CN114917954A - 一种食源性类黑精螯合物纳米酶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种食源性类黑精螯合物纳米酶及其制备方法和应用，属于模拟酶和检测分析技术领域。本发明中采用食源性类黑精为原料，合成了类黑精与金属离子形成的螯合物，并确定了该螯合物具有类过氧化物酶活性，能够催化过氧化氢氧化显色底物显色。被氧化后的显色底物能被抗氧化剂还原，因此通过测定还原反应前后体系的吸光度值并计算吸光度差值，建立吸光度差值与抗氧化剂浓度之间的线性方程，测定待测样品体系的吸光度值后，根据该线性方程可以得出待测样品体系中抗氧化剂浓度，进而得出样品的总抗氧化能力。本发明中使用食源性类黑精螯合物作为过氧化物模拟酶，比HRP具有更高的催化活性，对样品总抗氧化能力的最低检测限为1.19μmol/L。
Description
技术领域
本发明属于模拟酶和检测分析技术领域，具体涉及一种食源性类黑精螯合物纳米酶，该食源性类黑精螯合物纳米酶具有过氧化物模拟酶的活性，可以作为过氧化物模拟酶应用于检测样品总抗氧化能力的方法中。
背景技术
过氧化物酶是一种以血红素为辅基，参与生物体内生理代谢的天然酶。在生命活动过程中，过氧化物酶作为一种催化剂能够催化氧化物或过氧化物氧化其它物质，特别是对H2O2具有高效的活化作用。而过氧化反应参与多种重要疾病的发病机制，会引起生物细胞、组织乃至器官损伤。过氧化物酶作为一种天然酶，因其高催化效率以及高底物特异性等特点，被广泛应用于分析领域，包括用于酶联免疫吸附试验，作为比色和电化学传感器，以及用于横向流动免疫分析等。然而，天然过氧化物酶也存在一些缺点，如易受环境恶劣的影响、操作稳定性低、成本高等。例如，以辣根过氧化物酶(HRP)为代表的天然过氧化物酶是从植物中提取得到的，HRP除了价格昂贵，容易失活以外，还因分子较大在酶联免疫分析上不利于抗原抗体结合。因此，研究和开发纳米级别的模拟酶来替代天然HRP，并提高过氧化物模拟酶催化活性的研究工作具有重要的意义。
纳米级别的模拟酶结合了纳米材料和天然酶的优点，相比于天然酶，它具有高催化活性、高稳定性、易于储存、低成本的可控合成等特点，因此，逐渐被应用于生物分析领域。而利用食源性原料制备纳米模拟酶，相比于传统的金属和金属氧化物纳米模拟酶(例如纳米金、纳米银、纳米钯等)，具有低毒性、经济以及绿色环保的优点。
类黑精是指糖类与带自由氨基的氨基酸、肽等含氮化合物之间发生美拉德反应后期形成一种棕褐色物质，是一类结构复杂、聚合度不等高分子聚合物混合体。由于近年陆续发现类黑精具有抗氧化性、抗菌、抗肿瘤、降血糖等生物活性而备受关注，但是到目前为止国内对类黑精与金属形成的螯合物的研究工作报道极少。类黑精中具有丰富的氨基、羧基等官能团，为纳米酶的表面修饰提供了可能性。因此采用简便、低成本、绿色环保的方式研究类黑精与金属形成的螯合物是否具有作为纳米模拟酶使用的价值对纳米模拟酶的研究进展具有重要意义。
发明内容
本发明制备了食源性类黑精与金属离子螯合得到的一种食源性类黑精螯合物纳米酶(也称食源性类黑精螯合物模拟酶)，旨在提供催化活性和生物安全性更高的类过氧化物模拟酶，为替代天然过氧化物酶提供更好的选择。为了实现这一目的，本发明提供了该食源性类黑精螯合物纳米酶的制备方法和具体的应用方法。
具体地，该食源性类黑精螯合物纳米酶为类黑精与Fe3+形成的螯合物，其制备方法如下：将食源性类黑精分散于水中，得到的悬浮液加入到三价铁盐的溶液中，搅拌反应体系，得到类黑精/Fe3+螯合物粗品，所述粗品用蒸馏水透析，冻干，得类黑精/Fe3+螯合物粉末，即为所述食源性类黑精螯合物纳米酶；优选的，搅拌反应体系的时间为1h，粗品用蒸馏水透析48h。
优选的，所述食源性类黑精的制备方法包括以下步骤：
S1、将豆酱加入到蒸馏水中，在室温下搅拌均匀，将得到的混悬液进行细胞破碎处理，得混悬液A；进一步优选的，每毫升蒸馏水中含0.1g豆酱；
S2、将混悬液A与无水乙醇混合得混悬液B，静置反应，离心得到液体C，将所述液体C旋蒸至体积为混悬液B体积的1％得残余物D；进一步优选的，所述混悬液A与所述无水乙醇的体积比为1:9，静置反应的时间为12h；
