자의 발현을 검출하는 데 사용된다. RNA-Seq는 차세대 염기서열결정(next-generation sequencing; NGS)를 사용하여 특정 순간에 생물학적 샘플의 RNA를 검출하고 정량화하여 지속적으로 변화하는 세포 전사체의 분석을 가능하게 한다(Chu, Y. and Corey D.R., Nucleic Acid Therapeutics, 22 (4): 271-274 (2012); 및 Wang et al., Nature Reviews Genetics, 10(1): 57-63 (2009)). RNA-Seq는 대체 유전자 스플라이싱 전사체, 전사 후 변형, 유전자 융합, 돌연변이/단일 염기 다형성(SNP) 및 시간 경과에 따른 유전자 발현 변화를 조사하는 기능을 촉진시킨다(Maher et al., Nature, 458(7234): 97-101 (2009)). mRNA 전사체에 추가적으로, RNA-Seq는 작은 RNA, miRNA, tRNA 및 리보솜과 같은 상이한 RNA 집단을 분석하는 데 사용될 수 있다. RNA-Seq 방법 및 기법은, 예를 들어 문헌[Maekawa et al., Methods Mol Biol., 1164: 51-65 (2014)]에 기재되어 있고, 단일-세포 RNA-Seq에 대한 기법은, 예를 들어 문헌[Chen et al., Front. Genet., 10: 317 (2019)]에 기재되어 있다.
특정 유전자의 발현은 특정 뇌 내피 세포에서 단백질 또는 기타 생체분자의 혈장 흡수 증가 또는 감소와 상관관계가 있을 수 있다. 이와 관련하여, 특정 유전자의 발현의 상향 조절 또는 하향 조절은 단백질의 혈장 흡수 증가(즉, BBB 투과성 증가) 또는 단백질의 혈장 흡수 감소(즉, BBB 투과성 감소)를 직접적으로 또는 간접적으로 야기할 수 있다. 발현이 참조 또는 대조군 수준과 비교하여 적어도 약 20%(예를 들어, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 이상)만큼 감소되면 유전자의 발현은 하향 조절된다. 발현이 참조 또는 대조군 수준과 비교하여 적어도 약 20%(예를 들어, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 이상)만큼 증가되면 유전자의 발현은 상향 조절된다. 상향 조절 또는 하향 조절이 혈장 흡수의 증가 또는 감소와 상관관계가 있는 유전자에 의해 인코딩되는 단백질 또는 기타 생체분자는 혈액-뇌 투과성의 조절인자로서 선택될 수 있다.
다음 실시예는 본 발명을 추가로 예시하지만, 물론 어떤 식으로든 그 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예
실시예에 기재된 실험에서는 다음 재료 및 방법을 사용하였다.
동물
노령의 C57BL/6 마우스(20 내지 24개월령)를 국립 노화 설치류 콜로니 연구소(National Institute on Aging rodent colony)로부터 입수하였다. 어린 수컷 C57BL/6 마우스(3개월령)는 Jackson Laboratories 또는 Charles River Laboratories로부터 입수하였다. 모든 실험은 수컷 마우스를 사용하였다. 모든 마우스를 12시간의 명암 주기로 유지하였고 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있게 제공하였다. 모든 동물 관리 및 절차는 동물 복지법(Animal Welfare Act)을 준수하고 기관 지침에 따랐으며 미국 버지니아주 팔로 알토 동물 연구 위원회(V.A. Palo Alto Committee on Animal Research) 및 스탠포드 대학교의 실험용 동물 보호의 제도적 행정 위원회(institutional administrative panel of laboratory animal care at Stanford University)의 승인을 받았다.
혈장 수집 및 표지화
말기 심장내 출혈에 의해 항응고제로서 250mM EDTA(Millipore Sigma)를 이용하여 혈액을 수집하였다. EDTA-혈장을 4℃에서 15분 동안 1,000g에서 원심분리하여 분리한 후, 이를 풀링하고, 분취한 다음, 액체 질소에서 급속 냉동시키고 -80℃에서 보관한다. 용혈된 혈장은 버렸다. 표지화 전에, 냉동된 혈장을 얼음 위에서 해동시키고, 부드럽게 혼합한 다음, 침전물이 있는지 검사하였다. 혈장 단백질 몰 농도는 대략 750μM이었다. 표지화는 아민-반응성 NHS 에스터 모이어티에 의존하였으며, 표지화 비율과 시간은 각각의 특정 표지에 대해 경험적으로 결정되었다: 방사성 추적의 경우, NHS-DOTA(1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산, Macrocyclics)를 10× 몰비로 첨가하고; 형광의 경우, NHS-Atto 647N(Millipore Sigma, ATTO-TEC)을 1.4× 몰비로 첨가하였으며; 표지화된 혈장 단백질체를 특성화하기 위해, NHS-비오틴(Thermo Fisher) 및 NHS-트랜스-사이클로옥텐(Click Chemistry Tools)을 17.5× 몰비로 첨가하였다. NHS-Atto 647N을 PBS 투석 전에 실온에서 1.5시간 동안 혈장과 함께 밤새 인큐베이션하였다. 다음날, 50mM Tris pH 8.0을 실온에서 10분 동안 첨가하고, 표지화된 혈장을 Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit, 3 KDa 컷오프(Millipore Sigma, NHS-Atto 647N의 경우 10 KDa)로 광범위하게 3회 세척한 다음, 이어서 냉각된 PBS에서 Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO 컷오프(Thermo Fisher)로 4회 세척하였다. 다른 접합은 세척 전에 4℃에서 밤새 진행하였다. 이러한 단계는 잔류 자유 표지로 인한 오염을 최소화하기 위해 64Cu-표지화 DOTA(하기)의 99% 초과의 방사화학적 순도를 일관되게 산출하는 세척으로 확장되었다. 표지화 및 세척 단계 전반에 걸쳐, 혈장 샘플을 응집 및 엉김(flocculation)의 징후에 대해 모니터링하였다. Nanodrop 분광 광도계(Thermo Fisher)를 사용하여 혈장 농도를 측정하였으며, 대략 10 내지 15㎎(호스래디쉬 퍼옥시다제를 사용한 이전 연구 5, 6, 126에 따라, 0.5 ㎎/체중 g)을 150㎕ 이하의 부피로 마우스마다 정맥내(안구 뒤) 투여하였다.
질량 분석법 및 단백질 마이크로어레이에 의한 표지화된 혈장 특성화
질량 분석법에 의한 특성화를 위해, 앞서 기재(127)된 바와 같이, 표지화된 혈장에서 ProteoPrep Immunoaffinity Albumin & IgG Depletion Kit(Millipore Sigma)를 사용하여 알부민 및 IgG를 고갈시켰고, 4℃에서 밤새 테트라진 아가로스를 강화시킨 다음(Click Chemistry Tools), 광범위하게 세척하였다. 동시에, 앞서 기재(128)된 바와 같이, 표지화되지 않은 혈장을 단일-포트 고체상-강화 샘플 준비(Single-Pot Solid-Phase-enhanced Sample Preparation; SP3)라고 하는 상자성 비드를 사용하여 처리하였다. Pierce High pH Reversed-Phase Peptide Fractionation Kit(Thermo Fisher)를 사용하여 혈장을 분획화하고 C18-기반 STAGE 팁을 사용하여 연쇄 분획을 세정하고 동결건조시켰다. LTQ Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer(Thermo Fisher Scientific)에서 펩타이드를 분석하였다. 24㎝ 역상 칼럼(100㎛ 내경, ReproSil-Pur C18-AQ 3.0 m 수지(Dr. Maisch)로 내부 패킹됨) 상에서 모세혈관 역상 크로마토그래피에 의해 180분 동안 펩타이드를 분리하였다. Dionex Ultimate 3000 LC-시스템(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 4단계 선형 구배를 15분 동안 97% A + 3% B, 135분 동안 75% A + 25% B, 15분 동안 55% A + 45% B, 및 15분 동안 5% A + 95% B와 같이 달성하였으며, 여기서 완충액 A는 물 중 0.1% 폼산이고 완충액 B는 아세토나이트릴 중 0.1% 폼산이다. 데이터-종속 모드에서 120,000(FWHM)의 분해능 및 m/z 스캔 범위 340 내지 1540에서 Orbitrap 질량 분석기로 전체 MS 스캔을 획득하였다. AGC 표적은 4*105이고 FTMS1의 최대 주입 시간은 50㎳였다. 그 다음 가장 강렬한 이온을 서열결정을 위해 선택하고 정규화된 충돌 에너지가 30%이고 분해능이 15,000(FWHM)인 고에너지 충돌 해리(HCD)를 사용하여 Orbitrap 질량 분석기에서 분해하였다. 단일 동위원소 전구체 선택이 활성화되었으며 단일 하전된 이온 종 및 할당되지 않은 전하 상태가 없는 이온을 MS2 분석에서 제외하였다. 동적 제외는 반복 횟수 2로 활성화되었으며 MS2에 대해 선택된 이온 주변의 ±10 ppm m/z 창 내의 이온을 30초 동안 단편화를 위한 추가 선택에서 제외하였다. AGC 표적은 5*104이고 최대 주입 시간 200㎳였다. 원시 데이터 파일을 MaxQuant and Perseus(Max Planck)(129,130)을 사용하여 처리 및 분석하였다. 간단히 말해서, 스펙트럼을 uniprot.org에서 다운로드한 무스 무스쿨루스(Mus musculus) 데이터베이스와, 오염 물질 및 유인 데이터베이스와 일치시켰다. Cys 잔기(카복시아미도메틸화 +57.021 Da)의 고정 변형 및 Met 잔기(Ox +15.995 Da), Lys 잔기(아세틸화 +42.011 Da), Asn 및 Gln 잔기(탈아미드화 +0.984 Da) 및 N 말단(카바밀화 +43.006 Da)의 가변 변형과 함께 전구체 질량 내성을 4.5 p.p.m.으로 설정하고, 단편 이온 내성을 10 p.p.m.으로 설정하였다. 펩타이드 확인은 FDR < 0.01로 계산되었으며, 단백질 정량화를 위해 고유한 펩타이드와 레이저(razor) 펩타이드 둘 다가 정량화에 사용된 상태에서 최소 비율 수를 1로 설정하였다.
