CN114903887B - 卤化ⅱ型聚酮类抗生素在增强免疫力中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了卤化Ⅱ型聚酮类抗生素在增强免疫力的应用，卤化Ⅱ型聚酮类抗生素为zunyimycinC，从细胞水平看，使用zunyimycin C时，能在一定的浓度范围内刺激Jurkat细胞、Raji细胞以及巨噬细胞3种免疫细胞增殖，从而抑制增强免疫力。

Description

卤化Ⅱ型聚酮类抗生素在增强免疫力中的应用

技术领域

本发明属于基因生物医药领域，具体涉及卤化Ⅱ型聚酮类抗生素在增强免疫力中的应用。

背景技术

机体自身的免疫力与各种疾病的发生和发展有着及大的关系。机体免疫力的变化影响着体内一些细胞因子的水平，而细胞因子水平的变化也反应着机体免疫能力的高低。除此以外，机体免疫功能也受到肠道内短链脂肪酸(Short-chain fatty acids，SCFAs)的调节作用，它们可以改变免疫细胞基因的表达和分化，增殖和凋亡，调节所有类型免疫细胞的功能。所以，需要进一步研究药物用以增强机体的免疫力，zunyimycinC抗生素对增强机体免疫力显示了较好的作用，值得进一步开发，有可能为增强免疫力治疗药物的研发指明方向，给免疫力低下的患者带来希望。

发明内容

本发明的目的是提供卤化Ⅱ型聚酮类抗生素在增强免疫力中的应用，对增强机体免疫力有显著的效果。

本发明所采用的技术方案是，卤化Ⅱ型聚酮类抗生素在增强免疫力中的应用。

本发明的其他特征还在于，卤化Ⅱ型聚酮类抗生素为zunyimycinC。

本发明的有益效果为，通过将卤化Ⅱ型聚酮类抗生素zunyimycinC用于临床治疗机体免疫力低下患者，可以增强机体免疫力，为增强机体免疫力的临床研究提供了非常高的研究价值。

附图说明

图1为卤化Ⅱ型聚酮类抗生素zunyimycinC对Jurkat细胞增殖影响对比图；

图2为卤化Ⅱ型聚酮类抗生素zunyimycinC对Raji细胞株增殖作用的影响对比图；

图3为卤化Ⅱ型聚酮类抗生素zunyimycinC对Raw264.7细胞株增殖作用的影响对比图；

图4为卤化Ⅱ型聚酮类抗生素zunyimycinC处理组小鼠脏器指数的影响对比图；

图5为卤化Ⅱ型聚酮类抗生素zunyimycinC对溶血素含量的影响对比图；

图6为卤化Ⅱ型聚酮类抗生素zunyimycinC对小鼠血清细胞因子含量的影响对比图；

图7为卤化Ⅱ型聚酮类抗生素zunyimycinC对小鼠肠道短链脂肪酸含量变化影响对比图。

具体实施方式

本发明基于卤化Ⅱ型聚酮类抗生素对增强免疫力效应的分析，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

细胞因子水平的变化反应机体免疫能力的高低，从细胞水平看，使用zunyimycinC时，能在一定的浓度范围内刺激Jurkat细胞、Raji细胞以及巨噬细胞3种免疫细胞增殖，在小鼠体内时，对于胸腺和脾脏两种免疫器官来说，zunyimycin C组与CTX组相比，在一定程度上提高了胸腺指数和脾脏指数，且效果显著，同时小鼠体内的IL-2、IL-6、IFN-γ水平相比较CTX组来说也都有所恢复，说明zunyimycin C在一定程度上刺激免疫细胞产生IL-2、IL-6、IFN-γ，zunyimycin C对TNF-α水平的恢复没有作用，说明zunyimycin C增强免疫不是依靠TNF-α。

为了更好的理解本发明的实质，下面将用卤化Ⅱ型聚酮类抗生素zunyimycinC的药理实验来说明其在增强免疫力的应用。

(1)、细胞复苏：将3种细胞株的冻存管从-80℃冰箱取出后，立即放入37℃水浴锅快速晃动1-2min迅速溶解，然后转移到已消毒的超净工作台中；用移液枪将冻存管中的细胞转移到离心管中，1000rmp离心5min，离心后，弃去上清，加1ml完全培养基重悬细胞沉淀；将重悬后的细胞悬液接种至装有细胞培养液的细胞培养瓶中，然后置于含5％CO2的细胞培养箱中，37℃培养。

