CN114874160B - 多西紫杉醇衍生物、多西紫杉醇人工抗原、杂交瘤细胞株、多西紫杉醇单克隆抗体及应用 - Google Patents
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Abstract
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其涉及多西紫杉醇衍生物、多西紫杉醇人工抗原、杂交瘤细胞株、多西紫杉醇单克隆抗体及应用。
背景技术
多西紫杉醇(docetaxel)是一种半合成的新型抗肿瘤药物,是从欧洲紫杉树针叶中提取的无活性前体经化学处理后得到的活性药物,能有效地抑制肿瘤细胞的复制,作用于细胞G2~M生长期。临床研究表明,多西紫杉醇对多种肿瘤疾病有效,包括非小细胞肺癌、乳腺癌和卵巢癌。
目前,多西紫杉醇的治疗方法为根据癌症患者的体表面积(boby surface area,BSA)确定初始给药剂量;但是由于多西紫杉醇的毒性和疗效存在广泛而且高度不确定的个体间差异,其毒性又和个体间药动学差异密切相关,因此,使用上述多西紫杉醇的治疗方法容易发生严重的不良反应,因此在治疗期间需密切关注癌症患者的病情。而治疗药物监测(TDM)能够直接根据多西紫杉醇的血药浓度调整给药剂量。因此,多西紫杉醇的TDM在评价治疗效果、规避副反应以及个体化用药方案调整等方面发挥重要作用。
但目前多西紫杉醇血药浓度监测国内临床实践中开展很少,且多西紫杉醇血药浓度的检测方法繁琐。虽然,现有技术中存在对多西紫杉醇的检测方法,主要包括高效液相色谱-紫外(HPLC-UV)检测法或高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)检测法,但是这类方法满足不了临床高通量、快速准确的检测需求。
建立高灵敏度、高特异性的多西紫杉醇免疫学检测的前提是获得高质量的抗多西紫杉醇抗体,而抗多西紫杉醇抗体又依赖于多西紫杉醇人工抗原的设计,因此,有必要建立能够实现高灵敏度、高特异性的多西紫杉醇免疫学检测的多西紫杉醇人工抗原。而多西紫杉醇人工抗原包括多西紫杉醇衍生物和载体蛋白。
目前,多西紫杉醇的衍生位点主要集中在2号位,如公开号为CN107936058A的中国专利公开了一种多西紫杉醇2号位衍生物,用于为线粒体靶向药物递送;公开号为CN103351424A的中国专利公开了一种多烯紫杉醇奥曲肽偶联物的制备方法,也是通过2号位衍生,用于药物治疗;公开号为CN104447984A的中国专利公开了一种多西紫杉醇免疫原、抗多西紫杉醇特异性抗体和多西紫杉醇检测试剂。但是,上述现有技术均未披露关于多西紫杉醇内源性代谢物的交叉反应,无法满足临床样本TDM的需求。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供多西紫杉醇衍生物、多西紫杉醇人工抗原、杂交瘤细胞株、多西紫杉醇单克隆抗体及应用。本发明提供的多西紫杉醇衍生物与载体蛋白结合形成的多西紫杉醇人工抗原免疫动物后产生的多西紫杉醇单克隆抗体能够高灵敏度识别多西紫杉醇;同时,具备优于现有抗体的特异性,即同紫杉醇和多西紫杉醇代谢物无交叉反应,满足临床样本TDM的需求。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种多西紫杉醇衍生物,具有式I所示结构:
本发明还提供了上述技术方案所述的多西紫杉醇衍生物的制备方法,包括以下步骤:
将多西紫杉醇和丁二酸酐溶解,进行酯化反应,得到所述多西紫杉醇衍生物。
优选地,所述多西紫杉醇和丁二酸酐的摩尔比为1:2~1:50。
优选地,所述酯化反应的温度为0~5℃,时间为16~24h。
本发明还提供了一种多西紫杉醇人工抗原,包括多西紫杉醇衍生物和载体蛋白;
所述多西紫杉醇衍生物为上述技术方案所述的多西紫杉醇衍生物或上述技术方案所述的制备方法得到的多西紫杉醇衍生物。
优选地,所述多西紫杉醇人工抗原具有式II所示结构:
式II中,n=1~100。
本发明还提供了上述技术方案所述的多西紫杉醇人工抗原的制备方法,包括以下步骤:
将多西紫杉醇衍生物和偶联剂溶解混合,进行活化,得到活化多西紫杉醇衍生物体系;
将载体蛋白溶解,得到载体蛋白溶液;
将所述活化多西紫杉醇衍生物体系和载体蛋白溶液混合,依次进行复合反应和透析,得到所述西紫杉醇人工抗原。
