CN114920800B - 一种含色氨酸的5肽荧光探针及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种含色氨酸的5肽荧光探针及其应用,所述含色氨酸的5肽荧光探针,由组氨酸‑色氨酸‑组氨酸‑组氨酸‑谷氨酸组成,本发明还包括了所述含色氨酸的5肽荧光探针在检测Cu2+浓度方面的应用。本发明荧光探针检测灵敏度高,检测速度快,不受常见阳离子干扰,成本低,选择性好;可用于水中Cu2+的检测,环境友好;与其他含有3个组氨酸和1个色氨酸的多肽HWHH相比,HWHHE的空间折叠能力更强,与Cu2+更加容易络合,检测效果更加稳定,此外增加的谷氨酸可以有效增加多肽的水溶性,提高多肽荧光探针在水中的稳定性,本发明结合酶标仪,可用于高通量检测样品中Cu2+的浓度。
Description
技术领域
本发明涉及一种多肽荧光探针及其应用,具体涉及一种含色氨酸的多肽荧光探针及其应用。
背景技术
铜元素在人体内必不可少,是继铁元素和锌元素之后的第三大微量元素,它在中枢神经、大脑、肝脏、心脏的发育中起着不可替代的作用。保持体内铜离子正常水平有利于身体健康,但如果铜离子摄入过量,会产生毒性作用,并导致许多神经系统疾病,如阿尔茨海默症、威尔逊氏病等。过量铜离子的摄入主要来源于环境污染,比如工业生产中的废铜没有经过处理直接排入大自然,给水或者土壤等环境造成了危害和污染,动植物从土壤或者水中吸收铜离子,再通过食物链富集到人体,对人的身体健康产生不利影响。根据世界卫生组织(WHO)规定,Cu2+在饮用水中含量不能超过2 mg/L,成年人每天铜的摄取量不应超过10~12 mg。水中Cu2+含量的检测越来越受到重视。
目前,GB5009.13-2017中水中铜的测定方法有石墨炉原子吸收光谱法、火焰原子吸收光谱法、电感耦合等离子体质谱法和电感耦合等离子体发射光谱法,但这些方法一般都需要精密的仪器或者是复杂的操作流程,在实际应用中面临着耗时长、成本高和样品不可回收等问题。
CN 105482808 A公开了一种检测食源性水中S2-的荧光探针的制备方法和应用,所述荧光探针由Cu2+与含有至少3个组氨酸和至少1个色氨酸的多肽络合而成,且色氨酸的位置在组氨酸之间。但该方案中的3个组氨酸与至少1个色氨酸形成的多肽对铜离子的选择性不足,对多种阳离子有比较强的响应。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是,克服现有技术存在的上述缺陷,提供一种检测灵敏度高,成本低,选择性好,抗干扰,环境友好,可高通量检测水中Cu2+的含色氨酸的5肽荧光探针及其应用
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下:一种含色氨酸的5肽荧光探针,由组氨酸-色氨酸-组氨酸-组氨酸-谷氨酸组成,其分子结构式为:
本发明含色氨酸的5肽荧光探针,根据组氨酸-色氨酸-组氨酸-组氨酸-谷氨酸的结构,也简称为HWHHE探针或HWHHE多肽。
优选地,所述的含色氨酸的5肽荧光探针,采用多肽固相合成法合成。
本发明含色氨酸的5肽荧光探针的应用,用于检测Cu2+浓度。
优选地,将荧光探针配制成浓度为1~3μmol/L的标准检测溶液,向标准检测溶液中加入待测样品,分别测定加入待测样品前标准检测溶液的荧光强度和加入待测样品后标准检测溶液的荧光强度,与标准曲线进行对比,即可得到待测样品中的Cu2+含量。
优选地,所述待测样品与标准检测溶液的体积比1~1.5:1000。
优选地,标准检测溶液的浓度为1~3 μmol/L。
优选地,所述标准检测溶液的配置方法为:将冻干的荧光探针溶解在NaOH溶液中,制备多肽储备溶液;然后用4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液(HEPES缓冲液)稀释至所需的浓度。