S3、将残余物D与蒸馏水混合均匀，透析，冻干，得所述食源性类黑精；进一步优选的，所述残余物D与蒸馏水的体积比为1:10，透析使用分子截留量为1000Da的透析袋或透析膜。
优选的，所述三价铁盐为六水合三氯化铁。
优选的，反应体系中所述食源性类黑精与所述三价铁盐的浓度比为2:1。
优选的，所述食源性类黑精为纳米类黑精。
进一步优选的，所述纳米类黑精的粒径为1～18nm；所述食源性类黑精螯合物纳米酶的粒径为1～18nm。
本发明中制备的食源性类黑精螯合物纳米酶具有过氧化物模拟酶的活性，可以作为过氧化物模拟酶使用。具体地，本发明提供了所述食源性类黑精螯合物纳米酶应用于检测样品总抗氧化能力的具体方法，该方法包括以下步骤：
K1、将缓冲液、食源性类黑精螯合物纳米酶、显色底物和双氧水混合得到混合液E，取N份体积相同的所述混合液E，分别加入不同浓度的抗氧化剂水溶液混合均匀得混合液F，将N份所述混合液F分别用所述缓冲液定容至相同体积得到N份反应体系G；所述反应体系G中所述食源性类黑精螯合物纳米酶的浓度为0.6μg/mL，所述显色底物的浓度为0.5mmol/L，H2O2的浓度为0.5mmol/L，抗氧化剂的浓度为0～100μmol/L；其中抗氧化剂浓度为0的所述反应体系G作为对照组；
K2、将步骤K1中的N份反应体系G孵育10～15min，然后测定所有反应体系G在300～800nm范围内的吸光度值，记录不同抗氧化剂浓度下的吸光度值与对照组吸光度值的差值，对吸光度差值和抗氧化剂浓度进行数据分析，建立抗氧化剂浓度x与吸光度差值Y之间的模型关系，得到检测抗氧化剂的标准曲线；
K3、按照步骤K1、K2中的方法配制抗氧化剂浓度未知的样品溶液，测定所述样品溶液在300～800nm范围内的吸光度值，将得到的吸光度值与K1中对照组的吸光度值的差值代入到步骤K2的标准曲线中，计算出抗氧化剂的浓度，转换为总抗氧化能力。
优选的，所述显色底物为3,3',5,5'-四甲基联苯胺、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐、邻苯二胺中的一种；当所述显色底物为3,3',5,5'-四甲基联苯胺时，所述标准曲线为Y＝0.00607x-0.00803(R2＝0.998)。
优选的，步骤K1中所述缓冲液为pH＝4.0的NaAc-HAc缓冲液。
优选的，所述抗氧化剂为抗坏血酸。
本发明的有益效果是：(1)本发明制备的食源性类黑精螯合物模拟酶具有优异的类过氧化物酶活性，能够高效催化H2O2生成强氧化性的超氧阴离子，降低检测时所需H2O2浓度，对H2O2的米氏常数为0.38mmol/L，远高于天然辣根过氧化物酶、MOF(Co/2Fe)酶、Cu-hemin MOF酶的催化活性；(2)将本发明制备的食源性类黑精螯合物模拟酶应用于检测样品总抗氧化能力的方法中，对抗坏血酸的检测范围为0～100μmol/L，最低检测限为1.19μmol/L；(3)以食源性类黑精为原料合成纳米模拟酶，相比于现有技术中的其他模拟酶具有更好的生物安全性和稳定性。
附图说明
图1为本发明中食源性类黑精螯合物作为过氧化物模拟酶应用于样品总抗氧化能力检测方法中的反应原理和过程；
图2为TEM图，其中a图为本发明制备的食源性类黑精的TEM图，b图为本发明制备的食源性类黑精螯合物的TEM图；
图3为本发明制备的食源性类黑精和类黑精螯合物的FTIR图；
图4为本发明制备的食源性类黑精螯合物催化过氧化氢氧化TMB后的吸光度图；
图5为本发明制备的食源性类黑精螯合物催化过氧化氢氧化不同显色底物后的吸光度图；
图6为验证食源性类黑精螯合物催化过氧化氢产生活性氧的种类的结果图；
图7为食源性类黑精螯合物作为过氧化物模拟酶时稳态动力学研究结果图，a图为食源性类黑精螯合物对TMB的稳态动力学研究结果图，b图为食源性类黑精螯合物对H2O2的稳态动力学研究结果图；
图8为食源性类黑精螯合物用于检测抗坏血酸的结果图，a图为食源性类黑精螯合物模拟酶、TMB、过氧化氢反应体系在不同浓度抗坏血酸存在下的紫外可见吸收曲线图；b图为抗坏血酸浓度与反应体系中吸光度值变化量之间的线性关系图；
图9为食源性类黑精螯合物模拟酶抗干扰检测结果图；