本发明还提供了一种产生多西紫杉醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株,所述杂交瘤细胞株于2022年5月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮政编码为100101,保藏编号为CGMCC No. 45163。
本发明还提供了一种多西紫杉醇单克隆抗体,由上述技术方案所述的产生多西紫杉醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株产生。
本发明还提供了上述技术方案所述的多西紫杉醇单克隆抗体在制备检测多西紫杉醇药剂中的应用。
本发明提供了一种多西紫杉醇衍生物,具有式I所示结构。本发明的多西紫杉醇衍生物的衍生位点靠近多西紫杉醇与无活性多西紫杉醇代谢物(M1、M2、M3和M4)共同的特征结构,因此利用其免疫的抗体能够特异性识别多西紫杉醇。羟基位衍生最大程度的保留了多西紫杉醇本身的结构完整性。
本发明还提供了上述技术方案所述的多西紫杉醇衍生物的制备方法,本发明提供的制备方法操作简单。
本发明还提供了一种多西紫杉醇人工抗原,包括多西紫杉醇衍生物和载体蛋白;所述多西紫杉醇衍生物为上述技术方案所述的多西紫杉醇衍生物或上述技术方案所述的制备方法得到的多西紫杉醇衍生物。本发明将多西紫杉醇衍生物与载体蛋白结合,形成多西紫杉醇人工抗原;由该多西紫杉醇人工抗原免疫动物产生的多西紫杉醇单克隆抗体能够高灵敏度识别多西紫杉醇;同时,具备优于现有抗体的特异性,即同紫杉醇和多西紫杉醇代谢物无交叉反应。
本发明还提供了上述技术方案所述的多西紫杉醇人工抗原的制备方法,本发明提供的制备方法操作简单。
本发明还提供了一种产生多西紫杉醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株,所述杂交瘤细胞株于2022年5月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮政编码为100101,保藏编号为CGMCC No. 45163。本发明提供的杂交瘤细胞株能够产生多西紫杉醇单克隆抗体,产生的多西紫杉醇单克隆抗体能够高灵敏度识别多西紫杉醇;同时,具备优于现有抗体的特异性,即同紫杉醇和多西紫杉醇代谢物无交叉反应。
本发明还提供了一种多西紫杉醇单克隆抗体,由上述技术方案所述的产生多西紫杉醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株产生。本发明的多西紫杉醇单克隆抗体能够高灵敏度识别多西紫杉醇;同时,具备优于现有抗体的特异性,即同紫杉醇和多西紫杉醇代谢物无交叉反应。
本发明还提供了上述技术方案所述的多西紫杉醇单克隆抗体在制备检测多西紫杉醇药剂中的应用。由于本发明的西紫杉醇单克隆抗体具有高灵敏度和特异性识别多西紫杉醇的能力,使其能够应用于制备检测多西紫杉醇药剂,用于多西紫杉醇血药浓度或尿液浓度的检测。
附图说明
图1为实施例4的磁微粒发光法的四参数拟合曲线图;
图2为实施例5的均相酶法所得多西紫杉醇结果和LC-MS法所得多西紫杉醇结果的相关性曲线。
具体实施方式
本发明提供了一种多西紫杉醇衍生物,具有式I所示结构:
本发明还提供了上述技术方案所述的多西紫杉醇衍生物的制备方法,包括以下步骤:
将多西紫杉醇和丁二酸酐溶解,进行酯化反应,得到所述多西紫杉醇衍生物。
在本发明中,若无特殊说明,本发明所用原料均优选为市售产品。
在本发明中,所述多西紫杉醇和丁二酸酐的摩尔比优选为1:2~1:50,进一步优选为1:3~1:10。
在本发明中,所述溶解的试剂优选包括甲苯、吡啶和二甲基甲酰胺中的一种或多种,进一步优选为甲苯。
在本发明中,所述多西紫杉醇和丁二酸酐溶解优选包括:将多西紫杉醇和溶解的试剂混合,得到多西紫杉醇溶液;在所述多西紫杉醇溶液中加入丁二酸酐。在本发明中,所述多西紫杉醇和溶解的试剂混合优选在搅拌的条件下进行。在本发明中,所述丁二酸酐的加入温度优选为0~5℃。
在本发明中,所述酯化反应的温度优选为0~5℃,时间优选为16~24h。
所述酯化反应后,本发明优选还包括进行减压蒸干;所述减压蒸干的压力优选为0.5~4MPa,进一步优选为1~3MPa,更优选为2MPa;所述减压蒸干的温度优选为≤40℃,进一步优选为10~25℃;本发明对所述减压蒸干的时间不做具体限定,只要能够将溶解的溶剂去除干净即可。