(2)、细胞传代：待RAW264.7细胞生长密度覆盖培养瓶底面积的80％-90％时进行细胞传代；弃去原有培养基，加入PBS轻轻漂洗3次并弃去；加入1000μL胰蛋白酶轻轻摇晃，放入细胞培养箱3～5min，在显微镜下观察细胞形态变圆时，加入新鲜完全培养基终止消化；用移液枪将培养瓶壁上的细胞吹打下来转移至离心管中1000rpm离心5min弃去上清，加入1ml完全培养基重悬细胞沉淀，分装到两个培养瓶；T细胞和B细胞是悬浮细胞，省去胰酶消化，其余操作同RAW264.7相同。

(3)、细胞冻存：取生长状态良好的细胞制备成细胞悬液，离心洗涤后加入含10％DMSO的冻存液重悬，移入细胞冻存管；将冻存管放入含有异丙醇的冻存盒后，转入-80℃冰箱冻存细胞。

(4)、细胞计数：取生长状态良好且处于对数期的细胞RAW264.7巨噬细胞，PBS轻轻漂洗三次，用胰酶消化后进行细胞计数；显微镜下观察细胞计数板四角四个大方格细胞数，细胞总数按如下公式：

细胞个数(个/ml)＝4个大方格内细胞数(N)/4×104×稀释倍数。

(5)、检测药物对免疫细胞增殖率的影响(CCK-8法)：经过预实验，确定RAW264.7巨噬细胞接种4000个/孔，Raji细胞和Jurkat细胞接种10000个/孔；将3种细胞株分别计数后接种于96孔板，5％CO2，37℃于培养箱培养24h；称取少量的zunyimycin C用DMSO溶解，然后用完全培养稀释为1600μg/ml的母液；用完全培养基将黄酮母液稀释为100，50，25，12.5，6.25，3.125μg/ml溶液；用完全培养基稀释将zunyimycin C稀释为20，10，5，2.5，1.25，0.625μM，zunyimycin C和黄酮组设置相对应的溶剂对照；细胞在培养箱中培养24h以后，加入各不同浓度的药物100μL，RAW264.7巨噬细胞于培养箱继续培养48h，其余两种细胞于培养箱培养72h后，测定每孔OD450吸光度值。(每个浓度设置6个复孔)

细胞增殖率(％)＝(OD药物-OD空白)-(OD阴性对照-OD空白)/(OD阴性对照-OD空白)×100％

通过CCK-8试剂盒检测药物联用与药物单独使用对细胞增殖影响，确定各药物或药物组合最佳作用浓度。

(6)、台盼蓝法检测RAW264.7巨噬细胞吞噬能力配置：0.4％，0.04％，0.01％，0.004％台盼蓝溶液以待使用；将巨噬细胞细胞计数后4000个/孔铺板(每孔100μL)，培养箱培养48h；弃培养液，加入100μL配置好的各浓度的台盼蓝溶液，5％CO2，37℃于培养箱中孵育15min后，去掉台盼蓝溶液，每孔用200μLPBS轻轻漂洗三次，弃掉PBS，每孔加100μL细胞裂解液裂解2h，在450nm，490nm，540nm处测OD值。筛选出区别明显的OD值进行检测；将巨噬细胞细胞计数后4000个/孔铺板(每孔100μL)，培养箱培养24h后，阳性对照加LPS，实验组加筛选出的最佳浓度的zunyimycinC(每孔100μL)，阴性对照组加细胞培养液100μL，加入zunyimycinC后继续培养48h；弃培养液，加入100μL台盼蓝溶液，在培养箱中孵育15min后，去掉台盼蓝溶液，每孔用200μLPBS洗净，洗3次，弃掉PBS，每孔加100μL细胞裂解液裂解2h，在540nm处测OD值。吞噬率P＝(A药物-A阴性)/(A阴性-A空白)×100％