图10为按照本发明中的检测总抗氧化能力的方法检测不同样品的总抗氧化能力的结果图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发明所保护的范围。本领域技术人员依据以下实施方式所作的任何等效变换或替代，均属于本发明的保护范围之内。
实施例
1、类黑精螯合物的合成
1-1、纳米类黑精的提取
室温下，将1g豆酱加入10mL蒸馏水中，搅拌30min，将得到的混悬液置于细胞破碎仪中在290～300W功率下破碎30min，得到混悬液A；取10mL混悬液A用90mL无水乙醇稀释得到混悬液B，混悬液B在静置状态下反应12h后在8000rpm速度下离心10min，将得到的液体C旋蒸至体积减少到1mL得到残余物D；向残余物D中加入10mL蒸馏水中，混合均匀，用1000Da的透析膜对蒸馏水透析48h，以去除水溶性杂质，然后将得到的悬浮液于-80℃冻干得到类黑精粉末。如图2中a图所示，将得到的类黑精粉末用透射电子显微镜(TEM)分析，可以观察到类黑精粒子形态特征为粒径在1～18nm范围的纳米颗粒，平均粒径为8nm。
1-2、类黑精螯合物的合成
室温下，取0.5mL 40mg/mL的类黑精(MW＝1000Da)悬浮液加入到0.5mL 20mg/mL的FeCl3·6H2O溶液中，搅拌1h，得到类黑精/Fe3+螯合物粗品；将该粗品用蒸馏水透析48h，于-80℃冻干，得到类黑精/Fe3+螯合物粉末。在透射电子显微镜(TEM)下可以观察到类黑精螯合物粒子形态特征为粒径在1～18nm范围的纳米颗粒，平均粒径为8.5nm(如图2中b图所示)；傅里叶变换红外光谱表明Fe3+与类黑精螯合配位形成了Fe-O键(如图3所示)。
2、测定类黑精螯合物作为过氧化物模拟酶的活性
对照组1：室温下，取10μL 12μg/mL类黑精螯合物悬浮液、5μL 20mmol/L显色底物加入到185μL的NaAc-Hac缓冲液(pH＝4.0，20mmol/L)中，混合均匀，反应15min，然后测量反应体系的吸光度值；
对照组2：室温下，取5μL 20mmol/L显色底物、10μL 10mmol/L H2O2加入到185μL的NaAc-Hac缓冲液(pH＝4.0，20mmol/L)中，混合均匀，反应15min，然后测量反应体系的吸光度值；
实验组：室温下，取10μL 12μg/mL类黑精螯合物悬浮液、5μL 20mmol/L显色底物、10μL 10mmol/L H2O2加入到175μL的NaAc-Hac缓冲液(pH＝4.0，20mmol/L)中，混合均匀，反应15min，然后测量反应体系的吸光度值；结果如图4所示；
上述对照组1、对照组2、实验组中的显色底物均为TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)；按照实验组的方法将显色底物替换成ABTS(2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)和OPD(邻苯二胺)进行同样的实验；吸光度值测定结果如图5所示。
从图4中可以看出，只有实验组的反应体系在652nm处具有吸收峰，对照组1和对照组2在652nm处均无特征吸收峰；这说明只有实验组中的TMB被氧化从而在652nm处产生了吸收峰，并且在孵育反应的过程中，肉眼也能看见实验组的反应体系变成蓝色；进一步说明类黑精螯合物能够催化过氧化氢产生活性氧氧化TMB使其产生变色反应。从图5中可以看出，类黑精螯合物/H2O2/TMB反应体系、类黑精螯合物/H2O2/ABTS反应体系、类黑精螯合物/H2O2/OPD反应体系的吸收峰分别位于652nm、415nm和447nm处，说明本发明制备的类黑精螯合物催化过氧化氢反应的过程中除了可以使用TMB作为显色底物，还可以使用ABTS、OPD作为显色底物。
3、类黑精螯合物具有过氧化物模拟酶活性的机理研究
分别使用异丙醇、叔丁醇、叠氮化钠和对苯醌作为羟基自由基(·OH)、羟基自由基(·OH)、单态氧(1O2)和超氧阴离子(O2·-)的清除剂，测定类黑精螯合物作为模拟酶催化过氧化氢产生的活性氧的种类。
