CN114874348B - 乌饭树叶多糖VBLP-3b及其制备方法、应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种乌饭树叶多糖VBLP‑3b及其制备方法、应用，乌饭树叶多糖VBLP‑3b分子量为3.76×105Da，其单糖组成为阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖，摩尔比为1.56:1.00:1.63:2.12:2.05；乌饭树叶多糖VBLP‑3b的制备方法：以乌饭树叶多糖为原料，经醇沉、DEAE‑sepharose CL6B离子交换柱层析及sephadexG‑200凝胶柱层析分离纯化获得；本发明所提供的乌饭树叶多糖VBLP‑3a具有显著的抗氧化作用与提高土鸡机体免疫力的作用，可用于土鸡免疫佐剂产品的制备。

Description

乌饭树叶多糖VBLP-3b及其制备方法、应用
技术领域
本发明涉及一种乌饭树叶多糖VBLP-3b及其制备方法，属于天然植物活性多糖的提取分离技术领域。本发明还涉及上述多糖的应用。
背景技术
乌饭树(Vaccinium bracteatum Thunb.)又名南烛，古称染菽，属杜鹃花科常绿灌木，是一种药食兼用的传统植物资源。乌饭树叶含花青素、类黄酮化合物、有机酸、多糖、脂溶性成分、微量元素等成分，具有抗肿瘤、抗炎、抗凝血、降血糖等药理活性。多糖是乌饭树叶的主要成分之一，邓梅忠研究了水提取-超声萃取乌饭树树叶多糖工艺及在卷烟中的应用，结果表明乌饭树树叶多糖(Polysaccharides from Vaccinium bracteatumThunb.Leaves，VBLP)能改善烟气质,改善余味。程素娇等人利用响应面分析法优化乌饭树树叶多糖的提取工艺。利用回归分析优化得到了最佳提取工艺，多糖纯度达到38.2％。徐啟馨采用连续分级提取了乌饭树树叶多糖，测定了乌饭树树叶多糖的组成成分和基本特性，研究了乌饭树树叶多糖的流变学特性和乳化活性，分析了乌饭树树叶多糖的抗氧化活性，并对乌饭树树叶多糖四种组分的上述性质进行了比较。王立等人研究表明乌饭树叶多糖降血糖机理主要通过促进胰岛素分泌、修复糖尿病小鼠受损胰岛β细胞和提高糖尿病小鼠抗氧化能力实现。方斌等人研究发现乌饭树叶多糖可降低2型糖尿病小鼠血糖、血脂、炎症因子，促进胰岛素释放，调节NF-κB、PPARγ蛋白表达，改善胰岛素抵抗。公开号为CN105777927A的专利文献公开了乌饭树叶多糖的分离纯化方法，但是仅仅是对乌饭树叶多糖的初步分离纯化，并缺少对其结构特征进行表征。
综上所述，目前对乌饭树叶多糖的研究还不够深入，特别是乌饭树叶多糖单一组分的结构特性及活性评价研究未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种天然成分中具有增强土鸡机体免疫力的活性成分乌饭树叶多糖VBLP-3b、制备方法及其应用。
为达到上述目的，本发明的技术方案是：
乌饭树叶多糖VBLP-3b，其结构特征为：分子量为3.76×105Da，单糖组成为阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖，摩尔比为1.56:1.00:1.63:2.12:2.05。
乌饭树叶多糖VBLP-3b的制备方法，其包括如下步骤：
(1)粗多糖的提取
乌饭树叶清洗干净，粉碎，按照料液比为1:8-1:30(g/mL)加入水，在超声功率50W，微波功率50-80W条件下提取，提取时间30-60min，提取结束后离心得上清液，50℃减压浓缩，向浓缩液加入四倍体积无水乙醇，4℃静置24h沉淀多糖，10000r/min离心5min，收集得到沉淀，沉淀冷冻干燥后得到乌饭树叶粗多糖；