(7)、zunyimycinC对体外T淋巴细胞分泌淋巴因子的影响：将Jurkat细胞计数后10000个/孔铺板(每孔100μL)，培养箱培养24h后，阳性对照组加入LPS(2.5mg/ml)，实验组加入zunyimycinC的最佳浓度，加入zunyimycinC后继续培养箱培养72h；收集细胞培养液液于1.5mlEP管，4℃条件下1000rmp离心10min，离心后将上清等量分装。24h内检测可放置4℃冰箱保存；将ELISA试剂盒从冰箱取出后，室温放0.5h；计算需要的洗涤液体积，用超纯水将浓缩洗涤液稀释20倍以待使用；取出标准品和标准品稀释液，用1ml品稀释液溶解标品，其浓度为1000pg/ml，然后按照500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8、0pg/ml进行稀释；取出酶标板，用配置好的洗涤液洗板三次并甩干；加入100μL标准品及细胞上清于反应孔，用封板胶纸封板后，于37℃培养箱中孵育90min；孵育完成后，取出酶标板，洗板4次并拍干，用抗体稀释液将浓缩生物素化抗体稀释100倍，0.5h内加入各反应孔中，每孔100μL，封板胶纸封板后，于37℃培养箱中孵育60min；孵育完成后，取出酶标板，洗板4次并拍干，用酶结合物稀释液将浓缩酶结合物稀释100倍，0.5h内加入各反应孔中，每孔100μL，封板胶纸封板后，于37℃培养箱中孵育30min；孵育完成后，取出酶标板，洗板5次并拍干，每孔加入100μL显色液，封板胶纸封板后，于37℃培养箱中避光孵育15min；孵育完后，每孔加入50μL终止液，5min内测定OD450。

(8)、zunyimycinC对体外RAW264.7巨噬细胞分泌淋巴因子的影响：将RAW264.7巨噬细胞计数后10000个/孔铺板(每孔100μL)，培养箱培养24h后，阳性对照组加入LPS(2.5mg/ml)，实验组加入zunyimycinC的最佳浓度，加入zunyimycinC后继续培养箱培养72h；收集细胞培养液液于1.5mlEP管，4℃条件下1000rmp离心10min，离心后将上清等量分装。24h内检测可放置4℃冰箱保存；将ELISA试剂盒从冰箱取出后，室温放0.5h；计算需要的洗涤液体积，用超纯水将浓缩洗涤液稀释20倍以待使用；取出标准品和标准品稀释液，用1ml标品稀释液溶解标品，其浓度为1000pg/ml，然后按照500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8、0pg/ml进行稀释；取出酶标板，用配置好的洗涤液洗板三次并甩干；加入100μL标准品及细胞上清于反应孔，用封板胶纸封板后，于37℃培养箱中孵育90min；孵育完成后，取出酶标板，洗板4次并拍干，用抗体稀释液将浓缩生物素化抗体稀释100倍，0.5h内加入各反应孔中，每孔100μL，封板胶纸封板后，于37℃培养箱中孵育60min；孵育完成后，取出酶标板，洗板4次并拍干，用酶结合物稀释液将浓缩酶结合物稀释100倍，0.5h内加入各反应孔中，每孔100μL，封板胶纸封板后，于37℃培养箱中孵育30min；孵育完成后，取出酶标板，洗板5次并拍干，每孔加入100μL显色液，封板胶纸封板后，于37℃培养箱中避光孵育15min；孵育完后，每孔加入50μL终止液，5min内测定OD450。

(9)、zunyimycin C对免疫低下小鼠免疫功能的影响：体重18-22g昆明小鼠13只，在实验室条件下适应性喂养1W后，剔除体重偏高或者偏低的4只小鼠，其余的21只小鼠随机分成7组，每组3只，即正常组(KB)，模型组(CTX)，zunyimycin C(4.8)组；动物处理，表1为小鼠造模及灌胃处理，除KB组注射生理盐水(NS)外，其余两组小鼠均腹腔注射CTX(100mg/kg)，每日1次，连续3d，第4d所有小鼠均腹腔注射0.2ml6％鸡红细胞，同时除了KB组和CTX组外，其余实验组小鼠开始分别灌胃给药，每日1次，连续15d。KB组和CTX组灌胃生理盐水，连续15d。15d后，各组小鼠眼眶取血后处死，进行脏器重量比值测定，血清溶血素实验以及测定血清中各细胞因子变化；脏器指数测定，各组小鼠末次给药以后禁食不禁水12h，称重以后，眼眶取血，然后脱臼处死小鼠，取出心、肝、脾、肺、肾、胸腺，擦干血迹以后，用电子天平称量各脏器重量，计算脏器指数，按下面公式计算：