实验组：取10μL 12μg/mL的类黑精螯合物悬浮液、10μL 10mmol/L H2O2、5μL20mmol/L TMB、15μL清除剂加入到160μL的NaAc-Hac缓冲液(pH＝4.0，20mmol/L)中，混合均匀，孵育15min，测定反应体系在652nm处的吸光度值；
空白组：取10μL 12μg/mL的类黑精螯合物悬浮液、10μL 10mmol/L H2O2、5μL20mmol/L TMB加入到175μL的NaAc-Hac缓冲液(pH＝4.0，20mmol/L)中，混合均匀，孵育15min，测定反应体系在652nm处的吸光度值；
实验组和空白组的吸光度值测定结果如图6所示，从图6中可以看出，在加入对苯醌作为O2·-清除剂时，类黑精螯合物催化H2O2氧化TMB的能力减弱程度最大(吸光度值变化量最大)，异丙醇、叔丁醇、叠氮化钠的加入并未有效抑制类黑精螯合物催化H2O2对TMB的氧化效果，这说明在催化过程中产生的有效活性氧为O2·-。
4、类黑精螯合物模拟酶(或称类黑精螯合物纳米酶)的稳态动力学研究
室温下，分别取10份10μL 12μg/mL类黑精螯合物悬浮液、10份10μL 10mmol/L H2O2加入到10份NaAc-Hac缓冲液(pH＝4.0，20mmol/L)中，再向每份混合液中加入不同体积的浓度为20mmol/L的TMB，混合均匀，使每份反应体系的总体积为200μL，10份反应体系中的TMB浓度依次为0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L、0.6mmol/L、0.7mmol/L、0.8mmol/L、0.9mmol/L、1.0mmol/L；所有反应体系均孵育15min，然后测量每份反应体系在652nm处的吸光度值；
室温下，分别取8份10μL 12μg/mL类黑精螯合物悬浮液、8份5μL 20mmol/L的TMB加入到8份NaAc-Hac缓冲液(pH＝4.0，20mmol/L)中，再向每份混合液中加入不同体积的浓度为10mmol/L的H2O2，混合均匀，使每份反应体系的总体积为200μL，8份反应体系中的H2O2浓度依次为0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L、0.6mmol/L、0.7mmol/L、0.8mmol/L；所有反应体系均孵育15min，然后测量每份反应体系在652nm处的吸光度值；
将上述两组实验所得数据拟合到米夏埃利斯-门滕方程(Michaelis-Mentenequation)图，如图7中a、b图所示，计算表观酶动力学参数如米氏常数(Km)和最大反应速度(Vmax)：
式中，V0表示初始反应速度，mmol/(L·s)；Vmax表示最大反应速度，mmol/(L·s)；[S]为底物浓度，mmol/L；Km表示米氏常数，mmol/L；
根据上述公式计算出的类黑精螯合物模拟酶对TMB和H2O2的Km值分别为0.10mmo/L和0.38mmol/L，远低于HRP(辣根过氧化物酶)对H2O2的Km 3.702mmol/L，也远低于MOF(Co/2Fe)模拟酶对H2O2的Km 4.22mmol/L，还低于Cu–hemin MOFs模拟酶对H2O2的Km 2.18mmol/L。这表明类黑精螯合物模拟酶具有比HRP、MOF(Co/2Fe)、Cu–hemin MOFs都更优异的类过氧化物酶活性。
5、类黑精螯合物作为过氧化物模拟酶在检测总抗氧化能力方法中的应用
如图1所示，本发明中类黑精螯合物能催化过氧化氢氧化显色底物(例如TMB)，被氧化后的显色底物能被抗坏血酸还原，利用该原理可以测定样品的总抗氧化能力，本发明中测定样品的总抗氧化能力的方法包括如下步骤：
K1、向醋酸钠-醋酸缓冲液(pH＝4.0)中加入10μL 12μg/mL的类黑精螯合物悬浮液、5μL浓度为20mmol/L的TMB溶液、10μL浓度为10mmol/L的H2O2，混合均匀；相同的缓冲液体系配制11份，每份中分别加入抗坏血酸溶液，用醋酸钠-醋酸缓冲液(pH＝4.0)定容至200μL，使得最终的缓冲液体系中抗坏血酸的浓度依次为0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L、50μmol/L、60μmol/L、70μmol/L、80μmol/L、90μmol/L、100μmol/L，其中不加抗坏血酸的缓冲液体系作为对照组(如图8中a图所示)；