(2)粗多糖的纯化
将粗多糖配制成浓度为25mg/mL的溶液，加入Sevag试剂脱蛋白4次，然后再通过透析袋(截留分子量3500Da)透析24h，透析液冷冻干燥得到纯化多糖；
(3)乌饭树叶多糖组分的分离
将乌饭树叶纯化多糖配置成浓度为15mg/mL的溶液，然后上样至DEAE-SepharoseCL-6B离子交换柱，依次用浓度为去离子水、0.1-0.5mol/L的NaCl溶液洗脱，流速为60mL/h，自动收集，每管5mL，苯酚-硫酸法检测OD490，绘制洗脱曲线，分别获得3个洗脱峰，即0.2mol/L～0.4mol/L的NaCl溶液洗脱所对应的洗脱峰VBLP-1～3；分别收集合并VBLP-1～3所对应的洗脱液，获得VBLP-1(0.2mol/L的NaCl溶液洗脱)、VBLP-2(0.3mol/L的NaCl溶液洗脱)、VBLP-3(0.4mol/L的NaCl溶液洗脱)3个多糖组分，分别对3个多糖组分用去离子水对洗脱液透析24h，冷冻干燥分别得到多糖组分VBLP-1、VBLP-2和VBLP-3，然后，比较3个多糖组分的抗氧化活性，确定VBLP-3为抗氧化活性最高的组分；
将乌饭树叶多糖组分VBLP-3配置成浓度为10mg/mL的溶液，上样至SepharoseCL-6B凝胶色谱柱，用浓度为0.2mol/L的NaCl溶液洗脱，流速为60mL/h，自动收集，每管5mL，苯酚-硫酸法检测OD490，绘制洗脱曲线；根据洗脱曲线，得到两个洗脱峰VBLP-3a和VBLP-3b，分别收集合并VBLP-3a和VBLP-3b所对应的洗脱液，获得VBLP-3a和VBLP-3b两个多糖组分，分别对2个多糖组分用去离子水对洗脱液透析24h，冷冻干燥分别得到多糖组分VBLP-3a和VBLP-3b；然后，比较2个多糖组分的抗氧化活性，确定VBLP-3b为抗氧化活性最高的组分。
优选的，本发明所述的乌饭树叶多粗多糖的提取过程中，按照料液比为1:15(g/mL)加入水。
优选的，本发明所述的乌饭树叶多粗多糖的提取过程中，微波功率为60W。
优选的，本发明所述的乌饭树叶多粗多糖的提取过程中，提取时间为50min。
优选的，本发明所述的乌饭树叶多粗多糖纯化过程中，透析袋的截留分子量为3500Da。
优选的，本发明所述的乌饭树叶多粗多糖纯化过程中，采用的色谱柱为DEAE-Sepharose CL-6B离子交换柱和Sepharose CL-6B凝胶色谱柱。
乌饭树叶多糖VBLP-3b在制备抗氧化与增强土鸡机体免疫力的功能产品中的应用，制备的功能产品为颗粒剂。所述颗粒剂的制备方法为：将乌饭树叶多糖VBLP-3b、可溶性淀粉和糊精按照质量比例为(2～5)：(1～4)：(2～5)混合均匀，加80％乙醇作为润湿剂制备软材，过40目筛制得颗粒剂，烘干温度40～60℃，烘干时间1～4h，整粒，筛除细粉，即得VBLP-3b多糖颗粒剂。
本发明的有益技术效果：
(1)本发明的乌饭树叶多糖VBLP-3a为天然提取物，具有良好的安全性；
(2)基于抗氧化与免疫调节作用的相关性，本发明采用抗氧化活性导向分离纯化乌饭树叶多糖免疫调节多糖，所提供的乌饭树叶多糖VBLP-3a组分兼具了显著的抗氧化与增强机体免疫力作用。
(2)本发明的乌饭树叶多糖组分VBLP-3b能够提高土鸡机体免疫力，可以作为免疫调节剂广泛应用于土鸡饲料添加剂领域。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1为乌饭树叶纯化多糖的DEAE-Sepharose CL-6B洗脱曲线图。
图2为乌饭树叶多糖组分VBLP-3的Sepharose CL-6B洗脱曲线图。
图3为乌饭树叶多糖组分VBLP-3b单糖组成的高效液相色谱图。
图4为乌饭树叶多糖组分VBLP-3b的分子量分布图。