各脏器指数＝脏器重量(g)/体重(g)

第4d小鼠均腹腔注射0.2ml 6％鸡红细胞致敏，给药结束眼眶取血于抗凝管，室温静置1h后，4℃、2000rmp离心20min，取50μL上清于EP管，再加入6％CRBC和10％豚鼠血清各250μL，37℃温箱孵育1h，孵育完成以后，于冰上15min终止反应，然后4℃、2000rmp离心20min，取上清200μL于96孔板，于540nm测OD值，统计数据见表1；

表1数据统计表

(10)、小鼠血清IL-2，IL-6，IFN-γ，TNF-α的测定：检测原理：采用了双抗体夹心法的酶联免疫吸附检测技术。将小鼠的单克隆抗体包被在酶标板上以后，再加入各样品溶液，使样品溶液中的各因子会与酶标板上已包被的抗体充分结合。充分洗板以后再加生物素化抗体，该抗体可以与酶标板中包被抗体捕获的样本中各因子发生特异性结合；再次充分洗板以后加入辣根过氧化酶(HRP)标记的链霉亲和素，此时链霉亲和素和生物素会发生高强度的非共价结合，再次充分洗板后加入显色剂底物TMB，若反应孔中存在不同浓度的细胞因子，则会变为不同程度的蓝色物质，加入终止液后，孔中变为黄色，然后测OD450，反应孔中细胞因子浓度与OD值成正比，根据绘制出的标准曲线便可计算出相对应的细胞因子浓度。血清样本的收集，小鼠眼眶取血于抗凝管后，室温静置1h，在4℃条件下1000rmp离心10min，然后将上清等量分装，若24h内检测则放入4℃冰箱保存，若超过24h则放入-20℃冰箱保存；其余检测步骤均按说明书进行。

(11)、小鼠粪便不饱和脂肪酸含量检测：小鼠处理，体重18～22g昆明小鼠13只，在实验室条件下适应性喂养1W后，剔除体重偏离小鼠，剩余小鼠随机分成3组，每组3只，即正常组(KB)，模型组(CTX)和zunyiminy C组。除KB组注射生理盐水(NS)外，其余各小鼠均腹腔注射CTX(100mg/kg)，每日1次，连续3d，构建免疫低下小鼠模型。第4d开始，KB组和CTX组灌胃生理盐水，其余各组小鼠分别灌胃给药，每日1次，连续15d。15d后，牵拉小鼠尾巴使小鼠自主排粪，以无菌离心管收集粪便，-80℃冻存，干冰运输。小鼠粪便短链脂肪酸测定，粪便短链脂肪酸测定委托上海鹿鸣生物技术公司测定，采取液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)检测技术，基本技术流程包括：样品预处理(研磨、提纯、富集、纯化)，UPLC分离，MS/MS检测，MRM检测及数据分析等步骤。检测短链脂肪酸主要有乙酸(Acetic acid)、丙酸(propionicacid)、异丁酸(isobutyric acid)、丁酸(butyric acid)、异戊酸(Isovaleric acid)、戊酸(Pentanoic acid)、正己酸(Hexanoic acid)等7种。

(12)、小鼠粪便肠道菌群多样性检测：菌群多样性分析由上海欧易生物医学科技有限公司进行。通过高通量程序，分析粪便样品中16s rRNA的V3V4可变区核酸序列差异，通过相应的生物信息学软件分析各组小鼠粪便肠道菌群的多样性。