단백질 마이크로어레이에 의한 특성화를 위해, 앞서 기재(13)된 바와 같이, 수백 개의 분비되고 잠재적으로 절단된 막관통 마우스 또는 인간 신호전달 단백질에 대한 ELISA-등급 항체를 상업적 공급원으로부터 입수하고, 로봇 마이크로어레이(NanoPrint LM210, Arrayit)를 이용하여 SuperEpoxy2 유리 슬라이드(Arrayit) 상에 5회 복제하여 인쇄하였다. 그 다음 3%(w/v) 카제인 용액을 어레이를 차단한 후, 4℃에서 밤새 비오틴화된 혈장 샘플과 함께 인큐베이션하였다. 세척한 다음, 어레이를 Alexa Fluor 647-접합 스트렙타비딘 2차 항체(Thermo Fisher)와 함께 인큐베이션하고 GenePix4400A 스캐너 및 GenePix Pro7 소프트웨어(Molecular Devices)를 사용하여 형광 신호를 검출하였다. 데이터 처리 및 분석은 앞서 기재된 방법(13)을 따랐다.
뇌 관류
마우스를 2.5%(v/v) Avertin으로 안락사시키고 적어도 50 ㎖의 냉각된 PBS로 경심관류시켰다. 마우스 순환계의 생리적 압력을 근사하기 위해 10 ㎖/분을 초과하지 않는 유속으로 연동 펌프를 사용하여 관류를 수행하였다(131 내지 133). 콧구멍에서 새는 관류액이 있는 마우스는 분석을 위해 더 이상 처리하지 않았다. 면역조직화학(하기)의 경우, 유세포 분석을 위해 반뇌를 채취한 경우를 제외하고 마우스에 4% 파라폼알데하이드를 연속적으로 관류하였다(하기).
면역조직화학
뇌 조직 처리, 면역조직화학, 및 면역형광 실험을 앞서 기재(12, 13)된 바와 같이 수행하였다. 반뇌를 분리하고 4℃에서 밤새 4%(w/v) 파라폼알데하이드에서 후고정한 다음, PBS 중 30%(w/v) 수크로스에 보존하였다. 반뇌를 동결 슬라이딩 마이크로톰에서 50㎛ 두께로 관상 또는 시상으로 절편화하고 절편을 -20℃의 동결방지 매질에 보관하였다. 공초점 현미경 검사를 위해 다음 농도의 1차 항체와 함께 4℃에서 인큐베이션하기 전에 자유-부동 절편을 적절한 혈청으로 차단하였다: 염소 단클론성 항-CD31(1:100, AF3628, R&D), 플루오레세인-표지화 렉틴(1:200, Vector Laboratories), 토끼 단클론성 항-아쿠아포린 4(1:500, AB2218, Millipore Sigma), 래트 항-CD13(1:100, MCA2183EL, Bio-Rad), 염소 항-Alpl/ALPL(1:100, AF2909, R&D), 마우스 항-NeuN(1:400, MAB377, Millipore), 염소 항-알부민(1:100, NB600, Novus), 토끼 항-콜라겐 I(1:100, ab21286, Abcam), 및 염소 항-Iba1(1:500, ab5076, Abcam). 절편을 세척하고 Alexa Fluor-접합 2차 항체(1:250)로 염색한 다음, ProLong Gold(Life Technologies)로 장착하고 커버슬립을 덮은 후 공초점 레이저-스캐닝 현미경(Zeiss LSM880)으로 영상화하였다. 연령-관련 자가형광을 앞서 기재(73)된 바와 같이, 50mM 암모늄 아세테이트 완충액(pH 5)에서 1mM CuSO4로 퀀칭하였다. National Institutes of Health ImageJ 소프트웨어를 사용하여 앞서 기재(63)된 바와 같이 CD13, AQP4, 또는 ALPL에 포함된 혈관구조(CD31 또는 AQP4)의 백분율을 정량화하였다. 모든 분석은 맹검 관찰자가 수행하였다. 앞서 기재(83)된 바와 같이 알리자린 레드 염색을 수행하였으며, 이 때 다음과 같은 약간의 조정이 있었다: 절편을 실온에서 PBS(pH 7.4) 중 40mM 알리자린 레드에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 장착하기 전에 PBS로 밤새 광범위하게 세척하였다. 석회화된 결절을 검출하기 위해 종래의 광학 현미경으로 뇌 절편의 이미지를 획득하였다. 비오틴화된 혈장이 있는 절편을 실온에서 6% BSA에서 밤새 차단하고, 스트렙타비딘-Alexa Fluor 647(1:1500, Thermo Fisher)로 2시간 동안 검출한 다음, 밤새 세척한 후 장착하였다. L-아지도호모알라닌-표지화된 혈장을 포함하는 절편을 실온에서 6% BSA에서 밤새 차단하고, 100% 메탄올 중 45mM 요오도아세트아마이드(Millipore Sigma)에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 세척하고, 100% 메탄올 중 1.2μM sDIBO(Thermo Fisher Scientific)로 검출한 다음, 밤새 세척한 후 장착하였다. 전체 뇌 관상 및 시상 절편을 100㎛에서 처리하고, Focusclear(CellExplorer Labs)에서 인큐베이션한 다음, 타일로 영상화하였다. Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit(SK-5100, Vector Laboratories)를 사용하여 혈관 ALPL 활성을 20분간 인큐베이션하여 측정하였다.
감마 계수, 자기방사법, 및 PET 스캐닝
1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산(DOTA)을 이용한 래트 IgG2a(400501, BioLegend) 및 알부민/IgG 혈장의 접합을 앞서 기재(13, 134, 135)된 바와 같이 무금속 완충액을 사용하여 수행하였다. 접합은 HEPES 완충액(0.1㏖ l-1, pH 8)에서 10× 몰비의 DOTA-NHS 에스터로 4℃에서 밤새 진행되었고 50mM Tris-HCl(Millipore Sigma)로 퀀칭하였다. 과잉 DOTA-NHS를 Zeba Spin Desalting Columns(0.5 ㎖, 7K 분자량 컷오프, Thermo Fisher)로 제거하고, 생성된 용액은 Cu-64 표지화를 위해 암모늄 아세테이트 완충액(0.1M, pH 5.5)으로 완충액을 교환하였다. DOTA-접합체 용액을 한외여과(Amicon 0.5㎖, Millipore Sigma)로 농축하고 얼음 위에 보관하였다. 앞서 기재(13)된 바와 같이 64Cu(반감기 = 12.7시간)로 방사성표지화를 수행하였다. 간단히 말해서, DOTA-IgG2a 또는 DOTA-혈장(50㎕ 중 25㎍ 분취량)을 400 r.p.m.에서 부드럽게 진탕시키면서 37℃에서 pH-균형 [64Cu]Cl2 용액(pH 4.5 내지 5.5, 위스콘신 대학교, 미국 매디슨 소재)과 혼합하였다. 인큐베이션(IgG2a-DOTA의 경우 30분, 혈장-DOTA의 경우 60분) 후, 0.1M EDTA(0.5M, pH 8.0)를 최종 농도 0.01M로 첨가하고 주위 온도에서 15분 동안 인큐베이션하여 킬레이트화되지 않은 [64Cu]Cl2를 소기하였다. G25 Sephadex 크기-배제 정제(GE Life Sciences)로 정제를 달성하였다. 식염수에서 개발된 TEC-Control Chromatography 스트립(Biodex Medical Systems)을 이용한 즉각적인 박층 크로마토그래피 및 SEC 3000 칼럼(Phenomenex)을 이용한 크기 배제 액체 크로마토그래피에 의해 방사화학적 순도를 결정하였다.
7.7±1.5 MBq의 64Cu-표지화된 DOTA-IgG2a 또는 64Cu-표지화된 DOTA-혈장(방사화학적 순도 > 99%)를 마우스에 정맥내 주사하였다. 20시간 후, 마우스를 이중 마이크로PET/CT 스캐너(Inveon, Siemens)에 배치하여 앞서 기재(136, 137)된 바와 같이, VivoQuant 소프트웨어(버전 4.0, inviCRO)를 이용한 후속 분석을 위해 정적 이미지(10분)를 캡처하였다. 마취 후, 경심 관류 직전에 심장 천자로 혈액 샘플(100 내지 200㎕)을 수집하였다. 혈액과 뇌의 조직-관련 방사능(주입 시간에 대해 선량 및 붕괴 보정)을 자동화된 감마 계수기(Hidex Oy, 표준으로 초기 투여 선량의 분취량을 사용하여 보정됨)를 사용하여 문헌(13) 절차에 따라 평가하였다. 희생 시 심장 혈액 샘플의 활성을 사용하여 차등적인 생체 내 안정성과 혈장 대 IgG의 소거율에 대해 보정하였다. 뇌 조직을 최적-절단 온도 화합물(Tissue-Tek)에 포매시키고 생체외 자기방사법을 위해 관상 절편(40㎛)을 수득하였다. 자기방사법은 앞서 기재된 방법(13,138)을 사용하여 수행되었는데: 40㎛의 절편을 장착하고 10분 동안 공기 건조시킨 다음, 20℃에서 72시간 동안 디지털 저장 형광체 스크린(Amersham Biosciences)에 노출시켰다. 이미지 플레이트를 Typhoon 9410 Variable Mode Imager(Perkin Elmer)를 사용하여 분석하였다. 그 다음 슬라이드를 Nissl 염색하고 Nanozoomer 2.0-RS(Hamamatsu)를 사용하여 스캔하여 해부학적 공동-국소화를 가능하게 하였다. ImageJ를 이용하여 이미지를 시각화, 처리, 및 정량화하였다. 정량화를 위해, 각각의 마우스에 대해 적어도 10개의 일관된 크기의 해마 및 피질 영역을 추출하였다. 평균 픽셀 강도는 각각의 마우스에 대해 보정된 선량 및 붕괴이었다.
