CN114879352A - 一种具有可变光片的连续光学变焦光片荧光显微镜 - Google Patents
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Abstract
本发明提出一种具有可变光片的连续光学变焦光片荧光显微镜，该显微镜由控制系统、自适应探测物镜、自适应照明物镜和光片产生系统构成。在光片显微镜成像时，显微镜的横向分辨率与探测物镜的数值孔径和入射波长有关，而轴向分辨率则会受到照明光片厚度的影响，当光片厚度大于探测物镜的景深时焦平面外激发的荧光会对焦平面信息造成干扰且造成不必要的光毒性，而光片厚度过薄则会损失景深信息，因此光片厚度与探测物镜景深相匹配时可以在不丢失轴向信息的同时提高轴向分辨率。
Description
技术领域
本发明涉及一种光片荧光显微镜，更确切地来说，是一种具有可变光片的连续光学变焦光片荧光显微镜。
背景技术
显微镜在人类探索微观世界的过程中有着举足轻重的作用，它使人类对生物的认知从表面到了内部结构，显微镜的进步也推动了生物和医学的发展。光片显微镜用光平面激发物体发出荧光，与传统荧光显微镜照明方式相比，提高了图像和背景的反差，大大提高了成像速度和图像信噪比，具有较好的选层能力且很大程度上降低光漂白和光毒性，可以对活体生物样品进行长时间的三维成像。
显微镜的横向分辨率与探测物镜的数值孔径和入射波长有关，而轴向分辨率则会受到照明光片厚度的影响，当光片厚度大于探测物镜的景深时焦平面外激发的荧光会对焦平面信息造成干扰且造成不必要的光毒性，而光片厚度过薄则会损失景深信息，当光片厚度与探测物镜景深相匹配时可以在不丢失轴向信息的同时提高轴向分辨率。一直以来显微镜的视场和轴向分辨率不可兼得，照明光片也具有这样的矛盾，光片较薄时发散越快，可使用的照明范围也越小。传统的光片荧光显微镜一般使用光阑对光片厚度进行调节，但此调节方式多与固定探测物镜匹配，对连续变焦物镜来说有诸多限制。论文Chmielewski A K,“ Fast imaging of live organisms with sculpted light sheets”.，Sci Rep, 2015,5: 9385.提出在光片产生光路中加入由可调透镜构成的望远镜，通过调节可调透镜的焦距实现对光片厚度及腰斑位置的控制，得到大视场高分辨率图像，但这只能用于固定放大倍率的检测物镜。针对连续焦距可变的显微物镜来说亟需厚度连续可调且与之探测景深匹配的照明光片。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有可变光片的连续光学变焦光片荧光显微镜，使光片厚度可随探测物镜景深一起连续变化。如附图1所示，该显微镜包括控制系统、自适应探测物镜、自适应照明物镜和光片产生系统，自适应探测物镜和自适应照明物镜所在光轴在样本处正交。
本发明提出的具有可变光片的连续光学变焦光片荧光显微镜工作原理如附图1。光片产生系统内部通过使用柱透镜或扫描镜产生横向和纵向尺寸不一的激光光束，此光束在横向被压缩，纵向正常进入照明物镜，通过自适应照明物镜后，光束探测物镜焦平面方向即横向光束与传统荧光照明相同，照亮整个焦平面，而在纵向则是一条细光线，此光束特性使光片显微镜具有选层能力。自适应检测物镜与自适应照明物镜由自适应透镜和玻璃透镜构成，自适应透镜可通过外加驱动改变自身焦距，从而实现无机械移动光学变焦。自适应检测物镜和自适应照明物镜通过同一个控制系统控制其中的自适应透镜焦距。当显微镜进行低倍探测时系统的数值孔径较小，所能清楚观测到的样本深度较大，此时控制系统内部通过检测物镜的中的驱动电压判定控制自适应照明物镜中的自适应透镜焦距，从而产生与检测物镜观测深度相匹配的厚光片，如附图1所示；当显微镜进行高倍探测时系统的数值孔径较大，所能清楚观测到的样本深度较小，此时控制系统内部通过检测物镜的中的驱动电压判定控制自适应照明物镜中的自适应透镜焦距，从而产生与检测物镜观测深度相匹配的薄光片，如附图2所示。自适应透镜变焦速度极快，通过同一个控制系统可做到照明深度与观测深度完全匹配，减少不必要的荧光光毒性和杂散背景光，且避免机械移动造成扰动，更有利于活体成像，提高成像的轴向分辨率。