如图1所示，zunyimycin C对T淋巴细胞增殖能力的影响。NC为阴性对照组，LPS为阳性对照；*代表药物组与阴性对照组或DMSO组相比差异显著(P＜0.05)，**代表药物组与阴性对照组或DMSO组相比差异显著(P＜0.01)，***代表药物组与阴性对照组或DMSO组相比差异显著(P＜0.001)，****代表药物组与阴性对照组或DMSO组相比差异显著(P＜0.0001)，ns代表无统计学意义。zunyimycin C对Jurkat细胞的增殖也有刺激作用，在浓度为2.5μg/ml时，该药物对Jurkat细胞的刺激作用较强，增殖率为35.65％，与阴性对照组相比与统计学意义(P<0.05)。

如图2所示，zunyimycinC对B淋巴细胞增殖能力的影响。zunyimycin C对Raji细胞株的增殖也有刺激作用，在浓度为5μg/ml时，该药物对Jurkat细胞的刺激作用较强，细胞增殖率为92.29％，与阴性对照组相比有统计学意义(P<0.0001)，当浓度继续增大时，同样细胞增值率下降，甚至抑制了细胞增殖，对细胞也有毒副作用，与阴性对照组相比有统计学意义(P<0.05)。

如图3所示，zunyimycin C对巨噬细胞增殖能力的影响。zunyimycin C对Raw264.7细胞株的增殖也有明显的刺激作用，在浓度为5μg/ml时，该药物对Raw264.7细胞株的刺激作用最强，Raw264.7细胞株增殖率为211.65％，与阴性对照组相比有统计学意义(P<0.0001)。

如图4所示，图4中分别为受试小鼠的胸腺指数、脾脏指数、心脏指数、肝脏指数、肺指数和肾脏指数。其中A为胸腺指数；B为脾脏指数；C为心脏指数；D为肝脏指数；E为肺指数；F为肾脏指数；*代表zunyimycinC组与CTX组比差异显著(P＜0.05)，**代表zunyimycinC组与CTX组相比差异显著(P＜0.01)，***代表zunyimycinC组与CTX组相比差异显著(P＜0.001)，****代表zunyimycinC组与CTX组相相比差异显著(P＜0.0001)。CTX组与KB组相比，胸腺指数和脾脏指数显著降低，有统计学意义(P<0.01)，CTX组与KB组相比，胸腺和脾脏明显萎缩，说明小鼠造模成功。心脏指数，肾脏指数、肝脏指数和肺指数，CTX组与KB组相比，其差异无统计学意义，而各给药组脏器指数与CTX组相比也无明显升高和降低，无统计学意义，zunyimycinC组的脏器与CTX组相比也无明显增生或萎缩，说明CTX不能对小鼠的心脏、肝脏、肺脏和肾脏造成明显的影响。肝脏指数，给药组只有Zun C(4.8)组肝脏指数有升高，有统计学意义(P<0.05)。

如图5所示，检测不同处理小鼠溶血素水平,造模以后，CTX组小鼠溶血素水平较KB组降低，有统计学差异(P<0.05)，CTX可降低机体体液免疫。与CTX组相比，Zun C组小鼠溶血素水平升高明显，有统计学意义(P<0.001)，zunyimycinC可在一定程度上恢复小鼠的体液免疫能力。

如图6所示，IL-2检测试剂盒对利用zunyimycin C处理的免疫低下小鼠模型的血清IL-2水平。图6中A为IL-2水平变化；B为IL-6水平变化；C为IFN-γ水平变化；D为TNF-α水平变化；由图6中A可知，造模以后，CTX组与KB组相比，IL-2水平下降非常明显，有统计学意义(P<0.01)，给药以后，zunyimycinC组IL-2水平都有所恢复，与CTX组相比有统计学意义(P<0.05)；图6中B可知，CTX组IL-6的水平显著低于KB组，有统计学意义(P<0.05)，给药以后，zunyimycinC组IL-6水平与CTX组相比都明显提高，有统计学意义性(P<0.05)；图6中C可知，CTX组小鼠的IFN-γ水平显著低于KB组，有统计学意义(P<0.0001)，给药以后，zunyimycinC组小鼠IFN-γ水平有所升高，但升高不明显，与CTX组相比，只有Zun C(4.8)组有统计学意义(P<0.01)；图6中D可知，CTX组小鼠的TNF-α水平与KB组相比也是明显降低，有统计学意义(P<0.01)，给药以后，与CTX组相比，Zun C(4.8)组TNF-α水平没有升高和恢复。