유세포 분석을 위한 1차 CNS 세포 분리
CNS 세포 분리는 앞서 기재된 방법(42, 139, 140)을 채택하였다. 간단히 말해서, Neural Dissociation Kit(Miltenyi)를 사용하여 피질과 해마를 미세 해부하고, 다지고, 소화시켰다. 현탁액을 100㎛ 스트레이너를 통해 여과하고 0.9M 수크로스에서 원심분리하여 미엘린을 제거하였다. 남아있는 미엘린이 고갈된 세포 현탁액을 얼음 위에서 Fc 프리블록(preblock)(CD16/CD32, BD 553141)으로 10분 동안 차단하고, 뇌 내피 세포(CD31+/CD45-), 성상세포(ACSA-2+), 및 뉴런(NeuN+ 또는 CD90.2/Thy1.2+)을 구별하기 위해 항체로 30분 동안 염색하였다. 혈장 흡수 분석을 위해, 각각의 관심이 있는 집단의 적어도 1,000개 세포를 샘플당 분석하였다. 항체 희석액: 래트 항-CD31-PE/CF594(1:100, 클론 MEC 13.3, BD, 카탈로그 번호 563616), 래트 항-CD45-PE/Cy7(1:200, 클론 30-F11, Biolegend, 카탈로그 번호 103114), 래트 항 ACSA-2-PE(1:200, 클론 IH3-18A3, Miltenyi, 카탈로그 번호 130-102-365), 마우스 항-NeuN-PE(1:100, 클론 A60, Millipore Sigma, 카탈로그 번호 FCMAB317PE), 및 래트 항-CD90.2-FITC(1:100, 클론 30-H12, Biolegend, 카탈로그 번호 105305).
흐름 지수 분류 및 단일-세포 RNA 서열결정
앞서 기재(139 내지 141)된 바와 같이 Smart-seq-2 프로토콜을 사용하여 384-웰 형식에서 일부 수정하여 세포 용해, 첫 번째 가닥 합성 및 cDNA 합성을 수행하였다. 간단히 말해서, 뇌 내피 세포(CD31+/CD45-)를 최고 순도 설정('단일 세포')으로 SH800S(Sony) 분류기를 사용하여 분류하였다. Plasma-647 형광을 각각의 세포 및 해당하는 분류된 웰에 대해 기록하였다. Smart-seq2 프로토콜(140 내지 142)를 사용하여 cDNA 합성을 수행하였다. cDNA 증폭(23 주기) 후, PicoGreen 정량화 분석을 통해 농도를 결정하였다. TPPLabtech Mosquito HTS 및 Mantis(Formulatrix) 로봇 플랫폼을 사용하여 약 0.2 ng/㎕로 정규화된 맞춤형 스크립트 및 cDNA 농도를 통해 품질 관리를 통과하는 세포를 선택하였다. 제조업체의 지침에 따라 Nextera XT 키트(Illumina)를 사용하여 라이브러리를 준비하고 풀링하였다. 그 다음 200 사이클 키트(Illumina, 20012861)로 2×75 bp 쌍 말단(paired-end) 판독물 및 2×8bp 인덱스 판독물을 사용하여 Nextseq 또는 Novaseq(Illumina)에서 라이브러리를 서열결정하였다. 세포당 평균 1.5M 판독물로 샘플을 서열결정하였다. 원시 서열결정 파일을 bcl2fastq로 역다중화하고, STAR를 사용하여 판독물을 정렬한 다음, HTSEQ 버전 0.6.1p1을 사용하여 유전자 카운트를 수행하였다. 하류 분석은 앞서 기재(58)된 바와 같이 수행하였으며, 각각의 세포의 혈장 형광은 유전자 발현 및 구역화(zonation)와 상관관계(Spearman)가 있었다(59).
ALPL 저해제 처리
마우스를 3일에 걸쳐 6회 용량의 ALPL 저해제(613810, Millipore Sigma; 2,5-다이메톡시-N-(퀴놀린-3-일)벤젠설폰아마이드, 조직-비특이적 알칼리 포스파타제 저해제, MLS-0038949; C17H16N2O4S; CAS # 496014-13-2) 또는 '비히클' 대조군으로, 1일 2회 복강내 주사(8.75 ㎎/㎏)하여 처리하였다. '비히클' 처리는 일치하는 농도의 DMSO(4% v/v 미만)와 함께 인산염-완충 식염수(PBS)로 이루어졌다. 6차 처리 후, 마우스에 150㎕의 Atto 647N-표지화된 혈장(상기와 같음), 인간 홀로 트랜스페린(T4132, Millipore Sigma, 40 ㎎/㎏), 트랜스페린 수용체 항체(BE0175, BioXcell, 20 ㎎/㎏), 또는 3-kDa 덱스트란-FITC(10 ㎎/㎏, Thermo Fisher)를 정맥내 주사하였다. 혈장, 인간 홀로-트랜스페린, 및 트랜스페린 수용체 항체를 희생 20시간 전에 주입하였고, 3-kDa 덱스트란-FITC는 앞서 기재(143)된 바와 같이 희생 2시간 전에 주입하였다. 광범위한 관류 후, CNS 세포를 상기 기재된 바와 같이 분리하였다. 높은 CNS 세포 순도를 보장하기 위해 세포 펠릿을 Red Blood Cell Lysis Buffer(Millipore Sigma, R7757)에서 2분 동안 추가로 인큐베이션하였다. 뇌 내피 세포는 CD31+/CD45- 염색으로, 실질세포는 CD31-/CD45-염색으로 구분하였다.
웨스턴 블롯
TFRC 및 CAV1의 뇌 미세혈관 웨스턴 블롯팅을 위해, 피질 및 해마 미세혈관을 앞서 기재(51, 55, 144)된 바와 같이 분리하였다. 완전한 프로테아제 저해제 칵테일(Thermo Fisher Scientific)과 함께 50mM HEPES 중 1% SDS의 얼음 위에서 세포 펠릿을 인큐베이션하고 10분 동안 13,000 ×g에서 회전시킴으로써 단백질 용해물을 제조하였다. 상청액을 수집하고, Pierce BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific)로 단백질 농도를 측정하였다. 각각의 샘플의 단백질 10 내지 20㎍을 포함하는 분취량을 4× 로딩 완충액(Thermo Fisher Scientific)과 혼합하고 95℃에서 5분 동안 끓인 후 SDS-PAGE를 수행하고 나이트로셀룰로스 막(Bio-Rad)으로 옮겼다. 막을 먼저 5% 우유로 차단하고 지정된 농도의 1차 항체로 4℃에서 밤새 염색하였다: 토끼 항-카베올린-1(1:1000, D46G3, CST), 토끼 항-트랜스페린 수용체(1:1000, ab214039, Abcam), 및 토끼 항히스톤 H3(1:4000, ab1791, Abcam). 막을 세척하고 IRDye 접합 2차 항체(1:15,000, LI-COR)로 염색한 다음, Odyssey CLx(LI-COR)에서 이미지화하였다. ImageStudio 소프트웨어(LI-COR)를 이용하여 밴드 강도에 대해 이미지를 분석하였다.
뇌 내피 세포 지질체학, 질량 분석법
뇌 미세혈관을 밤새 금식(약 12시간)한 후 앞서 기재(51, 55, 144 내지 148)된 바와 같이 어린 마우스(3개월령) 및 노령 마우스(20개월령)로부터 분리하였다. 각각의 연령의 16마리의 마우스를 사용하였으며, 각각의 그룹(n = 4개 그룹)에 풀링된 4마리의 마우스 유래의 미세혈관이 이용되었다. 앞서 기재(149)된 바와 같이 차가운 메틸 tert-뷰틸 에터(MTBE), 메탄올 및 물로 2상 분리를 통해 지질을 무작위 순서로 추출하였다. 간단히 말해서, 260㎕의 메탄올과 40㎕의 물을 뇌 미세혈관에 첨가하고 20초 동안 와류시켰다. 각각의 샘플(EquiSPLASH LIPIDOMIX, Avanti Polar Lipids(카탈로그 번호: 330731), 및 d17-올레산, Cayman chemicals(카탈로그 번호: 9000432))에 지질 내부 표준 혼합물을 첨가하여 추출 효율에 대해 제어한 다음, LC-MS 성능을 평가하고, LC-MS 데이터를 정규화하였다. 샘플을 1,000㎕의 MTBE로 희석하고, 10초 동안 볼텍싱한 다음, 수조에서 30초 동안 3회 초음파 처리하고, 4℃에서 30분 동안 교반하면서 인큐베이션하였다. 250㎕의 물을 첨가한 후, 샘플을 1분 동안 볼텍싱하고 20℃에서 5분 동안 14,000g에서 원심분리하였다. 지질을 포함하는 상부 상을 수집하고 질소 하에 건조시켰다. 건조 추출물을 150㎕의 9:1 메탄올:톨루엔으로 재구성하였다.
지질 추출물을 앞서 기재(150)된 바와 같이 Q Exactive 질량 분석기(Thermo Fisher Scientific)와 커플링된 Ultimate 3000 RSLC 시스템을 사용하여 무작위 순서로 분석하였다. 각각의 샘플을 양 및 음 이온화 모드에서 2회 실행하였다. Accucore C18 칼럼 2.1×150㎜, 2.6㎛(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 지질을 분리하였으며, 이동상 용매는 60/40 아세토나이트릴/물 중 10mM 암모늄 아세테이트 및 0.1% 폼산(A) 및 90/10 아이소프로판올/아세토나이트릴 중 10mM 암모늄 아세테이트 및 0.1% 폼산(B)으로 이루어졌다. 사용된 구배 프로파일은 3분 동안 30% B, 2분에서 30 내지 43% B, 0.1분에서 43 내지 55% B, 10분에서 55 내지 65% B, 6분에서 65 내지 85% B, 2분에서 85 내지 100% B, 그리고 5분 동안 100%였다. 칼럼에서 지질을 0.4 ㎖/분의 속도로 용리하고 오븐 온도를 45℃로 설정하였으며, 주입 부피는 5㎕였다. 오토샘플러 온도를 20℃로 설정하여 지질 응집을 방지하였다. Q Exactive에는 HESI-II 프로브가 장착되어 있으며 모든 샘플에 대해 데이터 종속 수집 모드에서 작동하였다. 확인된 지질의 수를 최대화하기 위해, 블랭크에서 발견된 100개의 가장 풍부한 피크는 MS/MS 사건에서 제외하였다. Pierce LTQ Velos ESI Positive Ion Calibration Solution 또는 Pierce ESI Negative Ion Calibration Solution을 사용하여 외부 교정을 수행하였다.