优选地,NaOH溶液的浓度为8~10 mM。
优选地,多肽储备溶液的浓度为1~2 mmol/L。多肽储备溶液浓度若低于1 mmol/L,不利于后面多肽的稀释,而多肽储备溶液浓度若高于2 mmol/L,由于多肽在储备溶液中的溶解度不高,多肽的有效浓度降低,造成多肽溶液浓度的不准确,最终导致对Cu2+检测的不准确。
优选地,4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液的浓度为10~50mmol/L,pH值为7.0~7.8。4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液的浓度若低于10 mmol/L,不能发挥缓冲溶液的效果,4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液的浓度若高于50 mmol/L,则会影响多肽与Cu2+的络合,影响本方法的灵敏度。而4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液pH值过高或过低都会影响多肽与Cu2+的络合,影响本方法对Cu2+的检测,并且人体的生理环境的pH值在7.4左右,样品pH值也通常处在该范围内。缓冲溶液的用量不需要严格限制。
优选地,标准检测溶液与待测样品混合以及检测过程中的温度为20~37℃。检测的温度若低于20℃,会影响多肽的溶解度,若高于37℃,则会影响多肽与Cu2+的络合。
优选地,向标准检测溶液中加入待测样品后1~2min进行荧光强度的检测。多肽与Cu2+的络合物可以迅速络合,混合时间并不需要太长,络合后尽快完成检测有助于提高检测精度。
优选地,将标准检测溶液加入到微孔板中,用酶标仪进行高通量检测。
本发明的原理是:对于由组氨酸-色氨酸-组氨酸-组氨酸-谷氨酸组成的多肽,铜离子与其中的组氨酸络合,会阻断多肽分子内电子转移,会导致色氨酸荧光淬灭,且多肽荧光的强度跟铜离子浓度成正比。检测多肽在不同Cu2+浓度下的多肽荧光光谱,绘制标准曲线,测得待测样品在多肽-Cu2+络合物溶液中的荧光强度后,即可从标准曲线上得出待测样品中的Cu2+浓度。
本发明采用的荧光光谱法可以快速、大量地检测样品,因此本发明也适用于一次检测多个样品或者对同一种样品进行多种检测,即高通量检测技术。
本发明的有益效果如下:
(1)本发明荧光探针检测灵敏度高,检出限为0.036 μmol/L,能检测浓度范围0.05~20μmol/L的样品,检测速度快,不受常见阳离子干扰,成本低,选择性好;
(2)与其他含有3个组氨酸和1个色氨酸的多肽HWHH相比,HWHHE的空间折叠能力更强,与Cu2+更加容易络合,检测效果更加稳定,此外增加的谷氨酸(E)可以有效增加多肽的水溶性,提高多肽荧光探针在水中的稳定性;
(3)本发明荧光探针在检测过程中,无需复杂且昂贵的仪器设备,分析过程简易行,耗样少,无需添加有机溶剂溶解,可用于水中Cu2+的检测,环境友好;
(4)本发明采用多肽通用的制备方法制备,步骤简单、成本低;
(5)本发明结合酶标仪,可用于高通量检测样品中Cu2+的浓度。
附图说明
图1是实施例的HWHHE的紫外光谱图。
图2是实施例的HWHHE的荧光光谱图。
图3是实施例的添加了不同浓度Cu2+的2μmol/L HWHHE探针溶液在多功能酶标仪354 nm处的标准曲线图。
图4是实施例的添加了不同常见阳离子的2μmol/L HWHHE探针溶液在354 nm处的荧光强度图。
图5是实施例的HWHHE探针溶液不同温度下在354 nm处的荧光强度图。
图6是实施例的HWHHE探针溶液在不同pH条件下在354 nm处的荧光强度图。