优选地，自适应检测物镜由玻璃透镜和M个自适应透镜组成，其中2≤M≤8。
优选地，自适应照明物镜由玻璃透镜和N个自适应透镜组成，其中2≤N≤8。
优选地，自适应透镜为液体透镜、聚合物透镜和液晶透镜等。
优选地，自适应透镜可采用电湿润、介电力和电磁力等方式驱动。
附图说明
参照以下附图描述了各种示例性细节，应当理解，附图不一定按比例绘制仅作原理性说明，并且相同的数字可以指代相同的特征。
图1为可变光片的连续光学变焦光片荧光显微镜低倍观察时光片厚度匹配示意性图示；
图2为可变光片的连续光学变焦光片荧光显微镜高倍观察时光片厚度匹配示意性图示；
图3为自适应物镜布局图；
图4为NA和放大倍率变化曲线图；
图5为景深和NA变化曲线图；
图6为光片厚度与放大倍率匹配的曲线图。
上述附图中的图示标号为：
1控制系统，2自适应探测物镜，3自适应照明物镜，4观测样本，5光片产生系统，6窗口玻璃Ⅰ，7液体Ⅰ，8液体Ⅱ，9窗口玻璃Ⅱ，10双胶合透镜Ⅰ，11双胶合透镜Ⅱ，12载玻片，13像面，14电润湿液体透镜Ⅰ，15电润湿液体透镜Ⅱ。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的详细说明。有必要在此指出的是，以下实施例只用于本发明做进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域技术熟练人员根据上述发明内容对本发明做出一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
本发明实施例中提供了一种具有可变光片的连续光学变焦光片荧光显微镜，如附图1所示，显微镜具有两个自适应显微物镜，其中一个用于产生照明光片，另一个用于接收激光激发的样本荧光，且照明光路与检测光路在样本平面正交自适应检测物镜与自适应照明物镜由自适应透镜和玻璃透镜构成，其中用到的自适应透镜使用电润湿液体透镜进行设计，如附图3所示，该设计为10-20倍连续变焦的自适应物镜布局图，该设计使用两个液体透镜进行变焦，两个双胶合透镜用于矫正系统像差。基于电湿润原理液体Ⅰ和液体Ⅱ之间的液液面可通过外加电压实现曲率变化，控制系统通过控制此面曲率变化来改变液体透镜焦距，从而实现自适应物镜的变焦功能。
检测物镜的景深和放大率及数值孔径的变化如附图4、附图5和附图6所示，从图中可知检测物镜放大倍率越大，景深越小，需要的照明光片厚度越薄。当自适应检测物镜放大倍率为10倍时，检测物镜的数值孔径为0.25，检测深度为9.5μm，此时需要自适应照明物镜产生9.5μm的光片；当自适应检测物镜放大倍率为20倍时，检测物镜的数值孔径为0.4，检测深度为5.8μm，此时需要自适应照明物镜产生5.8μm的光片，通过光片厚度与检测物镜自身景深的匹配提高系统的轴向分辨率。
Claims (6)
1.一种具有可变光片的连续光学变焦光片荧光显微镜，包括控制系统、自适应探测物镜、自适应照明物镜和光片产生系统，其特征在于，自适应探测物镜和自适应照明物镜所在光轴在样本处正交。
2.其特征在于自适应检测物镜和自适应照明物镜由玻璃透镜自适应透镜构成，自适应照明物镜焦距随自适应检测物镜变化。
3.根据权利要求1所述的一种具有可变光片的连续光学变焦光片荧光显微镜，其特征在于自适应检测物镜由玻璃透镜和M个自适应透镜组成，其中2≤M≤8。
4.根据权利要求1所述的一种具有可变光片的连续光学变焦光片荧光显微镜，其特征在于自适应照明物镜由玻璃透镜和N个自适应透镜组成，其中2≤N≤8。
5.根据权利要求1所述的一种具有可变光片的连续光学变焦光片荧光显微镜，其特征在于自适应透镜为液体透镜、聚合物透镜和液晶透镜等。
6.根据权利要求1所述的一种具有可变光片的连续光学变焦光片荧光显微镜，其特征在于自适应透镜可采用电湿润、介电力和电磁力等方式驱动。
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