CN114903844B - 水凝胶载药体系、制备方法、应用及药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种水凝胶载药体系，该水凝胶载药体系包括三维网状结构的水凝胶，所述水凝胶通过巯基化的透明质酸与铜离子螯合形成，且所述水凝胶内包载有GSNO和antiPD‑L1。本发明还提供一种水凝胶载药体系的制备方法、应用及药物组合物。本发明的水凝胶可用于原位注射肿瘤部位，以稳定可控的速度释放包载药物，在GSNO有效调节免疫微环境后，启动化学动力疗法，呈递抗原，招募免疫细胞，并结合光热治疗，进一步改善肿瘤部位免疫环境，提高免疫检查点抑制剂的疗效。

Description

水凝胶载药体系、制备方法、应用及药物组合物
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体而言涉及一种水凝胶载药体系、制备方法、应用及药物组合物。
背景技术
癌症是全球最严重的公共卫生问题之一，全世界癌症发病率正呈现持续上升趋势。目前，针对癌症治疗，除了传统的化疗、放疗，人们还研发出许多新型治疗手段，包括光热治疗、免疫检查点抑制剂以及气体治疗等。
在肿瘤微酸性环境下，金属离子可被肿瘤内部高表达的谷胱甘肽还原，被还原的金属离子可和过氧化氢发生芬顿或类芬顿反应，从而产生能够杀伤肿瘤细胞的羟基自由基。受限于肿瘤部位有限的过氧化氢和谷胱甘肽浓度，这一治疗方法的效果并不显著。
光热疗法具有局部治疗、无创、可控照射和升温等优点。然而，为实现有效消融肿瘤的目的，通常需要达到50℃以上的高温，这个温度同时也会破坏正常组织。为减少对正常组织的损伤而降低光热治疗的温度，则会使疗效大打折扣，无法抑制剩余肿瘤边缘的生长。与此同时，有人注意到相对较低的温度(约45℃)虽不能直接杀死肿瘤，但可被用于辅助肿瘤治疗，用于创造有利于免疫反应的肿瘤微环境。但是轻微的升温也会上调肿瘤细胞上一些蛋白的表达，如PD-L1等，使肿瘤细胞产生免疫抑制。
免疫检查点是一类免疫抑制性的分子，可以调节免疫反应的强度和广度，从而避免正常组织的损伤和破坏。在肿瘤的发生、发展过程中，免疫检查点成为肿瘤免疫耐受的主要原因之一。免疫检查点疗法就是通过共抑制或共刺激信号等一系列途径来调节T细胞活性，从而杀伤肿瘤细胞的治疗方法。但这种治疗的疗效很大程度上取决于PD-L1在肿瘤组织中的表达和肿瘤浸润淋巴细胞的招募情况。
公布号为CN112121030A的中国专利公开了一种有化疗、热疗及免疫协同治疗功能的肿瘤靶向纳米粒子。以PLGA纳米粒为载体，在内部包裹化疗、光热及免疫治疗药物，表面连接靶向分子，制备具有肿瘤靶向功能的多功能纳米粒子。该纳米粒子不仅抗肿瘤效果好、毒副作用小，而且组织相容性好，适宜体内应用。但该纳米粒子需要通过全身给药的方式进入体内的，因此在达到肿瘤组织的过程中，会出现被网状内皮系统清除、在非靶向组织处过量富集、过度依赖于实体瘤的高通透性和滞留效应等问题，且该材料中的化疗药物、光热治疗剂和免疫治疗剂并不能发挥出最佳效果。
公布号为CN106890332A的中国专利公开了一种光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏金纳米笼水凝胶载药系统，在金纳米笼表面修饰有智能响应型聚合物，并利用硫酸铵远程药物负载技术将阿霉素(Dox)高效负载到金纳米笼内。在近红外光照射下，金纳米笼将光转换成热能，导致温度急剧升高，使得修饰于表面的聚合物收缩，分子布朗运动加快，实现药物在热疗温度下的脉冲释药，从而达到化疗与热疗的协同作用。该水凝胶载药系统可以通过瘤内注射进行给药，虽解决了传统化疗药物肿瘤靶向性差的缺点，但无法避免其发生耐药，且温和光热作用(＜50℃)并不能有效杀伤肿瘤细胞，反而会使肿瘤细胞的一些蛋白表达上调，如热休克蛋白(HSP)、吲哚胺2,3-双加氧酶和PD-L1，以助于肿瘤细胞自我保护，实现免疫逃避。
发明内容