本发明还提供了一种多西紫杉醇人工抗原,包括多西紫杉醇衍生物和载体蛋白;
所述多西紫杉醇衍生物为上述技术方案所述的多西紫杉醇衍生物或上述技术方案所述的制备方法得到的多西紫杉醇衍生物。
本发明提供的多西紫杉醇人工抗原包括多西紫杉醇衍生物;所述多西紫杉醇衍生物为上述技术方案所述的多西紫杉醇衍生物或上述技术方案所述的制备方法得到的多西紫杉醇衍生物。
本发明提供的多西紫杉醇人工抗原包括载体蛋白;所述载体蛋白优选包括牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵清蛋白、牛甲状腺球蛋白、人血清白蛋白或兔血清白蛋白,进一步优选为牛血清白蛋白(BSA)。
在本发明中,所述多西紫杉醇人工抗原具有式II所示结构:
式II中,n=1~100。
在本发明中,n优选为10~30。
在本发明中,式II所示的多西紫杉醇人工抗原为一个载体蛋白与n个多西紫杉醇衍生物连接。在本发明中,所述载体蛋白中的氨基和多西紫杉醇衍生物的羧基形成酰胺键,将所述载体蛋白和多西紫杉醇衍生物连接。
本发明还提供了上述技术方案所述的多西紫杉醇人工抗原的制备方法,包括以下步骤:
将多西紫杉醇衍生物和偶联剂溶解混合,进行活化,得到活化多西紫杉醇衍生物体系;
将载体蛋白溶解,得到载体蛋白溶液;
将所述活化多西紫杉醇衍生物体系和载体蛋白溶液混合,依次进行复合反应和透析,得到所述西紫杉醇人工抗原。
本发明将多西紫杉醇衍生物和偶联剂溶解混合,进行活化,得到活化多西紫杉醇衍生物体系。
在本发明中,所述偶联剂优选包括1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐、N,N'-二环己基碳二亚胺和氯甲酸乙酯中的一种或多种,进一步优选为1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐。
在本发明中,所述多西紫杉醇衍生物和偶联剂的用量比优选为1:1~10。
在本发明中,所述多西紫杉醇衍生物和偶联剂溶解混合优选包括:将所述多西紫杉醇衍生物溶解,得到多西紫杉醇衍生物溶液;将偶联剂溶解,得到偶联剂溶液;将所述偶联剂溶液加入到所述多西紫杉醇衍生物溶液中。在本发明中,所述多西紫杉醇衍生物溶解的试剂优选包括二甲基亚砜(DMSO)。在本发明中,所述偶联剂溶解的试剂优选包括水。
在本发明中,所述活化的温度优选为室温,所述活化的时间优选为0.5~2h,进一步优选为1~1.5h。
本发明将载体蛋白溶解,得到载体蛋白溶液。
在本发明中,所述载体蛋白溶解的试剂优选包括PBS溶液。
得到活化多西紫杉醇衍生物体系和载体蛋白溶液后,本发明将所述活化多西紫杉醇衍生物体系和载体蛋白溶液混合,依次进行复合反应和透析,得到所述西紫杉醇人工抗原。
在本发明中,所述复合反应的温度优选为室温,即既不需要额外加热也不需要额外降温;所述复合反应的保温时间优选为1~5h,进一步优选为2h。
在本发明中,所述透析的试剂优选包括PBS溶液。在本发明中,所述透析的透析袋的截留分子量优选为1000~30000Da。在本发明中,所述透析的次数优选为4次。
得到所述西紫杉醇人工抗原后,本发明优选将所述西紫杉醇人工抗原于-20℃冷冻保存。
本发明还提供了一种产生多西紫杉醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分类命名:杂交瘤细胞株;所述杂交瘤细胞株于2022年5月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮政编码为100101,保藏编号为CGMCC No. 45163。
在本发明中,所述产生多西紫杉醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法优选包括以下步骤:
对动物依次进行第一免疫和第二免疫,得到免疫动物;
提取所述免疫动物的脾细胞并和Sp2/0细胞进行融合,得到融合细胞;
对所述融合细胞进行杂交瘤筛选。
本发明对动物依次进行第一免疫和第二免疫,得到免疫动物。
在本发明中,所述动物优选包括小鼠、兔、山羊和绵羊中的一种或多种,进一步优选为小鼠。