图5为乌饭树叶多糖组分VBLP-3b的紫外扫描图。
图6为乌饭树叶多糖组分VBLP-3b的红外光谱图。
具体实施方式
本发明实施例采用新鲜乌饭树叶。
本发明实施例中所用的试剂：细胞因子IL-2、IL-12、TNF-α、IFN-γELISA试剂盒(武汉凯普瑞生物技术有限公司)；硫酸亚铁、双氧水、水杨酸、Tris-HCl缓冲溶液(50mmol/L，pH8.2)、邻苯三酚、葡萄糖、苯酚、浓硫酸、乙醇等均为分析纯。
本发明实施例中所用的仪器与设备：HH-2智能数显恒温水浴锅，RE-52A旋转蒸发仪，SHB-B95循环水式多用真空泵，EL-800酶联检测仪，DF-101S恒温加热磁力搅拌器，FTIR-650傅里叶变换红外光谱仪，752紫外-可见分光光度计，UV2102 PCS紫外扫描仪，GC-14A气相色谱仪，Waters 600高压液相气谱仪(美国Waters公司)。所有实验做三次平行，数据表达为均值±SD，数据的统计分析采用t-检验或ANOVA分析，p<0.05认为存在统计学差异。
另外，在下述的实施例中，如无特别说明，本发明中选用的所有试剂、原料和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
乌饭树叶粗多糖的提取与纯化：
乌饭树叶清洗干净，粉碎，按照料液比为1:15(g/mL)加入水，在超声功率50W，微波功率60W条件下提取，提取时间50min，提取结束后离心得上清液；50℃减压浓缩，向浓缩液加入四倍体积无水乙醇，4℃静置24h沉淀多糖，10000r/min离心5min，收集得到沉淀，沉淀冷冻干燥后得到乌饭树叶粗多糖。将粗多糖配制成浓度为25mg/mL的溶液，加入Sevag试剂(正丁醇:三氯甲烷＝1:4)脱蛋白4次，然后再通过透析袋(截留分子量3500Da)透析24h，透析液冷冻干燥得到纯化多糖。
乌饭树叶多糖组分的分离：
将乌饭树叶纯化多糖配置成浓度为15mg/mL的溶液，然后上样至DEAE-SepharoseCL-6B离子交换柱，依次用浓度为去离子水、0.1-0.5mol/L的NaCl溶液洗脱，流速为60mL/h，自动收集，每管5mL，苯酚-硫酸法检测OD490，绘制洗脱曲线，分别获得3个洗脱峰，即0.2mol/L～0.4mol/L的NaCl溶液洗脱所对应的洗脱峰VBLP-1～3；分别收集合并VBLP-1～3所对应的洗脱液，获得VBLP-1(0.2mol/L的NaCl溶液洗脱)、VBLP-2(0.3mol/L的NaCl溶液洗脱)、VBLP-3(0.4mol/L的NaCl溶液洗脱)3个多糖组分(图1)，分别对3个多糖组分用去离子水对洗脱液透析24h，冷冻干燥分别得到多糖组分VBLP-1、VBLP-2和VBLP-3，然后，比较3个多糖组分的抗氧化活性，确定VBLP-3为抗氧化活性最高的组分。
将乌饭树叶多糖组分VBLP-3配置成浓度为10mg/mL的溶液，上样至SepharoseCL-6B凝胶色谱柱，用浓度为0.2mol/L的NaCl溶液洗脱，流速为60mL/h，自动收集，每管5mL，苯酚-硫酸法检测OD490，绘制洗脱曲线；根据洗脱曲线，得到两个洗脱峰VBLP-3a和VBLP-3b，分别收集合并VBLP-3a和VBLP-3b所对应的洗脱液，获得VBLP-3a和VBLP-3b两个多糖组分(图2)，分别对2个多糖组分用去离子水对洗脱液透析24h，冷冻干燥分别得到多糖组分VBLP-3a和VBLP-3b；然后，比较2个多糖组分的抗氧化活性，确定VBLP-3b为抗氧化活性最高的组分。
乌饭树叶多糖组分的抗氧化活性比较：