本发明目的在于针对现有技术的不足，提供一种水凝胶载药体系，该水凝胶可用于原位注射肿瘤部位，以稳定可控的速度释放包载药物，在GSNO有效调节免疫微环境后，启动化学动力疗法，呈递抗原，招募免疫细胞，并结合光热治疗，进一步改善肿瘤部位免疫环境，提高免疫检查点抑制剂的疗效。
根据本发明目的的第一方面，提供一种水凝胶载药体系，该水凝胶载药体系包括三维网状结构的水凝胶，所述水凝胶通过巯基化的透明质酸与铜离子螯合形成，且所述水凝胶内包载有GSNO和anti PD-L1。
优选的，所述GSNO和anti PD-L1的质量比为1:5。
根据本发明目的的第二方面，提供一种前述凝胶载药体系的制备方法，包括如下步骤：
将透明质酸进行巯基化处理，得到巯基化透明质酸，再将所述巯基化透明质酸溶解于蒸馏水，得到第一溶液；
在所述第一溶液中加入anti PD-L1和GSNO水溶液，混合均匀，得到第二溶液；
向所述第二溶液中加入铜离子溶液，充分混合均匀后即得到凝胶载药体系。
优选的，透明质酸进行巯基化处理的过程如下：
向溶解后的透明质酸中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，得到混合溶液A，并将混合溶液A的pH调至4～5，得到第三溶液；
向所述第三溶液中加入胱胺二盐酸，置于室温下反应48小时后，得到混合溶液B，将混合溶液B的pH调至7～8，得到第四溶液；
向所述第四溶液中加入二硫苏糖醇，反应液于黑暗中继续反应24小时，得到混合溶液C，反应结束后将混合溶液C的pH调至4.5～5.5，得到第五溶液；
将第五溶液置于透析袋中，用含氯化钠的酸性透析液进行透析，最后将透析袋内的产物冻干，得巯基化透明质酸。
优选的，透明质酸和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的质量比为1：(1.9～2.0)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1：(0.55～0.65)，透明质酸和胱胺二盐酸的质量比为1：(1.6～1.8)，胱胺二盐酸和二硫苏糖醇的质量比为1：(2.7～2.8)。
优选的，采用稀盐酸将混合溶液A的pH调至4～5，所述稀盐酸的浓度为4.5～5.5mmol/L；采用氢氧化钠溶液将混合溶液B的pH调至7～8，所述氢氧化钠溶液浓度为4.5～5.5mmol/L。
优选的，含氯化钠的酸性透析液中，氯化钠浓度为4.0～4.5g/L，透析液的pH为4.5～5.5，所述的透析袋截留值为3500Da。
优选的，所述第一溶液的浓度为10～30mg/mL；所述铜离子溶液为氯化铜溶液，氯化铜溶液的浓度为0.01～1mol/L；所述的anti PD-L1浓度为0.99～1.01mg/mL，所述的GSNO水溶液的浓度为0.19～0.21mg/mL。
根据本发明目的的第三方面，提供一种前述水凝胶载药体系在制备肿瘤药物中的应用。
根据本发明目的的第四方面，提供一种药物组合物，包括前述水凝胶载药体系。
本发明的有益效果在于：
1、本发明的水凝胶载药体系，通过巯基化的透明质酸与铜离子螯合形成具有三维网状结构的水凝胶，且水凝胶内包载GSNO和anti PD-L1，经注射至肿瘤部位后，水凝胶内的GSNO作为NO供体，在808nm近红外光照射下释放NO气体，提供外源性NO，有效调节免疫微环境，降低肿瘤的迁移和侵袭；同时，GSNO在释放NO之后变成谷胱甘肽，弥补肿瘤部位谷胱甘肽不足的缺陷，促进组成水凝胶的Cu2+离子还原成Cu+，缓慢释放的Cu+在肿瘤部位进行类芬顿反应，实现肿瘤部位化学动力学治疗，同时呈递抗原，招募更多的免疫细胞；另一方面，凝胶中的Cu2+具有光热转化效应，在接受808nm近红外光照射后可显著升温，实现肿瘤部位光热治疗，从而引起肿瘤细胞PD-L1表达上调；而此时，随着Cu2+离子不断还原成Cu+，使得凝胶结构逐渐瓦解，并以稳定可控的速度释放出包载在凝胶内的免疫检查点抑制剂anti PD-L1，而肿瘤细胞中PD-L1表达上调，使得释放出来的anti PD-L1的靶向更精准、快速，从而使招募到的大量的免疫细胞能够更有效、更精准的作用于肿瘤细胞，实现更好的疗效。