LipidSearch 소프트웨어 버전 4.2.21(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 LC-MS 피크 추출, 정렬, 정량화 및 주석을 수행하였다. 전구체 이온 질량을 데이터베이스에 일치시키고 실험 MS/MS 스펙트럼을 이론적인 단편화 스펙트럼을 포함하는 스펙트럼 라이브러리에 일치시킴으로써 지질을 확인하였다. 각각의 지질 종에 대한 가장 풍부한 이온을 정량화에 사용하였으며, 즉, LPC, LPE, PC, SM 및 Cer의 경우 [M+H]+, PI, PS, PA 및 PG의 경우 [M-H]-, 및 CE, DAG 및 TAG의 경우 [M+NH4]+를 사용하였다. 오인의 위험을 감소시키기 위해, 관심이 있는 지질의 MS/MS 스펙트럼을 다음과 같이 검증하였다: 1) 양성 및 음성 모드 MS/MS 스펙트럼 둘 다 예상 단편과 일치함, 2) 양성 및 음성 모드에서 검출된 주요 지질 부가물 형태는 확인된 지질 부류와 일치함, 3) 머무름 시간이 확인된 지질 부류와 호환됨, 및 4) 피크 형상이 허용 가능함. 지질 내부 표준을 사용하여 각각의 지질 부류의 단편화 패턴을 실험적으로 검증하였다. (i) 추출 효율을 제어하기 위한 부류-특이적 내부 표준 및 (ii) 출발 물질의 차등적인 양을 보정하기 위해 주석이 달린 모든 지질의 중앙값을 사용하여 데이터를 정규화하였다.
뇌 내피 세포 단백질체학, 질량 분석법
SP3-준비 및 STAGE 팁 세척 뇌 미세혈관 펩타이드를 0.1% 폼산에 재현탁하고 온라인 모세혈관 나노LC-MS/MS로 분석하였다. 레이저로 끌어당기는 나노전자분무 이미터 팁이 장착된 자체 제작 20㎝ 역상 칼럼(내경 100㎛, ReproSil-Pur C18-AQ 3.0㎛ 수지(Dr. Maisch GmbH)로 포장됨)에서 샘플을 분리하였다. Dionex Ultimate 3000 LC-시스템(Thermo Fisher Scientific)에서 1분에 2 내지 4% 완충액 B, 120분에 4 내지 25% 완충액 B 및 30분에 25 내지 40% B, 2분에 40 내지 98% 완충액 B를 포함하는 4 단계 선형 구배를 사용하여 400 nL/분의 유속으로 펩타이드를 용출하였다(완충액 A: 물 중 0.2% 폼산 및 5% DMSO; 완충액 B: 아세토나이트릴 중 0.2% 폼산 및 5% DMSO). 그 다음 LTQ Orbitrap Elite 질량 분석기(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 펩타이드를 분석하였다. 60000의 분해능 및 340 내지 1600의 m/z 스캔 범위로 Orbitrap 질량 분석기에서 획득된 전체 MS 스캔을 이용하여 데이터 종속 모드에서 데이터 수집을 실행하였다. 강도 임계값이 500 카운트 초과이고 전하 상태가 2 이상인 상위 20개의 가장 풍부한 이온을 2m/z의 분리 창, 35%의 정규화된 충돌 에너지, 0.25의 활성화 Q 및 5㎳의 활성화 시간을 갖는 충돌-유도 해리(CID)를 사용하여 단편화를 위해 선택하였다. CID 단편을 빠른 스캔 속도로 이온 트랩에서 분석하였다. 1의 반복 횟수와 30초의 제외 기간으로 동적 제외를 활성화하였다. AGC 표적을 전체 FTMS 스캔 및 ITMSn 스캔에 대해 각각 1000000 및 5000으로 설정하였다. 최대 주입 시간을 전체 FTMS 스캔 및 ITMSn 스캔에 대해 각각 250㎳ 및 100㎳로 설정하였다. 상기와 같이 원시 파일을 분석하였지만, 전구체 질량 허용오차는 20 p.p.m.으로 설정되었고, 단편 이온 허용오차는 0.6 Da로 설정되었으며, 단백질 정량을 위해 최소 비율 카운트는 2로 설정되었고, 정량에는 고유한 펩타이드가 사용되었다.
혈액-뇌 장벽 투과성 및 관류 평가
150㎕의 식염수 또는 혈장(상기와 같이 준비됨)의 정맥내 주사 후, 앞서 기재(90, 139, 143)된 바와 같이 추적자를 20시간 후에 주사하였다. 간단히 말해서, 마우스에 식염수에 용해된 고정 가능한 3 kDa 덱스트란-FITC(10 ㎍/g, Thermo Fisher), 70 kDa 덱스트란-TMR(100 ㎍/g, ThermoFisher), 또는 2 mDa 덱스트란-FITC(100 ㎍/g, Thermo Fisher)를 주사하였다. 2시간(3 kDa 덱스트란-TMR의 경우) 또는 4시간(70 kDa 덱스트란-TMR의 경우) 후 마우스를 마취하고 관류한 다음, 피질과 해마를 미세해부하였다. 냉동 조직을 해동하고 맞춤형 용해 완충액(200mM Tris, 4% CHAPS, 1M NaCl, 8M 우레아, pH 8.0) 300㎕에 현탁시켰다. 그 다음 조직을 3초 동안 20% 진폭으로 설정된 Branson Digital Sonifier 초음파 처리기를 사용하여 균질화하고 얼음 위에서 30초 동안 두었으며, 이를 3회 반복하였다. 샘플을 4℃에서 20분 동안 14,000g에서 원심분리하고, 분석을 위해 상청액을 추출하였다. FITC 및 텍사스 레드에 대한 형광은 Varioskan Flash 마이크로플레이트 판독기(Thermo Fisher Scientific)로 측정하였다. 형광 신호를 Pierce BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 샘플당 단백질의 양으로 표준화하였다. 별도의 마우스의 뇌를 상기 기재한 바와 같이 면역조직화학을 위해 처리하고 내인성 마우스 IgG를 이미지화하고 정량화하였다. 양성 대조군으로서, 앞서 기재(151)된 바와 같이 Benchmark Stereotaxic Impactor(MyNeurolab)를 사용하여 마우스에서 피질 경증 외상성 뇌 손상(mTBI, 또한 뇌진탕이라고도 지칭됨) 상해를 유도하였다.
실시예 1
이 실시예는 혈장 단백질이 건강한 성체 마우스 뇌에 침투한다는 것을 입증하는 실험을 기재한다.
BBB는 전임상 연구에 사용되는 추적자에서 치료용 면역글로불린(IgG)에 이르기까지, 외인성 거대분자의 거의 100%를 배제한다(Pardridge, W. M. NeuroRx (2005). doi:10.1602/neurorx.2.1.3; Abbott et al., Neurobiol. Dis. (2010). doi:10.1016/j.nbd.2009.07.030; Banks, W. A. BMC Neurology (2009). doi:10.1186/1471-2377-9-S1-S3; St-Amour et al., J. Cereb. Blood Flow Metab. (2013). doi:10.1038/jcbfm.2013.160). 그러나 BBB가 구성적으로 노출되는 수천 개의 내인성 혈액 단백질을 배제하는 정도는 크게 알려져 있지 않다(Anderson, N. L. & Anderson, N. G., Mol. Cell. Proteomics (2002). doi:10.1074/mcp.R200007-MCP200; 및 Hood et al., J. Proteome Res. (2005). doi:10.1021/pr050107r). 이를 해결하기 위해, 마우스 혈장 단백질체를 어린 마우스 또는 노령 마우스 수용체로 전달 시 연구 패널을 활성화할 수 있는 다양한 작은 태그로 화학선택적으로 표지화하였다(Bragg, P. D. & Hou, C., Arch. Biochem. Biophys. (1975). doi:10.1016/0003-9861(75)90467-1;
Figure pct00006
, I. et al., J. Immunol. Methods (1996). doi:10.1016/S0022-1759(96)00173-1; 및 Anderson et al., J. Am. Chem. Soc. (1964). doi:10.1021/ja01063a037))(도 1a; 도 2d 내지 도 2e). 아민-반응성 N-하이드록시석신이미드 에스터 화학에 대한 조건을 최적화한 후, 항체 어레이 및 질량 분석-기반 단백질체를 사용하여 존재비, 크기 및 부류에 걸쳐 수백 개의 혈장 단백질 표지를 확인하였으며, 적용 범위는 검출 방법에 의해 크게 제한되었다(도 3a 내지 3d). 건강한 성체 마우스로 전달하고 20시간 후, 알부민과 IgG가 고갈된 방사성 추적자인 Cu64-표지화된 혈장은 누출되고 천공이 있는 뇌실주위 기관과 BBB로 보호된 뇌 조직 내에서 IgG 대조군보다 훨씬 더 높은 수준으로 축적되었다(도 1b; 도 4a 내지 도 4e).
세포 분해능에서 혈장 흡수를 연구하기 위해, 초고해상도 영상화에 사용되는 작지만 밝은 원적외선 Atto 647N 형광단으로 혈장을 표지화하였다(Dempsey et al., Nat. Methods (2011). doi:10.1038/nmeth.1768; Han et al., Nat. Commun. (2017). doi:10.1038/s41467-017-01503-6). 형광 영상화는 자기방사법과 매우 유사하다(도 1c). 다양한 고정 및 고정 불가능한 추적자에 의해 기능적으로 측정되고 단일-세포 RNA 서열결정에 의해 전사적으로 측정된 바와 같이, 혈장 투여는 고단백혈증을 유도하거나 BBB를 교란시키지 않았다(도 5a 내지 도 5f). 더욱이, 혈장 흡수는 10㎕(순환 부피의 0.5% 미만)까지 주입 부피에 걸쳐 검출 가능하였으며; 다양한 생체외 및 생체내 표지 화학에서 볼 수 있었고; 알부민 또는 IgG를 포함하는 소수의 혈관구조에서도 알부민 또는 IgG와 함께 공동-국소화되지 않으며(도 6a 내지 도 6c); 잔류 유리 염료에 의해 혼동되지 않았다(도 7m; 도 8i).