DPPH自由基清除能力测定：配置0.1mmol/L的DPPH乙醇溶液，避光保存备用。在试管中分别加入不同浓度的多糖组分溶液(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL)2.0mL以及2.0mLDPPH溶液，摇匀、室温下避光反应30min，于517nm处进行吸光度测定，2mL蒸馏水分别代替多糖组分溶液及2mL DPPH乙醇溶液(0.1mmol/L)反应作为空白参比，测定OD517值，以蒸馏水作参比调零。在计算清除率的基础上计算IC50(50％inhibiting concentration)，DPPH自由基清除率计算公式如下：
清除率(％)＝[1-(A2-A1)/A3]×100
式中：A1为蒸馏水替代多糖样品吸光度值；A2为不同浓度多糖样品的吸光度值；A3为蒸馏水替代DPPH的吸光度值；
羟基自由基清除能力的测定：配置9.0mmol/L的FeSO4溶液，9.0mmol/L的水杨酸乙醇溶液以及8.8mmol/L的H2O2溶液备用。分别向各试管中加入1mL的FeSO4、1mL的水杨酸乙醇溶液，混匀后加入不同浓度的多糖组分溶液(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL)1.0mL，再加入1.0mL H2O2启动反应。混匀后于37℃水浴加热反应30min，测定0D510值，在计算清除率的基础上计算IC50，羟基自由基的清除率计算公式如下：
清除率(％)＝[1-(A2-A1)/A3]×100
式中：A1为以蒸馏水代替水杨酸的吸光度值；A2为不同浓度多糖样品的吸光度值；A3为以蒸馏水代替不同浓度多糖样品的吸光度值。
超氧阴离子自由基清除能力测定：配置50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.2)，7mmol/L邻苯三酚溶液，10mol/L HCl溶液备用。向试管中加入4.5mL Tris-HCl缓冲液，1mL不同浓度的多糖溶液(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL)以及3.2mL蒸馏水，混匀后于25℃水浴20min。随后加入0.3mL邻苯三酚溶液(7mmol/L)，摇匀，25℃水浴加热3min后立即滴入1滴HCl(10mol/L)溶液终止反应，测定0D325值，在计算清除率的基础上计算IC50，超氧阴离子自由基清除率计算公式如下，
清除率＝(1-A/A0)×100
式中：A为不同浓度多糖样品的吸光度值；A0为以蒸馏水代替不同浓度多糖样品的吸光度值。
如表1所示，与乌饭树叶多糖组分VBLP-1和VBLP-2相比，VBLP-3具有较强的抗氧化活性(P<0.05，P<0.01)。
如表2所示，与VBLP-3a相比，VBLP-3b具有较强的抗氧化活性(P<0.05，P<0.01)。
表1.乌饭树叶多糖组分VBLP-1～3的抗氧化活性比较
Figure BDA0003694397510000071
表2.乌饭树叶多糖组分VBLP-3a与VBLP-3b的抗氧化活性比较
Figure BDA0003694397510000072
注：数据表示为均值±SD(n＝3)；在同一列中，上标的不同符号代表存在统计学差异(P<0.05或P<0.01)；IC50(D)代表清除DPPH自由基的半数抑制浓度；IC50(H)代表清除羟基自由基的半数抑制浓度；IC50 IC50(S)代表清除超氧阴离子自由基的半数抑制浓度。
乌饭树叶多糖组分VBLP-3b的结构特征：
单糖组成测定：取VBLP-3b样品10mg于具塞管中，加入2mol/L的三氟乙酸(TFA)溶液2mL真空封管后于121℃水解1h，水解液除尽过量的TFA后，真空干燥。采用糖腈乙酸酯衍生化法，加10mg盐酸羟胺、适量肌醇(内标)和0.5mL吡啶，90℃加热30min后，取出冷却至室温，加入0.5mL醋酸酐，90℃下继续反应30min进行乙酰化。反应产物直接进行气相色谱(GC)分析，根据单糖保留时间定性判断单糖种类，根据峰面积的比值确定各单糖间的比例关系。