2、本发明的水凝胶载药体系，形成的凝胶具有三维网状结构，能够缓慢释放所包载药物，从而充分发挥药效杀伤肿瘤细胞、调节肿瘤部位免疫微环境，达到有效治疗肿瘤目的；通过光热治疗和化学动力学治疗，治疗效果更佳，同时避免全身毒副作用。
3、本发明的水凝胶载药体系，制备方法简单易行，制备材料安全易得，有利于进一步推广使用。
附图说明
图1是本发明的水凝胶载药体系的制备流程图。
图2是实施例2所得样品的体外表征成胶宏观图。
图3是实施例2所得样品的体外表征时间扫描流变学分析，以6.3rad/s角频率进行动态时间扫描，记录空白凝胶储能模量(G’)和损耗模量(G”)随时间变化曲线图。
图4是实施例2所得样品的SEM扫描电镜图。
图5是本发明的水凝胶载药体系在808nm近红外光照射下的光热转化性能考察。
图6是本发明的水凝胶载药体系蛋白药物释放情况考察凝胶在不同pH释放介质中，蛋白药物从凝胶中释放情况。
图7是本发明的水凝胶载药体系在808nm近红外光照射下随时间从凝胶中释放气体药物的情况考察，
图8是本发明的水凝胶载药体系羟基自由基产生情况考察。
图9是本发明的水凝胶载药体系中亚铜离子的产生验证。
图10是实施例1-5中的样品在加光照和不加光照条件下对4T1肿瘤细胞的杀伤情况。
图11是本实施例1-5中的样品的在小鼠4T1肿瘤模型药效试验肿瘤生长情况。
图12是本实施例1-5中的样品的在小鼠4T1肿瘤模型药效试验肿瘤解剖情况。
图13是本实施例1-5中的样品的在小鼠4T1肿瘤模型药理实验免疫细胞分布情况。
具体实施方式
为了更了解本发明的技术内容，特举具体实施例并配合所附图式说明如下。
在本公开中参照附图来描述本发明的各方面，附图中示出了许多说明的实施例。本公开的实施例不必定意在包括本发明的所有方面。应当理解，上面介绍的多种构思和实施例，以及下面更加详细地描述的那些构思和实施方式可以以很多方式中任意一种来实施。
本发明提供一种水凝胶载药体系，可用于原位注射肿瘤部位，以稳定可控的速度释放包载药物，在GSNO有效调节免疫微环境后，启动化学动力疗法，呈递抗原，招募免疫细胞，并结合光热治疗，进一步改善肿瘤部位免疫环境，提高免疫检查点抑制剂的疗效。
在具体的实施例中，提供一种水凝胶载药体，该水凝胶载药体系包括三维网状结构的水凝胶，所述水凝胶通过巯基化的透明质酸与铜离子螯合形成，且所述水凝胶内包载有GSNO(亚硝基谷胱甘肽)和anti PD-L1。
在优选的实施例中，所述GSNO和anti PD-L1的质量比为1:5。
在另一个具体的实施例中，如图1所示，提供一种前述凝胶载药体系的制备方法，具体包括如下步骤：
将透明质酸(HA)进行巯基化处理，得到巯基化透明质酸(HA-SH)，再将所述巯基化透明质酸溶解于蒸馏水，得到第一溶液；
在所述第一溶液中加入anti PD-L1和GSNO水溶液，混合均匀，得到第二溶液；
向所述第二溶液中加入铜离子溶液，充分混合均匀后即得到凝胶载药体系GSNO/aP@Gel。
在优选的实施例中，透明质酸进行巯基化处理的过程如下：
向溶解后的透明质酸中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，得到混合溶液A，并将混合溶液A的pH调至4～5，得到第三溶液；
向所述第三溶液中加入胱胺二盐酸，置于室温下反应48小时后，得到混合溶液B，将混合溶液B的pH调至7～8，得到第四溶液；
向所述第四溶液中加入二硫苏糖醇(DTT)，反应液于黑暗中继续反应24小时，得到混合溶液C，反应结束后将混合溶液C的pH调至4.5～5.5，得到第五溶液；
将第五溶液置于透析袋中，用含氯化钠的酸性透析液进行透析，最后将透析袋内的产物冻干，得巯基化透明质酸。