K2、将步骤K1中11份缓冲液体系均在室温下孵育10min，测定在652nm处的吸光度值，记录不同抗坏血酸浓度下的吸光度值与对照组吸光度值的差值，对吸光度差值和抗坏血酸浓度进行数据分析，建立抗坏血酸浓度x与吸光度差值Y之间的模型关系，得到检测抗氧化剂的标准曲线为Y＝0.00607x-0.00803(R2＝0.998)(如图8中b图所示)；
通过计算标准差(SD)和线性图的斜率(K)，计算结果符合检测限(LOD)＝3*SD/K的公式。从图8中b图可以看出，当抗坏血酸浓度在10～100μmol/L范围内时，反应体系在652nm处的吸光度值变化量与抗坏血酸浓度之间呈现出良好的线性关系；根据(LOD)＝3*SD/K可以计算出，上述方法极限检测值(LOD)为1.19μmol/L；
K3、取水溶C饮料、美汁源橙汁饮料、猕猴桃、橙子、第一种维生素C片、第二种维生素C片作为待测样品进行总抗氧化能力(TAC)检测；将猕猴桃、橙子分别榨汁得到猕猴桃汁和橙汁；将待测样品稀释后，按照步骤K1的方法配制待测样品的样品溶液，检测样品溶液的吸光度值，若不在652nm处，则继续稀释待测样品，直到配制的样品溶液在652nm处有吸收峰；将样品溶液在652nm处的吸光度值与对照组吸光度值的差值代入到步骤K2的标准曲线中，计算出样品溶液中抗坏血酸的浓度，转换成抗坏血酸(AA)的毫摩尔当量；然后通过吸光度转化率乘以待测样品的稀释倍数，得到待测样品的总抗氧化能力值，以AA/L为单位表示样品中TAC值。结果如图10中a、b图所示，a图中表示按照本发明中的方法测定的两种维生素C片中抗坏血酸的含量分别与它们的说明书中标示的含量一致，说明按照本发明中的方法检测抗坏血酸的结果是准确可靠的；b图表示根据本发明的方法测出的水溶C饮料、美汁源橙汁饮料、猕猴桃汁、橙汁的总抗氧化能力结果。
实验中所用的水溶C饮料、美汁源橙汁饮料、猕猴桃、橙子均为常见市售产品；第一维生素C片为秦虹牌维生素C片，第二维生素C片为汤臣倍健牌维生素C片。
6、类黑精螯合物模拟酶的抗干扰性检测
取10μL 12μg/mL的类黑精螯合物悬浮液、10μL 10mmol/L H2O2、5μL 20mmol/L TMB加入到NaAc-Hac缓冲液(pH＝4.0，20mmol/L)中，再加入被检测物质，用NaAc-Hac缓冲液(pH＝4.0，20mmol/L)定容至200μL；按照此方法分别配制被检测物质为Na+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、K+、丙氨酸、酪氨酸、脯氨酸、苏氨酸、谷氨酸、蔗糖、组氨酸、精氨酸、淀粉、果糖、抗坏血酸的反应体系；其中，抗坏血酸的终浓度为0.1mmol/L，其他被检测物质的终浓度均为2mmol/L；以不加任何被检测物质的反应体系作为空白对照；将所有反应体系均在室温下孵育15min，测定每个反应体系在652nm处的吸光度值；结果如图9所示。从图9中可以看出，只有抗坏血酸对反应体系的吸光度值影响程度最大，其他被检测物质对反应体系吸光度值的影响可以忽略不计，说明样品中Na+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、K+、丙氨酸、酪氨酸、脯氨酸、苏氨酸、谷氨酸、蔗糖、组氨酸、精氨酸、淀粉、果糖等物质的存在对抗坏血酸的检测的干扰性可以忽略不计，因此，本发明提供的方法可以用于以抗坏血酸为主要抗氧化剂的样品的总抗氧化能力的检测。