在本发明中,所述第一免疫的试剂优选为1mg/mL的多西紫杉醇人工抗原-PBS溶液和弗氏完全佐剂等体积混合乳化的溶液。在本发明中,所述第一免疫的免疫次数优选为1次;每次第一免疫的免疫剂量优选为0.01~0.2mg/只。
在本发明中,所述第二免疫和第一免疫之间优选间隔2~6周。
在本发明中,所述第二免疫的试剂优选为1mg/mL的多西紫杉醇人工抗原-PBS溶液和弗式不完全佐剂等体积混合乳化的溶液。在本发明中,所述第二免疫的次数优选为4次,每次第二免疫的免疫剂量优选为0.01~0.2mg/只;两次第二免疫之间优选间隔1周。
得到免疫动物后,本发明提取所述免疫动物的脾细胞并和Sp2/0细胞进行融合,得到融合细胞。
在本发明中,所述提取免疫动物的脾细胞优选在最后一次免疫的一周后进行。
本发明对所述融合的方法不做具体限定,采用本领域技术人员熟知的手段即可。在本发明的具体实施例中,所述融合的方法优选参考GC Howard, MR Kaser .Making andusing antibodies: a practical handbook.2013 Book进行。
得到融合细胞后,本发明对所述融合细胞进行杂交瘤筛选。
在本发明中,所述杂交瘤筛选优选包括以下步骤:采用多西紫杉醇-BSA(牛血清白蛋白)1μg/mL包被ELISA 96孔板,对所述融合细胞的上清进行ELISA效价测定;选取ELISA效价测定阳性的细胞克隆上清进行竞争ELISA测定;筛选竞争性高的克隆进行亚克隆,得到单细胞克隆株。
本发明还提供了一种多西紫杉醇单克隆抗体,由上述技术方案所述的产生多西紫杉醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株产生。
在本发明中,所述由所述的产生多西紫杉醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株产生多西紫杉醇单克隆抗体的方法优选包括:依次进行小鼠腹水培养和Protein A/G纯化。本发明对所述小鼠腹水培养和Protein A/G纯化的操作不做具体限定,采用本领域技术人员熟知的技术手段即可。
本发明还提供了上述技术方案所述的多西紫杉醇单克隆抗体在制备检测多西紫杉醇药剂中的应用。
本发明对所述多西紫杉醇单克隆抗体在制备检测多西紫杉醇药剂中的应用的方式不做具体限定,采用本领域技术人员熟知的操作即可。
下面结合实施例对本发明提供的多西紫杉醇衍生物、多西紫杉醇人工抗原、杂交瘤细胞株、多西紫杉醇单克隆抗体及应用进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
由多西紫杉醇制备多西紫杉醇衍生物的反应式如下:
具体包括以下步骤:
多西紫杉醇40.4mg,加入10mL甲苯搅拌溶解,控温2℃加入丁二酸酐4.5mg;保持温度2℃避光,氮气保护搅拌反应20h。控制温度20℃、压力为2MPa下进行减压浓缩蒸干甲苯,得到多西紫杉醇衍生物。
所得多西紫杉醇衍生物的结构表征信息为:1H·NMR(DMSO-d6,400MHz)·8.00·(d,·2H),·7.76-7.73·(m,·1H),·7.61-7.64(m,·2H),7.42-7.49· (m,· 3H),·7.25-7.28· (m,· 1H),· 7.20-7.23· (m,· 1H), · 5.82-5.87· (m, ·2H),5.46-5.43·(d,·1H),·5.10-5.11·(s,·1H),·5.06-5.01·(d,·1H),·4.99-4.83·(m,·3H),·4.51-4.49·(s,·1H), 4.30-4.33·(m,·1H),·4.10-3.99(m,·3H),·3.66-3.63·(d,·1H ),·2.96-2.89·(s,·6H),2.23-2.19·(s,·3H),·176-1.62·(m,·6H),·1.60-1.51·(s,·3H),·1.46-1.37·(s,·9H),·1.06-0.95·(d,·6H).从结构表征信息可以看出:获得了预期的多西紫杉醇衍生物。
实施例2
多西紫杉醇人工抗原的制备方法,包括以下步骤:
取10mg实施例1所得多西紫杉醇衍生物,加入1mL的DMSO溶解完全,得到多西紫杉醇衍生物溶液。