더 큰 배율에서, 2가지 기본 특징이 관찰되었다: 점상 혈관구조 및 혈장-포함(혈장+) 실질 세포(도 1d 내지 도 1k; 도 7a 내지 도 7h). 리소좀 분해 또는 활성 통과세포외배출을 나타내는 점상 혈관구조는 외인성 추적자에서는 보이지 않는 내인성 혈장 단백질에 대한 BBB 내피에 의한 놀랍도록 높은 수준의 세포내섭취를 시사한다(Chow, B. W. & Gu, C. Trends Neurosci., 38: 598-608 (2015); Reese, T. S. & Karnovsky, M. J., J. Cell Biol. (1967). doi:10.1083/jcb.34.1.207, St-Amour et al., J. Cereb. Blood Flow Metab. (2013). doi:10.1038/jcbfm.2013.160; Rubin, L. L. & Staddon, J. M., Annu. Rev. Neurosci. (1999). doi:10.1146/annurev.neuro.22.1.11; Triguero et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1989). doi:10.1073/pnas.86.12.4761; 및
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et al., Sci. Rep. (2016). doi:10.1038/srep25658). 고해상도 영상화는 CD31+ 내피의 실질 쪽에 확산 신호와 점상 신호가 둘 다 있는 혈장 단백질 통과세포외배출을 나타내었다(도 1e; 도 7i). 게다가 혈장은 맥락총, 지주막하강, 및 혈관주위강에 축적되어 글림프계가 흡수, 분포 및 소거에 잠재적인 기여를 함을 암시한다(도 7j 내지 도 7l)(Iliff et al., Sci. Transl. Med. (2012). doi:10.1126/scitranslmed.3003748; Louveau et al., Nature, 523: 337-341 (2015); Da Mesquita et al., Nature (2018). doi:10.1038/s41586-018-0368-8). 트랜스페린 및 인슐린과 같은 선택된 단백질에 대한 BBB-투과성은 조 뇌 균질액 또는 분리된 혈관에서 조사된 한편(Pardridge et al., Metabolism (1987). doi:10.1016/0026-0495(87)90099-0; Poduslo et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 91, 5705-5709 (1994); Pardridge, W. M., Journal of NeuroVirology (1999). doi:10.3109/13550289909021285; Pardridge, W. M., Endocr. Rev. (1986). doi:10.1210/edrv-7-3-314; Pardridge, W. M., Drug Discovery Today (2007). doi:10.1016/j.drudis.2006.10.013; 및 Poduslo et al., Neurobiol. Dis. (2001). doi:10.1006/nbdi.2001.0402), 혈장+ 뉴런과 미세아교세포는 피질과 해마를 포함한 뇌 영역에 걸쳐 제자리에서 직접 시각화될 수 있었다(도 1g 내지 도 1k). 해마 치상회에서, 혈장은 혈관구조와 인접 신경 과정을 추적하였다(도 1i). 트랜스페린에 대한 염색에 의해, 기존 BBB 약물 전달 프로그램의 기초(
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et al., Cell Rep., 21: 3256-3270 (2017); Zucheroet al., Neuron (2016). doi:10.1016/j.neuron.2015.11.024; Couch et al., Sci. Transl. Med. (2013). doi:10.1126/scitranslmed.3005338; Atwal et al., Sci. Transl. Med. (2011). doi:10.1126/scitranslmed.3002254; Yu et al., Sci. Transl. Med. (2011). doi:10.1126/scitranslmed.3002230; 및 Niewoehner et al., Neuron (2014). doi:10.1016/j.neuron.2013.10.061), 실질적인 비-공동국소화 혈장 신호는 뉴런에서 관찰되었으며, 이는 다른 순환 인자가 유사하게 BBB-투과성임을 시사한다(도 1k).
종합하면, 이들 데이터는 내인성 순환 단백질이 건강한 성인 뇌에 구성적으로 들어가고 침투한다는 것을 나타낸다.
실시예 2
이 실시예는 뇌 혈관구조에 의한 혈장 흡수의 조절을 입증한다.
뇌에 의한 예상외로 많은 양의 혈장 흡수로 인해, 혈장이 향상된 BBB 수송을 위해 활용하는 유전 조절자의 복잡한 시스템(Jefferies et al., Nature (1984). doi:10.1038/312162a0; Broadwell, R. D.; Acta Neuropathologica (1989). doi:10.1007/BF00294368; Daneman, R., Ann. Neurol. (2012). doi:10.1002/ana.23648; 및 Zlokovic, B. V., Neuron (2008). doi:10.1016/j.neuron.2008.01.003)이 조사되었다. 유세포 분석을 통해 내피 세포에 의한 혈장 흡수를 기록하고 심층 단일-세포 RNA 서열결정(scRNA-seq, 세포당 평균 150만 판독물)을 위해 인덱스 분류하는 '기능적 전사체학' 플랫폼이 개발되었다. 모든 세포에 대한 전사체 데이터와 혈장 섭취를 연결하면 각각의 유전자의 발현과 혈장 섭취 정도 사이에 편견 없는 고-처리량 상관관계가 가능하였다. 745개의 뇌 내피 세포는 앞서 기재된 바와 같이 통과세포외배출의 측정을 보장하기 위해 형광-표지화된 혈장을 투여하고 4시간 후 건강한 성체 마우스로부터 처리되었다(Niewoehner, 상기함; Zuchero et al., Neuron (2016). doi:10.1016/j.neuron.2015.11.024; 및 Friden et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (2006). doi:10.1073/pnas.88.11.4771). 745개의 뇌 내피 세포와 서열결정된 19,899개의 유전자에 걸쳐, 조절인자 제어를 암시하는 혈장 흡수 계층이 관찰되었다(도 9a; 도 10a 내지 도 10d).
19,899개의 서열결정된 유전자의 대다수가 효과를 나타내지 않았지만, 표 1 및 도 9b에 나타낸 바와 같이 강화되거나 저해된 흡수의 특정 유전적 상관관계가 확인되었다. 트랜스페린 수용체(Tfrc) 및 CD98hc(Slc3a2)와 같은 특정 유전자는 검증 대조군의 역할을 하였으며; 예상대로, 향상된 혈장 섭취와 상관관계가 있는 유전자("상관관계")는 소포-매개 수송 경로에서 풍부하였다(도 9c). 놀랍게도, 상관관계 유전자는 또한 정준적으로 글루코스, 금속 이온, 및 기타 소분자를 이동시키는 역할을 하는 용질 운반체(SLC) 막관통 단백질에 대해 풍부하였다. 이들의 풍부화는 CD98hc를 인코딩하는 새로운 수용체-매개 통과세포외배출(RMT) BBB 전달 표적인 Slc3a2에 대해 최근에 발견된 바와 같이 단백질 통과세포외배출에서 가능한 이중 역할을 시사한다(Zuchero et al., Neuron (2016). doi:10.1016/j.neuron.2015.11.024). 흥미롭게도 Apoe(Bell et al., Nature (2012). doi:10.1038/nature11087; Zlokovic, JAMA Neurol. (2013). doi:10.1001/jamaneurol.2013.2152) 및 Mfsd2a(Andreone et al., Neuron, 94: 581-594.e5 (2017); 및 Ben-Zvi et al., Nature (2014). doi:10.1038/nature13324)와 같은 여러 상관관계가 BBB 무결성을 촉진하는 것으로 나타났으며, 이는 혈장 흡수를 유도하는 메커니즘이 조절되고 타협이 아님을 시사한다. 또한 이러한 유전자가 알려지지 않은 메커니즘을 통해 특정 혈장 단백질의 흡수를 촉진하거나 알려진 수용체와 긴밀하게 공동 발현된다는 것을 시사한다(도 9i). 발현이 혈장 흡수와 역상관관계가 있는 유전자("반상관관계")는 세포외 혈관 및 연조직 석회화 및 골화 경로 주위에 모여 있다(도 9c). 상관관계물과 반상관관계물은 둘 다 세포 표면에 국소화되어 있으며, 이는 혈장 흡수가 수용체에 대한 직접 결합에 의해 매개되고; 됨을 시사합니다. 세포 외 기질에서 시스(cis) 또는 격리로 작용하는 세포 표면 단백질에 의해 제해된다는 것을 시사한다(도 2d). 마지막으로, BBB-특이적 유전자의 강력한 농축(Daneman et al., PLoS One (2010). doi:10.1371/journal.pone.0013741)이 상관관계물과 반상관관계물에서 발견되었으며, 이는 혈장 흡수 및 통과세포외배출의 이러한 조절인자가 BBB에 고유할 수 있음을 시시한다(도 9e). 세포 표면 상관관계물 및 반상관관계물의 확인은 BBB 수송을 조절하는 새로운 분자 표적을 제공한다.
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뇌 혈관구조는 동정맥 구획화를 따른다(Vanlandewijck et al., Nature, 554: 475-480 (2018); Chen et al., bioRxiv (2019). doi:10.1101/617258; Simionescu et al., J. Cell Biol. (1976). doi:10.1083/jcb.68.3.705)(도 9f). 예상외로, 혈장 흡수는 혈관 분절에 따라 뚜렷하게 달랐으며, 정맥 세포는 가장 많은 혈장을, 동맥 세포는 가장 적은 혈장을 세포내섭취하고, 모세혈관이 그 사이이지만 가장 넓은 분포를 나타낸다(도 9g). 따라서 혈장 흡수는 혈관 분절이 느끼는 혈압과 역상관관계가 있다. 각각의 혈관 분절은 혈장 섭취 및 저해와 상관관계가 있는 고유한 전사 프로그램을 나타내었다(도 9h). 모세혈관 내에서, Tfrc 발현은 Mfsd2a와 같은 다른 상관관계물과 평행하여, 공통 상류 신호전달 경로에 의한 공동-조정을 제안하는 공동-발현 모듈을 형성한다(도 9i). 이러한 Tfrc 모듈의 발현은 Alpl과 같은 강력한 반상관관계물의 발현과 상호 배타적이어서, 모세혈관 내에서 상호 배타적인 집단을 표시한다. 모세혈관을 통한 다양한 혈장 흡수를 추가로 조사하기 위해, 내피 세포를 SPIN(sorting points into neighborhoods; 점을 이웃으로 분류)에 의해 1차원 축으로 정렬하였다(Vanlandewijck et al., 상기 참조; 및 Tsafrir et al., Bioinformatics (2005). doi:10.1093/bioinformatics/bti329). 동맥 세포와 전사적으로 더 유사한 모세혈관은 동맥 세포처럼 세포내섭취하고, 정맥-유사 모세혈관의 경우에는 그 반대이다(도 9j; 도 10e). 이것은 대뇌 동정맥 트리를 따라 혈장 흡수의 전사 및 아마도 공간적 구배를 시사한다. 혈장 흡수의 개별 유전적 상관관계가 동정맥 구역화(도 9k; 도 10f) 전반에 걸쳐 표현되지만, 별개의 공동-발현 모듈로의 어셈블리는 흡수의 혈관 분절 차이를 결정할 가능성이 있다.