在另一个优选的实施例中，透明质酸和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的质量比为1：(1.9～2.0)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1：(0.55～0.65)，透明质酸和胱胺二盐酸的质量比为1：(1.6～1.8)，胱胺二盐酸和二硫苏糖醇的质量比为1：(2.7～2.8)。
在另一个优选的实施例中，采用稀盐酸将混合溶液A的pH调至4～5，所述稀盐酸的浓度为4.5～5.5mmol/L；
采用氢氧化钠溶液将混合溶液B的pH调至7～8，所述氢氧化钠溶液浓度为4.5～5.5mmol/L。
在另一个优选的实施例中，含氯化钠的酸性透析液中，氯化钠浓度为4.0～4.5g/L，透析液的pH为4.5～5.5，所述的透析袋截留值为3500Da。
在另外优选的实施例中，所述第一溶液的浓度为10～30mg/mL；所述铜离子溶液为氯化铜溶液，氯化铜溶液的浓度为0.01～1mol/L；所述的anti PD-L1浓度为0.99～1.01mg/mL，所述的GSNO水溶液的浓度为0.19～0.21mg/mL。
在其他优选的实施例中，还提供一种前述水凝胶载药体系在制备肿瘤药物中的应用。
所述水凝胶载药体系可在肿瘤部位进行原位注射，进入肿瘤部位的水凝胶载药体系由于铜离子本身具有的光热转化能力，因而能在808nm近红外光照射下升温，缓慢释放出的铜离子能在肿瘤部位发生类芬顿反应，产生直接杀伤肿瘤细胞的羟基自由基；而在凝胶内部，包裹有免疫检查点抑制剂anti PD-L1，同时GSNO作为NO供体在凝胶中发挥着免疫佐剂的作用。
水凝胶所包载的药物能够以稳定可控的速度缓慢释放，从而充分发挥药效杀伤肿瘤细胞、调节肿瘤部位免疫微环境，同时避免全身毒副作用。
在另一个优选的实施例中，还提供一种药物组合物，包括前述水凝胶载药体系；例如，可在前述水凝胶载药体系内包裹紫杉醇、阿那曲唑等抗肿瘤药物，达到协同抗肿瘤的效果。
在另一个优选的实施例中，前述通过巯基化的透明质酸与铜离子螯合形成具有三维网状结构的水凝胶，可直接在肿瘤部位进行原位注射，用于肿瘤治疗。
在更为优选的实施例中，前述通过巯基化的透明质酸与铜离子螯合形成具有三维网状结构的水凝胶，也可作药物递送材料，水凝胶具有的空腔可进行载药，将药物递送至目标部位，达到治疗的目的，且具有良好的细胞相容性。
下面将结合具体的示例和试验，对前述水凝胶载药体系的制备及其效果进行示例性试验和对比。当然本发明的实施例并不以此为限。
下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施方式中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
以下实施例和对比例中，anti PD-L1购于Bio Cell，为液体形式(PBS溶解)。
【实施例1】
HA-SH的制备：
取一个洁净干燥的100mL圆底烧瓶，称定0.5g透明质酸粉末，加入50mL蒸馏水使其溶解，称取0.958g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和0.575gN-羟基琥珀酰亚胺加入溶解，用5mmol/L稀盐酸调节反应液pH至4.5。
然后加入0.843g胱胺二盐酸并在200rmp下室温反应48小时。随后将反应液pH用5mmol/L氢氧化钠溶液调至7.5，加入2.313g二硫苏糖醇并继续在黑暗条件下反应24小时。
反应结束后用稀盐酸调节pH至5，用3500Da截留值透析袋进行透析，透析液包含4g/L氯化钠且pH为5。
最后将所得样品进行冻干，并于-20℃进行保存，得到巯基化透明质酸HA-SH。
【实施例2】
Gel的制备：
取40mg实施例1中的HA-SH并溶解于蒸馏水中，配置0.027mol/L氯化铜溶液，将1.2mL HA-SH溶液与300μL氯化铜溶液充分混合均匀，即可得到水凝胶Gel。
【实施例3】
GSNO@Gel的制备：