如图7所示，图7中A为乙酸含量变化；B为丙酸含量变化；C为丁酸含量变化；D为戊酸含量变化；E为己酸含量变化；F为异丁酸含量变化；G为异戊酸含量变化；用CTX造模以后，CTX组小鼠7种短链脂肪酸的含量与KB组相比均明显降低，有统计学意义(P<0.001)，各组小鼠给药以后，如图A，zunyimycin C组与CTX组相比无差异性，说明zunyimycin C对恢复免疫低下小鼠肠道乙酸水平没有作用；如图B为丙酸含量变化图，从图中可知，zunyimycinC组均能使免疫低下小鼠的丙酸水平有所恢复，有统计学意义(P<0.05)；如图C为小鼠丁酸含量变化图，从图中可以看出，zunyimycin C组小鼠异丁酸水平比CTX组更低，有显统计学意义(P<0.05)，说明zunyimycin C抑制了肠道丁酸的产生；图D为小鼠戊酸含量变化图，由图得知，与CTX组相比，zunyimycin C组戊酸水平低于CTX组，有统计学意义(P<0.05)，图E为小鼠己酸含量变化图，由图可知zunyimycinC组小鼠的己酸含量均为0，可知zunyimycinC抑制了己酸的产生；图F为异丁酸含量变化图，zunyimycin C组对异丁酸含量的恢复无影响；图G为异戊酸含量变化图，zunyimycin C组对异戊酸含量的恢复无影响。

zunyimycinC不同的剂量对小鼠的肠道菌群改变较大，进而影响了各组小鼠肠道SCFAs含量水平。SCFAs除了为机体提供能量以外，还会SCFAs会进入肝静脉循环系统，进入循环系统的SCFAs会经免疫系统等转化为激素、白介素的等活性代谢小分子，通过血脑屏障后进入中枢神经系统，通过影响肠-脑轴来发挥对机体的调节作用。

在实验中，药物剂量对小鼠其他脏器指数没有产生明显的改变，认为zunyimycinC在一定的剂量范围内对机体免疫有毒副作用。用CTX造模以后，CTX组小鼠7种SCFAs的含量与KB组相比均明显减少。对乙酸来说，zunyimycin C(4.8)组与CTX组相比无差异性；对丙酸来说，zunyimycin C(4.8)组能使丙酸水平有所恢复；对丁酸来说，zunyimycin C(4.8)组抑制了肠道丁酸的产生；对戊酸来说，zunyimycin C(4.8)组与CTX组相比无差异性；对己酸来说，zunyimycin C(4.8)组抑制了己酸的产生；对异丁酸来说，zunyimycin C(4.8)组对异丁酸含量的恢复无影响；对异戊酸来说，zunyimycin C(4.8)组对异戊酸含量的恢复无影响。

zunyimycinC的不同剂量对小鼠的肠道菌群改变较大，进而影响了各组小鼠肠道SCFAs含量水平。SCFAs除了为机体提供能量以外，还会SCFAs会进入肝静脉循环系统，进入循环系统的SCFAs会经免疫系统等转化为激素、白介素的等活性代谢小分子，通过血脑屏障后进入中枢神经系统，通过影响肠-脑轴来发挥对机体的调节作用。SCFAs也可以直接调控胰岛β细胞的数量和功能，增加机体单糖吸收和转移，调节宿主的能量平衡和代谢，也能够直接调控小鼠结肠调节性T细胞(cTreg)的数目与功能，从而调节免疫系统。Zunyimycin C通过影响小鼠肠道菌群的丰度从而影响各SCFAs的含量和细胞因子的含量来调节机体免疫功能，也可以直接通过调节细胞因子发挥免疫调节作用。

Claims (1)

1.卤化Ⅱ型聚酮类抗生素在制备增强免疫力药物中的应用，所述卤化Ⅱ型聚酮类抗生素为zunyimycinC。