함께, 이들 데이터는 건강한 대상체에서 BBB-특이적이고 치료적으로 관련된 전사 프로그램이 혈장 수송을 능동적으로 조절하고 각각의 혈관 분절에 고유하다는 것을 시사한다.
실시예 3
이 실시예는 BBB 통과세포외배출의 연령-관련 이동을 기재한다.
나이가 들어감에 따라, BBB는 외인성 추적자에 대해 '누설'된다(Montagne et al., Neuron (2015). doi:10.1016/j.neuron.2014.12.032). IgG 뇌 흡수는 이전 연구(Poduslo et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 5705-5709 (1994))와 일치하는 수준에서 검출되었으며, 일치하게 나이에 따른 IgG 축적의 증가는 자기방사법 및 정량적 감마 계수 둘 다에 의해 관찰되었다(도 4c; 도 8b 내지 도 8c). 그러나, 놀랍게도 노화된 뇌에서 혈장 흡수가 감소하였다(도 8a 내지 도 8b; 도 4c). 이는 전체 뇌 또는 혈관이 제거된 피질 및 해마 실질 균질물이 분석되었는지 여부에 관계없이 사실이었다(도 8b 내지 도 8c). 그럼에도 불구하고, 혈장 섭취는 지속적으로 IgG의 섭취를 초과하였으며, 이는 BBB를 통한 향상된 혈장 수송을 매개하는 카베올라-독립적 메커니즘을 추가로 시사한다.
혈장 수송에서 연령-관련 손상을 담당하는 기전을 조사하기 위해, scRNA-seq 데이터를 이전에 공개된 뇌 내피 세포 전사체 노화 데이터세트와 결합하였다(Yousef et al., Nat. Med. (2019). doi:10.1038/s41591-019-0440-4)(도 8d). 연령에 따라 하향 조절되는 유전자 중 주목할 만한 정도의 85%가 어린 대상체에서의 혈장 흡수와 상관관계가 있었다(곡선 아래 면적의 92%). 농축 분석은 활성 RMT의 결함을 암시하는 클라트린 어댑터 활성 및 ATP 이용의 손실을 강조하였다. 실제로, 뇌 내피 세포에서 나이에 따른 리간드-특이적 RMT에서 비특이적 카베올라 세포 전이로의 전체적인 이동이 관찰되었다(도 8e; 도 11a 내지 도 11b). Tfrc를 포함한 추정 RMT 수용체는 하류 클라트린 구성요소 및 어댑터와 마찬가지로 전사체 및 단백질 수준 모두에서 연령에 따라 감소하였다. 카베올라 형성에 필수적인 Cav1(Andreone et al., 상기 참조)은 전사체와 단백질 수준 둘 다에서 나이가 들어감에 따라 증가하는 반면, 카베올라 통과세포외배출을 억제하는 Mfsd2a는 나이가 들면서 감소한다.
내피 통과세포외배출의 이러한 연령-관련 이동을 기능적으로 검증하기 위해, 3가지 독립적인 접근법, 즉 지질체학, 단백질체학, 및 유세포 분석을 이용하였다. 최근 연구에 따르면 뇌 내피 세포의 고유한 지질 구성이 낮은 비율의 카베올라 통과세포외배출의 기초가 되며; Mfsd2a는 카베올라 형성을 방지하기 위해 내강 원형질막에 오메가-3 지방산 도코사헥사엔산(DHA)-포함 인지질을 포매함으로써 이러한 특성을 유지하는 것으로 나타났다(Andreone et al., Neuron (2017). doi:10.1016/j.neuron.2017.03.043, Ben-Zvi et al., Nature (2014). doi:10.1038/nature13324; 및 Nguyen et al., Nature (2014). doi:10.1038/nature13241). 연령에 따른 감소된 Mfsd2a 발현과 일관되게, 편견 없는 지질체학 분석은 리소포스파티딜에탄올아민(LPE), 포스파티딜콜린(PC), 포스파티딜에탄올아민(PE), 및 포스파티딜세린(PS) 부류에서 DHA-포함 인지질 종의 연령-관련 감소를 나타내었다(도 8f 내지 도 8g; 도 11c). 이들은 말초 내피 세포에 비해 뇌에서 차등적으로 풍부한 바로 그 DHA-포함 부류였다(Andreone et al., Neuron (2017). doi:10.1016/j.neuron.2017.03.043). 차등적으로 160개의 풍부한 지질 중에서 스핑고미엘린, 에탄올아민 플라스마로겐(PE-p), 및 세라마이드(확장 데이터 도 8c)와 같은 특정 카베올라-관련 지질의 연령-상향 조절도 또한 관찰되었다.
트랜스페린 및 알부민은 각각 단백질 RMT 및 카베올라 통과세포외배출에 대한 정준 리간드이다(Fishman et al., J. Neurosci. Res. (1987). doi:10.1002/jnr.490180206; Roberts et al., J. Cell Sci. (1993); Lajoie, J. M. & Shusta, E. V., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. (2014). doi:10.1146/annurevpharmtox-010814-124852; 및 Schubert et al., J. Biol. Chem. (2001). doi:10.1074/jbc.C100613200). 질량 분석-기반 단백질체학에 의해, 내인성 트랜스페린의 감소와 알부민 풍부도의 동반 증가가 노화된 미세혈관 내에서 관찰되었다(도 8h). 이 결과는 Tfrc 및 클라트린 발현의 연령-관련 감소, 및 리간드 비특이적 카베올라의 증가와 일치한다. 내인성 알부민의 풍부함은 어린 마우스의 대부분의 미세혈관 샘플에서 검출 한계 미만이었지만, 나이가 들어감에 따라 일관되게 검출되었다. 트랜스페린의 풍부함은 알부민의 풍부함을 초과했지만, 그 차이는 나이가 들수록 좁혀져 RMT가 어린 BBB를 가로지르는 통과세포외배출의 주된 경로이지만 나이가 들면서 카베올라 통과세포외배출로 전환된다는 가설을 뒷받침한다. 주입된 RMT 리간드 렙틴과 카베올레-수송 리간드 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)를 사용하여 유사한 패턴이 관찰되었으며, 어린 내피는 렙틴이 더 많이 차지하지만 노화된 내피는 HRP가 더 많이 차지한다(도 19a).
마지막으로, 기능 수송의 연령-관련 변화가 수용체-매개(트랜스페린, 렙틴으로 예시됨)에서 카베올라(IgG, 알부민, HRP) 통과세포외배출로의 예측된 이동과 일치하여 측정되었기 때문에, 클라트린 및 카베올라 소포의 빈도를 나이에 따라 시각화하고 정량화하였다. 항체로-염색된 미세혈관의 고해상도 현미경을 통해, 어린 뇌 내피에서 더 큰 밀도의 클라트린 소포가 관찰되었지만, 노화된 뇌에서는 더 많은 카베올라 소포가 관찰되었다(도 19b 및 19c).
내피 세포에 걸쳐 계층적이었던 RMT와 대조적으로(도 9a), 카베올라 수송 경로는 광범위한 리간드-비특이적 흡수를 나타낸다(Nabi et al., Journal of Cell Biology (2003). doi:10.1083/jcb.200302028; and
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et al., Cellular and Molecular Life Sciences (2019). doi:10.1007/s00018-018-2982-x). 따라서 나이가 들어감에 따라, 내피 세포는 보다 균일한 흡수 패턴을 가져야 한다고 가정하였다. 유세포 분석을 사용하여, 먼저 검출된 혈장 신호가 특이적임을 확인하여, 연령-관련 자가형광을 우회하는 신뢰할 수 있는 정량화를 가능하게 하였다(Spitzer et al., J. Neurosci. Methods (2011). doi:10.1016/j.jneumeth.2011.01.029; Schnell et al., J. Histochem. Cytochem. (1999). doi:10.1177/002215549904700601(도 3i; 확장 데이터 도 8d; 확장 데이터(177) 도 11a 내지 e). 나이가 들어감에 따라 혈장+ 내피 세포의 비율 증가가 관찰되었으며, 이는 카베올라 수송의 비특이성과 일치한다(도 8j). 대조적으로, 세포내섭취 세포 내의 평균 혈장 양은 나이에 따라 감소하여, 자가방사법 및 감마 계수 데이터와 일치한고(도 8a 내지 도 8b) RMT가 혈장 단백질 통과세포외배출에 대한 카베올라보다 더 생산적인 경로임을 시사한다. 이 연령-관련 이동은 또한 현미경으로 확인되었으며, 나이가 들어감에 따라 더 확산되고 균일한 신호가 관찰되는 것과 비교하여 어린 혈관구조에서 더 이질적이고 계층적인 패턴의 혈장 흡수가 관찰되었다(도 8k). 이 이동은 또한 NeuN+ 및 Thy1+ 뉴런 둘 다에서 분명하였지만(도 8l; 도 11e), ACS2-A+ 성상세포에서는 그렇지 않았다(도 11f).
상기 기재된 데이터는 노화된 BBB가 수용체-매개에서 카베올라 통과세포외배출로의 이동을 겪으며, 이는 BBB-투과성 단백질의 변경된 조성 및 혈장 흡수의 전반적인 감소 둘 다를 초래함을 시사한다. 연령에 따른 BBB 통과세포외배출의 이동 모델은 도 16에 개략적으로 도시되어 있다.
실시예 4
이 실시예는 CNS의 연령-관련 석회화 및 ALPL 저해가 BBB 통과세포외배출을 회복시키는 것을 기재한다.
뇌 내피 수송의 연령-관련 이동과 연관된 명백한 해부학적 변화를 발견하기 위해, 혈관 밀도, 성상세포 커버리지, 및 주피세포 커버리지를 연령에 따라 평가하였다(도 20a 및 도 20b). 주피세포 커퍼리지의 특정 손실이 관찰되었으며(도 20a 및 도 20b), Tfrc, Lrp8 및 Mfsd2a와 같은 여러 주피세포-유도 유전자는 주피세포-결핍 Pdgf ret/ret 유전자이식 모델(Armulik et al., Nature, 468: 557-561 (2010)) 및 정상 노화(도 20b 및 도 20c) 둘 다에서 감소하였다. 이는 성숙한 BBB 기능을 유지하는 데 있어서 주피세포의 역할을 시사한다. 주피세포 결핍 유전자이식 모델은 골밀도 결절 및 혈관 회전 타원체로 나타나는 이소성 석회화를 나타낸다(Keller et al., Nat. Genet. (2013). doi:10.1038/ng.2723; 및 Zarb et al., Brain (2019). doi:10.1093/brain/awz032). 놀랍게도, 이와 같은 석회화는 질병이 없는 정상적인 노화에서 표현형이 모사되었다(도 12b). 따라서, 주피세포 손실 및 수반되는 이소성 뇌 석회화 및 BBB 기능장애는 뇌 노화의 정상적인 특징일 수 있다. 분자적으로, 석회화는 유형 I 콜라겐과 알칼리 포스파타제 ALPL의 공동-국소화로 인해 발생하며(Murshed et al., Genes Dev. (2005). doi:10.1101/gad.1276205), 둘 다 나이가 들면서 함께 증가한다(도 12d 및 12e).