取40mg实施例1中的HA-SH并溶解于2mL蒸馏水中，配置0.027mol/L氯化铜溶液和20mg/mL GSNO水溶液，取15μL GSNO水溶液混匀于1.2mL HA-SH水溶液中，再加入300μL氯化铜溶液，充分混匀使其成胶即可得到GSNO@Gel。
【实施例4】
aP@Gel的制备：
取40mg实施例1中的HA-SH并溶解于2mL蒸馏水中，配置0.027mol/L氯化铜溶液；取180μL anti PD-L1(8.29mg/mL)混匀于1.02mL HA-SH水溶液中，再加入300μL氯化铜溶液，充分混匀使其成胶即可得到aP@Gel。
【实施例5】
GSNO/aP@Gel的制备：
取40mg实施例1中的HA-SH并溶解于2mL蒸馏水中，，配置0.027mol/L氯化铜溶液和20mg/mL GSNO水溶液，取15μL GSNO水溶液和180μL anti PD-L1(8.29mg/mL)混匀于1.02mLHA-SH水溶液中，再加入300μL氯化铜溶液，充分混匀使其成胶即可得到水凝胶载药体系GSNO/aP@Gel。
以下所用样品均由实施例1-5所得。
【实施例6】
水凝胶体外表征
将2mL HA-SH和Gel置于透明西林瓶中，如图2所示，在未添加铜离子溶液时，HA呈可流动液态(1a)，在添加铜离子溶液后，样品Gel呈胶状，无法发生流动，且倾斜45°样品不发生形变(1b)，说明该方法可成功制备凝胶Gel。
取3mL Gel利用流变仪进行流变分析，参数设定为角频率6.28rad/s，温度37℃，振荡力矩8μN.m，结果如图3所示，所得凝胶的损失模量保持在750Pa左右，储存模量保持在30Pa左右，其中损失模量代表凝胶的弹性，储存模量代表凝胶的粘性，结果显示该凝胶性能稳定。
取1mL Gel进行冻干，冻干后样品呈海绵状，将冻干所得样品进行截面SEM扫描，所得结果如图4所示，SEM结果显示凝胶内部呈三维网状结构。
【实施例7】
光热转化性能考察
取200μL Gel于96孔板，再分别配制相同终浓度的HA-SH(16mg/mL)和氯化铜水溶液(5.4mmol/L)，各取200μL于相同96孔板上。每孔采用808nm近红外光照射140s，每隔20s记录一次实验数据。每组实验平行三次。
如图5所示，在接受光照140s后，Gel组显著升温33℃，相比之下，HA-SH水溶液几乎没有温度变化，与此同时，氯化铜水溶液也产生了近30℃的升温，这表明本发明的水凝胶载药体系具有光热转化性能，且这一性能是由于铜离子的存在而产生的。
【实施例8】
蛋白药物释放情况考察
考虑到anti PD-L1的成本及其性质，采用牛血清白蛋白(BSA)作为其替代品。
配制30mg/mL HA-SH溶液和50mg/mL氯化铜溶液。取六个洁净干燥的10mL离心管，每管加入0.4mL HA-SH溶液，随即每管加入0.1mL BSA(20mg)溶液，二者混合均匀后加入0.5mL氯化铜溶液，混合成胶后将离心管分为两组，每组三管，并分别加入4mLpH 5.4和pH7.4的缓冲盐溶液作为释放介质。在特定时间点采取每组样品的释放介质，并用BCA试剂盒进行蛋白含量检测。
所得蛋白释放曲线如图6所示，从图中可以看出，在pH 5.4的释放介质中，Gel于8小时内就释放出近20％的蛋白，相对于在pH 7.4的弱碱性释放介质中，Gel最终蛋白释放率不足2％的释药情况，说明Gel在酸性条件下更易降解，因此Gel在弱酸性释放介质中的释药速率相对更快，这与酸碱度对铜离子和巯基螯合作用的影响有关。
由此进一步说明本发明的水凝胶载药体系具有酸响应特性，我们的凝胶在肿瘤部位能够有效释放出anti PD-L1。
【实施例9】
气体药物释放情况考察
取70μL GSNO@Gel于96孔板，同时配制相同终浓度的透明质酸及氯化铜水溶液，取相同体积于同一96孔板。利用808nm近红外灯照射凝胶不同时长，采用Griess试剂盒检测释放的NO气体。
NO释放曲线如图7所示，在不接受近红外光照射的情况下，GSNO@Gel中的NO几乎不释放，而当近红外光照射凝胶后，NO释放显著增加，且释放量与照射时长正相关，证明808nm近红外光照射能够促进凝胶中GSNO释放NO。这是由于近红外光照射使得凝胶升温，而GSNO释放NO的速率受温度及光照影响，GSNO@Gel能够通过控制近红外光照射时长，以可控的速率释放NO，从而有效调节肿瘤部位免疫微环境。