图7是实施例的HWHHE探针溶液在不同pH条件下加入Cu2+后在354 nm处荧光强度的变化率图。
图8是对比例的添加了不同常见阳离子的2μmol/L HHWH探针溶液在314 nm处的荧光强度图。
具体实施方式
以下结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
本发明实施例所使用的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液(HEPES缓冲液)购于Sigma-Aldrich;其它所使用的化学试剂,如无特殊说明,均通过常规商业途径获得。
实施例
本实施例含色氨酸的5肽荧光探针,由组氨酸-色氨酸-组氨酸-组氨酸-谷氨酸组成,简称为HWHHE探针,其分子结构式为:
HWHHE探针用于检测水溶液中的Cu2+浓度时,先将荧光探针配制成标准检测溶液,向标准检测溶液中加入待测样品,分别测定加入待测样品前标准检测溶液的荧光强度和加入待测样品后标准检测溶液的荧光强度(向标准检测溶液中加入待测样品后2min进行荧光强度的检测),与标准曲线进行对比,即可得到待测样品中的Cu2+含量。
所述标准检测溶液的配置方法为:将冻干的荧光探针溶解在10 mM NaOH溶液中,制备多肽储备溶液;然后用10 mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液稀释至所需的浓度。
通过多肽固相合成法合成HWHHE探针:
(1)将2-氯三苯甲基氯树脂放入反应管中,加入15 mL二氯甲烷(DCM)溶胀,振荡60min;
(2)通过沙芯抽滤掉DCM,加入 3 倍摩尔过量 Fmoc 保护的 C 端第一个氨基酸,再加入 10 倍摩尔过量的 DIEA, 最后加入 DMF溶解,振荡 30min。用甲醇封头,静置30min;
(3)去掉 DMF,加 20%哌啶 DMF 溶液(15ml/g),去掉再加 20%哌啶 DMF 溶液(15ml/g);
(4)检测:抽掉哌啶溶液,取十几粒树脂,用乙醇洗三次,加入茚三酮、KCN、苯酚溶液各一滴,105℃-110℃加热 5min,变深蓝色为阳性反应;
(5)用20 mL DMF冲洗2次,20 mL DCM冲洗2次,20 mL DMF再冲洗2次;
(6)加入 3 倍摩尔过量 Fmoc 保护氨基酸,加入3 倍摩尔过量 HBTU, 再加入 10倍摩尔过量的 DIEA,最后加入 DMF 溶解,振荡 45min;
(7)检测:取十几粒树脂,用乙醇洗三次,加入茚三酮、吡啶、苯酚溶液各一滴,105℃-110℃加热 5min,无色为阴性反应;
(8)用DMF(10ml/g)洗一次,甲醇(10ml/g)洗两次,再用DMF(10ml/g)洗两次;
(9)重复(3)~(8)的操作,从右到左依次连接序列中的氨基酸;
(10)用20 mL DMF冲洗两次,20 mL甲醇冲洗2次,20 mL DMF冲洗2次,20 mL DCM再冲洗2次,抽干10min;
(11)加200 mL 切割液【三氟乙酸(TFA) 95wt%,水1wt%,1,2-乙二硫醇(EDT)2wt%,三异丙基硅烷(TIS)2wt%】避光切割120min;
(12)抽滤得到固体后用氮气尽量吹干,用乙醚洗所得固体6次,然后常温挥发干燥,得待纯化的多肽;
(13)用高效液相色谱(HPLC)通过C18柱纯化多肽:以含0.1wt%TFA的乙氰和含0.1wt%TFA的水作为流动相,洗涤时间为20 min,流速为4.75 mL/min,产物的出峰时间为9.5 min;
(14)最后将纯化后的溶液冻干,即得到成品;
(15)鉴定:分别取少量的成品多肽,做质谱(MS)的分子量鉴定;
(16)密封避光包装白色粉末状的多肽,-20℃保存。
对HWHHE探针性能的检测
(一)HWHHE探针的光谱性质