综上所述，本发明中制备的类黑精螯合物具有类过氧化物酶的活性，可以作为过氧化物模拟酶(或称过氧化物纳米酶)催化过氧化氢产生活性氧O2·-氧化显色底物；而抗坏血酸能将被氧化的显色底物还原使得反应体系的吸光度值发生变化(反应过程如图1所示)。本发明建立了反应体系吸光度值变化量与抗坏血酸浓度之间的线性关系，通过检测待测样品中抗坏血酸浓度，转换成抗坏血酸的毫摩尔当量，可以得出样品的总抗氧化能力值。因此，类黑精螯合物可以作为过氧化物模拟酶应用于检测样品总抗氧化能力的方法中。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明的保护范围。对于任何熟悉本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。任何依据本发明申请保护范围及说明书内容所作的简单的等效变化和修饰，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种食源性类黑精螯合物纳米酶，其特征在于，所述纳米酶含类黑精螯合物。
2.权利要求1所述的食源性类黑精螯合物纳米酶的制备方法，其特征在于，将食源性类黑精分散于水中，得到的悬浮液加入到三价铁盐的溶液中，搅拌反应体系得到类黑精/Fe3+螯合物粗品，所述粗品用蒸馏水透析，冻干，得类黑精/Fe3+螯合物粉末，即为所述食源性类黑精螯合物纳米酶。
3.根据权利要求2所述的食源性类黑精螯合物纳米酶的制备方法，其特征在于，所述食源性类黑精的制备方法包括以下步骤：
S1、将豆酱加入到蒸馏水中，在室温下搅拌均匀，将得到的混悬液进行细胞破碎处理，得混悬液A；
S2、将混悬液A与无水乙醇混合得混悬液B，静置反应，离心得到液体C，将所述液体C旋蒸至体积为混悬液B体积的1％得残余物D；
S3、将残余物D与蒸馏水混合均匀，透析，冻干，得所述食源性类黑精。
4.根据权利要求2所述的食源性类黑精螯合物纳米酶的制备方法，其特征在于，所述三价铁盐为六水合三氯化铁。
5.根据权利要求2所述的食源性类黑精螯合物纳米酶的制备方法，其特征在于，反应体系中所述食源性类黑精与所述三价铁盐的浓度比为2:1。
6.根据权利要求2～5任一项所述的食源性类黑精螯合物纳米酶的制备方法，其特征在于，所述食源性类黑精为粒径1～18nm的纳米类黑精；所述食源性类黑精螯合物纳米酶的粒径为1～18nm。
7.权利要求1所述的食源性类黑精螯合物纳米酶作为过氧化物模拟酶的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将所述食源性类黑精螯合物纳米酶应用于检测样品总抗氧化能力的方法中，具体包括以下步骤：
K1、将缓冲液、食源性类黑精螯合物纳米酶、显色底物和双氧水混合得到混合液E，取N份体积相同的所述混合液E，分别加入不同浓度的抗氧化剂水溶液混合均匀得混合液F，将N份所述混合液F分别用所述缓冲液定容至相同体积得到N份反应体系G；所述反应体系G中所述食源性类黑精螯合物纳米酶的浓度为0.6μg/mL，所述显色底物的浓度为0.5mmol/L，H2O2的浓度为0.5mmol/L，抗氧化剂的浓度为0～100μmol/L；其中抗氧化剂浓度为0的所述反应体系G作为对照组；
K2、将步骤K1中的N份反应体系G孵育10～15min，然后测定所有反应体系G在300～800nm范围内的吸光度值，记录不同抗氧化剂浓度下的吸光度值与对照组吸光度值的差值，对吸光度差值和抗氧化剂浓度进行数据分析，建立抗氧化剂浓度x与吸光度差值Y之间的模型关系，得到检测抗氧化剂的标准曲线；
K3、按照步骤K1、K2中的方法配制抗氧化剂浓度未知的样品溶液，测定所述样品溶液在300～800nm范围内的吸光度值，将得到的吸光度值与K1中对照组的吸光度值的差值代入到步骤K2的标准曲线中，计算出抗氧化剂的浓度，转换为总抗氧化能力。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述显色底物为3,3',5,5'-四甲基联苯胺、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐、邻苯二胺中的一种；当所述显色底物为3,3',5,5'-四甲基联苯胺时，所述标准曲线为Y＝0.00607x-0.00803。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤K1中所述缓冲液为pH＝4.0的NaAc-HAc缓冲液。
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