由此可知，本发明的水凝胶载药体系可通过近红外光照射促进水凝胶体系中NO释放。
【实施例10】
羟基自由基产生情况考察
取适量亚甲基蓝粉末溶解于pH 5.4缓冲盐溶液中，同时配制适宜浓度过氧化氢溶液、谷胱甘肽溶液以及不同浓度氯化铜溶液，溶剂均为pH 5.4缓冲盐溶液。将亚甲基蓝溶液、过氧化氢溶液、谷胱甘肽溶液分别与不同浓度氯化铜溶液混合。其中亚甲基蓝溶液终浓度为5μg/mL，过氧化氢溶液终浓度为10mmol/L，谷胱甘肽溶液终浓度为2.5mmol/L，氯化铜溶液终浓度分别为0.3，0.5，0.8mmol/L。
类芬顿反应产生的羟基自由基能够使亚甲基蓝褪色，因此可用亚甲基蓝检测羟基自由基的产生情况，利用紫外分光光度计进行580～700nm全波长扫描。
结果如图8所示，单纯的铜离子溶液，或铜离子和谷胱甘肽的混合溶液，均并不能使亚甲基蓝褪色，而在添加了过氧化氢和谷胱甘肽后，铜离子能够有效使之褪色，且随着铜离子浓度增大，亚甲基蓝褪色越明显，结果证实在过氧化氢和谷胱甘肽存在情况下，铜离子能够发生类芬顿反应产生羟基自由基，且所产生羟基自由基浓度与铜离子浓度正相关。
由上可知，本发明的水凝胶载药体系G+aP@Gel在到达肿瘤部位后缓慢释放铜离子，并能与肿瘤细胞内高表达的谷胱甘肽和过氧化氢反应产生羟基自由基，从而杀伤肿瘤细胞。
【实施例11】
亚铜离子的产生验证
为验证二价铜离子能被谷胱甘肽还原为一价铜，我们采用新亚铜试剂来证明一价铜离子的产生，其原理为一价铜离子能够使新亚铜试剂显色，并于450nm左右出峰。先配制10mM新亚铜试剂乙醇溶液和pH 6.2磷酸盐缓冲液，并准备好以下两组样品。
样品一：1.7mg/mL CuCl2溶液
样品二：1.7mg/mL CuCl2+3.07mg/mL GSH溶液
按0.9mL新亚铜试剂+1mL磷酸盐缓冲液+1mL乙醇+0.1mL样品溶液的比例处理两组样品，并利用紫外分光光度计进行360～600nm全波长扫描。
扫描结果如图9所示，在添加了谷胱甘肽之后，溶液于450nm处的吸收值明显增加，证明二价铜离子可被谷胱甘肽还原成一价铜离子。
由此，可以知道，水凝胶载药体系GSNO/aP@Gel中的GSNO在释放NO之后变成谷胱甘肽后，谷胱甘肽可将组成水凝胶的Cu2+离子还原成Cu+。
【实施例12】
体外肿瘤细胞杀伤效果考察
鉴于anti PD-L1的作用机制需要多种免疫细胞参与，因此本实验不涉及aP@Gel、GSNO/aP@Gel组别。
将4T1细胞以1×105细胞/孔的密度接种于96孔板上，37℃孵育过夜后，再与CuCl2溶液、空白凝胶(Gel)和含GSNO的载药凝胶(GSNO@Gel)共培养24小时。
孵育结束后用PBS小心冲洗每孔细胞，然后每孔加入80μL RPMI1640培养基和20μL3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)溶液，其中MTT浓度为5.0mg/mL。继续将96孔板在37℃下孵育4小时，孵育结束后用移液枪吸走上清液。
为了溶解活细胞产生的甲
Figure BDA0003573861600000101
晶体，每孔加入150μL DMSO。在振动筛上低速摇动10min后，于492nm波长下测量所有样品，结果如图10所示。
从图中可以看出，单纯的铜离子溶液杀死了近半数的肿瘤细胞，这是由于铜离子发生类芬顿反应，产生的羟基自由基对4T1肿瘤细胞存在细胞杀伤作用，但空白凝胶呈现出更好的细胞杀伤效果。在包载GSNO之后，载药凝胶的细胞杀伤效果明显高于其他各组，这是由于NO本身就具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用，同时GSNO在释放出NO之后变成谷胱甘肽，弥补了肿瘤细胞内谷胱甘肽不足的缺陷，促进类芬顿反应的发生，从而产生更多的羟基自由基。