(1)测定HWHHE紫外-可见光吸收光谱:
设置紫外光谱仪的检测条件:激发波长设置为280 nm,发射波长的范围是290 nm~450 nm。将两个空白背景溶液分别放于两个样品池中,然后单击基线以将系统调零;调零后,吸取2 mL HWHHE标准检测溶液,将其装入比色皿中,放入紫外可见分光光度计中进行检测,测得的数据为HWHHE工作液在280 nm处的吸光度。根据所测量出的在280 nm处吸光度和HDSGWEVHH中色氨酸的消光系数(Σ279 = 5400 L/(mol·cm))计算出工作液中浓度,再进一步推算出储备液中的浓度。
为了准确计算出HWHHE储备液的浓度,将储备液稀释1000倍,将稀释液放入紫外可见分光光度计中测量溶液在280 nm左右的吸光度。根据朗伯-比尔定律得出稀释液的浓度,从而计算出HWHHE储备液的浓度。HWHHE溶液在光度计下的峰如图1所示。HWHHE的最大峰值在280 nm左右,此时吸光度为0.009,根据公式:
A = Σbc = 5400 L/(mol·cm)×1cm×c
(A:吸光度;ε:色氨酸的摩尔吸光系数;b:吸收池的厚度;c:溶液的摩尔浓度)。
计算出:c = 1.48×10-6 mol/L=1.48 μmol/L ,则储备液中多肽浓度为1.48mmol/L。然后将储备液稀释成2 μmol/L 的HWHHE标准多肽工作液。
(2)测定HWHHE荧光探针光谱
设定好荧光分光光度仪的检测条件:激发波长(Exciting wavelength,Ex)设定为280nm;发射波长(Emission wavelength,Em)设置范围是290 nm~450 nm;激发波长和发射波长的狭缝均设置为10.0;电压选择500 V。
吸取2 mLHEPES缓冲液(10 mmol/L,pH7.4)装入荧光比色皿中,放入荧光仪中进行检测,测得HEPES在该实验条件下的荧光值,记录数据。
吸取2 mL HWHHE标准检测溶液,装入荧光比色皿中,放入仪器进行检测,测得多肽在该实验条件下的荧光值,记录数据。
在装有标准检测溶液的比色皿中加入2 μLCu2+(1 mmol/L),放入仪器中进行检测,测得该条件下的荧光强度并记录。
实验均重复三次,比较分析记录下的数值。
结果如图2所示,a指2 μmol/L的HWHHE;b指Cu2+浓度为1 μmol/L的多肽;c指pH=7.4的10 mmol/L的HEPES缓冲溶液;浓度为2 μmol/L的HWHHE探针溶液在354 nm处有荧光峰。通常,色氨酸的特征荧光峰约为360 nm,但是多肽中的色氨酸的峰会由于周围原子和电子的影响而发生偏移,使得该多肽的荧光峰的峰值位于354 nm。结果表明,HWHHE荧光探针自身具有较强的荧光;如图中b所示,向2 μmol/L多肽溶液中加入2 μL(1 mmol/L)的Cu2+后,溶液在354 nm处的荧光值大幅度降低,另外在310 nm处仍然有水的拉曼峰,表明Cu2+可以淬灭HWHHE的荧光。
(二)Cu2+浓度对HWHHE探针荧光强度的影响及其标准曲线
HWHHE荧光探针光谱的结果(图2)得知,Cu2+可以淬灭HWHHE的荧光,以下对Cu2+浓度对HWHHE荧光强度的进行测试,绘制Cu2+浓度-HWHHE荧光强度标准曲线。
配置Cu2+浓度不同的多肽溶液,吸取50 μL不同浓度的多肽溶液加入384孔板中在酶标仪中进行测量,设置的参数为激发波长(Exciting wavelength,Ex)为280 nm;发射波长(Emission wavelength,Em)为330 nm~450 nm;重复进行三次实验,记录酶标仪所测得的荧光值,选取合适的点进行Cu2+浓度-荧光强度的标准曲线的绘制。通过改变HWHHE的浓度测得本实施例所得HWHHE荧光探针的检测范围为0.05~20μmol/L。结果如图3所示,向多肽溶液中加入不同浓度的Cu2+来测定标准曲线。纵坐标为多肽探针的荧光强度,横坐标为标准Cu2+的浓度,测定Cu2+浓度的线性方程为:Y = -812453.30116X +922989.99611(Y为荧光强度值,X为Cu2+的浓度)。该方法得出的线性方程的相关系数(R2)为0.993。根据3倍空白标准偏差(3σ)计算该方法检测Cu2+的检出限为0.036μmol/L,同时也说明可以利用多肽荧光探针法同高通量检测技术结合来检测水中的Cu2+浓度。