色谱条件：采用OV1701弹性石英毛细管柱(Φ0.32mm×30m)，载气为N2，流速1.5mL/min，FID氢焰检测器，气化室温度260℃，检测器温度250℃，采用程序升温：起始温度150℃，停留lmin，以10℃/min升温至190℃，停留lmin，以3℃/min升温至240℃，停留20min。
相对分子质量测定：将相对分子质量为6100、26290、84000、158000和291000的标准Dextran相继进样，HPLC记录保留时间TR，以TR为横坐标，LgM为纵坐标绘制标准曲线，求得回归方程。待测样品VBLP-3b进样20μL，根据所得TR，通过回归方程计算多糖的相对分子质量。色谱柱：Waters UllrallydrogelTM Linear(Φ7.8mm×300mm)，检测器：Waters2410示差折光检测器，以0.lmol/L的NaN03为流动相，流速0.9mL/min，柱温45℃。
紫外光谱测定：VBLP-3b的紫外光谱测定采用上海精密仪器有限公司的UV2102PCS紫外扫描仪进行测定，扫描范围为190nm-900nm。
红外光谱测定：取VBLP-3b 1mg和100mgKBr混合研磨压片，采用Thermo Electron公司的Nicolet Nexus傅里叶红外光谱仪进行测定，扫描范围4000-400cm-1，分辩率为4cm-1。
如图3所示，VBLP-3b主要由阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖构成，摩尔比为1.56:1.00:1.63:2.12:2.05。
如图4所示，VBLP-3b相对分子质量为3.76×105Da。
如图5所示，从VBLP-3b的紫外光谱图中，可以观察到280nm左右不存在吸收峰，表明VBLP-3b经过纯化后不含有蛋白质。
如图6所示，从VBLP-3b的红外光谱图中，可以观察到3434cm-1附近存在一个宽峰，这是由-OH的伸缩振动引起的；2949cm-1附近的峰分别归属-CH2-的不对称伸缩振动；1633cm-1附近的强峰是典型的羰基所特有的吸收峰，1106cm-1和1026cm-1附近的吸收峰归属吡喃环的伸缩振动。红外分析结果表明，VBLP-3b符合吡喃型多糖的结构特征。
VBLP-3b多糖颗粒剂的制备：
将乌饭树叶多糖VBLP-3b、可溶性淀粉和糊精按照质量比例为2：1：3混合均匀，加80％乙醇作为润湿剂制备软材，过40目筛制得颗粒剂，置于60℃烘箱中干燥1h，整粒，筛除细粉，即得VBLP-3b多糖颗粒剂。
VBLP-3b多糖颗粒剂的制备：
将乌饭树叶多糖VBLP-3b、可溶性淀粉和糊精按照质量比例为3：2：4混合均匀，加80％乙醇作为润湿剂制备软材，过40目筛制得颗粒剂，置于50℃烘箱中干燥3h，整粒，筛除细粉，即得VBLP-3b多糖颗粒剂。
VBLP-3b多糖颗粒剂的制备：
将乌饭树叶多糖VBLP-3b、可溶性淀粉和糊精按照质量比例为4：3：5混合均匀，加80％乙醇作为润湿剂制备软材，过40目筛制得颗粒剂，置于55℃烘箱中干燥2h，整粒，筛除细粉，即得VBLP-3b多糖颗粒剂。
VBLP-3b颗粒剂对土鸡的免疫调节作用：
1.试验设计
选取200只健康、体重接近的1日龄土鸡，随机分为4组，每组5个重复，每个重复10只土鸡(公母各半)。对照组饲喂基础日粮，其他处理组分别在基础日粮中添加500mg/kg(试验1组)、1000mg/kg(试验2组)、1500mg/kg(试验3组)的VBLP-3b颗粒剂，试验周期为42d，基础日粮配制参考NRC(2012)鸡的营养标准和《鸡饲料标准》(NY/T 33-2004)。