CNS 약물 전달을 향상시키기 위한 여러 주요 약물 및 임상 개발 프로그램은 BBB RMT에 의존하며, 대부분은 트랜스페린 수용체인 TFRC를 표적으로 한다(Atwal et al., Sci. Transl. Med. (2011). doi:10.1126/scitranslmed.3002254; Yu et al., Sci. Transl. Med. (2011). doi:10.1126/scitranslmed.3002230; Zuchero et al., Neuron (2016). doi:10.1016/j.neuron.2015.11.024; Sonoda et al., Mol. Ther. (2018). doi:10.1016/j.ymthe.2018.02.032; Bien-Ly et al., J. Exp. Med. (2014). doi:10.1084/jem.20131660; 및 Oller-Salvia et al., Chemical Society Reviews (2016). doi:10.1039/c6cs00076b). 나이가 들어감에 따라 BBB RMT의 손실을 관찰한 후, (1) BBB가 풍부(도 13a 내지 도 13b; (2) 내피 세포 표면에서 발현(도 12a); (3) 연령에 따라 상향 조절(도 12d 내지 도 12e; 도 13d 내지 도 13e); (4) 혈장 흡수의 반상관관계(도 9b; 도 13c); 및 (5) FDA-승인 소분자 및 개선된 유도체로 억제 가능한 유전자를 필터링함으로써 노화된 BBB 통과세포외배출을 향상시키는 분자 표적에 대한 검색을 수행하였다(도 12a)(Debray et al., Bioorganic Med. Chem. (2013). doi:10.1016/j.bmc.2013.09.053; 및 Sheen et al., J. Bone Miner. Res. (2015). doi:10.1002/jbmr.2420). 알칼리 포스파타제 유전자인 Alpl만이 이러한 기준을 충족하였다.
그러나, Alpl의 정준 역할은 골 석회화의 핵심 이펙터이다(Sheen et al., J. Bone Miner. Res. (2015); Murshed et al., Genes Dev. (2005). doi:10.1101/gad.1276205; Villa-Bellosta, R. & O'Neill, W. C., Kidney International (2018). doi:10.1016/j.kint.2017.11.035; Savinov et al., J. Am. Heart Assoc. (2015). doi:10.1161/JAHA.115.002499; Romanelli, F., PLoS One (2017). doi:10.1371/journal.pone.0186426)). 놀랍게도, 알리자린 레드 염색은 정상적으로 노화된 뇌에서 석회화(뼈 밀도 결절)를 검출하였다(도 12b). 이러한 석회화는 주피세포-결핍 Pdgfret/ret 마우스 모델에서 관찰된 것을 재현하였지만(Keller, A. et al., Nat. Genet. (2013). doi:10.1038/ng.2723; Vanlandewijck, M. et al., PLoS One (2015). doi:10.1371/journal.pone.0143407; Zarb et al., Brain (2019). doi:10.1093/brain/awz032; Sagare et al., Nat. Commun. (2013). doi:10.1038/ncomms3932; Montagne et al., Nat. Med. (2018). doi:10.1038/nm.4482; 및 Bell et al., Neuron (2010). doi:10.1016/j.neuron.2010.09.043), 주피세포 손실은 정상적인 질병이 없는 노화에서는 입증되지 않았다. 분자적으로, 혈관 석회화는 I형 콜라겐과 ALPL(Alpl에 의해 인코딩됨)의 공동 국소화에 의해 표시되는데, 이는 세포외 기질 광물화가 이 조건에서만 발생하기 때문이다Murshed et al., Genes Dev. (2005). doi:10.1101/gad.1276205; 및 Villa-Bellosta, R. & O'Neill, W. C., Kidney International (2018). doi:10.1016/j.kint.2017.11.035). 강력한 광물화 저해제인 파이로포스페이트를 가수분해하는 ALPL의 혈관 과발현은 이소성 혈관 석회화를 유도하기에 충분하다(Sheen et al., J. Bone Miner. Res. (2015); Savinov et al., J. Am. Heart Assoc. (2015). doi:10.1161/JAHA.115.002499; 및 Romanelli, F., PLoS One (2017). doi:10.1371/journal.pone.0186426). 따라서, 노화된 뇌 내피에서 유형 I 콜라겐 및 ALPL 둘 다의 놀라운 증가는 노화와 함께 증가하는 골형성 환경 및 혈관 석회화와 일치한다(도 12c 내지 도 12e).
모세혈관에서 Alpl 및 Tfrc의 비중첩 발현과 일관되게(도 9i), 홀로-트랜스페린은 ALPL-결핍 모세혈관에 의해 우선적으로 흡수되었다(도 21a). 이 상관관계가 인과적 메커니즘을 암시하는지 여부를 결정하기 위해, 약리학적 ALPL 저해 후 노화된 뇌 내피 세포의 scRNA-seq를 수행하였다. 놀랍게도, ALPL 저해 후 상위 상향 조절된 유전자는 트랜스페린 수용체였으며, 이 때 약 70% 발현이 모세혈관에서 증가하고 대략 89%가 정맥 세포에서 증가하였다(도 21b 및 도 21c).
선택적 ALPL 저해제(Dahl et al., J. Med. Chem. (2009). doi:10.1021/jm900383s; 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용됨)의 투여는 ALPL 활성을 감소시켰고, 이에 따라 노화된 뇌 혈관구조에서 광물화 활성을 감소시켰다(도 12f 내지 도 12g). 노화된 마우스 뇌(23개월)에서 트랜스페린 흡수에 대한 ALPL 발현의 효과가 도 18에 나타나 있다.
BBB 단백질 흡수에서 Alpl에 대한 다면적 역할을 검증하기 위해, 이전 연구(Armulik et al., Nature, 468: 557-561 (2010))의 주입 패러다임이 채택되었고(도 12f), 선택적 ALPL 저해제 처리 시 어린 마우스와 노령 마우스 둘 다의 뇌 내피 세포에서 증가된 혈장 흡수가 관찰되었다(도 14a 내지 도 14b; 도 15e). 노령 쥐에서, 내피를 가로질러 뇌 실질 세포로의 증가된 혈장 수송이 관찰되었다(도 12i). 혈장+ 세포의 백분율은 변하지 않았지만 참여하는 세포에 의해 흡수된 혈장의 양이 증가하였다. 따라서 이전 유세포 분석 및 영상 데이터(도 8i 내지 도 8l; 도 11d 내지 도 11e)를 기반으로 하여 ALPL 저해는 연령-상향 조절된 카베올라 수송을 변경하지 않을 가능성이 높지만(도 14h), 그러나 대신에 단백질 RMT를 촉진한다. 흥미롭게도, ALPL 저해는 내피에서 더 많은 흡수에도 불구하고 어린 BBB를 가로질러 실질로의 혈장 통과세포외배출을 향한 경향이 있지만 유의하게 향상되지는 않았다(도 12j; 도 14a). 이는 혈관구조 소수를 구성하는 어린 BBB의 동맥 세포에 대한 ALPL의 제한된 발현 때문일 수 있으며, 따라서 ALPL 저해 시 유의하게 향상된 통과세포외배출을 부여하기에는 수가 불충분합니다(도 12d 내지 도 12e, 도 13d 내지 도 13e). ALPL 포스파타제 활성의 저해는 이전에 BBB 통과세포외배를 정지시키는 것으로 나타난 티로신 키나제 억제제인 이마티닙과 반대로 작용할 수 있다(Armulik et al., Nature (2010). doi:10.1038/nature09522; 및 Su et al., Nat. Med. (2008). doi:10.1038/nm178791,92).
임상 개발 중인 기존 트랜스페린 수용체 항체가 유사하게 RMT를 통해 BBB를 가로지르기 때문에, ALPL 저해가 뇌 흡수를 증강시키는 새로운 부류의 일반 "보조제"를 예시할 수 있는지 여부를 조사하였다. 실제로, 증가된 실질 흡수는 인간 홀로-트랜스페린 및 고친화성의 상업적으로 입수 가능한 트랜스페린 수용체 항체 둘 다에 대한 ALPL 저해 후에 관찰되었다(도 12k 내지 도 12l; 도 14c 내지 도 14f). 트랜스페린 수용체 항체 흡수의 증진은 홀로-트랜스페린만큼 강력하지 않았으며, 이는 이와 같은 고친화도의 2가 항체 변이체가 내피에서 우선적으로 포획되고 분해된다는 것을 나타내는 이전 연구와 일치한다(Yu et al., Sci. Transl. Med. (2011). doi:10.1126/scitranslmed.3002230; Niewoehner et al., Neuron (2014). doi:10.1016/j.neuron.2013.10.061, Bien-Ly et al., J. Exp. Med. (2014). doi:10.1084/jem.20131660, Haqqani et al., J. Neurochem. (2018). doi:10.1111/jnc.14482; 및 Johnsen et al., Theranostics (2018). doi:10.7150/thno.25228). ALPL 저해 후 홀로-트랜스페린 및 트랜스페린 수용체 항체의 실질 접근은 피질 NeuN+ 뉴런과 같은 여러 세포 유형에 축적되어 제자리에서 시각적으로 확인되었다(도 12m; 도 14e). ALPL 저해는 혈관 형태를 교란하거나 세포주위 밀착 연접을 손상시키지 않았다(도 14g 내지 도 14h).