称取10mg 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐,溶解在100μL水中,得到1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐溶液;将1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐溶液加入到多西紫杉醇衍生物溶液中,室温反应1h,得到预交联体系。
称取牛血清白蛋白20mg溶解在5mL的PBS溶液中,得到牛血清白蛋白溶液。
将预交联体系和牛血清白蛋白溶液混合,室温搅拌2h;然后用PBS溶液透析(透析袋的截留分子量为7000Da)4次,-20℃冷冻保存,得到多西紫杉醇人工抗原。
实施例3
多西紫杉醇鼠单克隆抗体的制备
采用PBS溶液将多西紫杉醇人工抗原稀释,得到浓度为1mg/mL的多西紫杉醇人工抗原溶液;将多西紫杉醇人工抗原溶液和弗氏完全佐剂等体积混合并乳化完全后,对小鼠进行注射;小鼠按照0.1mg/只的剂量进行第一免疫,第一免疫的次数为1次。
间隔4周后,取1mg/mL多西紫杉醇抗原和弗式不完全佐剂等体积混合乳化后,对小鼠进行第二免疫;第二免疫总共进行四次,每隔一周进行一次第二免疫,每次第二免疫的免疫剂量为0.1mg/只,得到免疫小鼠。
最后一次免疫7天后,取免疫小鼠的脾细胞同Sp2/0细胞按照GC Howard, MRKaser .Making and using antibodies: a practical handbook.2013 Book的方法进行融合,得到融合细胞;采用多西紫杉醇-BSA(牛血清白蛋白)1μg/mL包被ELISA 96孔板,对融合细胞的上清进行ELISA效价测定:具体过程为:在多西紫杉醇-BSA(牛血清白蛋白)1μg/mL包被ELISA 96孔板上加50μL的融合细胞上清37℃反应30min,清洗;然后加100μL羊抗鼠IgG-HRP反应30min,清洗;加入显色液,OD450读取OD值。选取ELISA效价测定阳性的细胞克隆上清进行竞争ELISA测定,具体过程为:加入50μL ELISA效价测定阳性的融合细胞上清和50μL竞争原(多西紫杉醇或紫杉醇)37℃反应30min,清洗;然后加入100μL羊抗鼠IgG-HRP反应30min,清洗;加入显色液,OD450读取OD值。筛选得到3株细胞(1B2,5C9,8H5),细胞上清的间接竞争ELISA结果如表1所示。
表1 细胞上清的间接竞争ELISA结果
从表1可以看出:1B2产生的单克隆抗体表现出对多西紫杉醇最高的灵敏度,IC50为2ng/mL,并且对紫杉醇无交叉反应;适合于多西紫杉醇药物浓度监测方法的建立。
因此,对1B2杂交瘤细胞株进行小鼠腹水培养,并Protein A/G纯化,得到多西紫杉醇单克隆抗体,用于后续多西紫杉醇方法的建立。
实施例4
磁微粒化学发光法多西紫杉醇血药浓度检测方法的建立
1)50mg Dynal beads M280 Tosyl磁珠,稀释在2mL 50mM BB(硼酸-硼砂缓冲液)pH 8.0缓冲液中,加入1mg实施例3得到的多西紫杉醇单克隆抗体,混匀后,37℃震荡反应8h。
2)磁吸去除上清,加入TBST(50mM Tris、0.9wt%NaCl、0.1wt%TW20、pH 7.4)37℃反应12h。
3)磁吸去除上清,加入TBST,稀释到0.4mg/mL,命名为磁微粒工作液,2~8℃保存待用。
1mg ALP(碱性磷酸酶)溶解在1mL PBS溶液中,加入0.5mg多西紫杉醇衍生物(溶解在100μL DMSO中),混合均匀,加入1mg EDC∙HCl固体,室温混匀2h。透析到PBS溶液中,用50mM MES 0.9%NaCl 5mg/mL BSA 1mM MgCl2 pH 6.7稀释到1μg/mL,命名为酶标工作液。
4)反应程序:10μL样本(用PBS溶液自动稀释10倍)+40μL磁微粒液工作液+50μL酶标工作液,37℃孵育反应5min,清洗,加入AMPPD发光液显色。
采用小牛血清基质配置不同浓度的多西紫杉醇的校准品(0-150-300-600-1200-2400ng/mL)制定标准曲线如表2和图1所示。
表2 磁微粒发光法多西紫杉醇定标曲线数据