2.饲养管理
采用3层笼养饲养方式，每天定时将VBLP-3b加在基础日粮中饲喂2次，期间自然光照、通风，常规消毒，自由采食饮水，保持鸡舍环境卫生，免疫接种按照正常免疫程序进行。第1周饲养环境温度保持在33-34℃，以后每周平均降低2℃，直至室温降低到22℃左右。给予充足自然光，最终室温维持在22℃左右。
3.免疫功能指标的测定
3.1免疫器官指数
在试验结束时，每组随机抽取4只土鸡，心脏采血后颈部脱臼处死后取胸腺、脾脏和法氏囊，清洗称重，免疫器官指数计算公式如下：
免疫器官指数(g/kg)＝免疫器官重量(g)/土鸡体重(kg)
3.2血清免疫指标
每组分别随机选取2只土鸡，禁食3h，然后通过翅静脉采血，离心(5000r/min，5min)制备血清，然后严格检测试剂盒说明书对血清中的IgA、IgG、IgM、IL-2、IL-12、TNF-α、IFN-γ含量进行检测。
4.数据分析
每组数据进行三次平行试验取平均值，以“平均值±标准差”表示，利用spss20软件处理数据软件进行方差分析和显著性分析，p<0.05表示存在显著性差异。
VBLP-3b颗粒剂对土鸡免疫器官指数的影响如表3所示，与对照组相比，在基础日粮中添加1000mg/kg(试验2组)、1500mg/kg(试验3组)的VBLP-3b颗粒剂，胸腺指数、脾脏指数和法氏囊指数明显提高(p<0.05)，说明VBLP-3b颗粒剂能够通过增加免疫器官质量，提高免疫指数进而增强土鸡的免疫功能。
表3 VBLP-3b颗粒剂对土鸡免疫器官指数的影响
Figure BDA0003694397510000101
注：与对照组相比，同列数据肩标不同小写字母为差异显著(p<0.05)。
VBLP-3b颗粒剂对土鸡免疫血清免疫球蛋白(IgA、Ig G、Ig M)的影响如表4所示，与对照组相比，在基础日粮中添加1000mg/kg(试验2组)、1500mg/kg(试验3组)的VBLP-3b颗粒剂，血清中IgA、Ig M含量明显提高(p<0.05)，另外在基础日粮中添加VBLP-3b颗粒剂，血清中Ig G明显提高(p<0.05)，说明VBLP-3b颗粒剂能够通过提高土鸡免疫球蛋白含量，进而增强土鸡的免疫功能。
表4 VBLP-3b颗粒剂对土鸡血清免疫球蛋白(IgA、IgG、IgM)的影响
Figure BDA0003694397510000102
注：与对照组相比，同列数据肩标不同小写字母为差异显著(p<0.05)。
VBLP-3b颗粒剂对土鸡血清IL-2、IL-12、TNF-α、IFN-γ含量的影响如表5所示，与对照组相比，在基础日粮中添加VBLP-3b颗粒剂，血清中IL-2、IL-12、TNF-α、IFN-γ含量明显提高(p<0.05)，说明VBLP-3b颗粒剂能够促进细胞因子IL-2、IL-12、TNF-α、IFN-γ的分泌而提高土鸡的免疫性能。
表5 VBLP-3b颗粒剂对土鸡血清IL-2、IL-12、TNF-α、IFN-γ含量的影响
Figure BDA0003694397510000111
注：与对照组相比，同列数据肩标不同小写字母为差异显著(p<0.05)。
以上结果综合表明，VBLP-3b颗粒剂通过提高土鸡免疫器官指数、免疫球蛋白含量，促进细胞因子IL-2、IL-12、TNF-α、IFN-γ的分泌来增强土鸡的免疫性能，可以作为免疫调节剂广泛应用于饲料中。
上述实施例不以任何方式限制本发明，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.乌饭树叶多糖VBLP-3b，其特征在于，结构特征为：分子量为3.76×105Da，单糖组成为阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖，摩尔比为1.56:1.00:1.63:2.12:2.05。