(三)HWHHE探针的阳离子选择性实验
实验方法为:配制浓度为1mmol/L的各种常见的阳离子溶液,吸取2 mL多肽标准检测溶液装入荧光比色皿,放入仪器扫描并记录在354 nm处的荧光强度,向装有多肽标准检测溶液的比色皿中加入2μL(1 mmol/L)的离子溶液混合均匀,放入仪器中扫描荧光并记录在354 nm处的荧光强度。重复以上操作,每次向比色皿中添加不同的金属离子(使离子浓度最终浓度为1 μmol/L),每组实验重复三次结果如图4所示,加入除Cu2+外的其他金属离子后(Na+、Co2+、Ca2+、Ni2+、Pb2+、Ba2+、Mg2+、Cd2+、Li+、Cr3+、Fe3+、Hg2+、K+),多肽在354 nm左右的峰值略微下降,而加入Cu2+之后峰值的变化明显降低,并且引起的多肽的荧光值变化的强度最大,是其他离子的3~7倍。说明该多肽具有选择专一性,可适用于对Cu2+的识别与检测。
(四)温度对HWHHE探针稳定性的影响
实验方法为:选取的温度梯度是:25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃。吸取2 mL HWHHE标准检测溶液装入荧光比色皿,恒温水浴锅调至到25℃,将比色皿放入25℃水浴锅中孵育10 min,迅速擦干表面的水,放入荧光仪中扫描测量,记录其再354 nm处的荧光强度;将水浴锅温度调至30℃,标准检测溶液和比色皿一起水浴10 min后擦干再测量记录。以此类推,根据选取的温度梯度,每组重复三次实验。结果如图5所示,HWHHE探针在不同温度下在354nm处的荧光强度,可以看出其荧光强度随着温度的升高,荧光强度降低。由此得出荧光探针的最佳工作温度为25℃,但60℃以内都具有较大的荧光强度,本实施例其他测试中的工作温度为25℃。
(五)pH值对HWHHE探针的影响
配制相同浓度不同pH的HEPES溶液,再用不同浓度的HEPES稀释多肽储备液至2 μmol/L。吸取2 mL不同pH的多肽溶液装入荧光比色皿,测量其荧光,记录在354 nm处的荧光强度,结果如图6所示。再向比色皿中加入2 μLCu2+(1 mmol/L),测量荧光强度的变化,结果如图7所示。从图6可以看出,HWHHE荧光探针在不同pH条件下在354 nm处的荧光强度,碱性越强,探针的荧光强度越高。从图7可以看出,在酸性条件下加入Cu2+后的荧光变化情况小,表明多肽荧光探针在酸性条件下与Cu2+结合较弱,酸性条件下荧光淬灭效果不明显,灵敏度不佳,pH增大,淬灭效果越来越明显,灵敏度也升高。当pH增大到7.4和8时灵敏度达到最佳,8之后pH越大,灵敏度会随之降低。通常情况下液体酸碱值大部分为中性,因此本实施例的其他测试都使用pH值7.4的HEPES溶液,使用pH值在7.4附近的HEPES溶液也能起到较好的测试效果。
(六)不同水中Cu2+浓度的测定
实验方法为:首先测定样品本身的荧光光谱,观察样品在354nm处是否有荧光值,再向装有标准检测溶液的比色皿中加入10 μL的样品,在酶标仪上进行荧光的测量,对应标准曲线测量出样品中Cu2+的浓度。如表1所示。
表1 不同样品溶液中Cu2+浓度的测定
样品名称 | Cu2+浓度(荧光仪) | Cu2+浓度(酶标仪) |