从图1可以看出:磁微粒发光法得到的定标曲线为:四参数方程式:Y = (A - D) /[1 + (X/C)B] + D;其中:A = 26282505.087107;B = 1.0727034213779;C =17.4319734345178;D = 40696.3283350498;相关系数R2:0.99999。
重复测定低值和高值质控各10次,并按照SD/Mean计算CV;LoB为测定一个零值样本20次,并按照Mean+2SD作为最低检出限,结果如表3所示。
表3 精密度和灵敏度
从表3可以看出:采用多西紫杉醇单克隆抗体制备的磁微粒发光法多西紫杉醇测定试剂灵敏度高。
在浓度为232.1ng/mL的多西紫杉醇样本中加入不同浓度的交叉测试物(紫杉醇、多西紫杉醇M1、多西紫杉醇M2、多西紫杉醇M3、多西紫杉醇M4和5-FU)进行交叉反应,计算交叉反应率,结果如表4所示。
表4 交叉反应结果
从表4可以看出:磁微粒发光法的多西紫杉醇对多种代谢物及常见联合用药紫杉醇和5FU无明显的交叉反应,特异性好。
实施例5
多西紫杉醇均相酶免疫检测试剂的制备
多西紫杉醇均相酶免疫检测试剂包括两种分开设置的试剂,具体如下:
试剂R1的制备:20mM NAD,30 mM葡萄糖-6-磷酸G6P、55mM pH=8.0的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物;加入质量百分含量为0.01%~0.1%的多西紫杉醇单克隆抗体到上述均相酶底物中,在本实施例中具体的质量百分含量为0.05%。
试剂R2的制备:0.1M pH=8.5的Tris缓冲液中加入质量百分含量为0.01~1%制备的多西紫杉醇衍生物-G6PDH酶标偶联物,在本实施例中具体的质量百分含量为0.05%。
其中多西紫杉醇衍生物-G6PDH酶标偶联物是采用600U G6PDH溶解在1mL PBS溶液中,加入0.5mg多西紫杉醇衍生物(溶解在100μL DMSO中),混合均匀,加入1mg EDC固体,室温混匀2h;透析到PBS溶液中,用100mM Tris 0.9%NaCl 5mg/mL BSA pH8.5稀释到5U/mL。
测试程序为:20μL样本+50μL试剂R1反应5min后加入50μL试剂R2继续反应5min,并测定OD340波长的升高速率,设备为日立7170。
选取临床40例多西紫杉醇尿液浓度样本,对比本发明构建的均相酶法同LC-MS法的测定多西紫杉醇结果进行比对,结果如图2所示。
从图2可以看出:基于本发明制备的抗体建立的均相酶法测定多西紫杉醇含量同LC-MS法相关性良好,符合临床需求。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种产生多西紫杉醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其特征在于,所述杂交瘤细胞株于2022年5月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮政编码为100101,保藏编号为CGMCC No. 45163。
2.一种多西紫杉醇单克隆抗体,其特征在于,由权利要求1所述的产生多西紫杉醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株产生。
3.权利要求2所述的多西紫杉醇单克隆抗体在制备检测多西紫杉醇药剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的多西紫杉醇人工抗原,其特征在于,所述多西紫杉醇衍生物的制备方法,包括以下步骤:
将多西紫杉醇和丁二酸酐溶解,进行酯化反应,得到所述多西紫杉醇衍生物。
6.根据权利要求5所述的多西紫杉醇人工抗原,其特征在于,所述酯化反应的温度为0~5℃,时间为16~24h。
7.权利要求4~6任一项所述的多西紫杉醇人工抗原的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
将多西紫杉醇衍生物和偶联剂溶解混合,进行活化,得到活化多西紫杉醇衍生物体系;
将载体蛋白溶解,得到载体蛋白溶液;
将所述活化多西紫杉醇衍生物体系和载体蛋白溶液混合,依次进行复合反应和透析,得到所述多西紫杉醇人工抗原。
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