此外，每组肿瘤细胞(空白对照组、CuCl2溶液组、空白凝胶组和含GSNO的载药凝胶组)在接受近红外光照射后，细胞活力都有下降，但对照组和铜离子溶液组的下降趋势并不显著，这可能是由于其光热转化性能差，导致升温幅度小，而微弱的温度上升反而会促进肿瘤细胞生长，因此细胞活力和不加光照组对比没有显著差异；而载药凝胶组在接受光照后，肿瘤细胞活力明显下降，这是因为光照使得凝胶升温，同时促进凝胶释放出NO，从而进一步杀伤肿瘤细胞。
因此，本发明的水凝胶可以利用光热转化对肿瘤细胞进行光热治疗，同时凝胶释放出的铜离子和NO也能增强疗效，产生强效抗肿瘤能力。
【实施例13】
小鼠4T1肿瘤模型药效试验
采用4T1肿瘤模型研究了水凝胶载药体系GSNO/aP@Gel的抗肿瘤作用。
将4T1细胞均匀悬浮于RPMI Medium 1640中，皮下注射于每只雌性BALB/c小鼠右侧。当初始肿瘤大小达到100～200mm3时开始治疗。将4T1荷瘤小鼠随机分为7组，分别于第0天和第5天瘤内注射100μL生理盐水、游离GSNO和aPD-L1溶液、载GSNO水凝胶(GSNO@HAGel)、载aPD-L1水凝胶(aP@Gel)、载GSNO及aPD-L1水凝胶(GSNO/aP@Gel)(其中各组分浓度aPD-L1,1.0mg/mL；GSNO,0.2mg/mL；CuCl2,0.92mg/mL)。
每组小鼠均接受近红外光照射治疗，其中生理盐水组和载GSNO及aPD-L1水凝胶组设置不加光照的对照组。接受光照的每组小鼠在第0，5，6天用功率密度为0.8W/cm2的808nm近红外光照射肿瘤部位1min，使肿瘤部位产生温和的光热效应。在整个治疗过程中记录小鼠的肿瘤大小和体重。肿瘤大小的计算公式为:短径2×长径×0.5。
从图11中可以看出，在进行为期三周的治疗后，载GSNO及anti PD-L1水凝胶光照组(GSNO/aP@Gel)显示出优秀的抗肿瘤疗效，如图12所示，从图中可看出，该组小鼠的肿瘤大小得到有效抑制，远优于其他各组。
同时游离GSNO和anti PD-L1溶液光照组和载anti PD-L1水凝胶光照组(aP@Gel)的肿瘤生长也受到抑制，但抑制程度较轻。这说明水凝胶能够缓慢释放药物，充分发挥药效，而NO作为免疫佐剂，有效地改善了肿瘤部位的免疫微环境，增强治疗效果。
值得注意的是，有光照和没有光照的生理盐水组肿瘤生长情况基本相同，也就是说光照对生理盐水组没有明显的影响。而GSNO/aP@Gel组在无光照条件下的肿瘤生长情况与生理盐水组相似，说明我们的水凝胶载药体系具有明显的光热效应，且能有效辅助化学动力学治疗和免疫治疗。
图中显示载GSNO水凝胶光照组(GSNO@Gel)抗肿瘤效果较差，这与肿瘤细胞上PD-L1表达上调有关，PD-L1能够帮助肿瘤细胞实现免疫逃避，使治疗效果大打折扣，而在添加了anti PD-L1之后，aP@Gel和GSNO/aP@Gel组的肿瘤生长均受到显著抑制，说明anti PD-L1可以有效增加免疫细胞对肿瘤细胞的识别，从而发挥免疫治疗作用。
【实施例14】
肿瘤部位免疫细胞浸润情况考察
为了评价混合治疗引起的免疫反应，我们从小鼠身上切除并收集肿瘤肉块，将其制备成细胞悬液。以培养基为溶剂将胶原酶I型、胶原酶IV型、透明质酸酶按1:1:1比例配置成终浓度为1.5mg/mL的酶裂解液，用制备的酶裂解液消化肿瘤小块，置于37℃摇床孵育1小时，然后通过70μm筛网得到细胞悬液。将制备的肿瘤细胞悬液按照标准方案分别用抗CD11c-FITC(Biolegend)、抗CD80-APC(Biolegend)和抗CD86-PE(Biolegend)抗体进行染色，然后利用流式细胞仪进行细胞流式分析，以检测肿瘤部位DC细胞的激活情况。
肿瘤细胞经化学动力学治疗和光热治疗死亡后，释放出的抗原将激活DC细胞，DC细胞是重要的抗原呈递免疫细胞，其流式结果如图13所示。