自来水 | 1.92±0.06 mg/L | 2.13±0.08 mg/L |
饮用水 | 0.64 ±0.04 mg/L | 0.87±0.07 mg/L |
将酶标仪高通量测出来的样品中Cu2+的浓度与用荧光仪测量的对比,结果无显著性差异,说明可以利用多肽荧光探针法同高通量检测技术结合来检测水中的Cu2+浓度。参考GB-5749的规定,饮用水中铜离子含量不超过1 mg/L即合格。
对比例
本对比例制备了CN 105482808 A的实施例1中涉及的HHWH多肽,通过荧光分光光度仪测得HHWH多肽的荧光峰的峰值位于314 nm处。对HHWH多肽进行阳离子选择性实验,除了记录的是314 nm处的荧光强度之外,测试方法与对本发明HWHHE探针的阳离子选择性实验基本相同,测试结果见图7。
由图7可以看出,HHWH多肽溶液在加入Co2+、Pb2+ 、Hg2+、Cu2+后都有较大的荧光值变化,因此不适用于对单一阳离子的识别与检测。
Claims (12)
1.一种含色氨酸的5肽荧光探针的应用,其特征在于,所述含色氨酸的5肽荧光探针为组氨酸-色氨酸-组氨酸-组氨酸-谷氨酸,用于检测Cu2+浓度。
2.根据权利要求1所述的含色氨酸的5肽荧光探针的应用,其特征在于,将荧光探针配制成浓度为1~3μmol/L的标准检测溶液,向标准检测溶液中加入待测样品,分别测定加入待测样品前标准检测溶液的荧光强度和加入待测样品后标准检测溶液的荧光强度,与标准曲线进行对比,即可得到待测样品中的Cu2+含量。
3. 根据权利要求2所述的含色氨酸的5肽荧光探针的应用,其特征在于,所述待测样品与标准检测溶液的体积比1~1.5:1000;标准检测溶液的浓度为1~3 μmol/L。
4.根据权利要求2或3所述的含色氨酸的5肽荧光探针的应用,其特征在于,所述标准检测溶液的配置方法为:将冻干的荧光探针溶解在NaOH溶液中,制备多肽储备溶液;然后用4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液稀释至所需的浓度。
5. 根据权利要求4所述的含色氨酸的5肽荧光探针的应用,其特征在于,NaOH溶液的浓度为8~10 mM;多肽储备溶液的浓度为1~2 mmol/L。
6.根据权利要求4所述的含色氨酸的5肽荧光探针的应用,其特征在于,4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液的浓度为10~50mmol/L,pH值为7.0~7.8。
7.根据权利要求5所述的含色氨酸的5肽荧光探针的应用,其特征在于,4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液的浓度为10~50mmol/L,pH值为7.0~7.8。
8.根据权利要求2、3、5或6所述的含色氨酸的5肽荧光探针的应用,其特征在于,标准检测溶液与待测样品混合以及检测过程中的温度为20~37℃;向标准检测溶液中加入待测样品后1~2min进行荧光强度的检测。
9.根据权利要求4所述的含色氨酸的5肽荧光探针的应用,其特征在于,标准检测溶液与待测样品混合以及检测过程中的温度为20~37℃;向标准检测溶液中加入待测样品后1~2min进行荧光强度的检测。
10.根据权利要求2、3、5或6所述的含色氨酸的5肽荧光探针的应用,其特征在于,将标准检测溶液加入到微孔板中,用酶标仪进行高通量检测。
11.根据权利要求4所述的含色氨酸的5肽荧光探针的应用,其特征在于,将标准检测溶液加入到微孔板中,用酶标仪进行高通量检测。
12.根据权利要求8所述的含色氨酸的5肽荧光探针的应用,其特征在于,将标准检测溶液加入到微孔板中,用酶标仪进行高通量检测。
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