이 실시예의 결과는 뇌 석회화가 정상적인 노화의 속성이고, 혈관구조에서 연령-상향 조절된 석회화-촉진 ALPL의 저해가 혈장 및 치료적으로 관련된 생물의약품의 흡수를 향상시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 5
혈장 흡수의 유전자 상관관계를 뇌 모세혈관, 정맥 및 세동맥에 대해 더 어린 대상체 및 더 고령의 대상체에서 결정하였으며, 그 결과는 각각 도 17a 내지 도 17c에 나타나 있다. 이 정보는 잠재적으로 독성을 최소화하기 위해 특정 질환 또는 기타 상황에 구체적으로 관련된 유전자 및/또는 혈관 유형을 표적화하는 데 유용하다.
실시예 6
이 실시예는 ALPL 저해가 혈액-뇌 장벽 철 수송체인 Tfrc 및 Slc40a1을 상향 조절한다는 것을 입증하고, 하지 불안 증후군(RLS)을 치료하기 위한 치료적 접근을 제공한다.
하지 불안 증후군(RLS)은 일반 인구의 7 내지 10%에 영향을 미치는 심각한 운동-관련 수면 장애이며, 3%는 치료적 개입을 필요로 한다(Allen et al., Arch. Intern. Med. (2005). doi:10.1001/archinte.165.11.1286; Innes, K. E., Selfe, T. K. & Agarwal, P. Sleep Medicine (2011). doi:10.1016/j.sleep.2010.12.018; Ohayon et al., Sleep Medicine Reviews (2012). doi:10.1016/j.smrv.2011.05.002). 유병률 및 중증도는 둘 다 연령에 따라 악화된다(Milligan, S. A. & Chesson, A. L., Drugs and Aging (2002). doi:10.2165/00002512-200219100-00003). RLS의 정확한 발병 기전은 불분명하지만, 임상 연구에 따르면 뇌의 철분 부족이 RLS와 연관이 있는 것으로 일관되게 나타난다. 그러나 말초 철분 보충은 혈액-뇌 장벽(BBB)을 가로지르는 철분의 제한된 투과성으로 인해 방해를 받으므로, 전용 수송체를 통한 촉진된 전달이 필요하다(Mills et al., Future Medicinal Chemistry (2010). doi:10.4155/fmc.09.140; 및 Chiou, B. et al., PLoS One (2018) doi:10.1371/journal.pone.0198775). 최근 연구는 RLS 환자에서 BBB를 가로지르는 항상성 철분 수송을 매개하는 바로 그 유전자의 손상된 발현을 밝혀내었다(Mizuno et al., J. Sleep Res. (2005). doi:10.1111/j.1365-2869.2004.00403.x; 및 Connor et al., Brain (2011). doi:10.1093/brain/awr0127,8). 따라서 철분 부족을 회복하기 위해 뇌로의 철분 전달을 촉진할 수 있는 치료제에 대한 충족되지 않은 상당한 수요가 남아 있다.
본 명세서에 기재된 방법론을 이용하는 선택적 ALPL 저해제의 정맥내 투여는 BBB를 가로지르는 철분 수송 경로를 향상시키기에 충분하다는 것이 밝혀졌다(도 22에 개략적으로 나타냄). 구체적으로, 철분 수송은 2가지 중요한 유전자, 즉 철분을 뇌 내피로 가져오기 위한 트랜스페린 수용체(TFRC) 및 가져온 철분을 적절한 뇌 실질로 생산적으로 전달하기 위한 페로포틴에 의해 결정된다. ALPL 저해는 노화된 BBB에서 TFRC 및 페로포틴 발현 둘 다를 강력하게 상향 조절하였다(도 23). 실제로, 전체 게놈에 걸쳐 TFRC는 가장 강력한 상향 조절된 수용체이고 페로포틴은 표 2 및 3 및 도 23에 나타낸 바와 같이 ALPL 저해 시 가장 강력한 상향 조절된 수송체였다. ALPL 저해는, TFRC 및 페로포틴이 정상적으로 발현되는 BBB 모세혈관 및 정맥 세포에서 TFRC 및 페로포틴 발현을 촉진하였다(도 24a 내지 도 24c).
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이러한 발견은 ALPL 저해가 뇌로의 철분 수송의 결정인자를 상향 조절하는 약리학적 접근을 제공하여 RLS에 대한 치료적 접근을 제공한다는 것을 입증한다.
일부 실시형태에서, ALPL 저해는 RLS에 대한 다른 치료 또는 요법과 조합하여 사용된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, ALPL 저해는 로피니롤(REQUIP), 로티고틴(NEUPRO), 프라미펙솔(MIRAPEX), 가바펜틴(NEURONTIN, GALISE), 가바펜틴 에나카빌(HORIZANT), 프레가발린(LYRICA), 트라마돌(ULTRAM, CONZIP), 코데인, 옥시코돈(OXYCONTIN, ROXICODONE), 하이드로코돈(HYSINGLA ER, ZOHYDRO ER), 근육 이완제 및 수면제와 조합된다.
본 명세서에 인용된 간행물, 특허 출원, 및 특허를 포함하는 모든 참고 문헌은 마치 각각의 참고 문헌이 개별적으로 그리고 구체적으로 참고로 원용되는 것으로 표시되고 전문이 본 명세서에 제시된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조로 원용된다.
용어 "단수 표현" 및 "적어도 하나"의 사용 및 본 발명을 기재하는 맥락에서(특히 다음 청구범위의 맥락에서) 유사한 지시대상은 본 명세서에 달리 표시되거나 문맥상 명백하게 모순되지 않는 한 단수와 복수를 둘 다 포괄하는 것으로 해석되어야 한다. 용어 "적어도 하나" 다음에 하나 이상의 항목 목록(예를 들어, "A 및 B 중 적어도 하나")의 사용은 본 명세서에 달리 표시되거나 문맥상 명백하게 모순되지 않는 열거된 항목(A 또는 B ) 또는 열거된 항목(A 및 B) 중 둘 이상의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나의 항목을 의미하는 것으로 해석되어야 한다. 용어 "포함하는", "갖는", "비롯하는", 및 "함유하는"은 달리 언급되지 않는 한 개방형 용어(즉, "포함하지만 이들로 제한되지 않는"을 의미함)로 해석되어야 한다. 본 명세서에서 값의 범위에 대한 언급은 단지 본 명세서에서 달리 지시되지 않는 한 범위 내에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 지칭하는 약칭 방법의 역할을 하는 것으로 의도되며, 각각의 개별 값은 마치 본 명세서에 개별적으로 인용된 것처럼 명세서에 통합된다. 본 명세서에 기재된 모든 방법은 본 명세서에 달리 표시되지 않거나 달리 문맥상 명백히 모순되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본 명세서에 제공된 임의의 및 모든 예, 또는 예시적인 언어(예를 들어, "예컨대")의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 설명하기 위한 것이며 달리 청구되지 않는 한 본 발명의 범주를 제한하지 않는다. 명세서의 어떤 언어도 본 발명의 실시에 필수적인 것으로 청구되지 않은 임의의 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 발명을 수행하기 위해 본 발명자들에게 알려진 최상의 모드를 포함하는 본 발명의 바람직한 실시형태가 본 명세서에 기재되어 있다. 이러한 바람직한 실시형태의 변형은 전술한 설명을 읽을 때 당업자에게 명백해질 수 있다. 본 발명자들은 숙련된 기술자가 이와 같은 변형을 적절하게 이용하는 것을 예상하고, 본 발명자들은 본 명세서에 구체적으로 기재된 것과는 다르게 본 발명이 실시되기를 의도한다. 따라서, 본 발명은 적용 가능한 법률이 허용하는 바에 따라 본 명세서에 첨부된 청구범위에 인용된 주제의 모든 변형 및 균등물을 포함합니다. 더욱이, 본 명세서에서 달리 표시되지 않거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한, 모든 가능한 변형에서 상기 기재한 요소의 임의의 조합은 본 발명에 포함된다.
참고문헌
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Claims (19)

  1. 대상체에서 혈액-뇌 장벽 투과성을 증가시키는 방법으로서, 알칼리 포스파타제 단백질(ALPL)의 활성을 저해하는 작용제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 치료제를 필요로 하는 대상체의 뇌에 치료제를 전달하는 방법으로서, (a) 뇌에서 알칼리 포스파타제 단백질(ALPL)의 활성을 저해하는 작용제; 및 (b) 치료제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 치료제는 거대분자인, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 거대분자는 단백질인, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 거대분자는 항체인, 방법.
  6. 제2항에 있어서, 상기 치료제는 소분자 약물인, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제는 알칼리 포스파타제 단백질(ALPL)의 소분자 저해제인, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 중추신경계(CNS) 질환을 앓고 있는, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 중추신경계 질환은 대사 질환, 외상, 행동 장애, 성격 장애, 치매, 암, 감염, 자가면역 질환, 혈관 질환, 수면 장애, 또는 신경퇴행성 질환인, 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 중추신경계 질환은 하지 불안 증후군(RLS)인, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 50세 이상인, 방법.
  12. 포유동물에서 혈액-뇌 장벽 투과성을 조절하는 생체분자를 확인하는 방법으로서,
    (a) 제1 포유동물로부터 분리한 혈장의 생체분자를 검출 가능하게 표지화하는 단계;
    (b) 표지화된 생체분자를 포함하는 분리된 혈장을 제2 포유동물에 도입하는 단계;
    (c) 혈액-뇌 장벽을 형성하는 제2 포유동물로부터 뇌 내피 세포를 분리하는 단계;
    (d) 분류된 뇌 내피 세포 집단을 생성하기 위해 유세포 분석을 사용하여 분리된 뇌 내피 세포 각각에서 혈장 흡수를 측정하는 단계;
    (e) 분류된 각각의 뇌 내피 세포에서 혈장 흡수와 상관관계가 있는 유전자의 발현을 검출하는 단계; 및
    (f) 발현이 뇌 내피 세포에서 증가 또는 감소된 혈장 흡수와 상관관계가 있는 유전자에 의해 인코딩되는 생체분자를 선택하여, 생체분자가 대상체에서 혈액-뇌 장벽 투과성을 조절하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 분리된 혈장의 생체분자는 형광 표지화된 것인, 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 유전자의 발현은 단일 세포 RNA 서열결정(scRNA-seq)을 사용하여 검출되는, 방법.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물은 마우스인, 방법.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체분자는 혈액-뇌 장벽 투과성을 증가시키는, 방법.
  17. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체분자는 혈액-뇌 장벽 투과성을 감소시키는, 방법.
  18. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체분자는 단백질 또는 팹타이드인, 방법.
  19. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체분자는 핵산인, 방법.
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