相较于其他组别，GSNO/aP@Gel组DC细胞的激活情况明显高于其他各组，其他组别的DC细胞激活情况虽然对比空白对照组略有上升，但并不显著，且各组中激活的DC细胞数值情况与药效试验中肿瘤生长抑制情况一致，说明本发明的GSNO/aP@Gel可以有效改善肿瘤部位免疫微环境，增加抗肿瘤免疫细胞的招募和激活。
虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明。本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰。因此，本发明的保护范围当视权利要求书所界定者为准。

Claims (10)

1.一种水凝胶载药体系，其特征在于，该水凝胶载药体系包括三维网状结构的水凝胶，所述水凝胶通过巯基化的透明质酸与铜离子螯合形成，且所述水凝胶内包载有GSNO和antiPD-L1。
2.根据权利要求1所述的水凝胶载药体系，其特征在于，所述GSNO和anti PD-L1的质量比为1:5。
3.一种权利要求1-2中任意一项所述的水凝胶载药体系的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将透明质酸进行巯基化处理，得到巯基化透明质酸，再将所述巯基化透明质酸溶解于蒸馏水，得到第一溶液；
在所述第一溶液中加入anti PD-L1和GSNO水溶液，混合均匀，得到第二溶液；
向所述第二溶液中加入铜离子溶液，充分混合均匀后即得到凝胶载药体系。
4.根据权利要求3所述的水凝胶载药体系的制备方法，其特征在于，透明质酸进行巯基化处理的过程如下：
向溶解后的透明质酸中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，得到混合溶液A，并将混合溶液A的pH调至4～5，得到第三溶液；
向所述第三溶液中加入胱胺二盐酸，置于室温下反应48小时后，得到混合溶液B，将混合溶液B的pH调至7～8，得到第四溶液；
向所述第四溶液中加入二硫苏糖醇，反应液于黑暗中继续反应24小时，得到混合溶液C，反应结束后将混合溶液C的pH调至4.5～5.5，得到第五溶液；
将第五溶液置于透析袋中，用含氯化钠的酸性透析液进行透析，最后将透析袋内的产物冻干，得巯基化透明质酸。
5.根据权利要求4所述的水凝胶载药体系的制备方法，其特征在于，透明质酸和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的质量比为1：(1.9～2.0)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1：(0.55～0.65)，透明质酸和胱胺二盐酸的质量比为1：(1.6～1.8)，胱胺二盐酸和二硫苏糖醇的质量比为1：(2.7～2.8)。
6.根据权利要求4所述的水凝胶载药体系的制备方法，其特征在于，采用稀盐酸将混合溶液A的pH调至4～5，所述稀盐酸的浓度为4.5～5.5mmol/L；
采用氢氧化钠溶液将混合溶液B的pH调至7～8，所述氢氧化钠溶液浓度为4.5～5.5mmol/L。
7.根据权利要求4所述的水凝胶载药体系的制备方法，其特征在于，含氯化钠的酸性透析液中，氯化钠浓度为4.0～4.5g/L，透析液的pH为4.5～5.5，所述的透析袋截留值为3500Da。
8.根据权利要求3所述的水凝胶载药体系的制备方法，其特征在于，所述第一溶液的浓度为10～30mg/mL；所述铜离子溶液为氯化铜溶液，氯化铜溶液的浓度为0.01～1mol/L；所述的anti PD-L1浓度为0.99～1.01mg/mL，所述的GSNO水溶液的浓度为0.19～0.21mg/mL。
9.一种权利要求1-2中任意一项所述的水凝胶载药体系在制备肿瘤药物中的应用。
10.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1-2中任意一项所述的水凝胶载药体系。
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