2.如权利要求1所述的乌饭树叶多糖VBLP-3b的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）粗多糖的提取
乌饭树叶清洗干净，粉碎，按照料液比为1:8-1:30g/mL加入水，在超声功率50W，微波功率50-80W条件下提取，提取时间30-60min，提取结束后离心得上清液，50℃减压浓缩，向浓缩液加入四倍体积无水乙醇，4℃静置24h沉淀多糖，10000 r/min离心5min，收集得到沉淀，沉淀冷冻干燥后得到乌饭树叶粗多糖；
（2）粗多糖的纯化
将粗多糖配制成浓度为25 mg/mL的溶液，加入Sevag试剂脱蛋白4次，然后再通过透析袋透析24h，透析液冷冻干燥得到纯化多糖；
（3）乌饭树叶多糖组分的分离
将乌饭树叶纯化多糖配置成浓度为15mg/mL的溶液，然后上样至DEAE-Sepharose CL-6B离子交换柱，依次用去离子水、浓度为0.1-0.5 mol/L的NaCl溶液洗脱，流速为60mL/h，自动收集，每管5mL，苯酚-硫酸法检测OD490，绘制洗脱曲线，分别获得3个洗脱峰，即0.2mol/L～0.4mol/L的NaCl溶液洗脱所对应的洗脱峰VBLP-1～3；分别收集合并VBLP-1～3所对应的洗脱液，经0.2mol/L的NaCl溶液洗脱获得VBLP-1多糖组分、经0.3mol/L的NaCl溶液洗脱获得VBLP-2多糖组分、经0.4mol/L的NaCl溶液洗脱获得VBLP-3多糖组分，分别对3个多糖组分用去离子水对洗脱液透析24h，冷冻干燥分别得到多糖组分VBLP-1、VBLP-2和VBLP-3，然后，比较3个多糖组分的抗氧化活性，确定VBLP-3为抗氧化活性最高的组分；
将乌饭树叶多糖组分VBLP-3配置成浓度为10mg /mL的溶液，上样至SepharoseCL-6B凝胶色谱柱，用浓度为0.2mol/L的NaCl溶液洗脱，流速为60mL/h，自动收集，每管5mL，苯酚-硫酸法检测OD490，绘制洗脱曲线；根据洗脱曲线，得到两个洗脱峰VBLP-3a和VBLP-3b，分别收集合并VBLP-3a和VBLP-3b所对应的洗脱液，获得VBLP-3a和VBLP-3b两个多糖组分，分别对2个多糖组分用去离子水对洗脱液透析24h，冷冻干燥分别得到多糖组分VBLP-3a和VBLP-3b；然后，比较2个多糖组分的抗氧化活性，确定VBLP-3b为抗氧化活性最高的组分。
3.根据权利要求2所述的乌饭树叶多糖VBLP-3b的制备方法，其特征在于：所述料液比为1:15。
4.根据权利要求2所述的乌饭树叶多糖VBLP-3b的制备方法，其特征在于：所述微波功率为60W。
5.根据权利要求2所述的乌饭树叶多糖VBLP-3b的制备方法，其特征在于：所述提取时间为50min。
6.根据权利要求2所述的乌饭树叶多糖VBLP-3b的制备方法，其特征在于：所述透析袋的截留分子量为3500Da。
7.根据权利要求1所述的乌饭树叶多糖VBLP-3b在制备抗氧化与增强土鸡机体免疫力的功能产品中的应用。
8.根据权利要求7所述的乌饭树叶多糖VBLP-3b的应用，其特征在于：制备的功能产品为颗粒剂。
9.根据权利要求8所述的乌饭树叶多糖VBLP-3b的应用，其特征在于：所述颗粒剂的制备方法为：将乌饭树叶多糖VBLP-3b、可溶性淀粉和糊精按照质量比例为2~5：1~4：2~5混合均匀，加80%乙醇作为润湿剂制备软材，过40目筛制得颗粒剂，烘干温度40~60℃，烘干时间1~4h，整粒，筛除细粉，即得VBLP-3b多糖颗粒剂。
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